يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التلاعب بالقوى الميكانيكية في قلب الزرد النامي باستخدام الخرز المغناطيسي

6.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67604

⸱

يناير 3, 2025

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2The Francis Crick Institute, 3Institute of Advanced Medical Sciences, Tokushima University, 4Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول طريقة لتطعيم حبة مغناطيسية في قلب سمكة الزرد النامية من خلال الجراحة المجهرية ، مما يتيح التلاعب بالقوى الميكانيكية في الجسم الحي وتحفيز تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي في خلايا الشغاف.

الملخص

توفر القوى الميكانيكية باستمرار التغذية الراجعة للبرامج المورفولوجية لصمام القلب. في سمك الزرد ، يعتمد نمو صمام القلب على تقلص القلب والمحفزات الجسدية الناتجة عن القلب النابض. تظهر ديناميكا الدم داخل القلب ، مدفوعة بتدفق الدم ، كمعلومات أساسية تشكل تطور القلب الجنيني. هنا ، نصف طريقة فعالة لمعالجة القوى الميكانيكية في الجسم الحي عن طريق تطعيم حبة مغناطيسية قطرها 30 ميكرومتر إلى 60 ميكرومتر في تجويف القلب. يتم إدخال الخرزة من خلال الجراحة المجهرية في اليرقات المخدرة دون الإخلال بوظيفة القلب وتمكن من التغيير الاصطناعي للظروف الحدودية ، وبالتالي تعديل قوى التدفق في النظام. نتيجة لذلك ، يؤدي وجود الخرزة إلى تضخيم القوى الميكانيكية التي تعاني منها خلايا الشغاف ويمكن أن يؤدي مباشرة إلى تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي. يسهل هذا النهج التحقيق في مسارات النقل الميكانيكي التي تحكم نمو القلب ويمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول دور القوى الميكانيكية في تكوين صمام القلب.

المقدمة

منذ تقديمه في أواخر السبعينيات1970 ، ظهر الزرد (Danio rerio) كنظام نموذجي قوي لدراسة تعقيدات نمو القلب واضطرابات القلب الخلقية. على عكس معظم الفقاريات ، بما في ذلك أجنة الفئران والكتاكيت ، التي تعتمد على نظام القلب والأوعية الدموية الوظيفي ولا يمكنها البقاء على قيد الحياة من عيوب القلب المبكرة ، توفر أسماك الزرد ميزة فريدة من خلال تمكين التحقيق في الأنماط الظاهرية الشديدة للقلب. ويرجع ذلك إلى صغر حجمها ، مما يسهل إمداد الأكسجين الكافي من خلال الانتشار السلبي ، مما يسمح بالبقاء على قيد الحياة حتى في حالة عدم وجود تقلص القلب والدورة الدموية النشطة2،3،4. علاوة على ذلك ، من بين السمات الهامة العديدة لأسماك الزرد الشفافية البصرية لأجنتها ، والتي تتيح المراقبة غير الغازية للقلب النامي5،6،7،8.

توفر القوى الميكانيكية باستمرار التغذية الراجعة لبرامج الوراثة الوراثية لصمامالقلب 9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22، وتدفق الدم الشاذ معترف به على نطاق واسع كعامل مشترك في اضطرابات القلب والأوعية الدموية المختلفة23،24. في سمك الزرد ، يعتمد نمو صمام القلب على تقلص القلب والقوى الميكانيكية الناتجة عن القلب النابض. أثبتت طفرات الزرد المتعددة أهمية المحفزات الميكانيكية التي يولدها القلب في تكوين الصمام. ومن اللافت للنظر أن الغياب التام لتقلص القلب ، وبالتالي تدفق الدم بسبب طفرات التروبونين القلبي T (tnnt2) في طفرات القلب الصامت (sih) يؤدي إلى عدم وجود تقارب الأنسجة وتجمع الخلايا الشغاف (EdC) خلال المراحل المورفوجينيةالمبكرة 25.

تظهر ديناميكا الدم داخل القلب والقوى الميكانيكية الناتجة عن تدفق الدم كمكونات جينية أساسية تشكل تطور القلب الجنيني لسمكة الزرد. تشير العديد من الدراسات إلى أن التشكل القلبي السليم في أسماك الزرد يتطلب محفزات تدفق مميزة ، وتؤدي الانحرافات عن هذه الأنماط الفسيولوجية إلى عيوب في صمام القلب10،13،14،22،26. هنا ، نصف طريقة فعالة ، مقتبسة من Fukui et al.13 ، للتلاعب بالقوى الميكانيكية في الجسم الحي عن طريق تطعيم حبة مغناطيسية قطرها 30 ميكرومتر إلى 60 ميكرومتر داخل القلب النابض لسمك الزرد النامي. تتضمن هذه التقنية إدخال حبة جراحية مجهرية في تجويف القلب لليرقات المخدرة دون الإخلال بوظيفة القلب. يؤدي وجود الخرزة إلى تضخيم القوى الميكانيكية التي تعاني منها EdCs ، مما يؤدي مباشرة إلى تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي13. يتيح هذا النهج التحقيق في مسارات النقل الميكانيكي التي تنظم تشكل القلب ويوفر وسيلة لتعميق فهمنا لدور القوى الميكانيكية في تكوين الصمامات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تلتزم إجراءات العمل مع أجنة أسماك الزرد الموضحة في هذا البروتوكول بالتوجيه الأوروبي 2010/63 / EU وإرشادات وزارة الداخلية بموجب ترخيص المشروع PP6020928.

1. الحصول على أجنة الزرد لتطعيم الخرز

  1. اعبر خط سمك الزرد ذي الصلة وقم بزراعة الأجنة في وسط دانيو عند 28.5 درجة مئوية. لمزيد من الإرشادات التفصيلية حول عبور خطوط أسماك الزرد ، راجع قاعدة بيانات تعليم العلوم JoVE27.
  2. عالج الأجنة باستخدام 1-phenyl-2-thiourea (PTU) من 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) لمنع تكوين الصبغة ، باستخدام تركيز 0.003٪ PTU في وسط دانيو.
  3. إذا كنت تستخدم خطا يحمل علامة فلورية ، فقم بفحص الأجنة تحت مجسم مضان قبل البدء في تطعيم الخرزة ، وحدد 10-20 جنينا سليما يظهر مضان ساطع. قم بإزالة الأجنة المحددة مسبقا برفق تحت المجهر المجري باستخدام الملقط ، مما يضمن عدم تلف الأجنة.

2. تركيب أجنة الزرد

  1. تحضير 20 مل من وسط دانيو الذي يحتوي على 0.02٪ ثلاثي الكنائين.
  2. تحضير 2 مل من أغاروز 1٪ نقطة انصهار منخفضة (LMP) تحتوي على 0.02٪ ثلاثاء في أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل. ضع الأنابيب في كتلة حرارية 38 درجة مئوية للحفاظ على LMP agarose في حالة سائلة.
    ملاحظة: يمكن تحضير أغاروز LMP 1٪ مسبقا للاستخدام في يوم التركيب وتطعيم الخرز.
  3. انقل 3-6 أجنة منزوعة التكاثر إلى طبق بتري يحتوي على وسط دانيو المكمل بنسبة 0.02٪ ثلاثي الكنائين.
  4. عندما يتم تخدير الأجنة ، انقلها إلى طبق زجاجي قاع 35 مم × 15 مم بأقل قدر من المتوسط. أضف بسرعة 300-400 ميكرولتر من 1٪ LMP agarose يحتوي على tricaine لإنشاء قبة. باستخدام الملقط ، ضع الأجنة بحيث تكون مستقيمة ، ملامسة للزجاج ، بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى ، كما هو موضح في الشكل 1. انتظر ~ 4 دقائق حتى يتماسك الاغاروز.
    ملاحظة: كمية الاغاروز المستخدمة في تركيب الأجنة مهمة جدا. استهدف قبة بحجم 350 ميكرولتر تقريبا ، والتي يجب أن توفر تغطية كافية مع ترك بضعة ملليمترات من المساحة فوق الأجنة. بالنسبة للمبتدئين ، قد يكون تركيب عدد أقل من الأجنة في وقت واحد نهجا أكثر أمانا.

3. تطعيم الخرزة

  1. بمجرد أن يتم ترسيخ الاغاروز ، قم بإيداع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي في الأعلى.
    ملاحظة: استخدم طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر لنقل الخرزات المغناطيسية. القياس الدقيق ل 0.5 ميكرولتر ليس ضروريا ، حيث أن الخرزات مركزة بشكل كبير في التعليق. ببساطة إدخال الطرف في القارورة بعد الدوران لأسفل سيكون كافيا لجمع كمية كافية من الخرز.
  2. أضف قطرة من وسط دانيو الذي يحتوي على 0.02٪ ثلاثاء فوق الاغاروز والخرز.
  3. حدد الخرزة المناسبة.
    ملاحظة: هذه الخطوة بالغة الأهمية. يمكن أن يختلف حجم الخرزات قليلا ، حيث يتراوح قطرها من 30 ميكرومتر إلى 60 ميكرومتر ، لذا فإن اختيار الخرزة المناسبة بالعين ، بناء على العينة وحجم القلب ، أمر ضروري.
  4. بمجرد اختيار الخرزة المناسبة ، استخدم الملقط لوضعها فوق صفار البيض (الشكل 2 أ والفيديو 1).
  5. قم بإنشاء آفة صفار أو "ثقب" في وسط الصفار باستخدام ذراع واحدة من الملقط (الشكل 2 ب والفيديو 2).
    ملاحظة: يجب ألا يتغلغل عمق الآفة في صفار البيض ؛ يجب أن يكون مستويا تقريبا مع الوريد الأساسي. يتوافق قطر الثقب الذي تم إنشاؤه مع طرف ذراع الملقط. تأكد من أن الآفة مصنوعة في صفار البيض وتجنب ملامسة الأوردة الأساسية عن طريق التصويب أسفلها. عادة ما تخرج كمية صغيرة من صفار البيض عند إنشاء الثقب.
  6. ضع الخرزة في الآفة التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.5 وادفعها برفق للأمام حتى تصل إلى العمود الوريدي. هناك ، ستؤدي تقلصات القلب إلى شفط ، مما يؤدي إلى سحب الخرزة إلى تجويف القلب (الشكل 2 والفيديو 2).
    ملاحظة: يتم اختراق الجدار الوريدي أثناء إدخال الخرزة ، وتساعد الكثافة العالية للصفار على تقليل النزيف الشديد. عادة ما تلتئم آفة الصفار في غضون بضع دقائق بعد إدخال الخرزة. قد تظهر بعض الأجنة وذمة التامور بعد 20-24 ساعة من تطعيم الخرز.

4. فك أجنة الزرد

  1. بعد تطعيم الخرز المغناطيسي في جميع الأجنة المركبة ، أضف 1-2 مل من وسط دانيو الذي يحتوي على PTU في الطبق ذو القاع الزجاجي.
  2. باستخدام الملقط ، قم بكسر أغاليز LMP برفق وقم بإزالة الأسماك بعناية ، مع التأكد من عدم ترك الاغاروز عليها.
  3. باستخدام ماصة باستور ، انقل الأجنة إلى طبق بتري جديد يحتوي على وسط دانيو مع PTU واسمح لها بالتعافي والتطور عند 28.5 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تظهر أمثلة على تطعيم الخرزة الناجح في الشكل 3 والفيديو 3 والفيديو 4. تم وضع الخرزة المغناطيسية بشكل صحيح داخل أذين قلب الزرد ، مما يسمح بتدفق الدم دون عائق وعدم ملاحظة النزيف. بالإضافة إلى ذلك ، حافظت جدران القلب على سلامتها الهيكلية دون انهيار (الشكل 3 والفيديو 3). بعد 24 ساعة ، لم يظهر الجنين أي علامات على وذمة التامور ، مما يؤكد نجاح إجراء التطعيم (فيديو 4).

هذه ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الحاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

تركيب أجنة الزرد

كمية الاغاروز المستخدمة لتركيب الأجنة مهمة. يجب ألا تكون القبة المتكونة كبيرة بشكل مفرط ، لأن هذا يمكن أن يعيق التلاعب بالخرزة من السطح إلى الأجنة. على العكس من ذلك ، لا ينبغي أن تكون صغيرة جدا. يمكن أن يؤدي وجود حبات متعددة فوق الاغاروز ، موضوعة بالقرب من الأجنة وصفار البيض ، إلى حدوث ارتباك. يوصى بحجم يبلغ حوالي 350 ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نشكر أعضاء مختبر Vermot على المناقشات والتعليقات على البروتوكول. نحن ممتنون لجميع موظفي منشأة إمبريال كوليدج لندن للأسماك. تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي: GA N°682939 و Additional Ventures (رقم الجائزة 1019496) و MRC (MR / X019837/1) و BBSRC (BB / Y00566X/1). تم دعم CV-P من خلال منحة قسم الهندسة الحيوية (إمبريال كوليدج لندن). تم دعم HF من قبل JSPS KAKENHI (23H04726 و 24K02207) ، وبرنامج JST FOREST (23719210) ، ومؤسسة Uehara Memorial Foundation ، ومؤسسة أبحاث علوم الخلية ، ومؤسسة Takeda للأبحاث الطبية ، ومؤسسة Novartis للأبحاث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
< قوي > المواد < / قوي >
المعدات الأساسية لتربية أسماك الزرد وتربيتها وجمع
الأجنة طبق زجاجي القاع (35 مم × 15 & nbsp ؛ مم)VWR International734-2905
كتلة حراريةEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
المجوهرات ملقطSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5 ، L 4 1/4 بوصة ، أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من سبائك Inox
2 ملEppendorf30120094
مجهر
مجسم<قوي > كواشف < / قوي >
4 مجم / مل محلول
ثلاثي الكيان دانيو المتوسطة (محلول مخزون 60x)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)Sigma-AldrichP7629
UltraPure نقطة انصهار منخفضة agaroseInvitrogen16520-050<
strong>Danieau's medium (محلول مخزون 60x)< / قوي>
34.8 جم كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS3014
1.6 جم KClسيجما-ألدريتشP9541
5.8 جم CaCl2 & middot ؛ 2H2Oسيجما ألدريتشC3306
9.78 جم MgCl2 & middot ؛ 6H2O Sigma-Aldrich442611-M
قم بإذابة المكونات في H2O إلى حجم نهائي قدره 2 لتر ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ، ثم الأوتوكلاف.
<قوي >4 مجم / مل محلول مخزون ثلاثي الكنائين< / قوي>
400 مجم من مسحوق التريكيين (ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سلفونات)Sigma-AldrichA5040
97.9 مل H2O
مزدوج 2.1 مل 1 م تريس (درجة الحموضة 9)
اضبط الرقم الهيدروجيني على 7 ، ثم قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
طبق بتري ماصة باستورمخزونمقطر

المراجع

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
  3. Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
  4. Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
  5. Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780(2016).
  6. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  7. Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
  8. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  9. Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706(2019).
  10. Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
  11. Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
  12. Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505(2022).
  13. Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
  14. Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
  15. Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214(2023).
  16. Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121(2024).
  17. Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
  18. Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
  19. da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633(2024).
  20. Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129(2004).
  21. Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
  22. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246(2009).
  23. Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
  24. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
  25. Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
  26. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  27. JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
  28. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تطور صمامات القلبالتخلق الشكلي القلبيمسارات نقل الإشارات الميكانيكيةتدفق الكالسيومالتصوير الضوئيالجراحة المجهريةديناميكا الدم القلبية
التلاعب بالقوى الميكانيكية في قلب الزرد النامي باستخدام الخرز المغناطيسي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.