مقالة منهجية

تقييم الجلوتامين كمصدر للوقود للبلاعم السنخية المعرضة للإيثانول المزمن باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية

965 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67579

⸱

نوفمبر 15, 2024

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, Emory University, 2Atlanta Veterans Affairs Health Care System

في هذه المقالة

ملخص

يؤدي إساءة استخدام الكحول إلى إضعاف مناعة البلاعم السنخية (AM) بسبب تنفس الميتوكوندريا المكبوت والطاقة الحيوية. لقد أظهرنا مؤخرا أن التعرض للإيثانول (EtOH) يزيد من اعتماد الجلوتامين على تنفس الميتوكوندريا في AMs. هنا ، يتم توفير طرق لتحديد استخدام الجلوتامين لتنفس الميتوكوندريا في AMs المعالجة ب EtOH باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية.

الملخص

البلاعم السنخية (AMs) هي خط الدفاع الخلوي في مجرى الهواء السفلي ضد مسببات الأمراض. ومع ذلك ، فإن تعاطي الكحول المزمن والمفرط يضعف قدرة AMs على البلعمة وإزالة مسببات الأمراض من الفضاء السنخي ، جزئيا من خلال عدم تنظيم استقلاب الوقود والطاقة الحيوية. أظهر عملنا السابق أن استهلاك الإيثانول المزمن (EtOH) يضعف الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ويزيد من مستويات اللاكتات في AMs. علاوة على ذلك ، أظهرنا مؤخرا أن EtOH يزيد من الاعتماد على الجلوتامين والتنفس الأقصى المعتمد على الجلوتامين مع تقليل المرونة ، والتحول بعيدا عن التنفس المعتمد على البيروفات ونحو التنفس المعتمد على الجلوتامين. يعد تحلل الجلوتامينات مسارا تعويضيا مهما لتنفس الميتوكوندريا عند استخدام البيروفات لإنتاج حمض اللاكتيك أو عندما تكون مصادر الوقود الأخرى غير كافية. باستخدام خط خلية AM للفأر ، خلايا MH-S ، التي تعرضت إما لعدم وجود EtOH أو EtOH (0.08٪) لمدة 72 ساعة ، حددنا اعتماد تنفس الميتوكوندريا والطاقة الحيوية على الجلوتامين كمصدر للوقود باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية. تم إجراء تدابير في الوقت الفعلي استجابة ل bis-2- (5-phenylacetamido-1،3،4-thiadiazol-2-yl) كبريتيد الإيثيل (BPTES) ، وهو مثبط للجلوتاميناز 1 ، والذي يمنع التحويل الأنزيمي للجلوتامين إلى غلوتامات ، في مركبة الوسائط أو استجابة للمركبة وحدها ، متبوعا باختبار إجهاد الميتوكوندريا. يصف البروتوكول التفصيلي المقدم هنا أساليبنا وحساباتنا لتحليل متوسط مستويات تنفس الميتوكوندريا القاعدي المعتمد على الجلوتامين ، والتنفس المرتبط ب ATP للميتوكوندريا ، وتنفس الميتوكوندريا الأقصى ، والقدرة التنفسية الاحتياطية للميتوكوندريا عبر العديد من التكرارات البيولوجية والتجريبية.

المقدمة

يؤثر اضطراب تعاطي الكحول (AUD) على أكثر من 28 مليون شخص في الولايات المتحدة1. الأشخاص المصابون بالاضطراب الأسترالي أكثر عرضة للإصابة بعدوى الجهاز التنفسي2،3 ، مما يزيد من خطر الإصابة بالأمراض المبكرة والوفيات3،4،5. يزيد إساءة استخدام الكحول من القابلية للإصابة بالتهابات الجهاز التنفسي ، جزئيا من خلال قمع وظيفة المناعة في الرئة. البلاعم السنخية (AMs) هي خط الدفاع الخلوي ضد مسببات الأمراض في الرئة السفلية ، حيث تقوم بلعمة وإزالة الميكروبات المستنشقة. ومع ذلك ، فإن استهلاك الكحول المزمن يضعف قدرة AMs على ابتلاع ومسببات الأمراضوقتلها 6،7.

الوظائف المناعية ل AMs ، مثل البلعمة ، هي عمليات تتطلب الطاقة وتتطلب مسارات نشطة من الناحية الأيضية ضرورية لتوليد ثلاثي الفوسفات الأدينوسين (ATP). الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا هي العملية الخلوية الأكثر كفاءة لإنتاج ATP ، لكن التعرض المزمن للإيثانول (EtOH) يزيد من الإجهاد التأكسدي المشتق من الميتوكوندريا ، والذي يمكن أن يؤدي إلى خلل في الميتوكوندريا في AMs8،9،10. يمكن قياس تنفس الميتوكوندريا المقاس باستخدام معدل استهلاك الأكسجين الخلوي (OCR) باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية في الوقت الفعلي. يتم تقييم ملامح تنفس الميتوكوندريا استجابة للأوليغومايسين (مثبط سينسيز ATP) ، وكاربونيل سيانيد - ف ثلاثي فلورو ميثاوكسي فينيل هيدرازون (FCCP ، مفك اقتران البروتون) ، والروتينون / أنتيمايسين أ (R / A ، مثبطات الميتوكوندريا المركب الأول والثالث ، على التوالي) لتحديد الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. يقلل EtOH المزمن من الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في AMs ، كما يتضح من تناقص التنفس القاعدي للميتوكوندريا ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والتنفس الأقصى ، والقدرة التنفسيةالاحتياطية 10.

الخلايا لها مستويات مختلفة من الاعتماد على مصادر الوقود ، مثل البيروفات أو الجلوتامين أو الأحماض الدهنية ، لإنتاج ATP. لديهم أيضا مستوى من المرونة يمكنهم من خلاله تبديل استخدام الوقود لتنظيم الطاقة الحيوية الخلوية. يعد تحلل الجلوتامينات مسارا رئيسيا لتنفس الميتوكوندريا ، خاصة عندما يتم تحويل البيروفات نحو إنتاج حمض اللاكتيك أو عندما تكون الأحماض الدهنية غير كافية. أظهرت دراستنا الحديثة أن التعرض المزمن ل EtOH يزيد من اعتماد AM على الجلوتامين ويقلل من مرونة AM لاستخدام الجلوتامين ومصادر الوقود الأخرى لتنفس الميتوكوندريا11. هذه النتائج ، جنبا إلى جنب مع البيانات التي توضح أن معالجة خلايا MH-S المعرضة ل EtOH بمثبط أكسدة البيروفات UK5099 لم يغير الطاقة الحيوية للميتوكوندريا مقارنة بخلايا MH-S المعرضة للتحكم في الوسائط المعالجة ب UK5099 ، اقترحت تحولا بعيدا عن التنفس المعتمد على البيروفات ونحو التنفس المعتمد على الجلوتامين في خلايا EtOH MH-S. ومع ذلك ، فإن هذا التحول غير كاف لتلبية متطلبات الطاقة الحيوية AM11. هنا ، نصف طرق تقييم الجلوتامين كمصدر وقود لتنفس الميتوكوندريا في AMs المزمنة المعرضة ل EtOH باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية. تم إنشاء هذا البروتوكول وتحسينه لتنسيق 96 بئرا (مساحة 11.04 مم2 ) ويجب تعديله لأحجام آبار زراعة الخلايا الأكبر. يتم تحديد الاعتماد على الجلوتامين للطاقة الحيوية للميتوكوندريا باستخدام كبريتيد الإيثيل bis-2- (5-phenylacetamido-1،3،4-thiadiazol-2-yl) (BPTES ، مثبط الجلوتاميناز 1) لتثبيط التحويل الأنزيمي للجلوتامين إلى غلوتامات بشكل انتقائي البيانات المقدمة في هذه الدراسة عبارة عن مكررات بيولوجية إضافية للمجموعات التجريبية المعالجة بالتحكم في الوسائط والمجموعات التجريبية المعالجة ب BPTES من خط خلايا الفأر AM غير المعالج والمزمن المتعرض ل EtOH ، خلايا MH-S ، والتي تم نشرها في Crotty et al.11.

البروتوكول

1. التعرض المزمن ل EtOH في المختبر

  1. زراعة خلايا MH-S ، وهي خط خلايا بلاعم سنخي للفأر ، في وسائط كاملة تحتوي على RPMI-1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 11.9 ملي مولار بيكربونات الصوديوم ، 40 مجم / مل جنتاميسين ، و 50 ميكرومتر 2-ميركابتو إيثانول عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة مرطبة.
  2. عالج خلايا MH-S المستنبتة مع أو بدون EtOH (0.8 مجم / مل أو 0.08٪) لمدة 72 ساعة ، حيث يجب تغيير EtOH كل 24 ساعة. احتضان خلايا MH-S المعالجة ب EtOH عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة مرطب منفصلة تحتوي على 0.08٪ EtOH في مياه الحاضنة.

2. طلاء خلايا MH-S لتقييم الجلوتامين كمصدر للوقود باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية

  1. تأكد من نمو خلايا MH-S غير المعالجة (Con) والمزمنة المعالجة ب EtOH إلى التقاء 50٪ على الأقل (التقاء 70٪ -90٪ مثالي) في قوارير T-75 للمرور إلى لوحة زراعة دقيقة للتدفق خارج الخلية مكونة من 96 بئر. قم بإعداد خريطة لوحة ل 5-6 مكررات تقنية لكل تكرار بيولوجي للظروف التجريبية Con و EtOH وضوابط الوسائط لكل منها للمقارنة مع حقن BPTES (أربع مجموعات إجمالية للبيولوجية n = 1).
  2. اشطف الخلايا بالوسائط أو المحلول الملحي المخزن بالفوسفات.
  3. أضف 6 مل من الوسائط المحتوية على المصل إلى القارورة.
  4. اكشط الخلايا حتى يتم فصلها ويصبح الجزء السفلي من اللوحة واضحا. التربسين غير ضروري لانفصال خلايا MH-S ولكنه قد يكون مفيدا في أنواع الخلايا الأخرى.
  5. افصل الخلايا باستخدام ماصة مصلية أو ماصة سعة 1 مل.
  6. انقل الخلايا العالقة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بطردها بمعدل 200 × جم لمدة 6 دقائق.
  7. شفط المادة الطافية.
  8. أضف 1 مل من الوسائط وأعد تعليق الخلايا جيدا.
  9. انقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. اخلط جيدا.
  10. انقل 10 ميكرولتر من خليط الخلية / التريبان الأزرق إلى جانب واحد من مقياس كثافة الدم أو عداد الخلية.
  11. احسب عدد الخلايا باستخدام مجهر ضوئي أو عداد خلية.
  12. احسب كثافة الخلية كمتوسط عدد الخلايا الحية لكل مليلتر.
  13. قم بإجراء حسابات للتخفيفات المطلوبة:
    عدد الآبار المطلوبة × 10000-15000 خلية = العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة.
    عدد الآبار المطلوبة × 80 ميكرولتر = الحجم الإجمالي للخلايا المعلقة المطلوبة.
  14. ضع 80 ميكرولتر من الخلايا على الآبار الضرورية للوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية المكونة من 96 بئرا.
  15. اترك آبار الزاوية خالية تماما من أي خلايا أو وسائط. سيتم استخدام هذه الآبار لقياسات الخلفية.
  16. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالالتصاق والتوازن في لوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية.
  17. عالج خلايا MH-S في لوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية المكونة من 96 بئرا لمدة 72 ساعة باستخدام الخطوة 1.
  18. قبل 4 ساعات على الأقل وحتى 24 ساعة قبل إجراء تجربة المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية ، قم بترطيب خرطوشة باك التدفق خارج الخلية 96 بئر.
    1. قم بإزالة الجزء العلوي من باك التدفق خارج الخلية وضع الجزء الذي تم فحصه من باك التدفق ووجهه لأعلى على المقعد. ضع 200 ميكرولتر من محلول التدفق خارج الخلية على كل بئر في الجزء السفلي من خرطوشة باك التدفق خارج الخلية.
    2. ضع الأقسام معا ولف خرطوشة باك التدفق خارج الخلية في بارافيلم ضعه في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية غير ثاني أكسيد الكربون2 أو حمام حبة 37 درجة مئوية.
  19. قم بتشغيل الكمبيوتر الذي يحتوي على تصميم الفحص وافتح برنامج التشغيل / التحليل المرفق بأداة المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية للسماح له بالتسخين لمدة 4 ساعات على الأقل قبل إجراء التجربة.

3. استخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية لتقييم الجلوتامين كمصدر وقود لتنفس الميتوكوندريا في خلايا MH-S

ملاحظة: تظهر النظرة العامة العامة لهذا الإجراء في الشكل 1.

  1. افحص خلايا MH-S المستزرعة المعالجة ب Con و EtOH تحت المجهر الضوئي وتأكد من أن الخلايا سليمة وتلتصق بالآبار في طبقة أحادية. تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 70٪ على الأقل (التقاء 90٪ مثالي) لإجراء الفحص بشكل موثوق.
  2. تحضير وسط قاعدة التدفق خارج الخلية بالمكملات التالية:
    1. Aliquot 35 مل من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية في أنبوب 50 مل.
    2. أضف 350 ميكرولتر من 100 ملي مولار بيروفات الصوديوم (التركيز النهائي 1 ملليمتر) ، و 350 ميكرولتر من جلوكوز الصوديوم (التركيز النهائي 10 مليمتر) ، و 350 ميكرولتر من الجلوتاماكس ، وهو أكثر ثباتا على الرف مقارنة ب L-glutamine (التركيز النهائي 2 مللي).
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام L-glutamine الطازج بنفس التركيز.
    3. قم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني 7.4 ± 0.05 عند 37 درجة مئوية.
  3. استنشق وسط النمو برفق من لوحة الزراعة الدقيقة خارج الخلية. اترك أقل قدر ممكن من الوسائط دون شفط الخلايا من الأسفل. يغسل مرة واحدة بحد أقصى 50 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية.
  4. أضف 180 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية إلى كل بئر واحتضان لوحة الزراعة الدقيقة خارج الخلية في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية غير ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة للسماح بالتوازن.
  5. قم بإذابة كواشف اختبار أكسدة الجلوتامين:
    1. في أنبوب BPTES ، أضف 700 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 120 ملم. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
      تنبيه: تسبب BPTES تهيج الجلد والعين وقد تسبب تهيج الجهاز التنفسي. ارتد قفازات واقية وحماية للعين وحماية للوجه عند التعامل معها. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
    2. في أنبوب oligomycin ، أضف 630 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 100 ملليمتر. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
    3. في أنبوب FCCP ، أضف 720 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 100 ملم. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
      تنبيه: FCCP ضار إذا تم ابتلاعه ، ويسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين ، وقد يسبب رد فعل تحسسي للجلد ، وقد يسبب آثارا ضارة طويلة الأمد على الحياة المائية. ارتد قفازات واقية وملابس واقية وواقية للعين وحماية للوجه عند المناولة. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
    4. في أنبوب R / A ، أضف 540 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 50 ملم. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
      تنبيه: يعتبر Rotenone قاتلا إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه ، ويسبب تهيجا للجلد ، ويسبب تهيجا خطيرا للعين ، وقد يسبب تهيجا في الجهاز التنفسي ، وهو شديد السمية للحياة المائية مع تأثيرات طويلة الأمد. ارتد قفازات واقية وحماية للعين وحماية الوجه وحماية الجهاز التنفسي. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات. أنتيمايسين أ قاتل إذا ابتلع وهو شديد السمية للحياة المائية ، وله تأثيرات طويلة الأمد. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
  6. تحضير تركيزات العمل من أكسدة الركيزة وكواشف اختبار إجهاد الميتوكوندريا:
    1. بالنسبة ل BPTES ، امزج 1,500 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 500 ميكرولتر من محلول مخزون 120 ملي مولار BPTES لصنع حل عمل 30 ميكرومتر BPTES.
    2. بالنسبة للأوليغومايسين ، امزج 2،520 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 480 ميكرولتر من 100 ملي مولار من oligomycin لصنع محلول عمل 16 ملي مولار.
    3. بالنسبة إلى FCCP ، امزج 2,865 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 135 ميكرولتر من 100 ملي مولار FCCP لعمل حل عمل FCCP 4.5 ملي.
    4. بالنسبة ل R / A ، امزج 2,700 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 300 ميكرولتر من 50 ملي مولار R / A لعمل حل عمل 5 ملي مولار R / A.
  7. قم بتحميل منافذ الجزء العلوي من خرطوشة باك التدفق خارج الخلية بما يلي:
    1. قم بتحميل آبار التحكم في الخلفية والوسائط ب 20 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية في المنفذ A ، و 22 ميكرولتر من oligomycin في المنفذ B ، و 25 ميكرولتر من FCCP في المنفذ C ، و 27 ميكرولتر من R / A في المنفذ D.
    2. تحميل الآبار المحتوية على الخلايا ب 20 ميكرولتر من التحكم في الوسائط أو BPTES في المنفذ A (التركيز النهائي 3 ميكرومتر ل BPTES) ، و 22 ميكرولتر من oligomycin في المنفذ B (التركيز النهائي 2 ميكرومتر للأوليغومايسين) ، و 25 ميكرولتر من FCCP في المنفذ C (التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر ل FCCP) ، و 27 ميكرولتر من R / A (التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر ل R / A) في المنفذ D.
  8. قم بإجراء تجربة المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية باستخدام برنامج الكمبيوتر لتصميم الفحص وتحليله المرفق بالجهاز باستخدام استراتيجية التوقيت والحقن التالية:
    1. بالنسبة للحقن باستخدام المنفذ A ل BPTES ، اضبط عدد القياسات على 6. اضبط وقت المزج على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 0 دقيقة ووقت قياس 3 دقائق.
    2. بالنسبة للحقن بالمنفذ B للأوليغومايسين، اضبط عدد القياسات على 3. اضبط وقت المزج على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 0 دقيقة ووقت قياس 3 دقائق.
    3. بالنسبة للحقن باستخدام المنفذ C ل FCCP ، اضبط عدد القياسات على 3. اضبط وقت الخلط على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 6 دقائق ووقت قياس 3 دقائق.
    4. بالنسبة للحقن باستخدام المنفذ D ل R / A ، اضبط عدد القياسات على 3. اضبط وقت المزج على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 0 دقيقة ووقت قياس 3 دقائق.
    5. راجع جميع الخلفية المحددة ، والتحكم في الوسائط ، وآبار المجموعة التجريبية. حفظ وتشغيل الفحص. أولا ، قم بتحميل باك التدفق خارج الخلية بحقن A-D. ستحدث المعايرة حتى تصبح لوحة الخلية جاهزة للتحميل.
    6. قم بإزالة لوحة الخلية مباشرة في نهاية الفحص. احفظ النتائج لتحليلها لاحقا على جهاز آخر.
    7. تحقق مما إذا كانت الخلايا لا تزال ملتزمة باستخدام المجهر الضوئي. اغسل 1x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات وخلايا الليز مع مخزن مؤقت مفضل لتحلل الخلايا. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو يفحص على الفور لتركيز البروتين.

4. تحليل النتائج لتقييم الجلوتامين كمصدر وقود لتنفس الميتوكوندريا في خلايا MH-S

  1. استخراج البروتين من الخلايا في كل بئر لتطبيع بيانات معدل استهلاك الأكسجين (OCR) إلى البروتين:
    1. احسب تركيز (نانوجرام / ميكرولتر [نانوغرام / ميكرولتر]) للبروتين لكل بئر.
    2. احسب متوسط تركيز البروتين (نانوغرام / ميكرولتر) للوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية بأكملها.
    3. اقسم تركيز بروتين كل بئر على متوسط تركيز البروتين في اللوحة للحصول على عامل التطبيع.
    4. تطبيق عامل التطبيع على ملف البيانات محل الاهتمام باستخدام برنامج الكمبيوتر لتصميم الفحص وتحليله.
  2. تأكد من أن قيم التعرف الضوئي على الحروف لجميع آبار الخلفية قريبة من 0.
  3. قم بإلغاء تحديد أي آبار خلوية حيث يكون التعرف الضوئي على الحروف < 10 عند خط الأساس. لن يتم حذف البيانات ، ولكن ستظهر الآبار المميزة في ملف البيانات المصدرة.
  4. تصدير البيانات من برنامج الكمبيوتر لتصميم الفحص وتحليله إلى برنامج جداول بيانات الكمبيوتر.
  5. افتح الملف في برنامج جدول بيانات الكمبيوتر وفرز جميع البيانات عن طريق تقليل قيم التعرف الضوئي على الحروف. حذف آبار الخلفية ، والآبار التي تم إلغاء تحديدها مسبقا (ولم يتم حذفها) ، وأي آبار ذات قابلية منخفضة للخلايا ، والآبار ذات التقاء الخلايا المنخفض ، والآبار التي لا تكتمل استراتيجية الحقن الكاملة ، والآبار ذات قراءات تركيز البروتين غير الدقيقة ، والآبار ذات خط الأساس OCR < 10 ، وأي معايير أخرى محددة مسبقا.
  6. قم بفرز جميع البيانات المتبقية حسب القياس ، ثم حسب المجموعة ، ثم حسب التعرف الضوئي على الحروف.
  7. يتكرر متوسط تقنية كل N البيولوجية بشكل مستقل عن طريق القياس. تأكد من وجود ما لا يقل عن 18 قيمة مختلفة (3 خط أساس ، 3 بعد الوسائط / BPTES ، 3 بعد oligomycin ، 3 بعد FCCP ، و 6 بعد rotenone / antimycin A) لكل مجموعة تجريبية لكل N بيولوجي بعد متوسط التكرارات التقنية. افعل ذلك لكل N بيولوجي على حدة بحيث يمكن حساب الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري للمتوسط لاحقا للبيانات التي تم تحليلها.
  8. انسخ جميع القيم المتوسطة إلى جدول بيانات جديد، مفصولا بمجموعة تجريبية.
  9. متوسط قيم التعرف الضوئي على الحروف حسب استراتيجية الحقن في كل مجموعة تجريبية.
  10. احسب معلمات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا بناء على استهلاك الأكسجين:
    1. احسب التنفس الأساسي:
      1. احسب تنفس الميتوكوندريا القاعدي على النحو التالي:
        تنفس الميتوكوندريا القاعدي (pmol O2 مستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18] × [الوقت # 3 - الوقت # 1])
        ملاحظة: يجب أن يكون التنفس القاعدي متشابها بين التحكم في الوسائط ومجموعات BPTES لأن هذا قبل حقن المثبط.
      2. احسب تنفس الميتوكوندريا القاعدي الذي لا يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        لا يعتمد تنفس الميتوكوندريا القاعدي على الجلوتامين (pmol O2 المستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18] × [الوقت # 9 - الوقت # 4])
        ملاحظة: يجب أن يكون تنفس الميتوكوندريا القاعدي الذي لا يعتمد على الجلوتامين أقل من تنفس الميتوكوندريا القاعدي ما لم تكن الخلايا لا تعتمد بشكل كبير على الجلوتامين.
      3. احسب تنفس الميتوكوندريا القاعدي المعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        يعتمد تنفس الميتوكوندريا القاعدي على الجلوتامين (مستهلكة pmol O2 ) = ([قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 - قياسات AVG OCR # 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9] × [الوقت # 9 - الوقت # 4])
        ملاحظة: لا ينبغي طرح تنفس الميتوكوندريا القاعدي الكلي من تنفس الميتوكوندريا القاعدي ، ولا ينبغي أن يعتمد على الجلوتامين لأنه يتم حسابه في نقاط زمنية مختلفة.
    2. احسب التنفس المرتبط ب ATP على النحو التالي:
      1. احسب إجمالي التنفس المرتبط ب ATP للميتوكوندريا من جميع أنواع الوقود على النحو التالي:
        إجمالي التنفس المرتبط ب ATP للميتوكوندريا من جميع أنواع الوقود (pmol O2 مستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 - قياسات AVG OCR # 10 ، 11 ، 12] × [الوقت # 12 - الوقت # 10])
        ملاحظة: يجب أن يكون متوسط التعرف الضوئي على الحروف للقياسات # 10 و 11 و 12 متشابها بين التحكم في الوسائط ومجموعات BPTES لأن oligomycin يجب أن يثبط بقوة سينسيز ATP ، ويجب ألا يغير تثبيط مسار وقود واحد إجمالي التنفس المرتبط ب ATP.
      2. احسب تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP الذي لا يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP لا يعتمد على الجلوتامين (pmol O2 المستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 - قياسات AVG OCR # 10 ، 11 ، 12] × [الوقت # 12 - الوقت # 10])
        ملاحظة: يجب أن يكون تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP الذي لا يعتمد على الجلوتامين أقل من تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP ما لم تكن الخلايا لا تعتمد بشكل كبير على الجلوتامين.
      3. احسب تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP الذي يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        يعتمد تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP على الجلوتامين (مستهلك pmol O2 ) = إجمالي تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP من جميع أنواع الوقود - تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP لا يعتمد على الجلوتامين
    3. احسب الحد الأقصى للتنفس على النحو التالي:
      1. احسب إجمالي الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا على النحو التالي:
        إجمالي تنفس الميتوكوندريا الأقصى (pmol O2 المستهلكة) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18] × [الوقت # 15 - الوقت # 13])
      2. احسب الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا الذي لا يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا لا يعتمد على الجلوتامين (pmol O2 مستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 من مجموعات BPTES - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18 من مجموعات BPTES] × [الوقت # 15 - #Time 13])
      3. احسب الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا المعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        أقصى تنفس للميتوكوندريا يعتمد على الجلوتامين (مستهلك pmol O2 ) = إجمالي تنفس الميتوكوندريا الأقصى من جميع أنواع الوقود - أقصى تنفس للميتوكوندريا لا يعتمد على الجلوتامين
        ملاحظة: يمكن استخدام هذا الحساب لتحديد اعتماد الخلية على الطاقة الفائضة للجلوتامين مقارنة بأنواع الوقود الأخرى. كلما زاد الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا ، زاد الاعتماد على الجلوتامين ، والذي يمكن التعبير عنه على أنه مجموعات BPTES - مجموعات التحكم لإظهار خسارة في أقصى تنفس للميتوكوندريا أو كنسبة مئوية من التنفس الكلي.
    4. احسب القدرة التنفسية الاحتياطية على النحو التالي:
      1. احسب إجمالي سعة التنفس الاحتياطية على النحو التالي:
        إجمالي سعة الجهاز التنفسي الاحتياطية (pmol O2 المستهلكة) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 - قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3] × [الوقت # 15 - الوقت # 13])
      2. احسب القدرة التنفسية الاحتياطية التي لا تعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        القدرة التنفسية الاحتياطية لا تعتمد على الجلوتامين (pmol O2 المستهلكة) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 من مجموعات BPTES - قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 من مجموعات BPTES] × [الوقت # 15 - الوقت # 13])
      3. احسب القدرة التنفسية الاحتياطية التي تعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        القدرة التنفسية الاحتياطية التي تعتمد على الجلوتامين (مستهلك PMOL O2 ) = إجمالي القدرة التنفسية الاحتياطية من جميع أنواع الوقود - القدرة التنفسية الاحتياطية التي لا تعتمد على الجلوتامين
        ملاحظة: يمثل هذا الحساب مرونة الخلايا التي تعتمد على الجلوتامين وما إذا كان بإمكانها تحقيق تنفس أكبر بدون الجلوتامين عند الحاجة.
  11. اطرح عناصر التحكم في الوسائط حسب مجموعات المثبطات وتطبيع pmol O2 المستهلك بالنسبة للمجموعة الضابطة إذا رغبت في ذلك.
  12. قم بإنشاء رسوم بيانية لملامح الطاقة الحيوية OCR (pmol O2 / min) ، والتنفس القاعدي (pmol O2) ، والتنفس المرتبط ب ATP (pmol O2) ، والتنفس الأقصى (pmol O2) ، والقدرة التنفسية الاحتياطية (pmol O2) التي تعتمد على الجلوتامين.
  13. تصور قيم نقطة نهاية الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الرسوم البيانية الشريطية أو التعبير عنها كوسيلة لمجموعات المثبطات بالنسبة لمجموعات التحكم في الوسائط. إذا تم حساب كل N بيولوجي على حدة ، فقم بحساب الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري لمتوسط البيانات التي تم تحليلها عبر جميع Ns البيولوجية.

5. التحليل الإحصائي

  1. إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج تحليل البيانات المناسب.
  2. بالنسبة للنقاط الخطية لملامح الطاقة الحيوية OCR ، قم بإجراء ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا بتحليلات Tukey اللاحقة لمقارنة البيانات من هذه المجموعات التجريبية الأربع بعاملين (استراتيجية العلاج والحقن): Con + media و Con + BPTES و EtOH + media و EtOH + BPTES.
  3. بالنسبة للرسوم البيانية الشريطية للتنفس القاعدي ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والتنفس الأقصى ، والقدرة التنفسية الاحتياطية التي تعتمد على الجلوتامين ، قم بإجراء تحليلات اختبار t للطالب لمقارنة البيانات من مجموعتين تجريبيتين ، Con + BPTES ، و EtOH + BPTES.
  4. عرض البيانات كوسيلة ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). ضع في اعتبارك ص < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

يقلل التعرض المزمن ل EtOH من الاعتماد على الجلوتامين في خلايا MH-S.
يعد تحلل الجلوتامينات مسارا مهما لتنفس الميتوكوندريا ، حيث يدعم الجلوتامين كمصدر وقود مهم للطاقة الحيوية الخلوية. لتحديد ما إذا كان التعرض المزمن ل EtOH يغير اعتماد خلايا MH-S على الجلوتامين كمصدر للوقود لتنفس الميتوكوندريا ، تمت معالجة خلايا MH-S بدون تحكم EtOH (Con) أو EtOH ، وتم قياس OCR بمرور الوقت استجابة للحقن التسلسلي للكواشف المرتبطة بتنفس الميتوكوندريا. تستخدم ملامح الطاقة الحيوية OCR استجابة للحقن التسلسلي للأوليغومايسين (مثبط سينسيز ATP) ، و FCCP (مفك اقتران البروتون) ، و R / A (مثبطات الميتوكوندريا المركب الأول والمركب الثالث ، على التوالي) لحساب المعلمات الأخرى للطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، مثل التنفس المرتبط ب ATP ، والتنفس الأقصى ، والقدرة التنفسية الاحتياطية. جميع البيانات المعروضة عبارة عن مكررات بيولوجية إضافية لوسائط Con + و Con + BPTES و EtOH + وسائط ، و EtOH + BPTES MH-S المجموعات التجريبية للخلايا التي تم نشرها في Crotty et al.11. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، انخفض أوليغومايسين من التعرف الضوئي على الحروف بسبب تثبيط المركب V ، وزاد FCCP من التعرف الضوئي على الحروف بسبب فك اقتران الميتوكوندريا لإمكانات الغشاء وجيل ATP المعتمد على الميتوكوندريا12 ، و R / A يغلق OCR المعتمد على الميتوكوندريا بشكل فعال. تتوافق هذه الملامح لاستجابات الطاقة الحيوية OCR للحقن التسلسلية مع دليل المستخدم لتقييم إجهاد الميتوكوندريا باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية13،14.

بعد قياس التعرف الضوئي على الحروف القاعدي في خلايا MH-S المعالجة ب Con- و EtOH ، تم تحميل حقن التحكم في الوسائط أو BPTES ، وهو مثبط للجلوتاميناز 1. وسائل الإعلام Con + مقابل خلايا Con + BPTES MH-S ووسائط EtOH + مقابل EtOH + BPTES لم تظهر خلايا MH-S اختلافات في ملامح الطاقة الحيوية OCR (الشكل 2 أ). أظهرت خلايا EtOH + BPTES MH-S انخفاضا في التنفس القاعدي المعتمد على الجلوتامين مقارنة ب Con + BPTES (القياس # 4 مقارنة بالقياس # 3 في الشكل 2 أ والشكل 2 ب) ، مما يشير إلى أن EtOH يقلل من أكسدة الجلوتامين القاعدية لخلايا MH-S مما يساهم في تنفس الميتوكوندريا. أظهرت خلايا EtOH + BPTES MH-S فقدانا لتنفس الميتوكوندريا المرتبط بالجلوتامين المعتمد على ATP مقارنة ب Con + BPTES (الشكل 2 ج). على الرغم من أن خلايا EtOH + BPTES MH-S أظهرت خسارة ضعيفة في التنفس الأقصى المعتمد على الجلوتامين مقارنة ب Con + BPTES (الشكل 2 د) ، أظهرت خلايا EtOH + BPTES MH-S انخفاضا في القدرة التنفسية الاحتياطية المعتمدة على الجلوتامين مقارنة ب Con + BPTES (الشكل 2 ه). تشير هذه النتائج إلى أن خلايا EtOH MH-S لديها القدرة على أن تكون أكثر اعتمادا على الجلوتامين للتنفس ، كما هو الحال عند الضغط عليها مع FCCP ، ولكنها قد تكون غير قادرة على القيام بذلك بسبب زيادة الطلب على الجلوتامين التي يفوقها انخفاض في التوافر البيولوجي للجلوتامين.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل لقياس تنفس الميتوكوندريا المعتمد على الجلوتامين والطاقة الحيوية في خلايا MH-S ، وهي خط خلية ضامة سنخية للفأر. تم احتضان الطبقات الأحادية لخلايا MH-S المزروعة في آبار لوحة الزراعة الدقيقة خارج الخلية (الخطوة 3.1) بوسط قاعدة تدفق خارج الخلية مع إضافة مكملات غذائية (الخطوة 3.2) عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة غير ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة (الخطوة 3.4). تم استخدام وسط قاعدة التدفق خارج الخلية مع المكملات المضافة (الخطوة 3.2) كتحكم في الوسائط ولتخفيف تركيزات العمل لمثبط أكسدة الجلوتامين BPTES إلى التركيز النهائي 3 ميكرومتر ، ومثبط الميتوكوندريا V oligomycin (Oligo) إلى التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر ، وثنائي اقتران الميتوكوندريا الكربونيل سيانيد - p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) إلى التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر ، ومركب الميتوكوندريا الأول ومثبطات الميتوكوندريا المركب الثالث روتينون / أنتيمايسين أ (R / A) إلى 0.5 ميكرومتر التركيز النهائي لمنافذ التحميل A-D في خرطوشة باك التدفق خارج الخلية العلوية (الخطوة 3.7). كانت استراتيجية الحقن للخلط والانتظار وقياس أوقات التشغيل التجريبي باستخدام المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية: 3 دقائق من وقت الخلط ، ووقت انتظار 0 دقيقة ، و 6 قياسات لوقت قياس 3 دقائق للمنفذ A (التحكم في الوسائط أو BPTES) ؛ 3 دقائق من وقت الخلط ، ووقت انتظار 0 دقيقة ، و 3 قياسات لوقت قياس 3 دقائق للمنفذ B (Oligo) ؛ وقت خلط 3 دقائق ، ووقت انتظار 6 دقائق ، و 3 قياسات لوقت قياس 3 دقائق للمنفذ C (FCCP) ؛ ووقت خلط 3 دقائق ، ووقت انتظار 0 دقيقة ، و 3 قياسات لمدة 3 دقائق لقياس وقت المنفذ D (R / A). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: يقلل الإيثانول المزمن (EtOH) من تنفس الميتوكوندريا المعتمد على الجلوتامين في خلايا MH-S ، وهي خط خلايا بلاعم سنخي للفأر. لم تتم معالجة خلايا MH-S (Con) أو معالجتها باستخدام EtOH (0.08٪ ، 72 ساعة) ، وتم قياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR) بمرور الوقت باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية قبل وبعد الحقن باستخدام التحكم في الوسائط أو مثبط أكسدة الجلوتامين (GLN) (3 ميكرومتر من BPTES) ، متبوعا بالحقن التسلسلي لمثبط V لمركب الميتوكوندريا (0.5 ميكرومتر من oligomycin ، Oligo) ، فك اقتران الميتوكوندريا (0.5 ميكرومتر من الكربونيل سيانيد - ف ثلاثي فلورو ميثوكسي فينيل هيدرازون ، FCCP) ، ومركب الميتوكوندريا الأول ومثبطات المركب الثالث (0.5 ميكرومتر من الروتينون / 0.5 ميكرومتر من مضادات المايسين A ، R / A). (أ) تم استخدام ملامح الطاقة الحيوية OCR لحساب التنفس الأساسي المعتمد على الجلوتامين (ب) ، (ج) التنفس المرتبط ب ATP ، (د) التنفس الأقصى ، و (ه) القدرة التنفسية الاحتياطية. تمثل النقاط الخطية الوسائل ± SEM (ن = 4 ، # p < 0.05 مقابل وسائط Con + و * p < 0.05 مقابل Con + BPTES ، ANOVA أحادي الاتجاه مع Tukey's post hoc). تمثل الأشرطة يعني ± SEM (ن = 4 ، * ص < 0.05 مقابل Con + BPTES ، اختبار الطالب t). البيانات المقدمة عبارة عن تكرارات بيولوجية إضافية للمجموعات التجريبية المعالجة بالتحكم في الوسائط والمجموعات التجريبية المعالجة BPTES لخلايا MH-S غير المعالجة والمزمنة المعرضة ل EtOH ، والتي تم نشرها في Crotty et al.11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

البيانات المعروضة هنا هي مكررات بيولوجية إضافية لخلايا MH-S غير المعالجة والمزمنة المعرضة ل EtOH المعالجة بالتحكم في الوسائط أو BPTES ، والتي تم نشرها في Crotty et al.11. يستخدم البروتوكول الموصوف لتقييم اعتماد خلايا MH-S المعرضة ل EtOH على الجلوتامين كمصدر للوقود لتنفس الميتوكوندريا والطاقة الحيوية باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا ، يعد تكوين خلايا MH-S والتقائها أمرا مهما. يتم زراعة خلايا MH-S في البداية في آبار الزراعة الدقيقة خارج الخلية عند التقاء منخفض وتستخدم عندما تكون الخلايا في طبقة أحادية عند التقاء نهائي بنسبة 90٪. نظرا لأن التعرض EtOH لخلايا MH-S كان لمدة 72 ساعة ، فقد تم تحقيق التقاء نهائي بنسبة 90٪ قبل التشغيل التجريبي على المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية. يتوافق هذا مع التقارير الأخرى عن تكوين الخلية أحادية الطبقة والتقاء 90٪ -100٪ قبل إجراء هذه التجارب15،16،17. ثانيا ، يعد تطبيع قيم تنفس الميتوكوندريا للبروتين في كل عينة أمرا بالغ الأهمية. تعمل بعض الدراسات على تطبيع الطاقة الحيوية للميتوكوندريا إلى رقم الخلية18،19،20. ومع ذلك ، فإن استراتيجية الحقن التسلسلي في هذا الاختبار تهدف إلى الضغط بالتتابع على الميتوكوندريا. في الخلايا التي تعتمد بشكل أساسي على الفسفرة المؤكسدة ، مثل AMs ، قد يؤدي ذلك إلى موت الخلايا أثناء التشغيل التجريبي على المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية. لذلك ، قد لا تكون أعداد الخلايا متسقة من بداية التجربة حتى نهاية التشغيل التجريبي ، وتطبيع قيم تنفس الميتوكوندريا إلى البروتين هو الأمثل21،22. يقترح هنا عامل تطبيع البروتين باستخدام متوسط البروتين عبر جميع الآبار من أجل الإبلاغ عن ملفات تعريف التعرف الضوئي على الحروف الخاصة بالخلية بشكل أكثر دقة. ثالثا ، يعد تحليل النتائج عبر التكرارات البيولوجية أمرا أساسيا. في بعض الأحيان ، يتم تقديم صور تمثيلية لملامح الطاقة الحيوية للميتوكوندريا22،23 بدلا من متوسط تنفس الميتوكوندريا عبر مكررات بيولوجية متعددة10،11،24. ومع ذلك ، فإن هذه الصور التمثيلية لا تقدم صورة كاملة للاختلافات بين التجارب. من خلال حساب كل تكرار بيولوجي على حدة ، يمكن أن يظهر الخطأ المعياري للمتوسط تباين متوسط قيم تنفس الميتوكوندريا عبر جميع التكرارات البيولوجية ويمكن استخدامه لحساب الاختلافات الإحصائية بين ملامح الطاقة الحيوية للميتوكوندريا.

قبل إجراء الفحص على المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية ، يجب تحديد كثافة الخلايا المثلى لخلايا MH-S للزراعة في لوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية لتحقيق طبقة أحادية من الخلايا في كل بئر. نظرا لأن التركيزات المناسبة من Oligo و FCCP لخلايا MH-S كانت بحاجة أيضا إلى تحديد ، فقد تم إجراء اختبارات لكثافة خلايا MH-S المختلفة مع التخفيفات التسلسلية ل Oligo و FCCP21،25. نتج عن الاستزراع الأولي ل 10,000-15,000 خلية MH-S طبقة أحادية من الخلايا عند التقاء 90٪ بعد 72 ساعة من التعرض مع وبدون EtOH10. بناء على تجارب التحسين هذه ، تم تحديد 2 ميكرومتر من Oligo و 0.5 ميكرومتر من FCCP لتكون الحد الأدنى من تركيزات هذه الكواشف التي تسببت في تغييرات في تنفس الميتوكوندريا10.

يتم استخدام مقاييس تنفس الميتوكوندريا في الوقت الفعلي عند خط الأساس وبعد العلاج باستخدام BPTES ، وهو مثبط للجلوتاميناز 1 ، والذي يمنع التحويل الأنزيمي للجلوتامين إلى غلوتامات ، لتحديد اعتماد الجلوتامين على التنفس القاعدي في خلايا MH-S المعرضة ل Con- و EtOH. يتمثل أحد قيود البيانات المقدمة في هذه الدراسة في أن أدوار الأحماض الدهنية قصيرة ومتوسطة السلسلة كمصادر للوقود لتنفس الميتوكوندريا والطاقة الحيوية ، بالإضافة إلى الجلوتامين في خلايا MH-S المعرضة ل EtOH ، لم يتم التحقيق فيها. أشارت نتائج الدراسة السابقة التي أجراها Crotty et al.11 إلى أن خلايا EtOH MH-S أظهرت تحولا من التنفس المعتمد على البيروفات إلى التنفس المعتمد على الجلوتامين دون تعويض كامل عن الخسارة في التنفس الكلي للميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، من خلال إجراء نفس التجربة مع حقن مشترك ل UK5099 (مثبط أكسدة البيروفات) والإيتوموكسير (مثبط أكسدة الأحماض الدهنية طويل السلسلة) ، يمكن تحديد مساهمة الجلوتامين في غياب كل من البيروفات والأحماض الدهنية كمصادر وقود لتنفس الميتوكوندريا في خلايا MH-S المعرضة ل EtOH.

تم قياس تنفس الميتوكوندريا باستخدام قطب كلارك لمدة سبعين عاما تقريبا26 عاما ، وهناك أيضا فحوصات مضان قائمة على الألواح لقياس تنفس الميتوكوندريا27. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تستغرق وقتا طويلا و / أو تفتقر إلى حساسية القياسات التي يمكن تحقيقها باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية. تتمثل ميزة استخدام المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية لتقييم الجلوتامين كمصدر للوقود لتنفس الميتوكوندريا والطاقة الحيوية في أنه يمكن إجراء تجارب على مكررات بيولوجية متعددة في نفس الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية بالمرونة لتجربة الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا السليمة. بالنسبة للخلايا التي لا تحتوي على تركيز عال من الميتوكوندريا، مثل خلايا العضلات الملساء للشريان الرئوي، فإن عزل كمية كافية من الميتوكوندريا من عينات محدودة يمثل تحديا. باستخدام المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية ، يمكن قياس تنفس الميتوكوندريا في خلايا العضلات الملساء للشريان الرئوي السليمة28 أو الفأر الأساسيAMs 10،11. يمكن استخدام البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة لتقييم الجلوتامين كمصدر وقود لتنفس الميتوكوندريا والطاقة الحيوية للعينات الأخرى ذات حجم العينة المحدود ، مثل AMs البشرية الأولية. لقد أظهرنا سابقا أن الإجهاد التأكسدي المشتق من الميتوكوندريا الناجم عن EtOH والاضطرابات في خلايا MH-S تظهر ملفا شخصيا مشابها لخلل تنظيم الميتوكوندريا في الفئران AMs الأولية و AMs البشرية6،7،11،28،29،30. بشكل جماعي ، تدعم الدراسات استخدام هذه الطريقة لتقييم الجلوتامين كمصدر للوقود لتنفس الميتوكوندريا والطاقة الحيوية في AMs في الظروف المرضية التي تتميز بالإجهاد التأكسدي المشتق من الميتوكوندريا.

الإفصاحات

ليس لدى جميع المؤلفين أي تضارب في المصالح المالية ذات الصلة للإبلاغ عنه.

شكر وتقدير

نحن نقدر مساهمات سارة س. تشانغ ، BS ، في زراعة الخلايا الأولية وإعداد خلايا MH-S للتجريب. تم دعم هذا العمل من قبل NIAAA R01-AA026086 إلى SMY (ORCID: 0000-0001-9309-0233) ، و NIAAA F31-F31AA029938 إلى KMC ، و NIGMS T32-GM008602 إلى راندي هول ، قسم علم الأدوية والبيولوجيا الكيميائية ، جامعة إيموري. لا تمثل محتويات هذا التقرير وجهات نظر وزارة شؤون المحاربين القدامى أو حكومة الولايات المتحدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنبوب مخروطي  شركة VWR الدولية، Inc.21008-670يستخدم لتحضير تركيزات المخزون من الكواشف المرتبطة بالميتوكوندريا.
2-mercaptoethanol شركة سيجما ألدريتشM6250يستخدم لزراعة خلايا MH-S.
مكشطة الخليةDot Scientific، Inc.70-1180تستخدم لكشط خلايا MH-S من قوارير T-75.
أداة الكونتيسة 3 FL: عداد الخلايايستخدم AMQAF2000 شركة فيشر العلميةلحساب عدد خلايا MH-S لإعداد التجارب.
د-الجلوكوز شركة سيجما ألدريتشG8270يستخدم لوسط قاعدة التدفق خارج الخلية.
الإيثانولفيشر العلمية4355720العلاج التجريبي لخلايا MH-S.
مصل الأبقار الجنينيمختبرات أبحاث ساينسل500تستخدم لزراعة خلايا MH-S.
جنتاميسينسيجما ألدريتشG1397يستخدم لزراعة خلايا MH-S.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061لوسط قاعدة التدفق خارج الخلية.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPadN / ASoftware للتحليل الإحصائي. يمكن تنزيله بعد الشراء في https://www.graphpad.com/features.
خلايا MH-S مجموعةالثقافة من النوع الأمريكيCRL-2019خط خلايا البلاعم السنخية للفأر.
أنبوب الطرد المركزي الدقيق الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، وشركة4036-3212تستخدم لتحضير تركيزات العمل من الكواشف المتعلقة بالميتوكوندريا.
Microsoft 365 Excel: برنامج جداول بيانات الكمبيوتربرنامج MicrosoftN / Aلتنظيم البيانات وحسابات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. يمكن تنزيله بعد الشراء في https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
15140122البنسلين / الستربتومايسينفيشر العلميةلزراعة خلايا MH-S.
ملحي مخزن بالفوسفاتVWR International، Inc.45000-446تستخدم لغسل خلايا MH-S.
RPMI-1640VWR الدولية، Inc.45000-396تستخدم لزراعة خلايا MH-S.
برنامج Seahorse Wave Pro: برنامج كمبيوتر لتصميم وتحليل الفحصAgilent Technologies، Inc.غير متاحالكمبيوتر متصل بأداة Seahorse XF Pro Analyzer. قابل للتنزيل من  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: وسط قاعدة التدفق خارج الخلية ، درجة الحموضة 7.4Agilent Technologies، Inc.103334-100تستخدم لإعداد المخزون وتركيزات العمل من الكواشف المرتبطة بالميتوكوندريا وزراعة خلايا MH-S قبل التشغيل التجريبي.
طقم اختبار إجهاد أكسدة الجلوتامين Seahorse XFAgilent Technologies، Inc.103674-100يحتوي على مخزون BPTES ، oligomycin ، FCCP ، وروتينون / أنتيمايسين A.
محلل Seahorse XF Pro: المحلل الحيوي للتدفق خارج الخليةAgilent Technologies، Inc.غير متاحمحلل حيوي للتدفق خارج الخلية.
Seahorse XFe96 FluxPak: خراطيش باك للتدفق خارج الخلية 96 بئر ، وألواح زراعة دقيقة للتدفق خارج الخلية 96 بئرا ، ومحلول العيارAgilent Technologies، Inc.102416-100تستخدم لتحضير خلايا MH-S للمقايسات باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية.
الماصة المصلية  شركة سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-550678يستخدم لإزالة الوسائط من خلايا MH-S.
بيكربونات الصوديومشركة سيجما ألدريتشS6014تستخدم لزراعة خلايا MH-S.
بيروفات الصوديوم شركة سيجما ألدريتشP4562يستخدم لوسط قاعدة التدفق خارج الخلية.
قوارير T-75 سانتاكروز للتكنولوجيا الحيوية، Inc.SC-200263تستخدم لزراعة خلايا MH-S.
شركة شركة يستخدم برنامج تستخدم شركة محلول

المراجع

  1. 2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021. , Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). At https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm (2021).
  2. Everts, R. J., et al. Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital. N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).
  3. de Roux, A., et al. Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia. Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).
  4. Moss, M. Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse. Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).
  5. Fernandez-Sola, J., et al. High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia. Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).
  6. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).
  7. Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).
  8. Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction. Biomed Res Int. 2014, 371593(2014).
  9. Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages. Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).
  10. Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4. Alcohol. 90, 27-38 (2021).
  11. Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype. Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).
  12. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  13. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  14. Chacko, B. K., et al. The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).
  15. Fan, Y., et al. Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology. STAR Protoc. 4 (1), 102073(2023).
  16. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).
  17. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  18. Winnica, D., et al. Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets. Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).
  19. Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity. Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).
  20. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  21. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health. Redox Biol. 10, 65-77 (2016).
  24. Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology. Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).
  25. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. 46, e2511(2010).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  27. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  28. Yeligar, S. M., et al. PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).
  29. Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199. J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).
  30. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Alcohol. 106, 30-43 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

أيض الغلوتامينالتعرض المزمن للإيثانولالتنفس الميتوكوندريتحلل الغلوتامينمعدل استهلاك الأكسجينالتنفس المرتبط بـ ATPخلايا MHSمثبط BPTES
تقييم الجلوتامين كمصدر للوقود للبلاعم السنخية المعرضة للإيثانول المزمن باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.