Method Article

التلاعب بالقوى الميكانيكية في قلب الزرد النامي باستخدام الخرز المغناطيسي

DOI:

10.3791/67604

⸱

January 3rd, 2025

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2The Francis Crick Institute, 3Institute of Advanced Medical Sciences, Tokushima University, 4Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة لتطعيم حبة مغناطيسية في قلب سمكة الزرد النامية من خلال الجراحة المجهرية ، مما يتيح التلاعب بالقوى الميكانيكية في الجسم الحي وتحفيز تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي في خلايا الشغاف.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر القوى الميكانيكية باستمرار التغذية الراجعة للبرامج المورفولوجية لصمام القلب. في سمك الزرد ، يعتمد نمو صمام القلب على تقلص القلب والمحفزات الجسدية الناتجة عن القلب النابض. تظهر ديناميكا الدم داخل القلب ، مدفوعة بتدفق الدم ، كمعلومات أساسية تشكل تطور القلب الجنيني. هنا ، نصف طريقة فعالة لمعالجة القوى الميكانيكية في الجسم الحي عن طريق تطعيم حبة مغناطيسية قطرها 30 ميكرومتر إلى 60 ميكرومتر في تجويف القلب. يتم إدخال الخرزة من خلال الجراحة المجهرية في اليرقات المخدرة دون الإخلال بوظيفة القلب وتمكن من التغيير الاصطناعي للظروف الحدودية ، وبالتالي تعديل قوى التدفق في النظام. نتيجة لذلك ، يؤدي وجود الخرزة إلى تضخيم القوى الميكانيكية التي تعاني منها خلايا الشغاف ويمكن أن يؤدي مباشرة إلى تدفق الكالسيوم المعتمد على التحفيز الميكانيكي. يسهل هذا النهج التحقيق في مسارات النقل الميكانيكي التي تحكم نمو القلب ويمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول دور القوى الميكانيكية في تكوين صمام القلب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ تقديمه في أواخر السبعينيات1970 ، ظهر الزرد (Danio rerio) كنظام نموذجي قوي لدراسة تعقيدات نمو القلب واضطرابات القلب الخلقية. على عكس معظم الفقاريات ، بما في ذلك أجنة الفئران والكتاكيت ، التي تعتمد على نظام القلب والأوعية الدموية الوظيفي ولا يمكنها البقاء على قيد الحياة من عيوب القلب المبكرة ، توفر أسماك الزرد ميزة فريدة من خلال تمكين التحقيق في الأنماط الظاهرية الشديدة للقلب. ويرجع ذلك إلى صغر حجمها ، مما يسهل إمداد الأكسجين الكافي من خلال الانتشار السلبي ، مما يسمح بالبقاء على قيد الحياة حتى في حالة عدم وجود تقلص القلب والدورة الدموية النشطة2،3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلتزم إجراءات العمل مع أجنة أسماك الزرد الموضحة في هذا البروتوكول بالتوجيه الأوروبي 2010/63 / EU وإرشادات وزارة الداخلية بموجب ترخيص المشروع PP6020928.

1. الحصول على أجنة الزرد لتطعيم الخرز

  1. اعبر خط سمك الزرد ذي الصلة وقم بزراعة الأجنة في وسط دانيو عند 28.5 درجة مئوية. لمزيد من الإرشادات التفصيلية حول عبور خطوط أسماك الزرد ، راجع قاعدة بيانات تعليم العلوم JoVE27.
  2. عالج الأجنة باستخدام 1-phenyl-2-thiourea (PTU) من 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) لمنع تكوين الصبغة ، باستخدام تركيز 0.003٪ PTU في وسط دانيو.
  3. إذا كنت تستخدم خطا يحمل علامة فلورية ، فق....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر أمثلة على تطعيم الخرزة الناجح في الشكل 3 والفيديو 3 والفيديو 4. تم وضع الخرزة المغناطيسية بشكل صحيح داخل أذين قلب الزرد ، مما يسمح بتدفق الدم دون عائق وعدم ملاحظة النزيف. بالإضافة إلى ذلك ، حافظت جدران القلب على سلامتها الهيكلية دون انهيار (الشكل 3 والفيديو 3). بعد 24 ساعة ، لم يظهر الجنين أي علامات على وذمة التامور ، مما يؤكد نجاح إجراء التطعيم (فيديو 4).

هذه ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

تركيب أجنة الزرد

كمية الاغاروز المستخدمة لتركيب الأجنة مهمة. يجب ألا تكون القبة المتكونة كبيرة بشكل مفرط ، لأن هذا يمكن أن يعيق التلاعب بالخرزة من السطح إلى الأجنة. على العكس من ذلك ، لا ينبغي أن تكون صغيرة جدا. يمكن أن يؤدي وجود حبات متعددة فوق الاغاروز ، موضوعة بالقرب من الأجنة وصفار البيض ، إلى حدوث ارتباك. يوصى بحجم يبلغ حوالي 350 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر Vermot على المناقشات والتعليقات على البروتوكول. نحن ممتنون لجميع موظفي منشأة إمبريال كوليدج لندن للأسماك. تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي: GA N°682939 و Additional Ventures (رقم الجائزة 1019496) و MRC (MR / X019837/1) و BBSRC (BB / Y00566X/1). تم دعم CV-P من خلال منحة قسم الهندسة الحيوية (إمبريال كوليدج لندن). تم دعم HF من قبل JSPS KAKENHI (23H04726 و 24K02207) ، وبرنامج JST FOREST (23719210) ، ومؤسسة Uehara Memorial Foundation ، ومؤسسة أبحاث علوم الخلية ، ومؤسسة Takeda للأبحاث الطبية ، ومؤسسة Novartis للأبحاث.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< قوي > المواد < / قوي >
المعدات الأساسية لتربية أسماك الزرد وتربيتها وجمع
الأجنة طبق زجاجي القاع (35 مم × 15 & nbsp ؛ مم)VWR International734-2905
كتلة حراريةEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
المجوهرات ملقطSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5 ، L 4 1/4 بوصة ، أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من سبائك Inox
2 ملEppendorf30120094
مجهر
مجسم<قوي > كواشف < / قوي >
4 مجم / مل محلول
ثلاثي الكيان دانيو المتوسطة (محلول مخزون 60x)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)Sigma-AldrichP7629
UltraPure نقطة انصهار منخفضة agaroseInvitrogen16520-050<
strong>Danieau's medium (محلول مخزون 60x)< / قوي>
34.8 جم كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS3014
1.6 جم KClسيجما-ألدريتشP9541
5.8 جم CaCl2 & middot ؛ 2H2Oسيجما ألدريتشC3306
9.78 جم MgCl2 & middot ؛ 6H2O Sigma-Aldrich442611-M
قم بإذابة المكونات في H2O إلى حجم نهائي قدره 2 لتر ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ، ثم الأوتوكلاف.
<قوي >4 مجم / مل محلول مخزون ثلاثي الكنائين< / قوي>
400 مجم من مسحوق التريكيين (ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سلفونات)Sigma-AldrichA5040
97.9 مل H2O
مزدوج 2.1 مل 1 م تريس (درجة الحموضة 9)
اضبط الرقم الهيدروجيني على 7 ، ثم قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
طبق بتري ماصة باستورمخزونمقطر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish HeartMechanical ForcesMagnetic BeadsHeart Valve DevelopmentCardiac MorphogenesisMechanotransduction PathwaysCalcium InfluxOptical ImagingMicrosurgeryCardiac Hemodynamics

Related Articles