مقالة منهجية

عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

DOI:

10.3791/67559

⸱

مارس 28, 2025

 ,  ,  , 
1IIPROSAM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP), 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3IQUIBIM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف ظروف الثقافة في المختبر ، والعزل ، وزيادة توليد الحويصلات خارج الخلية (EVs) من المشوكات الحبيبية. تميزت المركبات الكهربائية الصغيرة بتشتت الضوء الديناميكي والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. تمت دراسة امتصاص الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام وتعديلها الظاهري باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد إفراز الحويصلات خارج الخلية بواسطة الخيط أمرا بالغ الأهمية لتمكين الاتصال الخلوي ليس فقط بين الطفيليات ولكن أيضا مع الأنسجة المضيفة. على وجه الخصوص ، تعمل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) كناقلات نانوية تنقل المستضدات الطبيعية ، والتي تعتبر ضرورية في التعديل المناعي للمضيف وبقاء الطفيليات. تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل sevs من مزارع مرحلة اليرقات من المشوكات الحبيبية وتحلل امتصاصها بواسطة الخلايا المتغصنة التي تم الحصول عليها من نخاع عظم الفئران ، والتي تكتسب قدرة الالتصاق وعرض المستضد أثناء نضجها بعد أسبوع واحد من الزراعة في المختبر . توفر هذه المقالة معلومات شاملة لتوليد وتنقية وقياس sEVs باستخدام الطرد المركزي الفائق جنبا إلى جنب مع التحليلات المتوازية لتشتت الضوء الديناميكي والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد بروتوكول تجريبي مفصل لعزل وزراعة خلايا نخاع عظم الفأر ودفع تمايزها إلى خلايا متغصنة باستخدام Flt3L. يمكن لهذه الخلايا المتغصنة أن تقدم مستضدات للخلايا التائية الساذجة ، وبالتالي تعديل نوع الاستجابة المناعية في الجسم الحي. وبالتالي ، يتم اقتراح بروتوكولات بديلة ، بما في ذلك الفحص المجهري متحد البؤر وتحليل قياس التدفق الخلوي ، للتحقق من النمط الظاهري الناضج المكتسب للخلايا المتغصنة التي تعرضت سابقا للمركبات الكهربائية الطفيلية. أخيرا ، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف ككل أو في أجزاء فردية لإجراء الطفيليات في الثقافة المختبرية ، وعزل الحويصلات خارج الخلية ، وتوليد مزارع الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام ، وإجراء فحوصات الامتصاص مع هذه الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المشوكات الحبيبية هي الديدان الطفيلية الحيوانية المنشأ المسؤولة عن عدوى طويلة الأمد تعرف باسم داء المشوكاتالكيسي 1. في المضيفين الوسيطين ، مثل الماشية والبشر ، تؤثر عدوى الطفيليات بشكل أساسي على الكبد والرئتين ، حيث تتطور مرحلة اليرقات على شكل أكياس مملوءة بالسوائل أو قليل يحتوي على البروتوسكوليسيات (اليرقة نفسها). مثل جميع الديستوكيد الخيطية ، يفتقر هذا الطفيل إلى كل من الجهاز الهضمي والإخراجي ، وبالتالي فقد طور عمليات خلوية داخلية وخارجية نشطة لتنظيم امتصاص وإفراز المستقلبات بالإضافة إلى إطلاق الحويصلات خارج الخلية2،3. الحويصلات خارج الخلية (EVs) عبارة عن جزيئات محاطة بطبقة ثن....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقييم جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات والموافقة عليها من قبل اللجنة التجريبية الحيوانية التابعة لكلية العلوم الدقيقة والطبيعية ، مار ديل بلاتا (أرقام التصاريح: RD544-2020; RD624-625-2021 ؛ RD80-2022). في هذا البروتوكول ، تم القتل الرحيم للفئران ، وفقا ل "دليل رعاية واستخدام المختبر" الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة وإرشادات الخدمة الصحية الوطنية وجودة الغذاء (SENASA).

1. زراعة مرحلة اليرقات Echinococcus

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة.

  1. E. الحبيبات protoscoleces الوفاء
    1. قم بالشفط بإبرة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر في الشكل 1 مخطط انسيابي يلخص الخطوات الرئيسية للحفاظ على الثقافات النقية لمرحلة اليرقات بكتريا حبيبية ، وعزل وتوصيف sEVs ، وامتصاصها بواسطة الخلايا المتغصنة للفئران. لتحقيق إنتاج مرتفع من sev من E. granulosus protoscoleces و metacestodes ، تم استخدام طريقة زراعة في المختبر تم تطويرها مسبقا في المختبر لتعظيم البقاء على قيد الحياة والتوازن الأيضي للطفيلي المدروس (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توضيح سير عمل البروتوكول لزراعة الطفيليات ، وعزل sEVs المشتقة من الطفيليات ، وتمييز الخلايا المتغصنة عن نخاع العظام ، وتحليل امتصاص sEV بواسطة هذه الخلايا . وكان الهدف من ذلك هو الوصف المفصل لكل قسم من أقسام البروتوكول التي يمكن تنفيذها ككل أو على حدة، مع تسليط الضوء على الاعتبارات الرئيسية لضمان تنفيذ المنهجية. إن تحليل مجموعة المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من الكائنات الطفيلية الكاملة له تأثير ملموس على دراسة العلاقة المتبادلة بين الطفيلي والم.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون ب Lic. سيسيليا غوتيريز أيستا (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentina) و Lic. ليوناردو سيتشي وليك. إليانا مازا (INIFTA ، جامعة لا بلاتا الوطنية ، الأرجنتين) للمساعدة الفنية في الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال وتشتت الضوء الديناميكي ، على التوالي. نشكر أيضا درا. جراسييلا ساليرنو ، درا. كورينا بيرون والدكتور غونزالو كالو لاستخدام جهاز الطرد المركزي الفائق في INBIOTEC-CONICET-FIBA ، الأرجنتين. ويعترف المؤلفان بامتنان ليك. كيلي (SENASA، مار ديل بلاتا، الأرجنتين) وليك. H. Núnez García (CONICET ، Universidad Nacional de Mar del Plata ، الأرجنتين) لتعاونهم في تقييم رفاهية الفئران ، و Med. Vet. J. Re....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب 1.5 ملHensoN14059
لوحة 24 بئر   ؛JetBiofilCAP011024البوليسترين ، قاع مسطح ،
صفيحة معقمة 6 آبار   ؛  شركة هينسو الطبية المحدودةN14221قاع مسطح الشكل ، مادة PS ،
مصفاة خلية بولي بروبلين معقمة 70 ممBiologix Group Limited15-1070صبغة
معقمة Alcian blue 8 GX   ؛سانتا كروزsc-214517B
حاضنة CO2< / sub>NuarireUN-5100E / G DH
مصل الأبقار الألبومينمختبر Wiener1443151
CD11c الجسم المضاد أحادي النسيلة PECy5 & nbsp ؛   100 وميكرو ؛ زeBioscience15-0114-82استنساخ (N418)
CD40 الجسم المضاد أحادي النسيلة - FITC 100 & micro ؛ زeBioscience11-0402-82استنساخ (HM40-3)
CD80 الأجسام المضادة أحادية النسيلة - APC 100 & micro ؛ زeBioscience17-0801-82استنساخ (16-10A-1)
CD86 الأجسام المضادة أحادية النسيلة FITC   ؛ 100 & micro ؛ زeBioscience11-0862-82استنساخ (GL-1)
جهاز طردThermo ScientificIEC CL31R مجهر متحد البؤر متعدد السرعات
نيكونمجهر متحد البؤر C1
أنابيب مخروطية 15 مل بقطر 17 × 120 ممCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
ثنائي ميثيل سلفوكسيد   ؛Anedra6646
مصل الأبقار الجنينية 500 ملSigma-Aldrich   12352207
نظام قياس التدفقBD BiosciencesBD FACSCanto & trade ؛ II
الخلية الشعرية المطوية زيتا  مالفيرن التحليليةDTS1070
ملح كبريتات الجنتاميسينسيجماG1264
محلول الجلوتارالديهايدفلوكا49630
هيبسجيبكو11344041
تحت الجلد   إبرة 21 جم × 1 "25/8Weigaoمعقمة
تحت الجلد   إبرة 25 جم × 5/8"Weigaoعقيم
المجهر المقلوب لايكاDMIL LED Fluo 
الكيتامينهوليداي
عديدات السكاريد الدهنية   5 مجمInvitrogentlrl-rslpsLPS من البكتيريا سالبة الجرام بكتريا القولونية K12. TLR2 / 4 ناهضات
لوبراميد هيدروكلوريدسيجما ألدريتش5.08162
متوسط 199   ؛جيبكو11150059
الميثيلين الأزرقAnedra6337
MHC الفئة الأولى (H2kb) الجسم المضاد أحادي النسيلة PE 100 & micro ؛ زeBioscience12-5958-82استنساخ (AF6-88.5.5.3) معقد
التوافق النسيجي الكبير الفئة الثانية (IA / IE) الجسم المضاد أحادي النسيلة - FITC   ؛ 100 & micro ؛ زeBioscience11-5321-82استنساخ (M5 / 114.15.2)
مجهرأوليمبوسCX31
فأرة مؤتلفة Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Penicillin G ملح الصوديومSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Potassium Phosphate أحادي القاعدةللفوسفات المخزنة محلول ملحي (PBS)
تحلل كرات الدم الحمراء 100 ملروش11814389001
RPMI متوسط  1640 1x 500 ملسيجما ألدريتش (جيبكو)11875093
كاكوديلات الصوديوم   Sigma-AldrichC0250
كلوريد الصوديومAnedra7647-14-5للفوسفات الملحي المخزن (PBS)
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (اللامائية) ص. أ.Biopack1639.07لمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)
ملح كبريتات الستربتومايسينSigmaS9137
حقنة 10 ملكربونات السميكة المعقمة بريمن
بيكمان كولتر13 × 55 مم ، السعة الاسمية 4 مل
مجهر إلكتروني ناقلJeolJEOL JSM 100CX II
جهاز طرد مركزي فائقBeckmanOptima LE-80k 90 Ti الدوار
زيلازينريتشموند
زيتاسيزر نانو  مالفيرن Nano ZSizer-ZEN3600لإجراء تشتت الضوء الديناميكي وقياسات زيتا المحتملة
مركزي الخلوي مخزن أنابيب البولي الحركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wen, H., et al. Echinococcosis: advances in the 21st century. Clin Microbiol Rev. 32 (2), e00075-e00118 (2019).
  2. Geary, T. G., Thompson, D. P. Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol. 115 (2), 167-184 (2003).
  3. Drurey, C., Maizels, R. ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة