فحوصات التألق المناعي الآلي المتعدد الإرسال عالية الإنتاجية للأبحاث الانتقالية

Kevin Hwang; Alex Veith; Lauren Duro; Douglas Wood; Gourab Chatterjee; Yvette Cajigas; Je H. Lee; Angela Vasaturo

doi:10.3791/67584

مقالة منهجية

فحوصات التألق المناعي الآلي المتعدد الإرسال عالية الإنتاجية للأبحاث الانتقالية

DOI:

10.3791/67584

⸱

يونيو 10, 2025

Kevin Hwang^*¹ , Alex Veith^*¹ , Lauren Duro^*¹ , Douglas Wood¹ , Gourab Chatterjee¹ , Yvette Cajigas¹ , Je H. Lee¹ , Angela Vasaturo¹

¹Ultivue, Inc.

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التقرير بروتوكولا آليا لمقايسات التألق المناعي المتعدد الإرسال (mIF) على صبغة منزلقة آلية. إنه يوضح قابلية التكرار العالية للبروتينات المكانية على أجهزة الطلاء الذاتي للأنسجة القياسية عالية الإنتاجية وأجهزة تصوير التألق ذات الشريحة الكاملة ، وهو مثالي لمقايسات mIF المخصصة عبر عدد كبير من شرائح الأنسجة في البحث الانتقالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التألق المناعي متعدد الإرسال (mIF) هو تقنية متقدمة تسمح بتحليل مفصل وحلل مكانيا لعينات الأنسجة من خلال تصور مؤشرات حيوية متعددة للبروتين داخل قسم واحد. ومع ذلك ، تواجه معظم تقنيات mIF مقايضات كبيرة بين الحساسية والإنتاجية عند تعدد الإرسال ، مما يشكل قيدا خطيرا للكشف القوي عن المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة عبر أقسام متعددة من الأنسجة. يستخدم نهج جديد ل mIF الرموز الشريطية الفريدة للحمض النووي المرتبطة بالأجسام المضادة ، والتي يتم تضخيمها من خلال آلية تضخيم متوازية أحادية الجزيء. تحقق هذه الطريقة جودة تلطيخ يمكن مقارنتها بدرجة عالية من الكيمياء المناعية السريرية (IHC) مع توفير قدرات تعدد إرسال عالية وتصوير عالي الإنتاجية للشريحة الكاملة. يتضمن هذا الاختبار تضخيم مزيج من الأجسام المضادة المشفرة للحمض النووي على الأنسجة ، متبوعة بجولات متسلسلة من خطوات الكشف لتصور أربعة قليل النوكليوتيدات المسمى بالفلورسنت في كل دورة. وبالتالي تتيح هذه العملية اكتشاف ثمانية أو أكثر من المؤشرات الحيوية لكل عينة من الأنسجة. تشمل الخطوات الرئيسية في هذه الطريقة التحضير الآلي للأنسجة ، وتطبيق الأجسام المضادة الأولية المقترنة بالرموز الشريطية للحمض النووي ، وتضخيم الإشارة ، والدورات التكرارية للكشف والتصوير وإزالة الإشارة. يتبع الحصول على الصور تسجيل الصور وتحليل الخلية الواحدة باستخدام منصة علوم بيانات الصور المكانية المحسنة الذكاء الاصطناعي. في هذه الدراسة ، تم تطبيق البروتوكول على المصفوفات الدقيقة متعددة الأنسجة (TMAs) المثبتة بالفورمالين والبارافين (FFPE) ، بما في ذلك اللوزتين والورم الميلانيني والقولون والعقدة الليمفاوية في ثلاث نسخ. توفر تقنيات mIF المتقدمة مزيدا من الأفكار حول استجابة الورم والبيئة الدقيقة للورم والمشهد المناعي. من خلال التغلب على المقايضات المتأصلة بين الحساسية وقدرات تعدد الإرسال وإنتاجية التصوير ، يمكن للباحثين الآن أن يهدفوا إلى فهم عدم تجانس التوقيعات الجزيئية الصعبة والمؤشرات الحيوية للاستجابات العلاجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التألق المناعي عالي الإرسال (mIF) هو تقنية متقدمة تحدث ثورة في مجال تحليل الأنسجة من خلال تمكين التصور المتزامن للمؤشرات الحيوية البروتينية المتعددة داخل قسم نسيج^{واحد 1}^،². توفر هذه القدرة مستوى لا مثيل له من التفاصيل والدقة المكانية ، والتي غالبا ما تكون حاسمة لفهم التفاعلات بين أنواع الخلايا ذات الأشكال المعقدة داخل البيئة المكروية للأنسجة عبر مقاييس مكانية متعددة³. هذه التقنية ذات قيمة خاصة في أبحاث الأورام ، حيث يمكن استخدامها للمشاركة في تحديد المؤشرات الحيوية للورم ، وأهداف الأدوية البروتينية ، وحالة المناعة ونقطة التفتيش المحلية ، والتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة ، وحتى أنماط التموضع الخلوي المتعلق بعملية التمثيل الغذائي للدواء داخل الأنسجة⁴^،⁵^،⁶.

على الرغم من إمكاناتها ، لا تزال معظم تقنيات mIF تواجه تحديات كبيرة ، لا سيما في موازنة الحساسية والإنتاجية مع قدرات تعدد الإرسال. هذا القيد مهم بشكل خاص للكشف عن المؤشرات الحيوية السريرية التي يمكن أن تظهر تعبيرا منخفضا جدا مثل HER2 و PD-L1⁷^،⁸^،⁹. لمعرفة سبب ذلك ، من الضروري فهم الطرائق الأخرى ل mIF. مهدت هذه الأساليب التقليدية الطريق لمنصات mIF أكثر تطورا ، لكنها تأتي مع مجموعات من المزايا والقيود الخاصة بها.

يستخدم التألق المناعي المباشر (DIF) أجساما مضادة مترافقة مباشرة مع الفلوروفورات ، أو إلى قليل النوكليوتيد القادر على تجنيد الفلوروفورات¹⁰. هذه الطريقة سهلة الاستخدام ولكنها تعاني من حساسية أقل وصعوبة في حل الإشارة من خلفية الأنسجة أو تلطيخ القطع الأثرية.

يستخدم التألق المناعي غير المباشر (IIF) جسما مضادا ثانويا يرتبط بالجسم المضاد الأساسي. وقد أدى ذلك إلى زيادة الإشارة مقارنة ب DIF الأساسي. عند دمجها مع تصميمات خلايا التدفق المحسنة ، يمكن ل IIF المتسلسل اكتشاف ما يصل إلى 40 مؤشرا حيويا في اختبار^{واحد 2}^،¹¹. ومع ذلك ، لا تزال هذه تعاني من نقص نسبي في الحساسية مقارنة بالاستراتيجيات القائمة على الإنزيم لتضخيم الإشارة ، مثل تلك الموجودة في تقنيات الكيمياء المناعية (IHC).

غالبا ما يظهر التألق المناعي القائم على تحفيز الإنزيم في طرق IHC باستخدام بيروكسيداز الفجل (HRP) لترسيب صبغة الكروموجين (DAB) أو الفلورسنت (على سبيل المثال ، تضخيم إشارة التيراميد (TSA)). نظرا لأن هذه المقايسات تستند إلى نفس الإنزيم التحفيزي ، فإن حساسية الكشف عنها متشابهة ، مما يجعل فحوصات mIF المستندة إلى TSA متعددة الأطياف مناسبة للتطبيقات السريرية²^،¹². تتمثل ميزة تضخيم الإشارة المستندة إلى الحمض النووي في الدرجة العالية من تعدد الإرسال الممكنة مع الاحتفاظ بتضخيم الإشارة الممتاز والنمطية. في المقابل ، فإن الطرق المستندة إلى HRP أقل نمطية ويصعب تحسينها ، مما يتطلب دورات إضافية لتطوير اللوحة والاختبار.

التألق المناعي للأجسام المضادة المشفرة بالحمض النووي
يستخدم اختبار mIF الموضح هنا بوليميراز الحمض النووي لتضخيم الأجسام المضادة المشفرة للحمض النووي في وقت واحد ، متبوعة بدورات من تلطيخ مسبار المراسل وإزالة البقع باستخدام أربعة قليل النوكليوتيدات الفلورية لكل جولة تصوير (الشكل 1).

figure-introduction-1
الشكل 1: رسم توضيحي لبروتوكول فحص التألق المناعي متعدد الإرسال. تتم إضافة الأجسام المضادة المترافقة بالباركود في خطوة واحدة ، ويتم تضخيم الرموز الشريطية في وقت واحد. تتم إضافة مجموعات من أربعة مجسات فلورية في كل دورة ، مما يسمح بتصور أربع علامات في وقت واحد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تعمل إضافة الجسم المضاد أحادي الجولة والتضخيم أحادي الخطوة على تبسيط بروتوكول الفحص إلى حد كبير. يتم تسهيل العملية من خلال أنظمة التلوين والمسح الضوئي الآلية عالية الإنتاجية ، والتي تضمن نتائج قابلة للتكرار من الشريحة إلى الشريحة ومن دفعة إلى دفعة عبر عدد كبير من العينات المستخدمة في الدراسات السريرية¹³.

تتمثل إحدى المزايا الأساسية لهذه التقنية في قدرتها على الحفاظ على حساسية عالية مع السماح بمضاعفة الإرسال^{الواسعة النطاق 2}. يضمن سير العمل أيضا أن يظل إنتاجية التصوير مرتفعا ، وبالتالي يعالج أحد القيود الرئيسية لتقنيات mIF متعددة الإرسال (على سبيل المثال ، > 8 مؤشرات حيوية) للدراسات السريرية. هذا مهم بشكل خاص في البحث السريري ، حيث يمكن أن توفر الاختلافات الطفيفة في أهداف الأدوية منخفضة الوفرة (على سبيل المثال ، HER2 المنخفض) عبر المرضى رؤى مهمة حول الاستجابة العلاجية.

بالإضافة إلى هذه السمات الرئيسية ، يوفر هذا الاختبار أيضا قابلية تكوين اللوحة ، وقدرات تصوير الشريحة الكاملة عالية الإنتاجية ، والدقة البصرية اللازمة للتحقيق في العمليات والمقصورات تحت الخلوية ، بالإضافة إلى النتوءات الخلوية المرتبطة بالبلاعم والخلايا المتغصنة. تعد القدرة على التحقيق في الأنماط الظاهرية الخلوية المعقدة عبر المقاييس المكانية المتعددة ميزة حاسمة للتصوير البصري مقابل الطرق القائمة على قياس الكتلة الخلوية (IMC)².

في هذا العمل ، يتم تقديم بروتوكول لمقايسة mIF 8-plex باستخدام أداة قياس تلقائية وماسح ضوئي للشريحة الكاملة. يتضمن هذا الاختبار لوحة من ثمانية أجسام مضادة أساسية: CD3 و CD4 و CD8 و CD68 و FOXP3 و PD-1 و PD-L1 و Pan-Cytokeratin¹⁴. ستسمح لوحة العلامات هذه بالتنميط المناعي لأنسجة الورم وتحديد الخلايا الموجودة في بيئة الورم أو السدى. يستخدم هذا البروتوكول صبغة منزلقة آلية للتلوين الأولي وجولات تبادل المسبار ، ويمكن إكمال التلوين والتصوير في غضون يومين. يتم أيضا عرض طرق التحقق من صحة مقايسة mIF وإجراء تحليل للصور الناتجة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن تتبع جميع التجارب إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري المؤسسية. تم الحصول على جميع أقسام الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول من مزود أنسجة خارجي.

1. تحضير عينة الأنسجة

حدد كتلة أنسجة FFPE لتلطيخها باستخدام مقايسة mIF. في حالة استخدام شرائح مناديل FFPE ، تأكد من أن العينات يتراوح سمكها بين 3-5 ميكرومتر ، ومثبتة على شرائح زجاجية موجبة الشحنة ، وخالية من التجاعيد أو التمزقات الأخرى التي يمكن أن تؤثر سلبا على النتائج النهائية.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، تجنب تلطيخ عينات الأنسجة التي تم تقطيعها قبل أكثر من شهرين. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب الكتل التي تم تخزينها لأكثر من 10 سنوات أو التي تبدو جافة بصريا.
إذا كنت تعمل مع كتل الأنسجة FFPE ، فاستخدم ميكروتوما لقطع العدد المطلوب من شرائح الأنسجة بسمك 4 ميكرومتر ، وتركيب الشرائح على شريحة زجاجية موجبة الشحنة. لتحقيق النتائج الأكثر اتساقا ، قم بتركيب جميع الشرائح في نفس الاتجاه. تأكد من خلو الأنسجة من التجاعيد والدموع.
إذا لم يتم تلطيخ العينات على الفور ، فقم بتخزينها في صندوق منزلق تحت النيتروجين لمدة تصل إلى شهرين.

2. تسجيل الكواشف المساعدة والأجسام المضادة الأولية للإعداد الأولي

داخل برنامج autostainer ، انتقل إلى علامة التبويب إعداد الكاشف في الجزء العلوي من الشاشة. انقر فوق إضافة لإضافة كواشف جديدة.
ستستخدم فحوصات التلوين والتبادل تسع حاويات كاشف ، وفقا للمعلومات الموجودة في الجدول 1. لاستخدامها، على سبيل المثال، للكاشف الأول المسمى Wash Buffer، مع الاسم المختصر ISPWsh1، اتبع الخطوات. حدد النوع كمساعد، وتحقق من إدراج كل من *BWash وDI ضمن الكميات المتوافقة. حدد المربع المفضل قبل الحفظ.
كرر هذه العملية للكواشف المساعدة المتبقية ، باستخدام الأسماء والأسماء المختصرة الموجودة في الجدول 1.
1. كاشف محلول التضخيم (ULTAmp1) غير متوافق مع Bond Wash. في نافذة إعداد الكاشف لهذا الغرض، يرجى تحديد *BWash والنقر فوق الزر << لنقل هذا الكاشف من قائمة الكواشف المتوافقة وإلى قسم الكاشف المتاح. قد يؤدي عدم إزالة Bond Wash ككاشف متوافق لكاشف محلول التضخيم إلى انخفاض كبير في أداء تلطيخ المقايس.
بمجرد تسجيل جميع حاويات الكاشف، قم بإنشاء مجموعة أدوات الكشف عن الأبحاث قبل بدء التشغيل الأولي. ستحتاج مجموعة الكشف إلى حاوية معايرة واحدة سعة 30 مل.
أضف حاوية المعايرة بالتحليل الحجمي سعة 30 مل إلى مجموعة الكشف. لمنع فصل الاثنين، ألصق حاوية المعايرة بالتحليل الحجمي على العصا.
امسح الرمز الشريطي الموجود على الجانب الأيسر من مجموعة أدوات الكشف. في النافذة المنبثقة اللاحقة، قم بتسمية مجموعة أدوات الكشف (على سبيل المثال، InSituPlex Kit). قم بتعيين تاريخ انتهاء الصلاحية إلى 10 سنوات من تاريخ التسجيل.
ملاحظة: تاريخ انتهاء الصلاحية المحدد هنا ليس التاريخ المدرج في الكاشف ولكنه تاريخ انتهاء صلاحية الكاشف في حاوية المعايرة بالتحليل الحجمي. يضمن تحديد تاريخ انتهاء الصلاحية في المستقبل البعيد أن المجموعة لن تنتهي صلاحيتها دون داع.
بالنسبة لموضع الكاشف الأول للمجموعة، حدد Wash Buffer ككاشف من القائمة المنسدلة.
انقر فوق حقل الرمز الشريطي لموضع الكاشف هذا وامسح الرمز الشريطي لحاوية المعايرة بالتحليل الحجمي المسجلة سعة 30 مل لتسجيل هذه الحاوية كمخزن مؤقت للغسيل وربط حاوية الكاشف بعصا الكشف.
بمجرد ربط حاوية المعايرة بالتحليل الحجمي بالمجموعة ، انقر فوق الزر إضافة لحفظ النافذة المنبثقة وإغلاقها.
املأ حاوية المعايرة بالتحليل الحجمي ب 30 مل من 1x Bond Wash واحفظها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية بين عمليات التلوين.

الجدول 1: الكواشف المساعدة للإعداد. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

3. إعداد البروتوكول الأولي

بعد التسجيل الناجح لجميع حاويات الكاشف ، انتقل إلى علامة التبويب إعداد البروتوكول في الجزء العلوي من شاشة برنامج autostainer.
قم بتأكيد إصدار البرنامج الذي يتم تشغيله حاليا بالنقر فوق الشعار في أعلى يمين الشاشة. ستعرض النافذة المنبثقة الناتجة إصدار البرنامج المثبت حاليا تحت عنوان معلومات البرنامج.
إذا كان البرنامج هو الإصدار 7.0 أو أحدث ، فسيكون هناك قالب مثبت مسبقا لبروتوكول التلوين. في الجزء السفلي من الشاشة، تحقق من تعيين تحديد الحالة المفضلة إلى الكل. قم بتسمية بروتوكول القالب * مقايسة تلطيخ ISP. بالنسبة للإصدارات السابقة من البرامج ، يمكن العثور على البروتوكول في الجدول 2.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق * مقايسة تلطيخ مزود خدمة الإنترنت وانسخ البروتوكول. في النافذة المنبثقة الناتجة ، أعد تسمية البروتوكول Staining Assay 1 بالاسم المختصر (ISP_IHC1)
ضمن نظام الكشف المفضل، حدد النظام الذي تم إنشاؤه أثناء إعداد الكاشف الأولي في الخطوة 2.6.

الجدول 2: بروتوكول بروتوكول تلطيخ التألق المناعي متعدد الإرسال. * يتوافق MARKER مع محلول الجسم المضاد ، ويتوافق Wash Buffer مع محلول BOND Wash. جميع الكواشف المساعدة الأخرى لها مكونات المجموعة المسماة في المقابل. يتوافق هذا البروتوكول مع الإصدار 7.0 والإصدارات الأحدث BXD 39 والإصدارات الأحدث. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

4. إعداد الكاشف

قم بإذابة جميع كواشف المجموعة باستثناء اقتران الأجسام المضادة ، وإنزيم التضخيم ، وبادئ التبادل ، ومعادل التبادل في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين باقي مكونات المجموعة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
إذا لم يتم ذلك بالفعل، فقم بتسجيل حاوية معايرة بالتحليل الحجمي الجديدة لكل من الكواشف المحددة في الخطوة 2.3. ضع حشوة معايرة بالتحليل الحجمي الجديدة في كل منها.
خذ نظام الكشف عن الأبحاث المسجل في الخطوة 2.6 وتأكد من ملء حاوية الغسيل العازلة المرتبطة بها حتى 30 مل بمحلول غسيل 1x Bond. ضع حاويات المعايرة بالتحليل الحجمي لكل كاشف في النظام.
تحضير Ab المخفف في الحاوية المقابلة. الحجم المطلوب هو 350 + (150 ميكرولتر × عدد الشرائح) ويتكون من مخفف الجسم المضاد على النحو المنصوص عليه. دوامة المخزن المؤقت للخلط بعد الذوبان.
تحضير محلول تلطيخ الجسم المضاد في محلول تلطيخ الجسم المضاد 1 عبوة. أضف جميع الأجسام المضادة عند تخفيف 1: 100 في مخفف الجسم المضاد المقدم. الحجم المطلوب هو 350 + (150 ميكرولتر × عدد الشرائح). لا تقم بتدوير مخزون الأجسام المضادة أو محلول تلطيخ الجسم المضاد الكامل ، واخلطه عن طريق سحب العينة فقط.
قم بإعداد مزيج التضخيم المسبق في حاوية مزيج التضخيم المسبق. الحجم المطلوب هو 350 + (150 ميكرولتر × عدد الشرائح) ويتكون من مزيج ما قبل التضخيم على النحو المنصوص عليه. دوامة هذا الحل بعد الذوبان.
قم بإعداد محلول التضخيم في حاوية محلول التضخيم. الحجم المطلوب هو 350 + (150 ميكرولتر × عدد الشرائح) ، وهو يتألف من إنزيم تضخيم مخفف 1:10 في المخزن المؤقت للتضخيم. لا تقم بتدوير إنزيم التضخيم أو محلول التضخيم المكتمل، أو تخلط عن طريق سحب العينة فقط.
قم بإعداد بقعة نواوية في حاوية نواوية. الحجم المطلوب هو 350 + (300 ميكرولتر × عدد الشرائح) ويتكون من محلول البقع النووية المقدم المخفف بنسبة 1:100 في ماء فائق النقاء. تخلط عن طريق الدوامة.
قم بإعداد مزيج مجسات الفلورسنت المقابلة للجولة الأولى من التصوير في حاوية مسبار الفلورسنت. الحجم المطلوب هو 350 + (450 ميكرولتر × عدد الشرائح) ، يتكون من مجسات الفلورسنت 1 محلول مخفف 1:20 داخل المخزن المؤقت للمسبار. دوامة المكونات بعد الذوبان وكذلك الخليط الكامل النهائي.
بمجرد تحضير جميع الكواشف ووضعها في الحاويات المقابلة لها ، ضع عصا الكاشف الكاملة في البرنامج للسماح بقياس حجم الكاشف.

5. تشغيل الإعداد

بمجرد تحضير جميع الكواشف ، انتقل إلى علامة التبويب إعداد الشريحة في الجزء العلوي من البرنامج وحدد الزر دراسة جديدة . أضف معرف الدراسة واسم الدراسة وتعليقات الدراسة حسب الرغبة. راجع الشكل 2 كمثال.
ضمن حجم التوزيع ، حدد 150 ميكرولتر و * إزالة الشمع من 4 خطوات كبروتوكول تحضير. إذا لم تظهر *إزالة الشمع 4 خطوات في القائمة المنسدلة، فحدد موقع هذا البروتوكول في قائمة إعداد البروتوكول وحدد المربع المفضل . اضغط على موافق.
بمجرد إنشاء الدراسة ، حدد الزر إضافة شريحة على الجانب الأيمن من شاشة إعداد الشريحة. ضمن تعليقات الشرائح، قم بتسمية الشريحة بشكل فريد.
بالنسبة للحقول الإضافية في هذه الشاشة ، اضبط نوع الأنسجة على اختبار الأنسجة واضبط حجم التوزيع على 150 ميكرولتر مع وضع التلوين مفرد في القائمة المنسدلة اليسرى والروتين في القائمة المنسدلة اليمنى. أثناء العملية ، حدد IHC ، مع كون العلامة هي محلول تلطيخ الأجسام المضادة.
ضمن قسم البروتوكول في نافذة إضافة شريحة ، حدد فحص التلوين 1 للتلطيخ ، * إزالة الشمع 4 خطوات كتحضير ، و * HIER 20 دقيقة مع ER2 كHIER. سيبقى بروتوكول الإنزيم *----. بمجرد اكتمال ذلك ، انقر فوق إضافة شريحة. راجع الشكل 2 كمثال.
كرر هذه العملية حسب الحاجة لعدد الشرائح التي سيتم تشغيلها في الدراسة، مع التأكد من تحديث حقل "تعليقات الشرائح" لكل شريحة تمت إضافتها بحيث يمكن تحديدها بشكل فريد لاحقا. بعد إضافة جميع الشرائح، أغلق نافذة إضافة شريحة واطبع كافة التسميات، وألصقها على أقسام المناديل المقابلة لها.
قم بتحميل كل شريحة على الدرج وضع بلاط الغطاء أعلى كل قسم قبل تحميل الدرج على البرنامج. بمجرد إضافة الكواشف والشرائح ، حدد ملف صبغة تلقائية مقابلة على الجانب الأيمن من البرنامج. بمجرد تحديد هذا ، ستكون جميع صواني الشرائح الثلاثة والمعلومات الخاصة بجميع الكواشف الموجودة على البرنامج مرئية ، بما في ذلك الكواشف المجمعة وتلك المضافة أثناء إعداد الكاشف.
تأكد من ملء حاويات الكاشف السائب، وأن حاويات النفايات لديها حجم كاف متبقي لإكمال التشغيل، ثم اضغط على زر التشغيل لبدء التشغيل.
يستغرق كل تشغيل حوالي 5 ساعات و 15 دقيقة حتى يكتمل. قم بتدوين وقت التوقف وتأكد من إزالة الشرائح من autostainer على الفور بمجرد الانتهاء من البروتوكول.

figure-protocol-1
الشكل 2: مطالبات للبرنامج. (أ) مطالبة دراسة جديدة على برنامج Autostainer ، توضح الإعدادات الصحيحة لبروتوكول تلطيخ التألق المناعي متعدد الإرسال (mIF). (ب) إضافة موجه الشريحة على البرنامج ، مع إظهار الإعدادات الصحيحة لبروتوكول تلطيخ mIF. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. التصوير

بعد اكتمال بروتوكول التلوين ، قم بإزالة الشرائح الملطخة والغطاء في وسط التثبيت. اسمح لوسط التثبيت بالمعالجة في الظلام حتى يتم تثبيت الغطاء بإحكام في مكانه (عادة 1 ساعة أو أكثر ، نقطة الإيقاف المؤقت).
تنزلق الصورة على مجهر مضان أو ماسح ضوئي كامل الشريحة مع مرشحات مناسبة للمقايس. عادة ما تكون الأصباغ المستخدمة في هذا الاختبار متوافقة مع مرشحات DAPI و FITC و TRITC و Cy5 و Cy7.
ستظهر الصور مشابهة لتلك الموجودة في الشكل 3 أ. تأكد بصريا من أن جميع مناطق الأنسجة في بؤرة التركيز بشكل صحيح وأن الإشارات تظهر بمستوى شدة مناسب (وليس مفرط / غير معرض). إذا لزم الأمر، أعد تصوير الشرائح بإعدادات تعريض ضوئي مختلفة.
بعد التصوير ، إذا كانت جولة إضافية من التصوير ضرورية ، فقم بنقع الشرائح في 1x PBS حتى تسقط الأغطية من تلقاء نفسها. (نقطة الإيقاف المؤقت)

7. الإعداد الأولي لبروتوكول Exchange

إذا كان البرنامج هو الإصدار 7.0 أو أحدث ، فسيكون هناك قالب مثبت مسبقا لبروتوكول autostainer. في الجزء السفلي من الشاشة، تحقق من تعيين تحديد الحالة المفضلة إلى الكل. سيتم تسمية بروتوكول القالب * ISP Signal Exchg. بالنسبة للإصدارات السابقة من البرمجيات ، يمكن العثور على البروتوكول في الجدول 3.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق * ISP Signal Exchg وانسخ البروتوكول. في النافذة المنبثقة الناتجة ، أعد تسمية البروتوكول Exchange Protocol 1 بالاسم المختصر ISPEXCH1. تأكد من تحديد المربع المفضل قبل المتابعة وقم بتعيين نفس اسم المجموعة كما هو محدد في الخطوة 2.6.

الجدول 3: بروتوكول بروتوكول تبادل إشارات التألق المناعي متعدد الإرسال. يتوافق Wash Buffer مع محلول BOND Wash. جميع الكواشف المساعدة الأخرى لها مكونات المجموعة المسماة في المقابل. يتوافق هذا البروتوكول مع الإصدار 7.0 والإصدارات الأحدث BXD 39 والإصدارات الأحدث. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

8. إعداد بروتوكول Exchange وتشغيله

قم بإذابة المخزن المؤقت للتبادل في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بمعادل التبادل وبادئ التبادل عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. هناك حاجة إلى حاويتين للمعايرة بالتحليل الحجمي للكاشف ومجموعة أدوات الكشف لتنفيذ بروتوكول التبادل.
قم بإعداد محلول التبادل في الحاوية المقابلة. الحجم المطلوب هو 350 + (450 ميكرولتر × عدد الشرائح) ، وهو يتألف من بادئ تبادل مخفف 1: 500 في المخزن المؤقت للتبادل. لا تقم بتدوير إنزيم التبادل أو محلول التبادل المكتمل، واخلطه عن طريق سحب العينات فقط.
قم بإعداد مزيج مجسات الفلورسنت الثاني في حاوية مجسات الفلورسنت 2. الحجم المطلوب هو 350 + (450 ميكرولتر × عدد الشرائح) ويتكون من مجسات الفلورسنت 2 محلول مخفف 1:20 ومعادل التبادل المخفف 1:40 داخل المخزن المؤقت للمسبار 2. قد يكون مزيج المسبار الفلوري والمخزن المؤقت للمسبار دوامة ، ولكن يجب أن يكون محايد التبادل والمحلول المركب النهائي مختلطين فقط ماصة.
بمجرد تحضير جميع الكواشف ، ضع العصا الكاملة على آلة التصبغ التلقائي واترك الكواشف تختبر الغمس بواسطة الماكينة.
أضف جميع الشرائح باتباع الخطوة 5. أثناء إضافة الشريحة، قم بتغيير العلامة إلى *سلبي. بالنسبة للتحضير و HIER و Enzyme ، حدد خيار * ---- ، حيث لا يلزم إزالة الشمع أو استرجاع المستضد لبروتوكول التبادل. بمجرد اكتمال ذلك ، انقر فوق إضافة شريحة.
كرر هذه العملية حسب الحاجة لعدد الشرائح التي سيتم تشغيلها في الدراسة، مع التأكد من تحديث حقل "تعليقات الشرائح" لكل شريحة تمت إضافتها بحيث يمكن تحديدها بشكل فريد لاحقا.
بعد إضافة جميع الشرائح، أغلق نافذة إضافة شريحة واطبع كافة التسميات، وألصقها على أقسام المناديل المقابلة لها.
قم بتحميل كل شريحة على الدرج وضع بلاط الغطاء أعلى كل قسم قبل تحميل الدرج على البرنامج.
بمجرد إضافة جميع الكواشف والشرائح ، حدد ملف Autostainer المقابل في البرنامج ؛ سيكون هذا على الجانب الأيمن. بمجرد تحديد هذا ، ستكون جميع صواني الشرائح الثلاثة والمعلومات الخاصة بجميع الكواشف الموجودة على البرنامج مرئية ، بما في ذلك الكواشف المجمعة وتلك المضافة أثناء إعداد الكاشف.
تأكد من ملء حاويات الكاشف السائبة وأن حاويات النفايات لديها حجم كاف متبقي لإكمال التشغيل.
بعد تأكيد ذلك ، اضغط على زر التشغيل لبدء التشغيل. يستغرق البروتوكول حوالي 90 دقيقة حتى يكتمل. قم بتدوين وقت التوقف وتأكد من إزالة الشرائح على الفور بمجرد اكتمال التشغيل.

9. التصوير

كرر التصوير للجولة الجديدة من المجسات، كما في الخطوة 5. ستظهر الصور كما في الشكل 3 ب.

10. التراص (لتصوير البروتين >4-plex)

ستتوفر الآن صور متعددة لنفس الشريحة. ادمج الصور في برنامج التسجيل المشترك للصور لإنشاء صورة مكدسة 8 بلكس.
شارك في تسجيل صور كل جولة على النحو التالي.
1. تتم تسمية كل صورة مستديرة على النحو التالي: _ حيث هو الاسم الفريد للشريحة (الرمز الشريطي) و هي سلسلة ، عند فرزها أبجديا ، ستضع صورة الجولة 1 أولا ، والصورة المستديرة 2 ثانيا. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى = 1234ABC ، يمكن تسمية الملفات 1234ABC_Round1 و 1234ABC_Round2 ، مع وجود جميع الملفات لها الامتداد المناسب (على سبيل المثال ، .czi) للماسح الضوئي. ضع جميع الصور المستديرة في مجلد واحد يسمى على سبيل المثال ، الصور المصدر.
2. داخل برنامج التسجيل المشترك ، انقر فوق الزر "تعيين " في قسم دليل الصور المصدر بواجهة المستخدم وعندما يطلب منك ذلك ، حدد ملف المجلد الذي تم إنشاؤه أعلاه.
3. قم بتعيين نوع الملف في قسم الصور المصدر إلى امتداد الصور المصدر (على سبيل المثال ، .czi ، .qtiff ، إلخ). سيعرض البرنامج الآن الصورتين المستديرتين معا في جدول يوضح أن الشريحة 1234ABC تحتوي على صورتين دائريتين.
4. إذا رغبت في ذلك، قم بتعيين موقع الصور المكدسة الناتجة إلى دليل مختلف عن مجلد الصور المصدر باستخدام الزر Set في قسم دليل الصور المكدسة في واجهة المستخدم وعند سؤالك، اختر مجلد الإخراج المطلوب . وإلا، سيتم استخدام مجلد الصور المصدر افتراضيا.
5. بشكل افتراضي، يتم إنشاء تمثيل ملف .afi فقط للمكدس. حدد خيار حفظ ملف OME.tif للمكدس بأكمله في قسم خيارات المعالجة في الواجهة.
6. للتحقق من دقة التسجيل المشترك على العينة بأكملها، حدد خيار التحقق من الصحة في قسم الإخراج من الواجهة.
7. اضغط على زر START لبدء التسجيل المشترك للصورة.

11. تحليل الصور

بعد تصوير الشرائح، قم بتصور الشرائح وتحليلها باستخدام أي طريقة تحليل تختارها، مثل مجموعة معالجة الصور STARVUE من Ultivue أو QuPath¹⁵.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باتباع البروتوكول أعلاه ، سيتم تلطيخ أنسجة FFPE بأهداف متعددة ، وتم الحصول على صور عالية الجودة لجميع العلامات في مجموعات من أربعة (الشكل 3 أ ، ب). سيسمح برنامج التسجيل المشترك للصور بدمج الصور من نفس الشريحة وتسجيلها بشكل مشترك ، كما هو موضح في الشكل 3C. تظهر نتائج مماثلة في الشكل 4 لشريحة أنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC).

وينبغي تحديد نجاح البروتوكول من خلال تقييم نمط التلوين المتوقع. في مثال CRC الموضح ، يتم التعبير عن كل هدف من الأهداف الملطخة في الحيز تحت الخلوي المتوقع ، على سبيل المثال ، FoxP3 النووي ، CD3 الغشائي ، CD68 السيتوبلازمي (الشكل 4B-D). يتم التعبير عن كل هدف من الأهداف الوظيفية على نوع الخلية المناسب ، كما يتضح من مثال التوطين المشترك ل PD1 و CD3 أو PDL-1 و CD68 ، والتي تظهر الخلايا التائية المستنفدة والضامة المثبطة للمناعة ، على التوالي. عادة ما يتم إجراء تقييم نسبة الإشارة إلى الخلفية الجيدة ، مما يسمح بالتمييز الناجح للإشارة الإيجابية الحقيقية من ضوضاء الخلفية المحتملة ، نوعيا من قبل علماء الأمراض أو خبراء تحليل الصور الذين يؤكدون جودة التلوين ، مما يسمح بتحليل الصور بنجاح. لمزيد من التأكيد على جودة التلوين والأداء ، يمكن إضافة مقارنة بالمعيار الذهبي IHC (DAB الكروموجينيك) على الأقسام التسلسلية (انظر المثال في الشكل 5) ، بالإضافة إلى عينة من أنسجة التحكم الإيجابية مثل اللوزتين البشرية والتي يمكن أن تكون مفيدة لمعظم الأهداف المناعية لتأكيد نجاح تشغيل التلوين. لاحظ أن السرطانات قد تظهر تعبيرا أقل عن الأهداف من اللوزتين^{البشرية 16}.

بعد تأكيد النتائج نوعيا ، يمكن إجراء التحليل الكمي. في هذا العمل ، يتكون هذا بشكل أساسي من حساب كثافة الخلايا للأنماط الظاهرية المختلفة (عدد الخلايا / مم²) التي تعبر عن هدف أو أهداف معينة ، بالإضافة إلى حساب متوسط مستويات شدة الأهداف الوظيفية التي يمكن أن تظهر نطاقا ديناميكيا واسعا من التعبير. عند تقييم دقة فحوصات mIF ، يجب أن تظهر المقاطع التسلسلية الملطخة بنفس العلامات إشارات قابلة للمقارنة بين الشرائح ، والتي يمكن رؤيتها نوعيا في الشكل 6. مثال على النتائج الكمية لكثافة العلامة المفردة في أنواع الأنسجة المختلفة موضحة في الشكل 7. يتيح تحليل الصور على هذه الصور تحديد الخلايا الموجبة ، ويمكن حساب كثافة الخلية الموجبة المقابلة لكل علامة ، بالإضافة إلى متوسط شدة الإشارة لكل خلية موجبة. يسمح هذا بحساب معامل التباين (CV) لكل علامة لتقييم دقة مقايسة تعدد الإرسال (الجدول 4).

figure-results-1
الشكل 3: صور لنواة المصفوفة الدقيقة للأنسجة (TMA) التي تم الحصول عليها من جولات متتالية من التلوين في بروتوكول التألق المناعي 8-plex. (أ) الصورة التي تم الحصول عليها من الجولة الأولى من التصوير ، والتي تتميز بعلامات CD8 و PD1 و PD-L1 و CD68. بعد بروتوكول التبادل ، يعرض (B) الجولة الثانية من التصوير على نفس الشريحة للجولة الثانية من العلامات CD3 و CD4 و FoxP3 و CK / SOX10 ، و (C) يعرض صورة مسجلة بشكل مشترك تجمع بين الصور (A) و (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 4: تلطيخ تمثيلي لأنسجة سرطان القولون والمستقيم (CRC) مع تلطيخ التألق المناعي 8-plex. يوضح الشكل الأنماط الظاهرية الخلوية التي يمكن تحديدها عن طريق تحديد موقع أهداف متعددة في نفس الخلية. (أعلى) صورة شريحة كاملة لأنسجة CRC. (أسفل) مناظر مفصلة لمناطق الأنسجة التي تبرز (أ) خلايا T-reg (CD3 + / CD4 + / FOXP3 +) ، (ب) الخلايا التي تعبر عن PD-1- و PD-L1 داخل الورم والسدى ، (ج) الخلايا التائية السامة للخلايا المستنفدة (CD3 + / CD8 + / PD-1) ، (د) الخلايا السرطانية المتهربة المناعية (PD-L1 + / CK +) والضامة المثبطة للمناعة (CD68 + / PDL1 +). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 5: مقارنة نوعية بين الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) مع تلطيخ التألق المناعي (IF). الأقسام التسلسلية الملطخة بصبغة الكيمياء المناعية أحادية العلامة (DAB ، الصف العلوي) ، والتألق المناعي أحادي العلامة (ISP monoplex) ، وعرض أحادي القناة للتألق المناعي متعدد الإرسال (ISP multiplex) مما يدل على التوافق النوعي بين طرق التلوين المختلفة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 6: تلطيخ القسم التسلسلي. (أ) رسم تخطيطي يوضح تخطيط TMA متعدد الأنسجة. (ب) صور تمثيلية 8 بلكس لنوى الأنسجة من كل نوع من أنواع الأنسجة في TMA. (ج) صور تمثيلية ل CD8 في قلب اللوزتين عبر ستة أقسام TMA تسلسلية ملطخة في جولة واحدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 7: القياس الكمي لكثافة العلامة الواحدة لكل نوع من الأنسجة المدرجة في TMA. الكثافة لكل نسيج هي متوسط الكثافة عبر ثلاثة نوى تمثيلية لكل نوع من أنواع الأنسجة على شريحة TMA. يمثل المحور y كثافة العلامة المفردة في أنواع الأنسجة المختلفة على المحور السيني ، بوحدات الخلايا الموجبة / مم². الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 8: تحليل منطقة الاهتمام (ROI) لإشارة الفلورسنت النسبية التي تقارن ب ISP mIF المضخم الموصوف في هذا البروتوكول ب IF. (أ) شريحة تمثيلية ملطخة ل CK (يسار) أو PD-L1 (يمين) مع خمسة عائد استثمار مشار إليه. (ب) صور عائد الاستثمار التمثيلي ل CK (أعلى) و PD-L1 (أسفل). تم تحقيق متوسط شدة الإشارة باستخدام mIF المضخم (الأرجواني) و IF غير المباشر (الأزرق) ل (C) CK و (D) PD-L1 عبر خمسة عائد استثمار ، يبلغ قياس كل منها 100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر ويحتوي على ما يقرب من 200 خلية. تظهر قيم المحور Y وحدات فلورسنت عشوائية وتظهر أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية (n = 3). (ه) حسبت شدة الإشارة النسبية المحققة باستخدام مضخم مزود خدمة الإنترنت mIF (أرجواني) وIF غير المباشر (أزرق) بأخذ نسبة متوسط إشارة mIF المضخمة إلى متوسط إشارة IF غير المباشرة عبر جميع عائد الاستثمار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 4: معامل التباين المحسوب (CV). السيرة الذاتية لكثافة الخلية الموجبة ومتوسط شدة الإشارة لصور اللوزتين موضحة في الشكل 6. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التقرير بروتوكولا لتشغيل تلطيخ التألق المناعي متعدد الإرسال عالي الإنتاجية وعالي الحساسية باستخدام أداة صبغة تلقائية. عند إجراء هذا البروتوكول ، تكون خطوات تحضير الكاشف حاسمة وتستحق الاهتمام. من الضروري التأكد من خلط الكواشف بشكل مناسب وقياسها بشكل صحيح لتقليل تباين التلوين بين الشرائح المختلفة في نفس التشغيل أو بين عمليات التشغيل المختلفة باستخدام نفس المكونات.

تشمل المشكلات الشائعة عند تنفيذ هذا البروتوكول عدم خلط الكواشف بشكل صحيح قبل التحميل واحتمال فقدان الأنسجة بسبب إجراء إزالة الغطاء غير السليم. في حين أن بروتوكول التلوين هذا ينطبق على أي نوع من أنواع أنسجة FFPE ، بما في ذلك أنواع السرطان ، فقد تتطلب بعض أنواع الأنسجة معالجة أكثر دقة (على سبيل المثال ، الأنسجة التي تحتوي على نسبة عالية من الدهون). لتجنب فقدان الأنسجة ، اترك الشرائح المنزلقة للغطاء تنقع لفترة طويلة بما فيه الكفاية بحيث تنفصل الغطاء من تلقاء نفسها. لا تجبر الغطاء على إزاحة الزجاج أو نزع الزجاج.

يتمثل أحد القيود في أنه في حين أن العديد من الأهداف الأكثر استخداما في علم الأورام المناعي يتم التحقق من صحتها وجاهزة للاستخدام ، فقد تتطلب بعض الأهداف تطوير الفحص قبل تضمينها في لوحة تعدد الإرسال. في حين أن هذه العملية سريعة نسبيا ، إلا أن هذا قد يتطلب بضعة أسابيع إضافية قبل أن تتمكن من استخدام لوحة تعدد إرسال مخصصة.

هناك العديد من الاختلافات بين هذا الاختبار وتقنيات التألق المناعي المتعدد الأخرى. بالمقارنة مع التقنيات القائمة على التألق المناعي المباشر وغير المباشر ، فإن الاختبار الموضح هنا لديه مستوى أعلى بكثير من التضخيم ، مما يسمح بتحسين الإشارة إلى الضوضاء بشكل كبير ، لا سيما في القنوات التي تميل إلى إظهار التألق الذاتي للأنسجة ، مثل قناة FITC. ينتج عن هذا إشارة أقوى ~ 30 مرة من التألق المناعي المباشر وإشارة أقوى ~ 10 مرات من التألق المناعي غير المباشر كما هو محدد كميا باستخدام تحليل شدة الشريحة الكاملة والتحليل اليدوي القائم على عائد الاستثمار (الشكل 8). تتيح هذه الطريقة اكتشاف البروتين المستهدف الأكثر حساسية في أوقات التعرض المنخفضة بشكل كبير وتلغي الحاجة إلى معالجة الصور ، بما في ذلك طرح الخلفية الذي يخاطر بإزالة الإشارات منخفضة الكثافة.

بالمقارنة مع فحوصات mIF القائمة على التضخيم المحفز بالإنزيم ، فإن الاختبار الموضح هنا لديه قدرة محسنة بشكل كبير على تنفيذ تعدد الإرسال ، بالإضافة إلى وجود سير عمل أبسط ووقت تشغيل أقصر للفحص بشكل عام (الشكل 1). في هذا الاختبار ، يتم إضافة الأجسام المضادة معا في خطوة واحدة وتضخيمها في وقت واحد ، مما يبسط إلى حد كبير بروتوكول الفحص. علاوة على ذلك ، يمكن لبعض التقنيات القائمة على الإنزيم ، مثل تضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، أن تظهر تداخلا بين الأجسام المضادة المختلفة ، فيما يسمى بالتأثير الشامل¹²^،¹⁷^،¹⁸. تتجنب تقنية التضخيم المستخدمة هنا هذه المشكلة ، مما يسمح باكتشاف العديد من العلامات المشتركة والمعبر عنها في نفس الخلية ، كما يتضح من الشكل 4.

ما يقرب من 90٪ من السرطانات البشرية ترتفع من الخلايا الظهارية¹⁹. هذا لأنها غالبا ما تشكل خط الدفاع الأول ضد البيئة الخارجية وتتكاثر بشكل أسرع ، مما يؤدي إلى تراكم أسرع للطفرات التي يحتمل أن تكون مسببة للأورام. هنا ، يلعب الالتهاب دورا مهما في تكوين الأورام وتطورها وانتشارها. على مدى العقد الماضي ، ظهرت العديد من العلاجات التي تستهدف مثبطات نقاط التفتيش المناعية والخلايا المناعية كترسانة قوية ضد العديد من أنواع الأورام⁵^،²⁰^،²¹. ومع ذلك ، لا يزال جزء كبير من المرضى لا يستجيبون. من المحتمل أن تلعب البيئة المكروية للورم (TME) والمشهد المناعي المحلي دورا حاسما. من خلال تحديد ملامح التوقيعات الجزيئية TME المرتبطة بالاستجابة التفاضلية للأدوية عبر العديد من المرضى ، قد يكون من الممكن تحديد المؤشرات الحيوية العلاجية بشكل أفضل. يوضح هذا التقرير أنه يمكن استخدام تقنية mIF لتوصيف العديد من المؤشرات الحيوية للبروتين بالتوازي ، بما في ذلك العلامات ذات التعبير المنخفض ، عبر مئات شرائح العينات الكاملة أو المصفوفات الدقيقة للورم.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون K.H.، A. VEITH، L.D.، D.W.، G.C.، Y.C.، J.H.L.، و A. Vasaturo هم موظفون في Ultivue، التي تنتج مجموعات التألق المناعي متعدد الإرسال المستخدمة في هذا العمل.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل Ultivue.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Anti-CD3	Ultivue		Clone BC33 (BioCare). جزء من ULT50801
Anti-CD4	Ultivue		Clone SP35 (Abcam). جزء من ULT50801
Anti-CD68	Ultivue		Clone KP1 (BioCare). جزء من ULT50801
Anti-CD8	Ultivue		Clone C8 / 144B (BioCare). جزء من ULT50801
Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10	Ultivue		Clones AE1 / AE3 (Bethyl Labs) و BC34 (BioCare). جزء من ULT50801 ، يتم توفيره كخليط
Anti-FOXP3	Ultivue		Clone 236A / E7 (Thermo). جزء من ULT50801
Anti-PD1	Ultivue		Clone CAL20 (Abcam). جزء من ULT50801
Anti-PDL1	Ultivue		Clone 73-10 (Abcam). جزء من ULT50801
Axioscan.Z1 مجهر	زايس		يسمى المجهر الفلوري في النص
محلول إزالة الشمع السندات	Leica	AR9222
حل استرجاع حاتمة السندات 2	حاويات Leica	AR9640
Bond Open Containers ، 30 مل	Leica	OP309700
Bond Research Detection	Leica	DS9455
إدراج معايرة السندات	معايرة	OPT9049
	Leica	OPT9719
Bond Universal Covertiles	Leica	S21.4611
Bond Wash Solution 10x Concentrate	Leica	AR9590
BondRX Autostainer	Leica		يسمى "autostainer" في النص
برنامج BondRX	Leica		الإصدار 6.0 أو أحدث
Coverslips ، # 1.5 سمك	Corning	2980-244
الإيثانول ، 200 دليل	VWR	89370-084
كتل أنسجة FFPE	تختلف أنواع أنسجة	BioIVT
اختبار OmniVUE 8-plex (CD3 ، CD4 ، CD8 ، CD68 ، FOXP3 ، PD-1 ، PD-L1 ، عموم السيتوكيراتين / SOX10)	يحتوي ULT50801 Ultivue		على جميع مكونات Ultivue الأخرى
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	Boston BioProducts	C-9911F	(درجة الحموضة 7.4 مع 2.7 ملي كلوريد الصوديوم)
ProLong Gold Antifade	Mountant Thermo	P10144	يسمى "وسيط التركيب" في النص
	UltiAnalyzer.AI Ultivue
UltiStacker.AI	Ultivue Ultivue
Amplification Buffer	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue الأجسام المضادة المخففة	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue Exchange Buffer	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue Exchange Initiator	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue Exchange Neutralizer	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 1	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 2	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue Pre-amplification Mix	Ultivue		جزء من ULT50801
Ultivue Probe Buffer	Ultivue		جزء من ULT50801
المياه عالية النقاء	Sigma-Aldrich	W4502

Kit لمجموعة السندات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).
Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).
Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies. Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).
Singhal, S. K., et al. Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival. Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).
Patil, N. S., et al. Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).
Hong, D. S., et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).
Robbins, C. J., et al. Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry. Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).
Ko, H., et al. Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate. Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).
Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy. Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).
Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
Sheng, W., et al. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).
Myers, J. A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization. Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).
Schwarze, J. K., et al. Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial. J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).
Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
Koppel, C., et al. Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms. Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).
Parra, E. R., et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).
Surace, M., et al. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J Vis Exp. (143), e58390(2019).
Hinck, L., Näthke, I. Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon. Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).
Alturki, N. A. Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment. J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).
Sun, Q., et al. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

فحوصات التألق المناعي الآلي المتعدد الإرسال عالية الإنتاجية للأبحاث الانتقالية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة