Method Article

التنقية والتوسع والتدفق القائم على القياس الخلوي للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظام المشتقة من الفئران

DOI:

10.3791/67600

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Central Laboratory for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي طريقة فعالة من حيث التكلفة لتنقية الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم (BMSCs) شديدة التجانس (BMSCs) وتوسيعها وتوصيفها من الفئران. يسهل هذا النهج الحصول على كميات كبيرة من BMSCs ذات إمكانات عالية للانتشار والتمايز ، ودعم نماذج الفئران وتطوير الأبحاث قبل السريرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي مجموعة من الخلايا الجذعية التي يمكنها التجديد الذاتي والتمايز إلى سلالات خلايا متعددة. من بينها ، تلعب الخلايا الجذعية الوسيطة الموجودة في نخاع العظام ، والمعروفة باسم الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم (BMSCs) ، دورا مهما في تكوين العظم ، ودعم المكونة للدم ، والتوجيه / الهجرة ، وتثبيط المناعة. تستخدم BMSCs على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية وأبحاث هندسة الأنسجة نظرا لقدرتها على الاستراتيجيات العلاجية الخلوية ، فضلا عن سهولة توافرها واستقرارها الجيني وانخفاض المناعة. تتعايش الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) و BMSCs في نخاع العظام ولكن لها خلايا سلفية مميزة. عند استخراج الخلايا من نخاع العظام ، عادة ما يتم الحصول على أنواع متعددة من الخلايا ، مما قد يؤدي إلى عدم التجانس في مجموعة الخلايا ، مما قد يتسبب في التحيز وعدم تلبية المعايير التجريبية العالية. لذلك ، من الأهمية بمكان تطوير تقنيات فعالة لتحسين تجانس وإنتاجية BMSCs في المختبر. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا للتنقية والتوسع والتدفق الخلوي القائم على التنميط الظاهري لخلايا BMSCs التي تم الحصول عليها من فئران BALB / c. تم تمييز التجانس والنمط الظاهري للخلايا الجذعية لمركبات BMSC الممر الثالث باستخدام قياس التدفق الخلوي ، مما يدل على إيجابية CD29 و CD44 و Sca-1 ، والسلبية ل CD45 ، و CD31 ، وتأكيد قدرتها على التمايز العظمي والشحم. يوفر هذا البروتوكول الفعال من حيث التكلفة طريقة سهلة وفعالة للحصول على عدد كاف من BMSCs المتجانسة ذات إمكانات الانتشار والتمايز العالية ، وهو أمر ضروري لتطوير البحث في نماذج الفئران والدراسات قبل السريرية المكثفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشتهر الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم (BMSCs) بخصائصها متعددة القدرات وتستخدم على نطاق واسع في علاج الأمراض المختلفة نظرا لخصائصها المتجددة ذاتيا والتمايز والمعدلة للمناعة1،2. يمكن الحصول على BMSCs بسهولة ، وقادرة على التوسع على نطاق واسع ، وتظهر خصائص مثبطة للمناعة ، ولا تؤدي إلى تفاعلات مناعيةفورية 3 ، مما يجعلها جذابة لتطبيقات هندسة الأنسجة وناقلات فعالة للعلاج الخلوي.

في نخاع العظام ، هناك مجموعتان رئيسيتان من الخلايا الجذعية وذريتهما ، الخلايا الجذعية المكونة للدم و BMSCs ، هم السكانالأساسيون 4. تقليديا ، يتم الحصول على BMSCs من خلال شفط نخاع العظم المستهدف وتحديدها على أنها خلايا ملتصقة بالبلاستيك في المختبر. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة غير كافية للتمييز بين BMSCs ومجموعات سكانية فرعية أخرى لنخاع العظم ، بما في ذلك الخلايا البطانية ، والخلايا المحيطة ، والكريات البيض ، والخلايا الجذعية المكونة للدم5. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول سهل وفعال لعزل BMSCs.

يوضح العمل الحالي تفاصيل فصل وتنقية BMSCs من خلال التزامها المادي بألواح زراعة الخلايا البلاستيكية. أجريت تجارب قياس التدفق الخلوي على BMSCs الممر الثالث باستخدام علامات السطح CD29 و CD44 و Sca-1 ، كما هو موضح من قبل الجمعية الدولية للعلاج الخلوي والجيني (ISCT) لجنة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSC)6. وفقا لمعايير ISCT ، تتميز الخلايا الجذعية الجذعية للفأر بالإيجابية ل CD29 و CD44 ومستضد الخلايا الجذعية 1 (Sca-1) ، والسلبية لعلامة الخلايا المكونة للدم CD45 وعلامة الخلايا البطانية CD31. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون BMSCs متعددة القدرات ، مما يدل على تمايز ثلاثي السلالات إلى بانيات العظم والخلايا الغضروفية والخلايا الشحمية. في هذه التجربة ، تم تحفيز تكوين العظم في BMSCs المستخرجة ، مع تلطيخ ALP الذي تم إجراؤه في اليوم 7 ومقايسة S أحمر أليزارين في اليوم 21 لتقييم التمايز. كما تم إحداث التمايز الحمني لمركبات BMSC المعزولة والنقية ، مع تلطيخ Oil Red O الذي تم إجراؤه في اليوم 21 لتقييم تكوين الشحم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على التعامل مع وفقا لإرشادات أخلاقيات المختبر (رقم الموافقة الأخلاقية: PZSHUTCM2211070009) من جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. تم استخدام الفئران الإناث BALB / c البالغة من العمر ثمانية أسابيع (درجة SPF ، 20 ± 1 جرام من وزن الجسم) في هذه الدراسة. يحدد هذا البروتوكول التنقية ، والمرور ، والتنميط الظاهري القائم على قياس التدفق الخلوي ، والتمايز العظمي والشحمي لمركبات BMSC المشتقة من الفئران. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. التعامل مع

  1. الفئران المنزلية في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في أقفاص جيدة التهوية بشكل فردي ، مع خمسة فئران لكل قفص. توفير تغذية من الدرجة SPF ومياه معقمة. حافظ على دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة.
    ملاحظة: تم اختبار هذه الطريقة ووجد أنها مجدية في كل من سلالات الماوس BALB / c و C57BL / 6. تستخدم هذه الورقة بشكل أساسي BALB / c كمثال.

2. حصاد عظم الفخذ والظنبوب من الأطراف الخلفية للفأر

  1. القتل الرحيم للحيوانات عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنقالرحم 7 باتباع الإرشادات الأخلاقية.
  2. انقع الفئران في 75٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: تم حصاد الخلايا الجذعية في غضون 30 دقيقة2 بعد القتل الرحيم ، وتم الانتهاء من العملية بأكملها ، بما في ذلك تنظيف النخاع والترشيح والبذر في ألواح الاستزراع ، في غضون ساعتين لضمان بقاء الخلية المثلى.
    ملاحظة: استخدم الفئران البالغة (≥8 أسابيع) للحصول على العائد الأمثل ل BMSC ؛ الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا مثالية8.
  3. قم بعمل شق حوالي 1 سم في الطرف الخلفي لوتر العرقوب بمقص تشريح معقم (الشكل 1 ب).
  4. قم بعمل شق دائري حول الطرف الخلفي من وتر العرقوب بمقص معقم لفضح الظنبوب البعيد (الشكل 1 ج).
  5. قشر الجلد من الشق باتجاه الورك لإزالته من كلا الطرفين الخلفيين (الشكل 1 د).
  6. قطع على طول العظم الحرقفي لفصل رأس الفخذ عن عظم الورك (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: تجنب إتلاف المفاصل الثنائية لعظم الفخذ أثناء التشريح لمنع فقدان نخاع العظام.
  7. ضع عظم الفخذ والظنبوب المجمعين في طبق 60 مم يحتوي على PBS معقم قبل البرودة يحتوي على 2٪ بنسلين / ستربتومايسين (الشكل 2 ب).
  8. اقطع أكبر قدر ممكن من الأوتار والعضلات من الظنبوب والشظية باستخدام مشرط معقم لتسهيل التنظيف اللاحق (الشكل 2 ج).
  9. أعد العظام المعالجة إلى PBS التي تحتوي على 2٪ بنسلين / ستربتومايسين وانقلها إلى الغطاء المعقم لخطوات العزل اللاحقة.

3. تنقية واستزراع BMSCs للفئران

  1. تحضير وسيط تعديل ألفا (αMEM) الكامل لزراعة BMSC عن طريق استكمال αMEM بمصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    ملاحظة: اختر وسط αMEM لأنه يحتوي على 1000 مجم / لتر من الجلوكوز ، وهو تركيز منخفض نسبيا. يساعد هذا في منع تثبيط تكاثر الخلايا الذي يمكن أن يحدث في البيئات عالية الجلوكوز9
  2. خذ حقنة سعة 50 مل وقم بتوصيل الإبرة المرفقة مع المحقنة.
  3. اسحب 20 مل من وسط αMEM في المحقنة سعة 50 مل ، ثم استبدل الإبرة بتلك التي تأتي مع حقنة 1 مل.
    ملاحظة: استخدم إبرة حقنة سعة 1 مل لاستيعاب حجم العظام وتقليل تلف الخلايا. تسمح حقنة سعة 50 مل بالتنظيف الفعال لنخاع العظم مع تقليل خطر تلوث الخلايا من الإدخالات المتكررة.
  4. استخدم المقص لقطع طرفي عظم الفخذ أو الساق المنفصلين في غطاء معقم.
  5. أدخل الإبرة في العظم على طول الحافة المقطوعة واغسل نخاع العظم في طبق استزراع 100 مم يحتوي على وسط αMEM كامل (الشكل 2 د).
  6. اغسل تجاويف العظام بشكل متكرر حتى تبدو قطع العظام شاحبة لضمان استخراج معظم نخاع العظام (الشكل 2 ه).
  7. قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل 40 مرة برفق باستخدام طرف ماصة لتفريق الخلايا المجمعة قدر الإمكان.
  8. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل لإزالة الحطام وشظايا الأنسجة والكتل غير المشتتة.
  9. انقل معلق الخلية المفلتر إلى طبق ثقافة خلية 100 مم وأضف وسط αMEM الكامل إلى الحجم النهائي البالغ 15 مل لكل طبق.
    ملاحظة: استزراع جميع خلايا نخاع العظم التي تم جمعها من عظم الفخذ والظنبوب لكل فأر في طبق ثقافة واحد 100 مم لتسهيل نمو الخلايا. بناء على التجارب السابقة ، يمكن عزل ما يقرب من 1 × 107 BMC من فأر يبلغ من العمر 8 أسابيع (من عظمي الفخذ واثنين من الظنبوب). يتم زرع هذه الخلايا في طبق استزراع 100 مم بكثافة 1.8 × 105 خلايا / سم2 للثقافة الأولية.
  10. أمسك الطبق بكلتا يديه وقم بتدويره برفق بحركة على شكل ثمانية 15 مرة لضمان التوزيع المتساوي للخلايا عبر الطبق.
  11. ضع طبق الاستزراع على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة وثمارة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 أيام (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: تجنب تحريك طبق الثقافة خلال هذه الفترة لضمان نمو موحد للخلايا.

4. استبدال وسط αMEM لثقافة BMSC

  1. راقب الخلايا تحت المجهر لتحديد ما إذا كانت قد وصلت إلى 80٪ من التقاء. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فتابع الاستبدال المتوسطفي اليوم الخامس.
  2. ارسم 3 مل من PBS باستخدام ماصة باستور معقمة وقم بتوزيعها من ارتفاع 1 سم فوق طبق الاستزراع في أوضاع مختلفة.
    ملاحظة: تجنب توزيع السائل على جانب واحد من الطبق ، لأن ذلك قد يزيل الخلايا الملتصقة بسبب قوة التأثير المفرطة ويمنع الإزالة الفعالة للخلايا غير المرغوب فيها.
  3. بعد إضافة 3 مل من PBS ، رج طبق الثقافة برفق لغسل الخلايا جيدا ، وقم بإزالة PBS من الطبق باستخدام ماصة. كرر عملية الغسيل مرة أخرى للتأكد من غسل الخلايا جيدا.
  4. اسحب 15 مل من وسط αMEM الكامل باستخدام ماصة باستور معقمة وقم بتوزيعها من ارتفاع 1 سم فوق طبق الاستزراع في أوضاع مختلفة.
  5. أعد طبق الثقافة إلى الحاضنة وراقب حتى تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء قبل الزراعة الفرعية (الشكل 3 ب).

5. مرور BMSCs

  1. اغسل 80٪ من الخلايا المتقاربة مرتين باستخدام PBS (الشكل 3 ج).
    ملاحظة: يساعد غسل الخلايا باستخدام PBS قبل الهضم على إزالة الوسط المتبقي وإفرازات الخلايا ويقلل من التصاق MSC بطبق الثقافة.
  2. هضم الخلايا ب 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 2-3 دقائق.
  3. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 4 مل من وسط αMEM الكامل إلى تعليق الخلية.
  4. قم بشفط معلق الخلية من طبق المزرعة باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل ، واغسل قاع الطبق برفق لفصل جميع الخلايا الملتصقة.
  5. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدم ماصة للتخلص من المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط αMEM الكامل.
    ملاحظة: بالنسبة للزراعة الفرعية ، وجد أن كثافة البذر التي تبلغ حوالي 4 × 104 خلايا / سم2 هي المثلى لاستمرار النمو والانتشار.
  7. قسم الخلايا بنسبة 1: 1-1: 2 إلى أطباق زراعة خلية جديدة مقاس 100 مم (يشكل هذاالمقطع الأول ، P1) (الشكل 3 د).
  8. قم بتقسيم الخلايا كل ثلاثة أيام تقريبا بنسبة 1: 1.5 عندما تصل إلى 80٪ من التقاء لإنشاء الممر الثاني (P2) (الشكل 3E) والمقطع الثالث (P3) (الشكل 3F) من BMSCs.

6. إعداد P3 BMSCs لتحديد النمط الظاهري والتمايز العظمي

  1. تخلص من وسط زراعة الخلايا.
  2. اغسل P3 BMSCs ب 3 مل من PBS مرتين.
  3. استيعوم P3 BMSCs ب 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 2-3 دقائق عندما تصل إلى 80٪ التقاء.
  4. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 4 مل من وسط αMEM الكامل إلى تعليق الخلية.
  5. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي بسعة 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: سيتم استخدام كريات P3 BMSC المحضرة هنا لتحديد النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي ولتقييم التمايز العظمي أو الشحم.

7. تحديد النمط الظاهري ل BMSCs بواسطة مقياس التدفق الخلوي

  1. أعد تعليق كريات الخلايا من P3 BMSCs مع 1.5 مل من محلول PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS واضبط التركيز على 5 × 106 خلايا / مل.
  2. Aliquot 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل من 11 أنبوبا لتحقيق 5 × 105 خلايا لكل أنبوب. قم بإعداد المجموعات التالية: ملصق فارغ ، والتحكم في النمط المتنظير CD29 ، والتحكم في النمط المتماثل CD29 ، والتحكم في النمط المتماثل CD44 ، والتحكم في النمط المتماثل Sca-1 ، والتحكم في النمط المتماثل Sca-1 ، والتحكم في النمط المتشاحي CD31 ، والتحكم في النمط المتماثل CD45 ، و CD45.
    ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم استخدام الفلوروكرومات التالية: CD29-FITC ، النمط الإسوي CD29-FITC ، CD44-APC ، النمط الإسوي CD44-APC ، Sca-1-PECy7 ، النمط المتماثل Sca-1 - PECy7 ، CD45-PerCPcy5.5 ، CD45 النمط الميزوي - PerCPcy5.5 ، CD31-PE ، و CD31 النمط المماثل PE (كما هو موضح في جدول المواد). يمكن تعديل هذه الفلوروكرومات بناء على تكوينات مقاييس التدفق الخلوية المختلفة.
  3. لكل مجموعة ، تضاف الكواشف التالية: 2 ميكرولتر من PBS إلى مجموعة التسمية الفارغة ، 2 ميكرولتر من النمط الإسوي CD29 إلى مجموعة التحكم في النمط المتساوي CD29 (1: 50 التخفيف) ، 2 ميكرولتر من CD29 إلى مجموعة CD29 (1: التخفيف 50) ، 0.5 ميكرولتر من النمط الإسوي CD44 إلى مجموعة التحكم في النمط المتساوي CD44 (1: 200 التخفيف) ، 0.5 ميكرولتر من CD44 إلى مجموعة CD44 (1: 200 التخفيف) ، 0.5 ميكرولتر من النمط المماثل Sca-1 إلى مجموعة التحكم في النمط المتملي Sca-1 (التخفيف 1:200) ، 0.5 ميكرولتر من Sca-1 إلى مجموعة Sca-1 (التخفيف 1:200) ، 2 ميكرولتر من النمط الإسوي CD31 إلى مجموعة التحكم في النمط المتساوي CD31 (التخفيف 1:50) ، 2 ميكرولتر من CD31 إلى مجموعة CD31 (التخفيف 1:50) ، 2 ميكرولتر من النمط الإسوي CD45 إلى مجموعة التحكم في النمط المتشاوي CD45 (1:50 التخفيف) ، و 2 ميكرولتر من CD45 إلى مجموعة CD45 (تخفيف 1:50).
    ملاحظة: تم استخدام الأجسام المضادة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة المحسنة لقياس التدفق الخلوي. أكدت التجارب الأولية التلوين الأمثل والخصوصية للخلايا المستهدفة. الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للجرعة الخاصة بالشركة المصنعة وإجراء اختبارات مسبقة للعيار حسب الحاجة.
  4. تخلط برفق ، وجهاز الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي للنخيل ، وتحتضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  5. أضف 900 ميكرولتر من PBS إلى كل أنبوب ، واخلطها عن طريق العكس ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في كل أنبوب مع 300 ميكرولتر من PBS وتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: لا تحتاج الخلايا إلى التثبيت بفورمالديهايد محايد بنسبة 2.5٪ إذا كان من الممكن إكمال مقايسة مقياس التدفق الخلوي في غضون 1-2 ساعة. إذا تعذر إجراء التحليل في غضون 1-2 ساعة ، فقم بإصلاح الخلايا بالفورمالين المحايد المخزن المؤقت بنسبة 2.5٪ (المحضر عن طريق خلط 10٪ من الفورمالين المحايد مع PBS بنسبة 1: 3) وتخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام طوال الليل لإجراء مقايسة مقياس التدفق الخلوي في وقت لاحق.
  7. اضبط جهد مقياس التدفق الخلوي باستخدام مجموعة الملصق الفارغة للتأكد من أن التألق الذاتي للخلية يقع في حدود 1/4-1/3 تقريبا من محور الإحداثيات. قم بتحميل الخلايا بالتتابع من النمط الإساوي CD29 ، و CD29 ، و CD44 ، و CD44 ، و Sca-1 ، و Sca-1 ، و CD31 ، و CD45 ، و CD45 اضبط بوابة P1 (كما هو محدد في مخطط FSC / SSC) لالتقاط 10,000 خلية تعمل بسرعة متوسطة.
    ملاحظة: تأكد من أن مقياس التدفق الخلوي مجهز بالقنوات المناسبة ، مثل تلك المستخدمة بشكل شائع في التجارب: FITC و PE و PerCp-Cy5.5 و PE-Cy7 و APC أو القنوات الأخرى التي تتوافق مع الفلورسينات المقترنة بالأجسام المضادة.

8. التمايز العظمي ل BMSCs

  1. أعد تعليق كريات P3 BMSC في وسط αMEM كامل ، مع ضبط التركيز إلى 1 × 105 خلايا / مل.
  2. قم ببذور P3 BMSCs في صفيحة زراعة خلية مكونة من 24 بئرا عن طريق إضافة 1 مل من وسط αMEM الكامل الذي يحتوي على 1 × 105 خلايا لكل بئر.
  3. استزراع P3 BMSCs عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪CO2 لمدة 3-5 أيام حتى تصل إلى أكثر من 90٪ من التقاء. استبدل وسط αMEM الكامل بوسط طازج كل يومين.
  4. قسم الآبار المختلفة بالتساوي إلى مجموعتين: مجموعة التحكم السلبية (بدون تحريض التمايز العظمي) ومجموعة التمايز العظمي
  5. قم بإعداد وسيط تحريض التمايز العظمي عن طريق استكمال وسط αMEM الكامل ب 10 مليمول / لتر β-جليسيروفوسفات ، و 50 مجم / لتر من حمض الأسكوربيك ، و 10-8 مول / لتر ديكساميثازون.
  6. تخلص من وسط زراعة الخلايا واغسل P3 BMSCs ب 1 مل من PBS.
  7. أضف وسيط تحريض التمايز العظمي إلى آبار مجموعة التمايز العظمي لتحريض التمايز العظمي (1 مل / بئر).
  8. أضف وسط αMEM الكامل إلى آبار المجموعة الضابطة (1 مل / بئر).
  9. استزراع P3 BMSCs عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 بنسبة 5٪ لمدة 7 أو 21 يوما ، لتحل محل وسيط تحريض التمايز العظمي أو وسط αMEM الكامل بنفس الوسط الطازج كل 3 أيام.
    ملاحظة: يتم استخدام الخلايا ذات الحث لمدة 7 أيام لتلوين الفوسفاتيز القلوي (ALP). تستخدم الخلايا ذات الحث لمدة 21 يوما لمقايسة S الحمراء للأيزارين.

9. تحديد الخلايا العظمية المتمايزة مع تلطيخ ALP

  1. اغسل الخلايا في كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا ب 1 مل من PBS مرة واحدة.
  2. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ واحتضانها لمدة 20 دقيقة.
  3. اغسل الخلايا في كل بئر مرة أخرى باستخدام 1 مل من PBS مرة واحدة.
  4. أضف 0.5 مل من كاشف تلطيخ الفوسفاتيز القلوي 1-Step NBT / BCIP إلى كل بئر ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع غلاف رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء.
  5. تخلص من المحلول ، واغسل الخلايا في كل بئر ب 1 مل من الماء المقطر مرة واحدة ، واترك اللوحة تجف.
  6. راقب واحصل على صور للمستعمرات الملطخة باستخدام كاميرا لتحديد الخلايا الموجبة ل ALP ذات الرواسب السوداء الأرجوانية.
    ملاحظة: ينتج كاشف تلطيخ الفوسفاتيز القلوي (ALP) 1-Step NBT / BCIP راسب أسود أرجواني قوي وغير قابل للذوبان عند التفاعل مع ALP ، والذي يمكن تصوره بسهولة.

10. تحديد الخلايا العظمية المتمايزة عن طريق اختبار أليزارين ريد S

  1. اغسل الخلايا في كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا ب 1 مل من PBS مرة واحدة.
  2. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ واحتضانها لمدة 20 دقيقة.
  3. اغسل الخلايا في كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا ب 1 مل من PBS مرة واحدة.
  4. أضف 0.5 مل من 0.1٪ أليزارين أحمر S في 0.1 مول / لتر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.3) إلى كل بئر ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  5. تخلص من المحلول ، واغسل الخلايا في كل بئر ب 1 مل من الماء المقطر مرة واحدة ، واترك اللوحة تجف.
  6. راقب واحصل على صور للمستعمرات الملطخة باستخدام الكاميرا لتحديد الخلايا الإيجابية للسفن الأحمر للأيزارين.
    ملاحظة: ينتج عن مقايسة أليزارين الأحمر S لتمايز MSC إلى خلايا عظمية معدنية ناضجة تكوين مركب S-calcium أحمر أليزارين ، والذي ينتج عنه بقعة حمراء زاهية يمكن ملاحظتها بصريا.

11. تحضير وسائط التمايز التحريضي الشحمية A ل BMSCs

ملاحظة: من أجل تمايز الخلايا الشحمية ل BMSCs ، غالبا ما يتم استخدام مجموعة التمايز الشحمية للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفأر (انظر جدول المواد) وفقا للإرشادات.

  1. ضع مصل الأبقار الجنيني (أحد مكونات المجموعة ، يشار إليه باسم المصل) في الثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات على الأقل قبل الذوبان الكامل.
  2. ضع الملحق A-I (مكون من المجموعة) في الثلاجة 4 درجات مئوية قبل 30 دقيقة على الأقل من التحضير ؛ ضع الملحق A-II (مكون المجموعة) في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما.
  3. اقلب أنبوب الكاشف أو اضغط عليه برفق لخلط المحتويات.
  4. جهاز الطرد المركزي أنبوب كاشف الملحق A-II عند 300 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لضمان تجمع الكاشف في الأسفل لسهولة الاسترجاع.
  5. نظف العبوة الخارجية لجميع المكونات جيدا باستخدام 75٪ كحول طبي وافتحها في خزانة السلامة الحيوية.
  6. أضف المصل والمكمل A-I والملحق A-II إلى الوسط.
    ملاحظة: لضمان الذوبان المناسب ، قم بتسخين الوسط القاعدي (أحد مكونات المجموعة) إلى 37 درجة مئوية ، أو قد يترسب الملحق A-II بسبب التعرض للبرد.
  7. استخدم كمية صغيرة من Basal Medium لشطف كل زجاجة وأنبوب ، مع التأكد من نقل جميع المكونات إلى الوسط القاعدي.
  8. قم بتثبيت الغطاء على الزجاجة Basal Medium ورجه برفق حتى يمتزج جيدا.
  9. أغلق الزجاجة بغشاء البارافين ، ولفها بورق الألمنيوم ، وقم بتسميتها بالاسم وتاريخ التحضير وتفاصيل أخرى.

12. تحضير وسائط التمايز التحريضي الشحمية B ل BMSCs

  1. ضع مصل الأبقار الجنينية في الثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات على الأقل قبل الذوبان الكامل.
  2. ضع الملحق B (أحد مكونات المجموعة) في ثلاجة 4 درجات مئوية حتى يذوب تماما لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التحضير.
  3. اقلب أنبوب الكاشف أو اضغط عليه برفق لخلط المحتويات.
  4. جهاز الطرد المركزي أنبوب الملحق B لتركيز الكاشف في الأسفل لتسهيل الجمع.
  5. نظف العبوة الخارجية لجميع المكونات جيدا باستخدام 75٪ كحول طبي وافتحها في خزانة السلامة الحيوية.
  6. أضف المصل والمكمل الغذائي B إلى الوسط القاعدي.
  7. استخدم جزءا صغيرا من الوسط القاعدي لغسل كل زجاجة وأنبوب ، مع ضمان نقل جميع المكونات بالكامل إلى الوسط.
  8. قم بتثبيت الغطاء على الزجاجة Basal Medium ورجه برفق حتى يمتزج جيدا.
  9. أغلق الزجاجة بالبارافيلم ، ولفها بورق الألمنيوم ، وقم بتسميتها بالاسم وتاريخ التحضير وتفاصيل أخرى.

13. تمايز الخلايا الشحمية من BMSCs

  1. أضف 1 مل من الجيلاتين 0.1٪ إلى طبق من ستة آبار ، ورجها لتغطية قاع كل بئر بالتساوي.
  2. ضع الصفيحة المكونة من ستة آبار المغطاة بجيلاتين 0.1٪ في غطاء معقم أو حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  3. استنشق الجيلاتين ، وتكون اللوحة جاهزة لبذر الخلايا ، أو انتظر حتى تجف الآبار قبل البذر بعد 30 دقيقة.
  4. قم بزرع P3 BMSCs بكثافة 4 × 104 خلايا / سم2 في كل بئر من الصفيحة المكونة من ستة آبار ، مع إضافة 2 مل من الوسط الكامل لكل بئر.
  5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة المشبعة.
  6. استنشق الوسط بعناية وأضف 2 مل من وسط تحريض التمايز الدهني A إلى كل بئر عندما تصل الخلايا إلى التقاء 100٪.
  7. نشفط الوسط A من الآبار بعد 3 أيام من الحث ، وأضف 2 مل من وسط التمايز الدهني B.
  8. استنشق متوسط B بعد يوم واحد ، وقم بالتبديل مرة أخرى إلى المتوسط A لمزيد من الحث.
  9. قم بالتبديل بين المتوسط A و B ، وراقب الخلايا يوميا. إذا حدث تقلص الخلية أو موتها أثناء التحريض مع الوسط A ، فقم بالتبديل إلى الوسط B على الفور.
  10. كرر عملية الحث والصيانة حتى يظهر عدد كاف من قطرات الدهون ذات الحجم المناسب ، ثم استعد للتلطيخ.

14. تلطيخ الزيت الأحمر O (ORO)

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات بلطف قدر الإمكان لتجنب انفصال قطرات الدهون.

  1. قم بشفط وسط التمايز التعريفي الشحمي من اللوحة المكونة من 6 آبار بعد اكتمال التمايز التعريفي الشحمي واغسله برفق باستخدام 1× PBS 2-3 مرات.
  2. أضف 2 مل من الفورمالين المحايد 10٪ لكل بئر ، وثبته لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإعداد محلول عمل Oil Red O عن طريق خلط مخزون الزيت الأحمر مع الماء المقطر بنسبة 3: 2. بعد الخلط ، جهاز الطرد المركزي على حرارة 250 × جم لمدة 4 دقائق واستخدم المادة الطافية.
  4. قم بشفط المثبت واغسله برفق باستخدام PBS 2-3 مرات ، مما يضمن الإزالة الشاملة للمثبت.
  5. أضف 0.8 مل من محلول البقع الأحمر O إلى كل بئر ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  6. استنشق محلول البقعة ، واغسلها مرتين ب 1 مل 75٪ إيثانول.
  7. أضف 1 مل من الهيماتوكسيلين المضاد إلى كل بئر لمدة دقيقتين ، ثم استنشق.
  8. أضف 2 مل من PBS إلى كل بئر وراقب نتائج تلطيخ الشحم تحت المجهر.
  9. أغلق الصفيحة الملونة المكونة من ستة آبار بالبارافيلم واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا تخزن لأكثر من 1 أسبوع. قد تندمج قطرات الدهون وتفقد حالة التلوين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل BMSCs المشتقة من الفئران وزراعتها لمدة أسبوعين تقريبا لتوليد الممر الثالث (P3) BMSCs (الشكل 3). كما هو موضح في الشكل 3 أ ، ظلت الخلايا المستخرجة حديثا من نخاع العظم أحادية النواة مع قطرات دهنية مرئية. ظهرت خلايا على شكل مغزل في طبق الاستزراع ، ووصلت إلى التقاء 60٪ -80٪ فييوم الاستزراع الخامس (الشكل 3 ب ، ج). من P1-P3 (الشكل 3D-F...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حظي العلاج بالخلايا الجذعية باهتمام كبير نظرا لقدرته على إحداث ثورة في الطب التجديدي. قدمت الدراسات قبل السريرية أدلة قوية تدعم التطبيق السريري للخلايا الجذعية ، وخاصة BMSCs13. ومع ذلك ، فإن التحديات مثل انخفاض إنتاجية الخلايا والتلوث والنمو البطيء أعاقت تطبيقها السريري. لذلك ، هناك حاجة ملحة للبحث الذي يركز على توحيد عمليات تحضير BMSC لتعزيز إنتاجية الخلايا ووظائفها ، وبالتالي توسيع استخدامها السريري2.

تقدم هذه ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه الدراسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFE0201600) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82174408 و 82374477).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حقنة 1 مل (إبرة حقنة 22 جرام)مجموعة الطلبة (KDL)60017031
1 خطوة NBT / BCIP   ؛بيرس بيوتكنولوجي ، إنك.34042تلطيخ الفوسفاتيز القلوي
10٪ فورمالين مخزن محايدويكسيس5200250تثبيت الخلية
لوحة 6 بئرمختبر11110ثقافة الخلية
لوحة 24 بئرمختبر11310ثقافة الخلية
40 μ م مصفاة الخليةكورنيج352340الترشيح لإزالة التكتلات
حقنة 50 ملمجموعة الطلبة (KDL)60017040
75٪ إيثانول   ؛شنغهاي NianYue التكنولوجيا الحيوية المحدودة31009001تطهير جلد الفئران
أليزارين ريد إسسيجما ألدريتش   ؛أ 5533الكشف عن رواسب الكالسيوم والعقيدات المتكلسة
الجسم المضاد أحادي النسيلة APC CD44 (استنساخ: IM7)العلوم الحيوية الإلكترونية17-0441-82قياس التدفق الخلوي 
APC الفئران IgG2b kappa التحكم في النمط المتماثل (استنساخ: eB149 / 10H5)العلوم الحيوية الإلكترونية17-4031-82قياس التدفق الخلوي 
الأوتوكلافشركة هيرياما اليابانيةإتش في -50أدوات التعقيم الجراحية
حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2< / sub>ثيرمو فيشر التكنولوجيا (الصين) المحدودة300583057ثقافة الخلية
قياس التدفق Cytoflexبيكمان كولتر   ؛أ 00-1-1102قياس التدفق الخلوي 
ديكساميثازونسيجما ألدريتش   ؛D4902BMSCs التمايز العظمي
طبق (100 مم)كورنينج430167ثقافة الخلية
طبق (60 ملم)كورنينج430166عينة من الزرع أثناء الزرع  
كرات قطنية مطهرةشنغهاي Honglong الصناعية المحدودة20230627تطهير جلد الفئران
قفازات معقمة يمكن التخلص منهاشنغهاي Honglong الصناعية المحدودةYT21131عملية معقمة
حمية القوارض المشعة الأسد المزدوجسوتشو شوانغشي التجريبية لتكنولوجيا الأعلاف الحيوانية المحدودةجيجابايت 14924.3الاعلاف
مصل الأبقار الجنيني   ؛شنغهاي Biosun للعلوم وأمبير التكنولوجيا المحدودةBS-0002-500ثقافة الخلية
FITC Hamster Anti-Rat CD29 (استنساخ: Ha2 / 5)BD Biosciences555003قياس التدفق الخلوي 
FITC Hamster IgM ، & lambda ؛ 1 التحكم في النمط المتساوي (استنساخ: G235-1)BD Biosciences553960قياس التدفق الخلوي 
الجيلاتين (0.1٪)أوريسيلجي إل تي -11301تعزيز قدرة التصاق الخلايا
قفص الفئران IVCsسوتشو الملك المعدات التجريبية التكنولوجيا المحدودةإتش إتش - MMB -2حاجز
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتش   ؛أ 8960BMSCs التمايز العظمي
قلم ماركحمار وحشي للتجارة (شنتشن) المحدودة ؛YYST5ضع علامة على المعلومات الخلوية على طبق بتري
تعديل MEM ألفا (1X)شنغهاي NianYue التكنولوجيا الحيوية المحدودةSH30265ثقافة الخلية
نخاع عظم الفأر الخلايا الجذعية الوسيطة طقم التمايز ثنائي المنشأسياجنموكسمكس-90031BMSCs التمايز الدهني المنشأ 
نيكون Eclipse Ti2 مجهر مقلوب Synstemاليابان نيكون كوربوراتينتي2-يوراقب الخلايا والتقط الصور
مقص العيون شنغهاي NianYue التكنولوجيا الحيوية المحدودةY00030 JZقص الجلد
ملاقط العيونشنغهاي NianYue التكنولوجيا الحيوية المحدودةBS-ZER-S-100 بيوشاربالحصول على أنسجة عظام الفأر.
ماصة باستورشنغهاي NianYue التكنولوجيا الحيوية المحدودةBS-XG-03Mاستشفاق وسيط الثقافة
PE الفئران المضادة للماوس CD31 (استنساخ: Ha2 / 5)BD Biosciences553373قياس التدفق الخلوي 
PE الفئران IgG2a ، &kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل (استنساخ: R35-95)BD Biosciences553930قياس التدفق الخلوي 
PE-Cyanine7 Ly-6A / E (Sca-1) جسم مضاد أحادي النسيلة (استنساخ: D7)العلوم الحيوية الإلكترونية25-5981-82قياس التدفق الخلوي 
PE-Cyanine7 Rat IgG2a kappa التحكم في النمط الإساثي (استنساخ: eBR2a)العلوم الحيوية الإلكترونية25-4321-82قياس التدفق الخلوي 
البنسلين - الستربتومايسينشنغهاي NianYue التكنولوجيا الحيوية المحدودة2585636ثقافة الخلية
PerCP-Cy5.5 الفئران المضادة للماوس CD45 (استنساخ: Ha2 / 5)BD Biosciences561869قياس التدفق الخلوي 
PerCP-Cy5.5 الفئران IgG2b ، &kappa ؛ التحكم في النمط المتساوي (استنساخ: A95-1)BD Biosciences550764قياس التدفق الخلوي 
المشارطمصنع الأدوات الجراحية oشنغهاي للأجهزة الطبية؟ المجموعة؟Co., Ltd. J11010-10 # JZعزل الأطراف الخلفية والجذع للفأر ، وإزالة الأنسجة الدخيلة من العظم
غطاء معقمثيرمو فيشر التكنولوجيا (الصين) المحدودةاقتصادي 0.9طاولة العمليات الجراحية
الستائر الجراحية المعقمةخنان هوايو المعدات الطبية المحدودة20160900توفير منطقة جراحة معقمة
أنبوب (50 مل)شنغهاي بايساي ، شركة التكنولوجيا الحيوية المحدودة ؛BLD-BL2002500تخزين محلول الخلية المفلتر
التربسين-EDTA (0.25٪)جيبكو25200056هضم الخلايا الملتصقة
β-glycerophosphateسيجما ألدريتش   ؛جي 5422BMSCs التمايز العظمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chu, D. -T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  2. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Transl. 3 (1), 26-33 (2015).
  3. Li, M., et al. Extracellular vesicles from apoptotic BMSCs ameliorate osteoporosis via transporting regenerative signals. Theranostics. 14 (9), 3583-3602 (2024).
  4. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. J Vis Exp. (131), e56750(2018).
  5. Chu, D. -T., et al. Adipose tissue stem cells for therapy: An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application. J Clin Med. 8 (7), 917(2019).
  6. Qin, L., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic diseases—the two sides of the same coin. Acta Pharmacol Sin. 44 (2), 268-287 (2023).
  7. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  8. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
  9. Grossner, T., Haberkorn, U., Hofmann, J., Gotterbarm, T. Effects of different basal cell culture media upon the osteogenic response of hMSCs evaluated by 99mTc-HDP labeling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6288(2022).
  10. Janda, C. Y., et al. Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt and β-catenin signalling. Nature. 545 (7653), 234-237 (2017).
  11. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the Alizarin Red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. Int J Mol Sci. 24 (1), 723(2022).
  12. Wang, C., et al. Restoration of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in mice inhibited by cyclophosphamide with psoralen. Chin J Tissue Eng Res. 29 (1), 16-23 (2025).
  13. Papaccio, F., et al. Concise review: Cancer cells, cancer stem cells, and mesenchymal stem cells: Influence in cancer development. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2115-2125 (2017).
  14. Kolf, C. M., Cho, E., Tuan, R. S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: Regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 9 (1), 204(2007).
  15. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  16. Abdallah, B. M., et al. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biol Proced Online. 21 (1), 3(2019).
  17. Liu, S., et al. Single cell sequencing reveals gene expression signatures associated with bone marrow stromal cell subpopulations and time in culture. J Transl Med. 17 (1), 23(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow Mesenchymal Stem CellsMesenchymal Stem CellsFlow CytometryCell PurificationCell ExpansionMouse Bone MarrowCell PhenotypingCD29 MarkerCD44 MarkerSca 1 Marker

Related Articles