Method Article

طريقة فعالة لتصوير رئتي الفئران التي تحافظ على الديناميكيات المكانية للجراثيم الفطرية في الشعب الهوائية

DOI:

10.3791/67556

⸱

December 13th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers - The State University of New Jersey

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة لنموذج التسبب في المرض الفطري الذي يحافظ على الوضع الطبيعي للجراثيم الفطرية في الشعب الهوائية للرئة لتحليلها عبر الفحص المجهري الفلوري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصيب الفطريات البشر عندما يتم استنشاق الجراثيم البيئية في الرئتين. الرئة عضو غير متجانس. تفرع المسالك الهوائية الموصلة ، بما في ذلك الشعب الهوائية والقصيبات الهوائية ، حتى تنتهي في المجال الجوي السنخي حيث يحدث تبادل الغازات. تثير العدوى التي تنشأ في القصيبات أو الحويصلات الهوائية استجابات مميزة للمضيف ومظاهر مرضية. لذلك ، فإن الفهم الدقيق لمكان تتموضع الجراثيم بشكل طبيعي في الرئتين ، خاصة بعد فترة وجيزة من الإصابة ، يوسع فرص التحقيق في تفاعلات المضيف والمسببات المرضية. هنا ، نشرح بالتفصيل تحليلا في الموقع للرئتين من الفئران المصابة ب Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ arthroconidia. تتضمن الطرق التقليدية للحفظ النسيجي تضخما سائلا للممرات الهوائية بمحلول مثبت ، مما يزيح الموقع الطبيعي للجزيئات الفطرية المستنشقة ، مما يدفع الجراثيم من القصيبات القريبة إلى المساحات الطرفية.

على العكس من ذلك ، فإن طريقة نفخ الهواء هذه مع تثبيت نضح الأوعية الدموية تحافظ على الوضع الفسيولوجي للجراثيم الفطرية داخل القصيبات. علاوة على ذلك ، نصف نهجا بسيطا لحفظ عينات الرئة بالتبريد وتضمينها وتصويرها. نشارك أيضا التقنيات الحسابية عالية الإنتاجية عبر برنامج QuPath مفتوح المصدر لتحليل التوزيع المكاني للجراثيم الفطرية داخل الرئة. الطريقة المعروضة هنا بسيطة وسريعة ، وتتطلب الحد الأدنى من المعدات لأدائها ، ويمكن تكييفها بسهولة للاستخدام مع العديد من نماذج العدوى الفطرية التنفسية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن للبشر استنشاق ما يصل إلى مليارات الجراثيم يوميا من مجموعة متنوعة من الفطريات البيئية1. لفهم دفاعاتنا الحاجزة ضد هذه الجراثيم المستنشقة ، يجب أن نقدر البيئات التشريحية الدقيقة حيث تهبط هذه الجراثيم داخل الشعب الهوائية وحمة الرئة. يتحول التركيب الخلوي للممرات الهوائية (أي الخلايا الظهارية) بشكل كبير على طول القصبة الهوائية والشعب الهوائية والقصيبات الهوائية والحويصلات الهوائية. تتكون كل منطقة من هذه المناطق المتميزة من أنواع مختلفة من الخلايا ذات الوظائف المنفصلة التي توفر ترسانة من الدفاعات لمنع العدوى المرضية.

يمكن أن يختلف الموقع الدقيق لترسب الأبواغ الفطرية الرئوية بين تجويف مجرى الهواء للقصيبات العمودية المبطنة بالظهارة أو القنوات السنخية أو الحويصلاتالهوائية 2. تنتج معظم الأنواع الفطرية ذات الصلة سريريا جراثيم يتراوح قطرها بين 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر3. يعتمد ترسب جزيئات البوغ هذه في الرئة على عدة عوامل ، مثل الديناميكا الهوائية والكثافة والشحنة الكهربائية والقوى الفوريتية ، والتي يمكن أن تؤثر على آلية الترسيب بعد الاستنشاق4. بشكل عام ، ترسيب الجسيمات الكبيرة (> 6 ميكرومتر) في مجرى الهواء العلوي ، ويمكن للجزيئات متوسطة الحجم (2-6 ميكرومتر) أن تترسب في الشعب الهوائية الأصغر ، وتصل الجسيمات الصغيرة (<2 ميكرومتر) إلى المنطقة السنخية5. تم الإبلاغ عن وصول جراثيم الرشاشيات (2-3 ميكرومتر) إلى الفراغات السنخية ، لكن تقارير علم الأمراض السريرية تشير أيضا إلى عبء كبير من مرض الشعب الهوائية والقصيباتالهوائية 6. هناك أيضا اعتراف متزايد بالالتهابات الفطرية داخل القصبات من Aspergillus fumigatus و Coccidioides immitis و Candida و Cryptococcus neoformans و Histoplasma capsulatum و Zygomycetes بسبب الشعبية المتزايدة لتنظير القصبات المرن7. كشفت التطورات الحديثة في التصوير المجهري لعدوى الرشاشيات في الفئران أيضا أن المزيد من المساحات الجوية القريبة مثل الشعب الهوائية والقصيبات الهوائية قد تتحمل العبء الأكبر لتكاثر الفطريات المرضية8. أظهرت الأبحاث التي أجريت على استجابة المضيف للالتهابات الفطرية الرئوية أن كلا من الخلايا الظهارية القصبية والخلايا الظهارية السنخية تلعب أدوارا مهمة كحراس مناعيين ، لذا فإن توضيح المواقع الدقيقة لترسب الأبواغ والتفاعل الظهاري سيكون أمرا حيويا للعمل المستقبلي2،9،10.

من الصعب دراسة ديناميكيات التسبب في مجرى الهواء القريب لأن تقنيات تثبيت الرئة القياسية وتحضير المقطع يمكن أن تحل محل الجراثيم من هذه المواضع القريبة في الشعب الهوائية المبطنة بالظهارة وتدفعها نحو المناطق السنخية الطرفية البعيدة. بشكل عام ، يتم استخدام 10٪ فورمالين أو 4٪ بارافورمالدهايد لتضخيم الرئتين وتعريض الرئة بأكملها بسرعة للتثبيت. عند تحضير الرئتين للاستئصال بالتبريد ، تقوم بعض المجموعات بإدارة مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في الرئتين لتحسين أداء القطع بالتبريد11. هذه الممارسات مفيدة في السياق الصحيح ولكن وجد مختبرنا ومجموعات أخرى أنها تحل محل الجراثيم والجسيمات من المواقع القريبة ، وبالتالي تتداخل مع التفسيرات حول أنواع الخلايا المعرضة للأبواغ واستجابة المضيفاللاحقة 12.

لتحديد التوطين التشريحي الدقيق للجراثيم الفطرية المستنشقة بدقة ، قمنا بتطوير طريقة سريعة ومنخفضة الموارد للحفاظ على موقع الجراثيم الفطرية في الشعب الهوائية للفئران. قمنا بتكييف طريقة تثبيت نضح الأوعية الدموية لتضخم هواء الفئران من Thomas et al. (2021) ، حيث قمنا بتقليل كمية المعدات والوقت والمهارة الفنية المطلوبة لتحقيق نتيجة مرضية13. من الطريقة الموضحة هنا ، لاحظنا أن Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ arthroconidia (حجم 3-5 ميكرومتر) يتراكم بشكل قريب أكثر مما هو موضح سابقا ، أي في القصيبات البعيدة والوصلات القصبية السنخية بدلا من الحويصلات الهوائية الطرفية. يمكن أن تركز هذه المعلومات على الأسئلة البيولوجية المتعلقة بأنواع الخلايا الحرجة المرتبطة بهذه المناطق من الرئة وتأثيرها على الاستجابات المبكرة للجراثيم الفطرية المستنشقة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) التابعة لعلوم روتجرز الطبية الحيوية.

1. تسمية الجراثيم مع التألق داخل الخلايا

  1. صبغ 1 × 106 جراثيم في كربوكسي فلوريسين إستر السكسينيميديل (CFSE) ، أو Cell Tracker Orange ، أو Cell Tracker Red (أو صبغة داخل الخلايا المفضلة) عند 5 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية ، ثم اغسلها باستخدام PBS ، وقم بتدوير الجراثيم عند 12,000 × جم. كرر هذا الغسيل مرة واحدة.
  2. تحضير لقاح البوغ بالتركيز المناسب بحيث يحتوي 25 ميكرولتر على جرعة البوغ المناسبة لفأر واحد.

2. تلقيح الفأر بالجراثيم من خلال استنشاق الشفط باستخدام تخدير الأيزوفلوران

تنبيه: الأيزوفلوران هو عامل تخدير متطاير ويجب استخدامه داخل خزانة السلامة الحيوية الأنبوبية أو غطاء الدخان.

  1. لتحضير جرة التعرض للأيزوفلوران ، ضع منديلا مطويا في وعاء Nalgene بحجم 1 لتر وضع دائرة شبكية بلاستيكية فوق المنديل كمنصة للفئران. أضف 2 مل من الأيزوفلوران إلى المنديل ، وأغلق البرطمان ، وانتظر 1-2 دقيقة حتى يتوازن الغاز في الحاوية.

figure-protocol-1
الشكل 1: جهاز لطريقة الإسقاط المفتوح للإيزوفلوران لتلقيح الأبواغ. يتم وضع منديل مطوي في الجزء السفلي من جرة علوية لولبية سعة 1 لتر ، ثم يتم إدخال شبكة بلاستيكية دائرية لتكون بمثابة منصة للفئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قبل تعريض الفأر للتخدير ، قم بإعداد ماصة تحتوي على 25 ميكرولتر من اللقاح. ضع الماوس في حاوية الأيزوفلوران وقم بإمالة الحاوية لمراقبة فقدان منعكس التصحيح، حيث فقد الماوس وعيه ويكون مقلوبا رأسا على عقب. يستغرق هذا عادة حوالي 10 ثوان.
  2. راقب معدل التنفس (RR) حتى يتباطأ إلى 50-80 نفسا ثابتا في الدقيقة (نبضة في الدقيقة) ، أي حوالي 50٪ من RR أثناء الراحة. يستغرق هذا عادة 10 ثوان أخرى. في هذا الوقت ، قم بإزالة الماوس من جرة الأيزوفلوران.
    ملاحظة: هذا تركيز عال من الأيزوفلوران ، والذي سينتج عنه تحريض سريع للتخدير ، ويجب مراقبة الفأر عن كثب. تعد جرعة زائدة من الأيزوفلوران المميتة خطرا ، حيث يمكن أن يكون تركيز الأيزوفلوران متغيرا ، ومنحنى الاستجابة للجرعة إلى الأيزوفلوران شديد الانحدار. إذا انخفض معدل التنفس إلى أقل من 50 نبضة في الدقيقة و / أو كان غير منتظم ، فقم بإزالة الفأر من الأيزوفلوران ، واتركه يتعافى لمدة 3-5 دقائق ، وحاول مرة أخرى (بحد أقصى محاولتين متكررتين).
  3. تأكد من عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم. بعد ذلك ، ضع الماوس في وضع ضعيف بيد واحدة ، واسمح للفأر بأخذ 3-5 أنفاس شهقة منتظمة بمعدل متزايد (يبدأ من 50-60 نبضة في الدقيقة) وقوة. عندما يبدأ هذا ، ضع طرف الماصة في الجزء الخلفي من البلعوم الفموي للفأر وحرر اللقاح أثناء الاستنشاق.
    ملاحظة: هذه الشهقات من خلال الفم تهز الرأس بشكل أدنى بسبب تجنيد العضلات الملحقة للتنفس. عندما يتم إدخال الماصة أثناء هذه اللحظات ، يجب أن يفتح الفم مع كل شهقة. إذا لم يفتح الفم ، فإن الفأر غير مخدر بشكل كاف ومن المحتمل ألا يستنشق محتويات من البلعوم الفموي. يجب أن تضغط الماصة على اللسان ، وتدفعه نحو أسفل وأمام الفم لمنع ابتلاع اللقاح. عندما تكون الماصة في الفم ويتم تخدير الفأر بشكل كاف ، سيفتح الفأر فمه مع كل شهقة.
  4. مع إمساك اليد والإبهام بالفأر ، اشعر بالخشخشة على الجوانب الخلفية والأمامية لصدر الفأر لتأكيد استنشاق اللقاح.

3. القتل الرحيم للفئران

  1. حقن الفأر داخل الصفاق بمزيج من 200 مجم / كجم من الكيتامين و 24 مجم / كجم زيلازين قبل 10 دقائق من نقطة وقت التضحية.
  2. انتظر 10 دقائق بعد الحقن حتى يدخل الفأر في مستوى التخدير الجراحي ، وهو ما يؤكده عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم.

4. نضح الرئتين مع PBS والفورمالين

  1. رش الفأر المخدر بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم المقص لقص جلد الماوس وتفكيك الجلد لكشف الصفاق من جميع الجوانب. اسحب الجلد من النصف العلوي للفأر فوق رأسه ، واسحب الذراعين من الجلد.
  2. قطع الغشاء البريتوني عند القص وعلى طول الجانب السفلي من القفص الصدري ، وتعريض الصفاق. إزاحة الكبد بشكل أدنى ، وكشف عن الحجاب الحاجز. استخدم المقص لثقب الحجاب الحاجز بعناية بعيدا عن حمة الرئة لتجنب ثقب ثقب في الرئتين نفسها.
    ملاحظة: سيؤدي ثقب الرئتين عن غير قصد إلى جعل تضخم الهواء اللاحق مستحيلا.
  3. بعد ثقب الحجاب الحاجز ، يدخل الهواء إلى الصدر ، مما يؤدي إلى انهيار الرئتين. قطع القفص الصدري على الجانب الأيسر للكشف عن القلب. حقن 5-10 مل من PBS في البطين الأيمن بإبرة 30 جم بمعدل 1 مل لكل 5 ثوان (لتجنب إتلاف الأوعية) ، وتبييض الرئتين بسرعة.
    تنبيه: الفورمالين مادة متطايرة خطرة يجب التعامل معها داخل خزانة السلامة الحيوية الأنبوبية أو غطاء الدخان.
  4. عند الانتهاء ، قم بإزالة الإبرة واستخدم إبرة جديدة لحقن 5 مل من الفورمالين المحايد 10٪ (NBF) في البطين الأيمن بنفس المعدل.

5. تضخيم الرئة المنفوخة بالهواء

  1. قم بإزالة النصف الأمامي من القفص الصدري. لفضح القصبة الهوائية ، قم بقص الأضلاع العلوية وعظام الترقوة على يمين ويسار الرقبة. احرص على تجنب القطع بالقرب من خط الوسط حيث تقع القصبة الهوائية. باستخدام الملقط ، قم بتثبيت الأضلاع العلوية وعظام الترقوة المتبقية على خط الوسط للرقبة واسحبها بشكل متفوق حتى تنكشف القصبة الهوائية.
  2. قم بإعداد خيط خياطة بطول 10 سم ، واسحبه تحت القصبة الهوائية ، واربط عقدة فضفاضة مسبقا في الطرف السفلي من القصبة الهوائية المكشوفة. قم بإعداد حقنة هواء سعة 1 مل بقسطرة 18 جرام. استخدم إبرة 18 جم لإحداث ثقب في القصبة الهوائية في الطرف العلوي من المنطقة المكشوفة.
  3. ضع القسطرة في تلك الفتحة ، مما يضمن ملاءمة محكمة نسبيا لمنع الهواء من الهروب. قم بحقن 1 مل من الهواء ببطء في الرئتين على مدار 10 ثوان ، مع مراقبة تضخم الرئة في جميع الفصوص. ينتج عن التضخم الكامل الرئتين الالتفاف قليلا حول القلب وملء الحجم الذي تشغلانه في الحجاب الحاجز غير المثقوب.
  4. اسحب العقدة بإحكام حول القصبة الهوائية ، وقم بإزالة القسطرة. أمسك القصبة الهوائية واستخدم مقصا غير حاد لإزالة الرئتين من الفأر ، مع الحرص على عدم ثقب الرئة.

6. الغمر التثبيت والجفاف

  1. ضع الرئتين على الحافة العلوية لأنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب 20 مل من 10٪ NBF. احتفظ بخيوط الخياطة خارج المخروطي ، وقم بلف الغطاء ، واقلب المخروطي بحيث يتم تعليق الرئتين رأسا على عقب في 20 مل من NBF. ضعه في 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة.
  2. اشطف الرئتين في PBS ، ثم ضعه في محلول 30٪ من السكروز PBS (وزن / حجم) لمدة 72-96 ساعة عند 4 درجات مئوية لتجفيف الرئتين استعدادا للحفظ بالتبريد. قم بإزالة الرئتين من السكروز ، ووضع الرئتين في CRYOOLD بدرجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وتجميد العينة عند -80 درجة مئوية.

7. التقطيع بالتبريد

  1. قم بموازنة العينات في كتل التبريد OCT إلى درجة حرارة -20 درجة مئوية للناظم لمدة ساعة واحدة قبل التقسيم. قسم الكتل بسماكة 20-100 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي تضخم الهواء إلى زيادة هشاشة العينة ، ويمكن أن يمنع القطع بزيادة السماكة كسر الأنسجة أثناء التقطع.
  2. اجمع الأقسام على شرائح زجاجية واتركها تجف لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة لضمان التصاق الأنسجة بالشريحة.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالشرائح عند -80 درجة مئوية في هذه المرحلة.

8. إعداد الشرائح وحجب

  1. ضع الشرائح في حمام PBS (في طبق أو برطمان كوبلين) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لإزالة OCT من الشرائح.
    ملاحظة: قد لا تلتصق المقاطع السميكة (40-100 ميكرومتر) بالشرائح الزجاجية وكذلك الأقسام الرقيقة ، لذلك من الأفضل إبقائها مسطحة ومنتصبة في طبق بدلا من وضعها على جانبها في جرة كوبلين.
  2. جفف الشرائح بعد ذوبان OCT بعيدا عن الأنسجة. استخدم منديلا لتجفيف القطرات الزائدة من محيط الشريحة حول عينة الأنسجة.
  3. استخدم قلم عنق الرحم المقاوم للماء لرسم محيط حول العينة ، واتركه يجف لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإعداد مخزن مؤقت مانع لمحلول حجب خال من مع 0.3٪ Tween-20 و 1: 100 Fc Block في 300 مل لكل شريحة.
    ملاحظة: بالنسبة للأهداف داخل الخلايا ، يمكن استخدام 1٪ Tween-20. عادة ما يكون حجم 300 ميكرولتر كافيا ، لكن الحجم اللازم لتغطية الأنسجة يعتمد بشكل كامل على حجم محيط العلامة الكارهة للماء. يجب ألا تجف الأنسجة من هذه النقطة فصاعدا.
  5. اترك محلول الحظر على الشرائح لمدة 1 ساعة في RT.

9. تلطيخ المناعة

  1. اغسل الشريحة عن طريق سحب السائل وإضافة 300-500 ميكرولتر من PBS. كرر الغسيل مرة واحدة.
  2. قم بإعداد الجسم المضاد الأولي للفئران المترافقة AlexaFluor-647 (استنساخ G8.8) (علامة ظهارية مجرى الهواء) في محلول مانع خال من مع 0.33٪ Tween-20 (أو 1٪ للأهداف داخل الخلايا). أضف 300 ميكرولتر لكل شريحة من هذا المحلول وصمة عار طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب اختبار الأجسام المضادة تجريبيا لتركيز التلوين والوقت ودرجة الحرارة. يتم تلطيخ الأجزاء الرقيقة (8-20 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية والأقسام السميكة (20-100 ميكرومتر) عند 4 درجات مئوية طوال الليل باستخدام 1: 100 تخفيفات لمعظم الأجسام المضادة. في حالة استخدام الأجسام المضادة غير المترافقة ، اغسل 2x (كما هو مذكور أعلاه) وقم بتطبيق جسم مضاد فلوري ثانوي لفترة ودرجة حرارة محددة تجريبيا. بشكل عام ، يتم تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية في RT لمدة ساعة واحدة عند تخفيف 1: 1000.
  3. قم بإزالة محلول الجسم المضاد من العينة ، واغسل الشريحة ب 300 مل من PBS لمدة 5 دقائق. كرر هذا الغسيل مرة واحدة. جفف الشرائح ، وإزالة كل السوائل الزائدة من العينة والزجاج المحيط.
  4. أضف قطرة واحدة من وسائط التثبيت ذات الضبط الناعم RT (على سبيل المثال ، زجاج SlowFade) إلى كل قطعة من المناديل. احرص على تجنب الفقاعات عن طريق ترك الزجاجة تستقر وهي مقلوبة وإسقاط كل قطرة ببطء على المناديل. ضع زلة غطاء بحجم مناسب لتمتد إلى ما وراء العينة ومحيط العلامة الكارهة للماء.

10. التصوير عن طريق المجهر الفلوري

  1. استخدم مجهر فلوري متعدد القنوات لمسح أقسام الرئة بأكملها بطريقة غير متحيزة باستخدام هدف ذو دقة كافية لحل الجراثيم الفردية والخلايا المضيفة (على سبيل المثال ، Zeiss Axioscan 7 باستخدام هدف الزيت 20x مع NA = 0.8 أو ما شابه ذلك).
    ملاحظة: تأكد من ضبط طاقة الليزر وكسب جهد PMT لزيادة نسب الإشارة إلى الضوضاء للهدف على الخلفية المحددة باستخدام عنصر تحكم مضان ناقص واحد (FMO).
  2. اجمع بلاطات صور كافية لالتقاط فص الرئة بالكامل (على سبيل المثال ، ~ 200 بلاطة بحجم 400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر). استخدم برنامج المجهر (على سبيل المثال ، Zeiss ZEN 3.7 أو ما شابه) لتصدير صورة البلاط المدمجة للمعالجة النهائية.

11. التحليل المكاني عبر QuPath

  1. في QuPath ، وهو برنامج مجاني مفتوح المصدر14 ، قم بإنشاء ملف مشروع وإضافة صور الفلورسنت إلى الملف.
  2. صنف وحدات بكسل EpCAM+ على أنها ظهارة بالنقر فوق خيار القائمة العلوية تصنيف، ثم تصنيف البكسل > إنشاء عتبة. حدد الدقة والقناة وسينعي سيجما وقيمة العتبة التي تحدد المنطقة المستهدفة بشكل أفضل. احفظ المصنف تحت اسم فريد، وحدد إنشاء كائنات.
  3. في نافذة إنشاء كائنات الجديدة، حدد نوع كائن جديد كتعليق توضيحي. بالنسبة لظهارة الرئة ، اضبط الحد الأدنى لحجم الجسم والحد الأدنى لحجم الثقب على 100 مم2. ليست هناك حاجة لتحديد تقسيم الكائنات هنا. بعد تحديد OK ، سيتم إنشاء التعليقات التوضيحية ، ويمكن تعديلها بالعين باستخدام أداة Brush في المنطقة العلوية اليسرى.
  4. لتصنيف الجراثيم ، كرر الخطوات من 11.3-11.4 باستخدام القناة التي تم التقاط الجراثيم فيها وجعل نوع الكائن الجديد الكشف بدلا من التعليق التوضيحي. قم بتعيين الحد الأدنى لحجم الكائن والحد الأدنى لحجم الثقب إلى 0 مم2، وحدد تقسيم الكائنات.
  5. لإجراء التحليل المكاني للجراثيم ، حدد خيار القائمة العلوية تحليل > التحليل المكاني > حساب المسافة الموقعة للتعليقات التوضيحية 2D. سيتم حساب المسافات إلى ظهارة EpCAM+ لكل بوغ تم اكتشافه. قم بتصديرها عبر خيار القائمة العلوية قياس > تصدير القياسات.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتج هذه الطريقة في النهاية صورا مناعية فلورية لرئتي الفئران باستخدام نفخ الهواء الفسيولوجي لترك الشعب الهوائية دون إزعاج. الأهم من ذلك ، أن نقاط التفتيش المتعددة على طول الطريق ستؤكد أن مكونات البروتوكول قد تم تنفيذها بنجاح. أثناء التلقيح ، من المهم التأكد من أن اللقاح قد تم استنشاقه عن طريق الشعور ب "طقطقة" على جدار الصدر الخلفي للفأر والتي تشير إلى أن السائل قد دخل الشعب الهوائية. إذا لم يكن هناك إحساس بالخشخشة ، فمن الممكن أن يكون الفأر قد ابتلع اللقاح. يجب أن يؤدي نضح رئتي الفأر باستخدام PBS إلى تبقع أبيض في الرئتين متبوعا بتبييض كامل للرئة بأكملها (الشكل 2 أ). إذا كان هناك تبييض غير مكتمل ، فلن يصل نضح الفورمالين اللاحق إلى جميع مناطق حمة الرئة (الشكل 2 ب). عند نفخ الرئة بالهواء ، يجب أن تتمدد الرئتان ببطء حتى تصل إلى الحجم الفسيولوجي. بعد ربط خياطة القصبة الهوائية لتأمين الهواء داخل الرئتين ، يجب ألا تنقبض حجم الرئتين. إذا فعلوا ذلك ، فمن المحتمل أن تكون الرئة قد ثقبت أثناء العملية.

هنا ، نعرض صورا تمثيلية للأقسام التي تحمل جراثيم Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ (خضراء) و EpCAM + ظهارة قصبية عمودية (أرجوانية) في كل من الرئتين المنتفختين بالهواء والفورمالين المنتفخة بالسائل (الشكل 3 أ ، ب على التوالي). تتراكم هذه الجراثيم بشكل أساسي داخل القصيبات البعيدة وفي الفراغات السنخية المجاورة مباشرة لتلك القصيبات البعيدة ، على الأرجح في القنوات السنخية. تحتوي الرئتان المنتفختان بالهواء على جراثيم تظهر بشكل متكرر داخل القصيبات وتتجمع بالقرب من القصيبات (الشكل 3 أ) ، بدلا من المثبت السائل حيث تظهر الجراثيم أكثر تشتتا قليلا من ظهارة القصبات الهوائية (الشكل 3 ب). من خلال التحليل المكاني QuPath ، نقيس مسافة الجراثيم الفردية إلى أقرب ظهارة قصبية EpCAM + للإشارة إلى مستوى تشتت الجراثيم بعيدا عن القصيبات وفي المساحات السنخية البعيدة. نوضح أن التضخم السائل يشتت الجراثيم بعيدا عن القصيبات مقارنة بتضخم الهواء الفسيولوجي (الشكل 4 أ ، ب). يحافظ نضح الأوعية الدموية لتضخم الهواء على الوضع الطبيعي لهذه الجراثيم في القصيبات البعيدة ويمنع التشتت الاصطناعي لهذه الجراثيم في المساحات السنخية البعيدة عن طريق التقطير المثبت داخل القصبة الهوائية.

figure-results-1
الشكل 2: مؤشر نجاح نضح الرئة. (أ) ستكون الرئتان المنتفختان بنجاح بيضاء تماما. (ب) ستظهر الرئتان غير المنفختين بالكامل باللون الوردي أو مرقط في المظهر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3: صور تمثيلية لتوزيع الأبواغ في الرئتين المنفختين بالفورمالين في الهواء مقابل الرئتين المنتفختين بالفورمالين. ينظر إلى الجراثيم الفلورية داخل الخلايا (الخضراء) على أنها موزعة على مقربة من ظهارة القصبات الهوائية EpCAM + (أرجواني) في (أ) الرئتين المنتفختين بالهواء مقارنة بالرئتين المنتفختين بالفورمالين. تم الحصول على الصور من أقسام بعمق 1.2 مم من السطح الخلفي للفصوص اليسرى للفئران في كل مجموعة معالجة على مجهر فلوري متعدد القنوات بتكبير 20x ، وتم خياطة البلاط باستخدام برنامج الفحص المجهري. شريط المقياس = 800 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 4: مقارنة بين مسافة الأبواغ (مم) وظهارة الشعب الهوائية بين الرئتين المعالجة بالأبواغ المنتفخة بالهواء والمتضخمة بالفورمالين. تم حصاد الرئتين من 3 فئران لكل مجموعة علاج ومعالجتها وتصويرها لمدة 1.5 ساعة بعد التلقيح ب 1 × 106 Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ arthroconidia. تم أخذ عينات من أربعة أقسام لكل فأر على بعد 0.8 مم و 1.2 مم و 1.6 مم و 2.0 مم من السطح الخلفي للفص الأيسر ، ملطخة ، وتصويرها على مجهر فلوري متعدد القنوات. تم اكتشاف جميع الجراثيم من كل مجموعة وتحليلها مكانيا في QuPath لتحديد المسافة (A) إلى أقرب ظهارة قصبية عمودية EpCAM + ، و (B) يتم عرض فترات الثقة المتوسطة و 95٪ بوحدات ميكرومتر. جراثيم تضخم الهواء ، ن = 11،673. جراثيم التضخم السائل ، ن = 9،837. تم إجراء اختبار مان ويتني t بسبب عدم وجود حالة طبيعية ، و p < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أنشأنا خط أنابيب لاستنشاق الأبواغ وتحليل الترسب المكاني للجراثيم المستنشقة. يوفر خط الأنابيب هذا معلومات قيمة لتحديد المناطق اللحمية ذات الصلة في الرئة المتأثرة باستنشاق Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ arthroconidia. لقد لاحظنا أن جراثيم Coccidioides والجسيمات الخاملة ذات الحجم المماثل (البيانات غير معروضة) تتراكم في مناطق القصبات الهوائية البعيدة والتقاطعات القصبية السنخية بدلا من أن تنتشر بالكامل في جميع أنحاء تجويف مجرى الهواء السنخي. يتطلب هذا النموذج مستوى منخفضا نسبيا من المعدات والمهارة الفنية لإنتاج عمليات القطع بالتبريد للتألق المناعي (أو خطوط الأنابيب النهائية الأخرى مثل الكيمياء المناعية [IHC]) التي تحافظ على السلامة الفسيولوجية لمحتويات مجرى الهواء مع الحفاظ على مورفولوجيا الرئة الطبيعية. بدون تضخم الهواء ، يؤدي انهيار الحويصلات الهوائية إلى تشويه الهندسة المعمارية الطبيعية لحمة الرئة المحيطة بالقصيبات13،15. تمت الإشارة إلى فقدان حجم هواء الرئة أثناء المعالجة النسيجية على أنه "مشكلة خطيرة" من خلال بيان سياسة بحثية رسمي مشترك للجمعية الأمريكية لأمراض الصدر والجمعية الأوروبية للجهاز التنفسي في تحديد معايير التقييم الكمي لبنية الرئة16. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي التقطير داخل القصبة الهوائية للمثبتات إلى تعطيل طبيعة وموقع المكونات الجزيئية والخلوية لمجرى الهواء القريب مثل الميوسين والفاعل بالسطح وأهداب مجرى الهواء17،18،19. تحافظ الطريقة الموضحة هنا بشكل كاف على حجم هواء الرئة جنبا إلى جنب مع المكونات الجزيئية والخلوية على طول الشعب الهوائية التي تتفاعل مع الجراثيم الفطرية المستنشقة.

يوفر الفحص المجهري المناعي أداة قوية لاستجواب الديناميكيات المكانية لمكونات الرئة ، وقد تمت مراجعته جيدا20،21. لا توجد قيود على الأهداف التي يمكن تلطيخها عن طريق التألق المناعي لهذه الأقسام ، باستثناء أن الأجسام المضادة ذات الحواتم الحساسة لتثبيت الفورمالين قد لا تربط أهدافها بشكل مرض. عند استخدام جسم مضاد جديد ، من الأفضل تحضير عنصر تحكم مضان ناقص واحد (FMO) لتحديد ما إذا كان الجسم المضاد يولد أي إشارة فوق الخلفية. في حالة استخدام الجسم المضاد الثانوي ، استخدم مجموعة علاج بدون الجسم المضاد الأساسي للتحكم في الارتباط خارج الهدف للجسم المضاد الثانوي. الأجسام المضادة أحادية النسيلة الأولية المترافقة محددة للغاية ، لذا فإن التلوين في درجات حرارة أعلى (37 درجة مئوية) لفترة أقل (30 دقيقة) أمر شائع ويرتبط بشكل عام بهدفها على وجه التحديد. من ناحية أخرى ، تكون الأجسام المضادة متعددة النسيلة غير المترافقة أكثر حساسية للكشف عن المستضدات ولكنها أقل تحديدا ، لذا فإن الحضانات الأطول (~ 16 ساعة) في درجات حرارة أكثر برودة (4 درجات مئوية) تعمل على تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ستتطلب جميع الأجسام المضادة تحسينا تجريبيا.

يقيس نموذج التحليل المكاني المستخدم في هذه الدراسة لتوطين الأبواغ مسافة الجراثيم الفردية إلى أقرب ظهارة قصبي. يتطلب ذلك التحديد المناسب لظهارة الشعب الهوائية باستخدام إشارة EpCAM العالية ومظهرها المميز شكليا كهياكل تشبه الظهارة العمودية التي تبطين أنبوب. يمكن أيضا التعبير عن EpCAM عند مستويات أقل بواسطة الظهارة السنخية ، لذلك من المهم عتبة إشارة EpCAM في QuPath للحد من التعليقات التوضيحية المحددة لمناطق القصبات الهوائية المؤكدة شكليا. نظرا لأن القصيبات لها حد أدنى للحجم التشريحي ، يمكننا قصر تعريف QuPath لهذه المناطق على الحد الأدنى لمساحة 100 مم2 ، كما هو مذكور في الخطوة 11.3. سيؤدي ذلك إلى استبعاد الخلايا أو القطع الأثرية المعزولة التي تعبر عن EpCAM العالية عبر المساحات السنخية ، مثل الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني ، من التعليقات التوضيحية QuPath. تسمح لنا هذه الخطوات بتعريف ظهارة القصبات الهوائية حصريا على أنها تعليقات توضيحية QuPath وتحديد قرب الجراثيم من ظهارة القصبات الهوائية المحددة.

يستخدم نموذج العدوى الموصوف هنا تخدير الأيزوفلوران للحث على استجابة شهيق عن طريق الفم في الفئران لشفط الجراثيم الفطرية. تم تطوير طريقة الإسقاط المفتوح للإيزوفلوران كتقنية سريعة ومنخفضة الموارد للحث على التخدير قصير المدى في الفئران9،22،23. تتطلب هذه الطريقة بعض الممارسة لأدائها باستمرار. يجب أن يكون الوقت تحت التخدير طويلا بما يكفي لتخدير الفأر بشكل كاف لشفط محتويات البلعوم. إذا لم يتم تخدير الفأر بشكل كاف ، فيمكنه ابتلاع اللقاح بدلا من شفطه. يتم الوصول إلى علامة التخدير الكافي عندما ينتج الفأر شهقة فموية منتظمة ذات قوة متزايدة بمعدل حوالي 50-60 شهقة / دقيقة. يجب أن يتحرك رأس الفأر المستلق للأمام مع كل شهقة. يمكن تحديد التخدير غير الكافي من خلال قلة اللهاث أو أي حركة للشعيرات أو اللسان أو الأطراف. من أفضل الممارسات الضغط على اللسان بطرف الماصة أثناء إعطاء اللقاح لمنع البلع. يمكن أن تؤدي جرعة زائدة من الأيزوفلوران إلى موت الفأر ويجب منعها. من القواعد الأساسية الجيدة لمنع ذلك إزالة الماوس من الأيزوفلوران بعد نفس القدر من الوقت الذي يستغرقه الماوس لفقدان رد الفعل الصحيح. على سبيل المثال ، إذا استغرق الماوس 10 ثوان لفقدان المنعكس الصحيح ، فقم بإزالة الماوس بعد 10 ثوان إضافية. مع هروب غاز الأيزوفلوران على مدار علاجات الفئران المتعددة ، قد يزداد هذا الإطار الزمني. في أيدينا ، يمكننا علاج 6-8 فئران دون إضافة المزيد من الأيزوفلوران.

هناك بعض القيود على مكونات هذا البروتوكول. يستخدم إجراء التلقيح جراثيم معلقة في 25 ميكرولتر من وسط PBS السائل ، وهو أقل فسيولوجيا من التلقيح البخاخي للجراثيم. يبقى السؤال المفتوح ما إذا كان استخدام السائل المستنشق يغير توطين الجراثيم / الجسيمات مقارنة بطرق التلقيح الأخرى ، مثل استنشاق الجراثيم المحمولة جوا. ومع ذلك ، يتطلب الاستنشاق الهباء الجوي استثمارا مكثفا في الموارد وله قيود أخرى (حجم اللقاح المحدود ، والتعرض المتغير ، والمخاطر المهنية) التي قد لا تكون مثالية اعتمادا على طبيعة الدراسة وبيئة المختبر. هناك قيد آخر لهذا البروتوكول وهو أن هشاشة الأنسجة قد تحدث أثناء القطع بالتبريد ، والتي قد تكون إما بسبب وجود الهواء في جميع أنحاء الأنسجة أو انخفاض فعالية تثبيت الأوعية الدموية مقارنة بالتثبيت داخل القصبة الهوائية. يمكن التغلب على هشاشة القطع بالتبريد هذه عن طريق قطع الأقسام السميكة من 60-100 ميكرومتر واستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصوير مستويات ثنائية الأبعاد (2D) داخل الأنسجة.

نعتقد أن بساطة هذه الطريقة وقدرتها على التكيف ستمكن المجموعات الأخرى من العثور على فائدة مع مسببات الأمراض المستنشقة التي اختاروها واستجابات المضيف ذات الاهتمام.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على التمويل والدعم من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة K22 AI153678-01 وكلية روتجرز للدراسات العليا. نشكر فؤاد يوسفزاي ولوك فريتزكي من جامعة روتجرز للعلوم الصحية الحيوية للتصوير الخلوي والأنسجة الأساسية على عملهما وخبرتهما في الحصول على صور الفلورسنت المناعي.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 جم ، 1 1/2 إبرة (305185)فيشر305185
1 لتر & nbsp ؛ جرة لولبية  (نالجين)فيشر سيانتيفيك11-823-33
محاقن غير معقمة بحجم Air-Tite 10 مل Luer LockFisher14-817-175
AnaSed Injection (محلول معقم xylazine)Akorn59399-110-20
حاصرات ومخففة خالية من ، RTUVectorSP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV القسطرة مع مادة قسطرة BD Vialon 18 جم × 1.88 بوصةBD381547
BD Pharmingen منقى الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32 (كتلة الماوس BD Fc & التجارة ؛)BD553142
CellTracker البرتقال CMRA صبغفيشر NC0873640
CFSELabviva75003
Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3 & Delta ؛  مصافي BEI ResourcesNR-166
Corning 70 ميكرونVWR10054-456
EpCAM AlexaFluor647 الأجسام المضادة أحادية النسيلةBiolegend118211
إبر Exel International HYpodermic 30 جم × 1/2 بوصةLabvivaEN3012
محاقن فيشربراند معقمة للاستخدام الفردي (1 مل ، ليور زلة)فيشر14-955-462
الجلوكوز مونوهيدراتآزر العلمية ES17530-500G
شحم عالي الفراغVWR59344-055
Hoechst 33342 محلول 20 ملي مولار (5 مل)ThermoFischer62249
Isoflurane USPCovetrus29405
الكيتامين هيدروكلوريدDechra1000001250
KIMWIPES مساحات المهام الحساسة (4.4 بوصة × 8.4 بوصة)VWR21905-026
مقص الأطفال من LexerFST14078-10
ملقط Micro-AdsonFST11018-12
فورمالين محايد مخزن مؤقت (10٪) (Azer Scientific)فيشر22-026-350
Nunc EasYFlask قوارير زراعة الأنسجة ، T75 ، أغطية مرشحVWR15708-134
PBSVWR45000-446
Peel-A-Way قوالب التضمينSigmaE6032-1CS
QuPath 0.5.1 برنامجمفتوح المصدرhttps://qupath.github.io/
خياطة الحرير حجم الخيط 3/0FST18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus VWR48311-703
SlowFade Glass Soft-Set Antifade Mountant (2 مل)ThermoFischerS36917
SucroseSigmaS0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. مركب ، Sakura FinetekVWR25608-930
Tween 20ThermoFischerJ20605. AP
Vector Laboratories مجموعة قلم حاجز مسعور ImmEDGE مكونة من 2من فيشر ScientificNC9545623
VWR ، مستطيلة (24 مم × 40 مم # 1.5)VWR48393-230
شبكة سلكية بلاستيكية بيضاءMAPORCH789862904922
مستخلص الخميرةفيشرBP9727-500
Zeiss AxioScan 7 & nbsp ؛Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.htmlمجهر فلوري متعدد القنوات
ZEN 3.7 SoftwareCarl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.htmlبرنامج الفحص المجهري
العلمي نظارات غطاء مايكرو

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , Washington, DC. (2019).
  2. Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).
  3. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
  4. Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , Elsevier, Academic Press. (2020).
  5. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  6. Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
  7. Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
  8. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
  9. Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
  10. Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
  11. Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
  12. Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
  13. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215(2021).
  14. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  15. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605(2020).
  16. Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
  17. Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
  18. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
  19. Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281(2015).
  20. Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).
  21. Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35(2021).
  22. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  23. Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Murine Lung ImagingFungal Spore LocalizationAirway Spatial DynamicsAir Inflation FixationVascular Perfusion FixationCryopreservation TechniqueFluorescent MicroscopyQuPath AnalysisEpCAM Antibody StainingRespiratory Fungal Infection

Related Articles