نصف بروتوكولا بسيطا لإزالة الكيسة الستاتوغرافية والأنسجة المرتبطة بها في ctenophore Mnemiopsis leidyi ، وهو قابل للتصوير الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الاستئصال الجراحي لعضو حسي معقد في ctenophores عالي التجدد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ctenophore Mnemiopsis leidyi هو نموذج حيواني كلاسيكي لتجديد الجسم بالكامل. أدت زيادة قابلية التتبع للعديد من التقنيات المختبرية ووضعها في النشوء والتطور كمجموعة شقيقة محتملة للمتلازمة المتبقية إلى تجديد الاهتمام العلمي مؤخرا بالعمل مع ctenophores. يمكنهم تجديد أي عضو أو نوع خلية مفقود ، بما في ذلك التجديد الكامل للجسم بالكامل من جزء صغير يصل إلى ~ 15٪ من الجسم ، على مدار بضعة أيام. مثل معظم ctenophores ، M. leidyi لديها عضو مستشعر للجاذبية يقع في الجنين يربط المدخلات الحسية بالإخراج الحركي للتحكم في وضع الجسم واتجاهه. يوضح هذا البروتوكول الاستئصال الجراحي لمركب العضو الفموي (AO) والهياكل المرتبطة به في M. leidyi جنبا إلى جنب مع طرق التزريع والمناولة والتركيب المناسبة لتصوير عمليات التئام الجروح وتجديدها التي تحدث في الساعات إلى الأيام التالية. هذه التقنيات المباشرة قابلة للتكيف على نطاق واسع مع النماذج التجريبية والسياقات المختبرية المختلفة.
المقدمة
تعتبر Ctenophores ، المعروفة أيضا باسم الهلام المشط ، عالمية في البيئات البحرية للأرض ويمكن أن تكون لاعبا رئيسيا في النظم البيئية ، لا سيما كجزء من شبكة الغذاء. ctenophore Mnemiopsis leidyi هو نموذج حيواني تاريخي وشائع بشكل متزايد لتجديد الجسم بالكامل1،2. تنشأ قدرتها على تجديد أي عضو أو نوع خلية مفقودة في نهاية التطور الجنيني وتستمر طوال حياتها بعد الجنين 3,4 (~ 0.1 إلى >1,000 مم في حجم الجسم). كما أنها شفافة طوال حياتها وقابلة لتقنيات التصوير الحية والثابتة المتنوعة. كان أحدث سلف مشترك لجميع ctenophores العديد من أنواع الخلايا والأعضاء المعقدة. تمتلك معظم ctenophores الموجودة معظمها خلال مرحلة حياة واحدة على الأقل: عضو استشعار الجاذبية (يسمى تاريخيا العضو القمي ويسمى هنا العضو الفموي ، AO) ، هياكل حركية متخصصة تتكون من أهداب كبيرة منظمة للغاية تنبض بطريقة منسقة (صفوف مشط) ، مخالب تغذية قابلة للسحب ، والخلايا الضوئية التي تتألق بيولوجيا استجابة للمنبهات الضارة (الشكل 1).
على الرغم من أنواع الخلايا العديدة والسلوكيات المعقدة المعتمدة على السياق ، إلا أن مجموعة قوية من البيانات الجينومية تدعم وضع ctenophores كمجموعة شقيقة محتملة لجميع الحية الأخرى5،6،7،8. اقترحت الاختلافات الرئيسية في الأساس الخلوي والوظيفي للجهاز العصبي ctenophore عن الأخرى التي تمتلك جهازا عصبيا (ثنائيين ومجوف) فرضية أن الجهاز العصبي ctenophore يمثل أصلا مستقلا. ومع ذلك ، لا يزال هذا غير مؤكد9،10،11،12.
يشمل مركب الأعضاء الحسية الفموية الكيسة الساكنة ، والتي تشمل العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك أنواع متعددة من الخلايا الحسية العصبية المفترضة13،14،15،16،17،18 ، وتخضع للصيانة المستمرة في ctenophores غير المتلاعب بها. تحمل الخلايا الحسية الميكانيكية حزما هدبية كبيرة ، تنحرف بواسطة ستاتوليث يتكون من خلايا معدنية حيوية (تسمى الخلايا الصخرية) للكشف عن الجاذبية. هناك "مجالان قطبيان" ، يحتويان على هياكل حسية مفترضة ذات وظيفة غير معروفة14 والخلايا الحسية الضوئيةالمحتملة 16 ، مجاورة للكيسة الستاتو.
امتد التحقيق التجريبي لقدرة M . leidyi على التجدد إلى أصغر عند الانتقال من الجنين إلى الفقس (~ 100 ميكرومتر) إلى البالغين العيانية الذين يعيشون بحرية (>2 سم). M. leidyi يبلغ قطر الجسم ~ 1 مم كبيرة بما يكفي للسماح بالتلاعب الجراحي اليدوي بدون أدوات خاصة مثل المعالجات الدقيقة ولكنها صغيرة بما يكفي لتثبيتها على شريحة مجهر قياسية للتصوير بأهداف عالية القوة. يوضح هذا البروتوكول الاستئصال الجراحي للعضو الحسي الفموي والهياكل المرتبطة به ، جنبا إلى جنب مع طرق الاستزراع والتصوير المناسبة لتوثيق عمليات التئام الجروح وتجديدها التي تحدث في الساعات إلى الأيام التالية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير الأدوات واللوازم
- باستخدام موقد بنسن القياسي ، قم بسحب إبر تشريح الزجاج يدويا من الماصات الدقيقة الشعرية الزجاجية. بالنسبة للحيوانات التي يزيد طولها عن 1 مم، استخدم ماصات دقيقة من زجاج الصودا والجير معايرة مخصصة لمناولة السوائل.
ملاحظة: يعمل الحجم 100 ميكرولتر بشكل جيد عبر النطاق البؤري من 0.5-3 مم.- قم بإنشاء مخروط أزرق حاد من اللهب في موقد بنسن.
- أمسك النقطة المركزية للماصة الزجاجية في اللهب حتى تنضج بدرجة كافية لتتحرك تحت ضغط لطيف.
- قم بإزالة الماصة من اللهب واسحب الجانبين على الفور بعيدا عن بعضهما البعض لإنشاء إبرة قصيرة وقوية.
ملاحظة: يمكن إعادة إذابة الإبرة الزجاجية إذا لم يتم الحصول على نتيجة مرضية في المحاولة الأولى ، ويمكن حفظ الإبر المكسورة وإعادة سحبها. انظر الشكل 2 للحصول على أمثلة للإبر القابلة للاستخدام وغير القابلة للاستخدام التي يتم سحبها بهذه الطريقة.
البديل: تعمل الإبر 26 G 1/2 بوصة أيضا بشكل جيد ، خاصة في الطرف الأكبر من نطاق الحجم البؤري.
- قم بإعداد مياه البحر المعقمة عن طريق تمرير مياه البحر الطبيعية أو الاصطناعية عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.
- إنشاء ماصات قياس.
- باستخدام مقص حاد أو شفرة حلاقة ، قم بقص ماصة نقل بلاستيكية لإنتاج فتحة ذات قطر داخلي بالحجم المفضل. حافظ على الاستعداد لماصة واحدة على الأقل لأعلى النطاق المطلوب وأخرى لأسفل النطاق المطلوب. انظر الشكل 3 للحصول على مثال لمجموعة ماصات القياس.
ملاحظة: تعمل هذه الماصات بشكل جيد حتى ~8 مم. من الممكن أيضا تقدير الحجم باستخدام ميكرومتر أو أدوات قياس من الصور الفوتوغرافية.
- باستخدام مقص حاد أو شفرة حلاقة ، قم بقص ماصة نقل بلاستيكية لإنتاج فتحة ذات قطر داخلي بالحجم المفضل. حافظ على الاستعداد لماصة واحدة على الأقل لأعلى النطاق المطلوب وأخرى لأسفل النطاق المطلوب. انظر الشكل 3 للحصول على مثال لمجموعة ماصات القياس.
2. تحضير للتجربة
- حدد الأفراد العاديين شكليا بالحجم والمرحلة المطلوبين.
ملاحظة: نجد أن التي يبلغ قطرها ~ 0.5-3 مم مثالية للتركيب على الشرائح. تأكد من أن لا تتناسب مع ماصة التحجيم السفلية ولكنها تتناسب بشكل مريح مع ماصة التحجيم الأعلى في المجموعة. - تجويع التجارب لمدة 8-16 ساعة.
ملاحظة: في حين أن M. leidyi شفافة بصريا وليست ذاتية الفلورسنت ، فإن الطعام المتداول عبر الجهاز الهضمي يكون معتما بشكل عام وغالبا ما يكون ذاتي الفلورسنت.
3. أداء التخفيضات
- استخدم أنبوب نقل أعرض من حجم جسم التجربة لنقله إلى طبق بوليسترين مقاس 35 مم يحتوي على مياه البحر المعقمة.
- تصور العينة باستخدام مجهر التشريح. دحرج واحدا على جانبه الغدي (الشكل 1). يوفر هذا العرض أسهل وصول لإزالة العضو الفموي. ركز على العضو الفموي.
ملاحظة: قد يختلف التكبير الأكثر فائدة حسب حجم وتفضيلات المستخدم. بشكل عام ، يعمل التكبير 12-20x بشكل جيد. - أمسك برفق في مكانه بإبرة زجاجية واحدة باستخدام اليد غير المهيمنة.
- باستخدام اليد المهيمنة ، أدخل طرف الإبرة أسفل العضو الفموي قليلا. أدخل بشكل غير مباشر لعمل قطع واحد من حافة مرئية للعضو الفموي إلى أسفل قاعدته. اسحب الإبرة وقم بعمل قطع ثان لإزالة قطعة من الأنسجة على شكل إسفين تحتوي على جميع هياكل العضو الفموي (انظر الشكل 4 ، اللوحة العلوية). افحص والأنسجة المستأصلة بعناية للتأكد من نجاح العملية.
- استخدم نفس أنبوب النقل لنقل المقطوع حديثا إلى طبق طازج يحتوي على مياه البحر المعقمة.
ملاحظة: سوف يغلق الجرح بسرعة ، لذلك اعتمادا على الأهداف التجريبية (مثل عينات التجديد المتزامن المتعددة أو لتصوير المراحل المبكرة من الشفاء والتجديد) ، يجب على المرء أن يتحرك بسرعة لتوليد عدة عينات. استخدم مؤقتا للحد من وقت الجراحة لإبقاء مجموعات المتجددة أقرب إلى بعضها البعض.
4. تأكد من صحة التخفيضات
ملاحظة: حتى عند التحقق بعناية تحت مجهر التشريح ، من الممكن أحيانا تفويت الأخطاء الجراحية.
- اتبع خطوات التركيب أدناه لتركيب كل فرد بعد الجراحة مؤقتا على شريحة زجاجية للتحقق تحت المجهر المركب باستخدام DIC من إزالة جميع الهياكل المقصودة بشكل صحيح. قم بإجراء هذا الفحص حتى لو لم يتم إجراء مزيد من التصوير في هذا الوقت.
ملاحظة: قدرات الشفاء الممتازة للctenophores تضفي عليها جيدا تجارب التطعيم. نقوم دائما بإزالة الأعضاء الفموية المستأصلة من وعاء الاستزراع لمنع احتمال أن تلتصق الجوانب المقطوعة لجهاز AO الذي تمت إزالته وبقية الذي تمت إزالته منه ببعضها البعض وتندمج
إذا لم تنتقل مباشرة إلى التصوير طويل المدى ، فلا تغلق الشريحة. سيسهل ذلك الشفاء السريع والعودة إلى ثقافة هذا التجريبي. يوصى بفحص الدقة الجراحية تحت التكبير العالي. على وجه الخصوص ، يمكن إخراج الستاتوليث من القبة دون إكمال الجراحة.
5. التصوير المباشر
- تصاعد
- عالج شريحة المجهر الزجاجي القياسية بعامل سيلان ، مثل طارد الماء لمعالجة الزجاج ، واتركه حتى يجف تماما.
- انقل واحدا بعد الجراحة إلى شريحة معدة باستخدام ماصة نقل. تأكد من أن حبات الماء مع بالداخل.
- ضع كمية صغيرة من طين النمذجة (~ 1.5 مجم) على كل ركن من أركان الغطاء لتشكيل "أقدام" تعمل كمبادر لرفع الغطاء بعيدا عن.
- ضع الغطاء الزجاجي برفق ، من الطين ، فوق. أمسك كل ركن من أركان الغطاء الزجاجي ، وقم بلف في موضعه للتصوير. اضغط لأسفل لضغط قليلا ، مع تثبيته في مكانه. أعد وضع العينة بقدر ما هو مطلوب للوصول إلى رؤية مرضية.
- للتصوير لمدة تزيد عن ~ 30 دقيقة ، ضع طبقة رقيقة من الفازلين على كل حافة من الغطاء الزجاجي لمنع جفاف العينة.
ملاحظة: يمكن استرداد M. leidyi المثبتة بهذه الطريقة بسهولة لمزيد من الثقافة أو المقايسات الأخرى. ومع ذلك ، فإن ستحرر بشكل عام وتعيد وضع نفسها في غضون 1-2 ساعة ، لذا فإن التقاط الفاصل الزمني المستمر لمدة تزيد عن ساعتين سيتطلب نهجا مختلفا للتصوير.
6. الثقافة
- ظروف الاستزراع Cydippid
- التلاعب بالحيوانات الجراحية والتحكم في مياه البحر الطبيعية أو الاصطناعية المفلترة بالقرب من درجة حرارة الغرفة. استخدم حاضنة مضبوطة على 20-22 درجة مئوية لضمان نتائج متسقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عادة ما يكمل التجديد الكامل للعضو في المرحلة Cydippid في غضون ~ 20 دقيقة بعد الإصابة (الشكل 4 والشكل 5) ، بينما يمكن أن يستغرق التجديد الكامل للعضو من 1 إلى 3 أيام. يحتوي هذا التوقيت على بعض التباين البيولوجي ولكنه يكتمل دائما تقريبا بعد 72 ساعة من الجراحة (الشكل 6).
يؤدي الاستئصال الجراحي للخلايا والميزوغليا من مجمع الأعضاء الفموية والأنسجة المجاورة ، متبوعا بالإغلاق السريع للجرح إلى قطر جسم أصغ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن إجراء تجارب مماثلة على أي حجم من M. leidyi المطلوب. يكتمل تكوين العضو بالتزامن مع بداية القدرة التجديدية4. يمكن جمع من البرية19 أو تربيتها في المختبر20،21. إذا كان حجم جسم معين مطلوبا ، فيمكن السماح للحيوانات بالتكاثر ، ورفع النسل إلى الحجم المطلوب. يمكن تقريب حجم الجسم باستخدام ماصات القياس ، المصنوعة في خطوة البروتوكول 1.3 ، مقطوعة إلى القطر الداخلي المطلوب (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
يعترف المؤلفون بامتنان لجوفيتا جوزيف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.2 μ مرشح حقنة م SFCA | ثيرمو / نالجين | 723-2520 | إنشاء مياه بحر معقمة |
| طبق بوليسترين بتري 35 مم | فالكون / كورنينج | 351008 | إجراء تخفيضات ثقافة الصغيرة |
| 60 مل حقنة luer-lock يمكن التخلص منها | لوازم BH | بي إتش 60 إل | إنشاء مياه بحر معقمة |
| ماصات زجاجية معايرة ، 100 &mu ؛ L | دروموند | 2-000-100 | إجراء التخفيضات |
| غطاء النظارات ، # 1.5 ، 18 مم مربع | VWR | 16004-326 | جبل للتصوير |
| ctenophores | عينات الخليج | الحية | |
| شرائح منخفضة زجاجية مزدوجة التجويف، 1.3 مم | VWR | 470200-930 | جبل للتصوير |
| شرائح المجهر الزجاجي | VWR | 16004-398 | جبل للتصوير |
| ملح بحر المحيط الفوري | المحيط الفوري | وسط استزراع | |
| مسطرة صغيرة | تيد بيلا | 13623 | قياس الماصات البلاستيكية |
| نمذجة الطين (البلاستيسين) | بيبي بلاستيلينا | جبل للتصوير | |
| هلام بترويلوم | الفازيلين | جبل للتصوير | |
| ماصات نقل البلاستيك (أحجام متنوعة) | كول بارمر | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | نقل الصغيرة |
| معالجة زجاج Rain-X | المطر X | شرائح مجهر Silanize | |
| حاكم | ويستكوت | 10564 | قياس الماصات البلاستيكية |
| مقص | اوكسو | قطع الماصات البلاستيكية |
المراجع
- Edgar, A., Mitchell, D. G., Martindale, M. Q. Whole-body regeneration in the lobate ctenophore Mnemiopsis leidyi. Genes. 12 (6), 867(2021).
- Martindale, M. Q., Henry, J. Q. Ctenophora. Evolutionary Developmental Biology of Invertebrates 1. , Springer. 179-201 (2015).
- Martindale, M. Q. The onset of regenerative properties in ctenophores. Curr Opin Genet Dev. 40, 113-119 (2016).
- Martindale, M. Q. The ontogeny and maintenance of adult symmetry properties in the ctenophore, Mnemiopsis mccradyi. Dev Biol. 118 (2), 556-576 (1986).
- Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
- Ryan, J. F., et al. The genome of the ctenophore Mnemiopsis leidyi and its implications for cell type evolution. Science. 342 (6164), 1242592-1242592 (2013).
- Whelan, N. V., et al. Ctenophore relationships and their placement as the sister group to all other animals. Nat Ecol Evol. 1 (11), 1737-1746 (2017).
- Schultz, D. T., et al. Ancient gene linkages support ctenophores as sister to other animals. Nature. 618, 110-117 (2023).
- Burkhardt, P. Ctenophores and the evolutionary origin(s) of neurons. Trends Neurosci. 45 (12), 878-880 (2022).
- Sachkova, M. Y., et al. Neuropeptide repertoire and 3D anatomy of the ctenophore nervous system. Curr Biol. 31 (23), 5274-5285.e6 (2021).
- Moroz, L. L., et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature. 510 (7503), 109-114 (2014).
- Burkhardt, P., et al. Syncytial nerve net in a ctenophore adds insights on the evolution of nervous systems. Science. 380 (6642), 293-297 (2023).
- Tamm, S. L., Tamm, S. Novel bridge of axon-like processes of epithelial cells in the aboral sense organ of ctenophores. J Morphol. 254 (2), 99-120 (2002).
- Jager, M., et al. New insights on ctenophore neural anatomy: Immunofluorescence study in Pleurobrachia pileus (Müller, 1776). J Exp Zool B Mol Dev Evol. 316B (3), 171-187 (2011).
- Hernandez-Nicaise, M. -L. The nervous system of ctenophores III. Ultrastructure of synapses. J Neurocytol. 2 (3), 249-263 (1973).
- Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biol. 10 (1), 107(2012).
- Harrison, F. W., Westfall, J. A. Ctenophora. Microscopic Anatomy of Invertebrates. 2: Placozoa, Porifera, Cnidaria, and Ctenophora. , Wiley. New York. 359-418 (1991).
- Horridge, G. A. Presumed photoreceptive cilia in a ctenophore. J Cell Sci. S3-105 (71), 311-317 (1964).
- Ramon-Mateu, J., Edgar, A., Mitchell, D., Martindale, M. Q. Experimental methods to study ctenophore whole-body regeneration. Methods Mol Biol. 2450, 95-119 (2022).
- Soto-Àngel, J. J., et al. Stable laboratory culture system for the ctenophore Mnemiopsis leidyi. Methods Mol Biol. 2757, 123-145 (2022).
- Presnell, J. S., Bubel, M., Knowles, T., Patry, W., Browne, W. E. Multigenerational laboratory culture of pelagic ctenophores and CRISPR-Cas9 genome editing in the lobate Mnemiopsis leidyi. Nat Protoc. 17 (8), 1868-1900 (2022).
- Coonfield, B. R. Apical dominance and polarity in Mnemiopsis leidyi, Agassiz. Biol Bull. 70 (3), 460-471 (1936).
- Freeman, G. Studies on regeneration in the creeping ctenophore, Vallicula multiformis. J Morphol. 123, 71-84 (1967).
- Bading, K. T., Kaehlert, S., Chi, X., Jaspers, C., Martindale, M. Q., Javidpour, J. Food availability drives plastic self-repair response in a basal metazoan-case study on the ctenophore Mnemiopsis leidyi A. Agassiz. Sci Rep. 7 (1), 16419(2017).
- Mateu, J. R., Ellison, S. T., Angelini, T. E., Martindale, M. Q. Regeneration in the ctenophore Mnemiopsis leidyi occurs in the absence of a blastema, requires cell division, and is temporally separable from wound healing. BMC Biol. 17 (1), 80(2019).
- Mitchell, D. G., Edgar, A., Mateu, J. R., Ryan, J. F., Martindale, M. Q. The ctenophore Mnemiopsis leidyi deploys a rapid injury response dating back to the last common animal ancestor. Commun Biol. 7 (1), 203(2024).
- Jokura, K., Anttonen, T., Rodriguez-Santiago, M., Arenas, O. M. Rapid physiological integration of fused ctenophores. Curr Biol. 34 (19), R889-R890 (2024).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
