مقالة منهجية

التصوير المجهري للفحص المجهري للزائفة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية غير المتجانسة

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67617

⸱

فبراير 14, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biophysics, UConn Health, 2School of Dental Medicine, UConn Health, 3Richard D. Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, UConn Health

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا شاملا لتقييم بقاء المضادات الحيوية ل Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus ، وتحويل البلازميدات إلى P. aeruginosa و S. aureus لإنشاء سلالات مراسل وتصور المتغيرات المظهرية ، مثل المثابرات ، عن طريق الفحص المجهري للتألق بفاصل زمني.

الملخص

ثبات المضادات الحيوية هو ظاهرة ينجو فيها عدد صغير من الخلايا البكتيرية في السكان المعرضين وراثيا للعلاج بالمضادات الحيوية التي تقتل الخلايا الأخرى المتطابقة وراثيا. يمكن للمثابرات البكتيرية استئناف التكاثر بمجرد انتهاء العلاج بالمضادات الحيوية ويعتقد عموما أنها تكمن وراء فشل العلاج السريري. أدى العمل الأخير الذي يسخر قوة الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني ، حيث يتم تصنيف البكتيريا بمراسلي النسخ الفلوري ، والمراسلين الانتقاليين ، و / أو الأصباغ لمجموعة متنوعة من الميزات الخلوية ، إلى تطوير فهمنا لثبتي الإشريكية القولونية بما يتجاوز ما يمكن تعلمه من فحوصات بقاء المضادات الحيوية على مستوى السكان. مثل هذه الأساليب أحادية الخلية ، بدلا من فحوصات السكان السائبة ، ضرورية لتحديد آليات تكوين الثبات والاستجابة للضرر والبقاء على قيد الحياة. ومع ذلك ، فإن طرق دراسة الثباتات في الأنواع المسببة للأمراض المهمة الأخرى في هذا المستوى من التفاصيل لا تزال محدودة.

توفر هذه الدراسة نهجا قابلا للتكيف للتصوير بفاصل زمني للزائفة الزنجارية (قضيب سالب الجرام) والمكورات العنقودية الذهبية (كوكوس موجب الجرام) أثناء العلاج بالمضادات الحيوية والتعافي. نناقش الأساليب الجينية الجزيئية لإدخال مراسلي الفلورسنت في هذه البكتيريا. باستخدام هؤلاء المراسلين ، بالإضافة إلى الأصباغ ، يمكننا تتبع التغيرات المظهرية والسمات المورفولوجية ومصير الخلايا الفردية استجابة للعلاج بالمضادات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، نحن قادرون على مراقبة الأنماط الظاهرية للمثابرين الفرديين أثناء إنعاشهم بعد العلاج. إجمالا ، يعمل هذا العمل كمورد للمهتمين بتتبع البقاء والتعبير الجيني للخلايا الفردية المعالجة بالمضادات الحيوية ، بما في ذلك الثباتات ، أثناء العلاج وبعده ، في مسببات الأمراض المهمة سريريا.

المقدمة

يمكن لمسببات الأمراض البكتيرية أن تتهرب من آثار المضادات الحيوية من خلال آليتين أساسيتين: مقاومة المضادات الحيوية ، والتي تنطوي على تغيرات جينية ، وتحمل النمط الظاهري ، والذي ينطوي على تغييرات غير جينية. مقاومة المضادات الحيوية هي ظاهرة مشفرة وراثيا تمنح قدرة خلية بكتيرية معينة ليس فقط على البقاء على قيد الحياة ولكن أيضا على التكاثر في وجود مضاد حيوي1. يحدث تحمل النمط الظاهري ، الذي يمكن أن يشمل البكتيريا التي تتحمل المضادات الحيوية أو الثابتة بالمضادات الحيوية ، عندما تتحمل الخلايا العلاج بالمضادات الحيوية المبيد للجراثيم دون اكتساب القدرة على التكاثر في وجود تركيز مثبط للمضاد الحيوي1،2. ما يميز التسامح عن المثابرة هو أن التسامح يشير إلى قدرة جميع السكان على البقاء على قيد الحياة في العلاج ، بينما يشير المثابرة إلى مجموعة فرعية من مجموعة سكانية متساوية المنشأ ولكنها غير متجانسة ظاهريا تنجو من العلاج بالمضادات الحيوية. عندما يتم علاج ثقافة نسيلة بالمضادات الحيوية المضادة للجراثيم ويتم رسم الناجين الذين بقوا في المزرعة مع مرور الوقت على مقياس خطي لوغاريتمي ، عادة ما يتم اكتشاف منحنى ثنائي الطور عند وجود المثابرين. على هذه المنحنيات ، تظهر المرحلة الأولى أن غالبية السكان يقتلون بسرعة نسبيا ، وتشير المرحلة الثانية إلى أن جزءا ثابتا من المضادات الحيوية يقتل بمعدل أبطأ أو لا يقتل على الإطلاق1،2.

يمثل استمرار المضادات الحيوية عبئا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية العالمية. على سبيل المثال ، يعتقد أن المكورات العنقودية الذهبية والمستثبرات الزائفة الزنجارية ، والتي تركز عليها هذه المقالة ، تسبب التهابات المضادات الحيوية المتمردة ، بما في ذلك التهابات مجرى الهواء المتكررة لدى المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي والتهابات الجروح المزمنة3،4. لذلك ، فإن زيادة توضيح بيولوجيا الخلية المستمرة وبرامج النمط الظاهري أمر بالغ الأهمية. بينما تم إحراز تقدم في فهم كيفية تكوين المثابرين وإنعاشهم ، تظل الفجوات المعرفية الحرجة المتعلقة بتنسيق إعادة البرمجة الأيضية والأحداث الجزيئية في الخلايا الفردية التي تكمن وراء الثبات5،6،7،8.

أثبتت الدراسة الفعالة للمثابرة أنها تمثل تحديا تقنيا. نظرا لأن الثبات لا يمكن ملاحظته إلا في مجموعة فرعية صغيرة من مجموعة بكتيرية ، فإن التقنيات التي تأخذ عينات من مجموعات البكتيريا السائبة غالبا ما تفشل في التقاط المعلومات البيولوجية ذات الصلة1،2،8،9،10. علاوة على ذلك ، نظرا لأن التغيرات المظهرية التي تكمن وراء الثبات عابرة وغير وراثية ، فإن تتبع مصير الخلايا الثابتة يمكن أن يكون معقدا1،8،9،10،11. بمجرد أن تستأنف البكتيريا النمو ، فإنها يمكن أن تنقسم وتؤدي إلى ظهور كل من الثباتات وغير المثابرة ، مما يجعل من المستحيل إثراء المجموعات الثابتة النقية عن طريق الزراعة. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة إلى تقنيات يمكن أن تفي بالمعايير التالية: 1) القدرة على التقاط المعلومات البيولوجية للخلايا الحية والمفردة و 2) القدرة على استخدامها جنبا إلى جنب مع الأصباغ الفلورية والمجسات وأجهزة الاستشعار والمراسلين التي تسمح باستجواب الأنماط الظاهرية للخلايا الفردية في مجموعات غير متجانسة بمرور الوقت.

وفرت التطورات الحديثة في تقنيات الخلية المفردة وسيلة للتحقيق الفعال في عدم التجانس البكتيري والتغلب على هذه العقبات في دراسة الثبات12،13. تشمل بعض هذه التقنيات الفحص المجهري الفلوري ، وقياس التدفق الخلوي / فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، والموائع الدقيقة ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية12،13. هنا ، نصف بروتوكولات توضيح فسيولوجيا الخلية المفردة المستمرة باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني لسلالات المراسلين النسخية أو الانتقالية. الفحص المجهري الفلوري هو تقنية قوية تفي بمعايير دراسة الأنماط الظاهرية الثابتة ، وهي القدرة على تحديد الخلايا الفردية في عدد كبير من السكان التي تنتشر بعد إزالة المضادات الحيوية وبالتالي يمكن تعريفها على أنها ثابتة. مع إدخال تقنيات الكاميرا الآلية والغرف المحتضنة ، يمكن الوصول إلى التقاط الخلايا البكتيرية الحية على نطاق واسع في مجال علم الأحياء الدقيقة. بشكل حاسم ، يوفر الفحص المجهري بفاصل زمني القدرة على تصور الخلايا المفردة في الوقت الفعلي ، على مدار ساعات وحتى أيام ، مما يجعل من الممكن تتبع البكتيريا قبل وأثناء وبعد العلاج بالمضادات الحيوية14،15،16. تتمتع الرؤى المستقاة من هذه التحقيقات التي تسخر الفحص المجهري بفاصل زمني بإمكانيات هائلة لتوليد نظرة ثاقبة للآليات المعقدة لعلم الأحياء المستمر.

البروتوكول

1. توليد سلالات مراسل الفلورسنت من  المكورات العنقودية الذهبية عن طريق التحويل والتنبيغ

ملاحظة: تحتوي سلالات المراسل على بروتين فلوري للإشارة إلى التعبير عن جين أو بروتين ذي أهمية. يتميز مراسلو النسخ بنسخة مكررة من تسلسل المحفز الأصلي لجين ذي أهمية في المنبع من بروتين الفلورسنت بحيث يزداد التألق مع زيادة التعبير عن جين ذي أهمية. يربط المراسلون الانتقاليون إطارات القراءة المفتوحة لبروتين الفلورسنت والبروتين ذي الأهمية بموصل ببتيد مرن. يمكن أن يكشف تصور سلالات المراسل باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية ما إذا كان الجين / البروتين المعين المعني مرتبطا بأشكال خلوية معينة أو مصائر خلوية معينة (الشكل 1 ، الفيديو التكميلي 1 ، والفيديو التكميلي 2). اختر بروتين فلورسنت محسن للكودون للمكورات العنقودية الذهبية. بينما تستخدم هذه الدراسة sGFP من pCM29 الموهوب من الدكتور ألكسندر هورسويل ، فإن مجموعة الأدوات الجينية لمكتبة Nebraska Transposon Mutant Library تحتوي على بلازميدات تحمل sGFP و eYFP و eCFP و DsRed.T3 و eqFP65017،18.

  1. تحويل بلازميدات المراسل إلى المكورات العنقودية الذهبية RN4220.
    ملاحظة: تم اقتباس قسم البروتوكول التالي من ورشة عمل أساسيات علم الوراثة والتمثيل الغذائي للمكورات العنقودية في المركز الطبي بجامعة نبراسكا19،20.
    1. أولا ، قم بإعداد المكورات العنقودية الذهبية RN4220 ذات الكفاءة الكهربائية. تحضير 200 مل من مرق B2 عن طريق الجمع بين 2 جم من أحماض الكازامينو ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 2 مل من 10٪ K2HPO4 ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 2 مل من محلول الجلوكوز بنسبة 50٪ ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم. ارفع الحجم إلى 100 مل بماء معقم فائق النقاء. تخلط لفترة وجيزة عند 37 درجة مئوية لإذابة المكونات وتعقيمها باستخدام مرشح أعلى الزجاجة (حجم المسام 0.22 ميكرومتر).
    2. تلقيح S. aureus RN4220 من مخزون مجمد مخزن عند -80 درجة مئوية في 25٪ جلسرين إلى 30 مل من مرق B2 في قارورة محيرة سعة 250 مل واحتضانها لمدة 18 ساعة عند 30 درجة مئوية ، واهتز عند 125 دورة في الدقيقة.
    3. احتضن قارورتين محيرتين سعة 250 مل مع 50 مل من مرق B2 لكل منهما عند 37 درجة مئوية طوال الليل لتسخين الوسائط مسبقا لليوم التالي.
    4. في اليوم التالي ، قم بقياسOD 600 للثقافة الليلية. أضف ما يكفي من الثقافة الليلية إلى كل قارورة تحتوي على 50 مل من مرق B2 للحصول على OD600 نهائي من 0.25.
    5. احتضان عند 37 درجة مئوية ، ويهتز عند 250 دورة في الدقيقة ، حتى يصل OD600 إلى 0.35-0.4.
      ملاحظة: تحقق من OD600 بعد حوالي 30 دقيقة من التثقيف الفرعي للتأكد من أن الثقافة لا تنمو بعد 0.35-0.4. إذا لم يصل OD600 إلى 0.35-0.4 في غضون ساعة واحدة من الزراعة الفرعية ، فقم بالتخلي عن الإجراء وحاول مرة أخرى في اليوم التالي. نمت البكتيريا على الأرجح بين عشية وضحاها وكانت عميقة جدا في المرحلة الثابتة.
    6. بمجرد أن تصل المزرعة إلى مرحلة منتصف السجل ، اسكب المزرعة من كل قارورة في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق.
    7. صب المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من الماء المعقم بدرجة حرارة الغرفة (RT). نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    8. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 21,000 × جم لمدة 30 ثانية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليقها في 1 مل من ماء RT المعقم. كرر الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية وإعادة التعليق في 1 مل من خطوات الماء مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
    9. الطرد المركزي للخلايا ، وإزالة الماء ، ثم إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من RT معقم 10٪ جلسرين (في الماء ، مفلتر معقم) واتركه في RT لمدة 15 دقيقة.
    10. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 21,000 × جم لمدة 30 ثانية ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل أخرى من الجلسرين المعقم RT 10٪. هذه الخلايا الآن قادرة على الكفاءة الكهربائية.
    11. Aliquot 70 ميكرولتر من الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء المفاجئ وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
    12. لتحويل المكورات العنقودية الذهبية RN4220 ذات الكفاءة الكهربائية ، قم بإذابة مجموعة من الخلايا على الجليد. أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا ، ونفض العينة للخلط ، واحتضن على الجليد لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بالكهرباء للخلايا والسماح لها بالتعافي في 390 ميكرولتر من وسائط B2 لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة ، ومحولات الألواح على أجار الصويا التربتيك الانتقائي.
      ملاحظة: تتميز معظم نواقل المكوك المستخدمة في هذه الدراسة بشريط مقاوم للأمبيسلين للاختيار في بكتريا قولونية (100 ميكروغرام / مل) وكلورامفينيكول- (10 ميكروغرام / مل) أو إريثروميسين- (Erm ، 10 ميكروغرام / مل) كاسيت مقاومة للاختيار في المكورات العنقودية الذهبية. العديد من سلالات المكورات العنقودية الذهبية التي تستخدم بشكل روتيني في المختبر مقاومة ل Erm. تأكد من أن سلالة الاهتمام متوافقة مع المضاد الحيوي الانتقائي قبل استخدام ناقل مكوكي معين. من المهم تقليل حجم الحمض النووي المضاف إلى الخلايا (أي <5 ميكرولتر) لمنع الانحناء ، والذي يحدث عندما تكون العينة موصلة للغاية أثناء التثقيب الكهربائي. سيساعد تنقية التركيزات العالية (≥300 نانوغرام / ميكرولتر) من الحمض النووي البلازميد من الإشريكية القولونية في الحفاظ على انخفاض الأحجام.
  2. نشر العاثيات على المحولة S. aureus RN4220.
    ملاحظة: تم اقتباس قسم البروتوكول التالي من طرق Krausz و Bose21وأولسون22. اثنان من العاثيات الأكثر استخداما ل S. aureus التنبيغ هي φ11 و 80α. إجراء حصاد كلاهما هو نفسه ، باستثناء أننا نحصل على φ11 من S. aureus RN451 و 80α من S. aureus RN10359. تم استخدام φ11 بنجاح مع السلالات الشائعة JE2 و HG003 ، من بين أمور أخرى ، ويستخدم في هذا البروتوكول23,24. ومع ذلك ، قد لا تقوم هذه العاثيات بتحويل العزلات السريرية التي لها مقاومة مختلفة للعاثيات بكفاءة. راجع منشورات Krausz و Bose21 وأولسون22 لطريقة لتحضير φ11 وتحديد عيار العاثية.
    1. لتحويل بلازميد المراسل ، قم بإعداد ستة أطباق أجار الصويا التريبتيك (TSA) مع 5 ملي مولار CaCl2 والتركيز المناسب للمضاد الحيوي الانتقائي. Streak S. aureus RN4220 تحولت مع بلازميد المراسل إلى لوحة TSA تحتوي على المضاد الحيوي الانتقائي ولا يحتوي على CaCl2 وتحتضن بين عشية وضحاها.
    2. في اليوم التالي ، قم بتشغيل حاضنة أو حمام مائي إلى 56 درجة مئوية. قم بتسمية ستة أنابيب ذات غطاء مفاجئ سعة 5 مل 1 × 104 إلى 1 × 109 ، وقم بتسمية 40 ميكرولتر من 500 ملي مولار CaCl2 في كل أنبوب غطاء مفاجئ.
    3. قم بإذابة TSA الناعم (0.5٪ أجار) في الميكروويف مع فك الغطاء لمنع تراكم الضغط مع الحفاظ على العقم. ثم ، قم بإدخال 4 مل في كل من أنابيب الغطاء المفاجئ. اقلب الأنابيب للخلط ، ثم ضعها في الحاضنة 56 درجة مئوية لمنع الأجار الناعم من التصلب.
    4. خفف مخزون العاثيات إلى 1 × 1010 PFU / مل في مرق الصويا التريبتيك (TSB) + 5 ملي CaCl2. أضف 100 ميكرولتر من 1 × 1010 PFU/مل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 900 ميكرولتر من TSB + 5 ملي مولار CaCl2 للتركيز النهائي 1 × 109 PFU/mL. ثم يخفف بشكل متسلسل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة إضافية تحتوي على 900 ميكرولتر من TSB + 5 ملي CaCl2 حتى تركيز 1 × 104 PFU / مل. قم بتسمية كل من ألواح أجار المضادات الحيوية الستة TSA + 5 mMCaCl 2 + بتخفيف تسلسلي: 1 × 104 إلى 1 ×10 9 PFU / مل.
    5. أعد تعليق المكورات العنقودية الذهبية RN4220 التي تحتوي على البلازميد في 1 مل من TSB + 5 ملي CaCl2. قم بإزالة أنبوب الغطاءالمفاجئ 10 9 من الحاضنة وأضف بسرعة 10 ميكرولتر من RN4220 المعلق الذي يحتوي على البلازميد و 100 ميكرولتر من تخفيف العاثية 1 × 109 PFU / مل ، واقلبها للخلط ، واسكب المحتويات على TSA + 5 ملي مولار CaCl2 + لوحة أجار المضادات الحيوية الانتقائية.
    6. قم بتنفيذ هذا الإجراء لتخفيفات العاثيات المتبقية والألواح الخاصة بها. اسمح للأجار الناعم بالتصلب على الألواح ، ثم احتضانه مع توجيه الأجار الناعم لأعلى طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    7. في اليوم التالي ، تأكد من ظهور اللويحات (مناطق الإزالة على العشب البكتيري) على الألواح (الشكل 2 أ). تمثل اللويحات مناطق التحلل التي أصاب فيها العاثيات RN4220 بنجاح ، وستتناول بعض العاثيات البلازميد المهم. حدد اللوحة التي تحتوي على مخزون العاثيات الأقل تخفيفا والذي يحتوي على تحلل شبه ملتقى (على سبيل المثال: 1 × 109 PFU / مل من العاثية) بالإضافة إلى الألواح التي تلقت التخفيفين أدناه (في هذه الحالة ، 1 × 108 PFU / مل و 1 × 107 PFU / مل ، والتي يجب أن يكون لكليهما تحلل قريب من التقاء).
    8. أضف 3 مل من TSB + 5 ملي CaCl2 إلى الأقل تخفيفا من هذه الألواح (1 × 109 PFU / مل ، على سبيل المثال). استخدم موزعة خلايا معقمة على شكل حرف L لكشط طبقة الأجار الناعم برفق من الأجار العادي (الشكل 2 ب). استخدم موزع الخلايا لتعطيل الأجار قدر الإمكان لتسهيل إطلاق العاثية من الأجار الناعم.
    9. بمجرد تعطيل الأجار الناعم على اللوحة الأولى تماما ، اسكب الملاط الناعم والمرق برفق على الطبق التالي (في هذه الحالة ، 1 × 108 PFU / مل). اكشط وقم بتعطيل الأجار الناعم على هذه اللوحة ، ثم صب الملاط الناتج على اللوحة النهائية وكرر.
    10. بعد تحضير ملاط أجار الناعم من جميع الألواح الثلاثة ، اسكب الملاط برفق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. الماصة برفق لزيادة تعطيل الأجار الناعم ، ولكن تجنب تكوين الفقاعات. لا تقم بالدوامة ، لأنها قد تتلف العاثية وتقلل من العيار.
    11. جهاز الطرد المركزي ملاط الأجار الناعم عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق في RT. صب المادة الطافية برفق في حقنة متصلة بمرشح 0.45 ميكرومتر.
      ملاحظة: من الضروري الصب برفق وتجنب إدخال قطع من الأجار في الفلتر. ستؤدي هذه القطع إلى انسداد المرشح ومنع تصفية المادة الطافية المتبقية ، مما يقلل من العيار.
    12. حدد عيار محللة العاثية الناتجة باستخدام النوع البري RN422021.
  3. أدخل بلازميدات المراسل في سلالات المكورات العنقودية الذهبية ذات الأهمية عن طريق التنبيغ.
    1. تحضير ثماني ألواح TSA تحتوي على 500 ميكروغرام / مل سترات الصوديوم والتركيز المناسب من المضادات الحيوية الانتقائية. قم بربط المتلقي المطلوب بكثافة S. aureus سلالة على TSA عادي واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    2. في اليوم التالي ، امسح اللوحة وأعد تعليق السلالة المتلقية في 1 مل من TSB + 5 ملي CaCl2.
    3. قم بتخفيف مخزون العاثيات الذي يحمل بلازميد المراسل المطلوب إلى 1 ×10 10 PFU / مل.
    4. امزج 1.5 مل من TSB + 5 ملي CaCl2 ، و 0.5 مل من سلالة المتلقي المعلق ، و 0.5 مل من مخزون العاثيات المخفف في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. احتضن عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة ، لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: لا يوصى بأوقات حضانة أطول لأنها من المحتمل أن تقلل من كفاءة التنبيغ عندما تبدأ العاثية في تحلل الخلايا المتلقية.
    5. بعد ذلك مباشرة ، أضف 1 مل من سترات الصوديوم الباردة المعقمة 0.02 M (في الماء) إلى الأنبوب المخروطي وجهاز الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم, أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من سترات الصوديوم المثلجة 0.02 M.
    6. نشر 100 ميكرولتر من الحصص على كل من ألواح TSA الستة التي تحتوي على 500 ميكروغرام / مل سترات الصوديوم والتركيز المناسب من المضاد الحيوي الانتقائي للاختيار من أجل المنقولات. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
    7. في اليوم التالي ، قم بوضع مستعمرات فردية من ألواح التنبيغ على لوحين متبقيين من TSA يحتويان على 500 ميكروغرام / مل من سترات الصوديوم والتركيز المناسب للمضادات الحيوية الانتقائية. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تساعد خطوة المرور هذه على ألواح سترات الصوديوم الإضافية على تقليل عيار العاثية حول الخلايا المنقولة ، مما يمنع التحلل22.
    8. اختر مستعمرات فردية من صفيحة الخط ، وقم بتنمية الخلايا إلى المرحلة الأسية في TSB الذي يحتوي على المضاد الحيوي الانتقائي ، وقم بتخزينه في 25٪ من الجلسرين عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

2. توليد سلالات مراسل الفلورسنت من  المتصورة الزنجارية عن طريق الاقتران

ملاحظة: نقل بلازميد مراسل إلى P. aeruginosa من بكتريا قولونية يمكن أن يتم سلالة الاستنساخ عن طريق التزاوج ثلاثي الأبوية25. سلالة مانحة من بكتريا قولونية تحمل البلازميد محل الاهتمام (والذي يجب أن يحتوي على oriT للنقل الزوجي) ، الإشريكية القولونية HB101 + pRK2013 - سلالة مساعدة لتسهيل الاقتران (استخدم 50 ميكروغرام / مل كاناميسين لصيانة البلازميد pRK2013) ، و P. aeruginosa السلالة المتلقية التي ستتلقى البلازميد مطلوبة. في هذا المثال ، يحتوي البلازميد محل الاهتمام على علامة مقاومة التتراسيكلين (Tet) ، لذلك فإن أي بكتريا قولونية مع البلازميد ستحتاج إلى 10 ميكروغرام / مل تيت ، و P. aeruginosa مع البلازميد ستحتاج إلى 75 ميكروغرام / مل Tet للاختيار26.

  1. تلقيح البكتيريا من المخزونات المجمدة المخزنة عند -80 درجة مئوية في 25٪ من الجلسرين في مرق ليسوجيني (LB) بالمضاد الحيوي المناسب للنمو بين عشية وضحاها ، مع رجها عند 225 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي ، وزعي 200 ميكرولتر من كل مزرعة سائلة بين عشية وضحاها على صفيحة أجار LB مع المضاد الحيوي الانتقائي المناسب. اعتمادا على عدد التزاوج التحويلي الذي يجب إجراؤه ، انشر المزيد من اللوحات لسلالات المساعد والمتبرع. يوصى بلوحة واحدة من المساعد / المتبرع لكل تحويل. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية للحصول على مروج كثيفة من كل سلالة.
  3. في اليوم التالي ، اجمع مروج النمو عن طريق مسح كل سطح لوحة بقطعة قطن معقمة ومسحها على طول أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز الطرد المركزي لكل أنبوب لفترة وجيزة (نبض لمدة 5 ثوان) لجمع الخلايا إلى أسفل الأنبوب. أعد تعليق كل حبيبات خلية في 200 ميكرولتر من LB.
    ملاحظة: يجب أن تبدو عمليات إعادة التعليق سميكة جدا وغير شفافة وتخلصت من التكتلات.
  4. في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة لكل تزاوج ، اجمع بين 5 ميكرولتر من السلالة المتصورة الزنجارية المتلقية ، و 160 ميكرولتر من سلالة الإشريكية القولونية المانحة التي تحمل البلازميد محل الاهتمام ، و 160 ميكرولتر من الإشريكية القولونية المساعد HB101 + pRK2013. اخلطيهم برفق ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل ، ثم ضعي 50 ميكرولتر من المزيج على طبق أجار LB مجفف مسبقا. أيضا ، ضع 20 ميكرولتر من كل سلالة فردية في LB agar لعناصر التحكم. اترك البقع تجف في الطبق تماما ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 3-6 ساعات.
    ملاحظة: يمنع التجفيف المسبق لأغار LB البقعة سعة 50 ميكرولتر من الانتشار عبر السطح وبالتالي يجبر الخلايا على التفاعل داخل منطقة أصغر.
  5. بعد الحضانة ، اسحب طرف الماصة برفق عبر بقعة التزاوج لنقل بعض الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع الخلايا في الجزء السفلي من الأنبوب. أعد تعليق 200 ميكرولتر من LB وقم بإعادة التعليق بالكامل إلى LB + Irgasan (Igr ؛ 25 ميكروغرام / مل) + Tet (75 ميكروغرام / مل) لوحة أجار.
    ملاحظة: P. aeruginosa مقاوم جوهريا ل Igrasan ، ويحتوي البلازميد المورد للاهتمام على علامة مقاومة Tet ، لذلك يجب أن يكون P . aeruginosa قادرا على النمو على ألواح LB + Irgasan + Tet. اعتمادا على كفاءة التحويل ، قد يؤدي تعليق بقعة التزاوج بأكملها وطلاءها إلى عشب من المحولات في اليوم التالي. لتحقيق مستعمرات فردية ، إما (أنا) إعادة تعليق بقعة التزاوج بأكملها بحجم أكبر من LB ثم لوحة 200 ميكرولتر منها أو (ii) نقل جزء صغير من بقعة التزاوج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ثم إعادة تعليقها في 200 ميكرولتر ولوحة.
  6. باستخدام نقاط التحكم في كل سلالة فردية ، اسحب برفق بعض بقعة الخلية الكثيفة على طرف الماصة ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من LB ، ثم ضع 50 ميكرولتر على لوحة أجار LB + Irgasan + Tet (يمكن وضع نقاط تحكم متعددة على نفس لوحة أجار). دع البقع تجف تماما. احتضن جميع الألواح لمدة 16-20 ساعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لنقاط التحكم ، فإن الهدف هو التحقق من أن صفيحة المضادات الحيوية انتقائية لمحولات P. aeruginosa . إذا كانت نقاط التحكم مركزة للغاية عند رصدها على ألواح LB + Irgasan + Tet agar ، فسيكون من الصعب تحديد ما إذا كان الاختيار قد نجح في اليوم التالي لأنه ستكون هناك هالة من الخلايا الميتة التي قد يتم الخلط بينها وبين النمو.
  7. في اليوم التالي ، تأكد من انتقائية المضادات الحيوية لألواح LB + Irgasan + Tet من خلال ملاحظة عدم نمو الخلايا لنقاط التحكم في السلالة الفردية.
    ملاحظة: المستعمرات التي تظهر على التزاوج الثلاثي LB + Igrasan + Tet هي P. aeruginosa محولات تحمل البلازميد محل الاهتمام.
  8. اختياري لالتقاط المستعمرات وخطها على LB + Irgasan + Tet agar وتنمو بين عشية وضحاها للتخلص من الإشريكية القولونية الميتة الزائدة من خليط التزاوج.
  9. اختر مستعمرات فردية ، وتنمو لمدة 3-6 ساعات في LB السائل + Tet (75 ميكروغرام / مل) حتى تصبح عكرة بشكل واضح ، ثم قم بتخزين المخزونات المجمدة في 25٪ جلسرين (500 ميكرولتر مزرعة خلية + 500 ميكرولتر 50٪ جلسرين في الماء). تحقق من تحويل المستنسخة بنجاح عن طريق مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل متبوعا بتسلسل سانجر أو البلازميد الكامل.

3. تحديد جرعات المضادات الحيوية للمقايسات المستمرة

ملاحظة: لتحديد جرعة من مضاد حيوي معين لعلاج البكتيريا للتجارب المستمرة ، قم أولا بقياس الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للمضاد الحيوي ضد السلالة البكتيرية ذات الأهمية. يمكن تحقيق ذلك إما باستخدام طريقة التخفيف الدقيق للمرق - وهو نهج يؤيده معهد المعايير السريرية والمختبرية (CLSI) - أو اختبار مقياس الضغط (الاختبار الإلكتروني) ، والذي يتم إجراؤه باستخدام شرائط اختبار مع مجموعة من جرعات المضادات الحيوية27. بمجرد تحديد MIC ، اختر ما لا يقل عن خمسة تركيزات من المضاد الحيوي تتراوح من 1 إلى 100 ضعف MIC لعلاج الخلايا.

  1. تلقيح البكتيريا من المخزونات المجمدة المخزنة عند -80 درجة مئوية في 25٪ من الجلسرين إلى 2 مل من MHB المعدل بالكاتيون (CA-MHB) أو أي وسائط أخرى غنية بالمغذيات. قم بزراعة الخلايا لمدة 4 ساعات تقريبا عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة قبل نقل 125 ميكرولتر من المزرعة إلى 25 مل من الوسائط الطازجة المحددة كيميائيا في قارورة إرلينماير محيرة سعة 250 مل. تنمو البكتيريا لمدة 16 ساعة (إلى المرحلة الثابتة) عند 37 درجة مئوية ، وتهتز عند 250 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: عادة ما تستخدم وسائط الملح القاعدية (BSM) مع السكسينات كمصدر الكربون الوحيد في P. aeruginosa التجارب وعادة ما تستخدم الوسائط الغنية المحددة كيميائيا في تجارب S. aureus 28،29،30،31.
  2. في صباح اليوم التالي ، قم بإعداد مخزون 100x من المضادات الحيوية (في المذيبات المعنية) للنطاق المطلوب من تركيزات فوق MIC. أضف 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى أنابيب اختبار فردية.
  3. قم بقياس OD600 للاستزراع الليلي لتأكيد تعكر الطور الثابت. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من الثقافة بشكل متسلسل وقم بوضع التخفيفات على ألواح أجار المغذية - مثل LB agar أو CA-MHB agar أو TSA - لتحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) قبل العلاج بالمضادات الحيوية.
  4. للعلاج بالمضادات الحيوية ، قم بتوزيع 1 مل من حصة المزرعة في أنابيب الاختبار التي تحتوي على 10 ميكرولتر من تركيزات المضادات الحيوية 100x. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة ، لمدة كافية لقتل غير المثابرين في السكان ، تاركين المثابرين كخلايا مكونة للمستعمرة الوحيدة.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف مدة العلاج حسب التجربة والسلالة البكتيرية التي يتم اختبارها. عادة المكورات العنقودية الذهبية يتم علاجها لمدة 5 ساعات أو 7 ساعات و P. aeruginosa لمدة 7 ساعات أو 24 ساعة. بشكل عام ، يمكن استخدام أي نقطة زمنية في المرحلة الثانية من اختبار البقاء المعتمد على الوقت لأنه من المتوقع أن تكون الخلايا المتبقية في المرحلة الثانية ثابتة.
  5. بعد العلاج بالمضادات الحيوية ، انقل 100 ميكرولتر من الخلايا من أنابيب الاختبار إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 900 ميكرولتر من محلول ملحي معقم بفوسفات (PBS). حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي في RT عند 21,000 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة 900 ميكرولتر من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 900 ميكرولتر من PBS المعقم. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى على الأقل لتقليل المضادات الحيوية المتبقية إلى مستويات فرعية من الميكروفونات.
  6. قم بتخفيف المزرعة بشكل متسلسل 10 أضعاف (ست مرات) ولوحة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح أجار المغذية. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: استخدم ألواح مستديرة القاع غير المعالجة ذات 96 بئرا للتخفيف التسلسلي وخلايا الصفائح على ألواح أجار مربعة باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  7. في اليوم التالي ، عد المستعمرات عند كل تركيز مضاد حيوي. جزء البقاء على قيد الحياة مؤامرة (CFU في نهاية العلاج / CFU قبل العلاج) ضد التركيز على مقياس خطي لوغاريتميامي. لاختيار تركيز الدواء للمقايسات المستقبلية الثابتة ، حدد تركيزا في المرحلة الثانية من المنحنى ثنائي الطور (الشكل 3).

4. تصوير الخلايا أثناء العلاج بالمضادات الحيوية أو التعافي

  1. تحضير ضمادات الاغاروز وعينات الخلايا للتصوير بفاصل زمني
    ملاحظة: تم تطوير بروتوكول تحضير العينة التالي كبديل سهل الاستخدام وفعال من حيث التكلفة لطرق "شطيرة" الاغاروز التقليدية14,16. يتجنب استخدام طبق غطاء قابل للتبديل الحاجة إلى الشحوم الفوضوية أو طلاء الأظافر لإغلاق العينة ، مما قد يحد من تهوية العينة. يتم وضع الاغاروز في طبق الغطاء القابل للتبديل مع وجود الغطاء في مكانه بالفعل ، مما يخلق أسطح أغاروز مستوية بشكل موثوق مقارنة بمستحضرات وسادة الاغاروز اليدوية. بشكل عام ، سمحت هذه الطريقة بتصوير عينات مع تركيز محسن عبر مجال الرؤية ولفترات أطول بسبب الترطيب المستقر. تستخدم الطريقة الموضحة هنا لتصور البكتيريا أثناء العلاج بالمضادات الحيوية (الشكل 4, فيديو تكميلي 3و فيديو تكميلي 4). لتصور المثابرين أثناء إنعاشهم واستيقاظهم بعد العلاج بالمضادات الحيوية (الشكل 5, فيديو تكميلي 5و فيديو تكميلي 6) ، قم بإعداد ضمادات الاغاروز بوسائط مزرعة جديدة بدلا من الوسائط المستهلكة ولا تضف المضادات الحيوية إلى الفوط (باستثناء تلك المضافة لصيانة البلازميد / اختيار المضادات الحيوية).
    1. ضع غطاء معقم مقاس 30 مم (سمك # 1.5) في الجزء السفلي من قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ لطبق غطاء قابل للتبديل ("الغرفة"). قم بربط ملحق البولي كربونات برفق في القاعدة بحيث يشكل غطاء الغطاء مقاس 30 مم قاعدة الغرفة ، وأغلقه في مكانه عن طريق ضغط حلقة السيليكون المرفقة. كرر هذه الخطوة لإعداد غرفة مكررة.
      ملاحظة: يوصى بإعداد نسخ مكررة لكل تجربة في حالة أن يكون تحضير إحدى الغرف دون المستوى الأمثل. يتم وضع مقسم مخصص مطبوع ثلاثي الأبعاد مقابل غطاء 30 مم لمنع الخلايا المتحركة مثل P. aeruginosa من التلوث المتبادل ولتوفير معالم لمواقع العينات. يتوفر ملف STL للطباعة ثلاثية الأبعاد في الملف التكميلي 1.
    2. تحضير 1.5٪ agarose في أنبوب مخروطي سعة 50 مل باستخدام الوسائط التي تختارها. حرك برفق حتى يمتزج.
      ملاحظة: لتصوير خلايا الطور الثابت أثناء العلاج ، يتم استخدام الوسائط المستهلكة الخالية من الخلايا من مزرعة عشية وضحاها في المرحلة الثابتة كوسيط أساسي. عادة ، يتم تحضير وسائط الاغاروز على شكل 0.105 غرام من الاغاروز في 7 مل من الوسائط لإعداد غرفتين. تتطلب كل غرفة 2 مل من وسائط الاغاروز ، والفائض مفيد لتجنب فقاعات الهواء عند سحب العينات.
    3. ضع المخروطي سعة 50 مل في دورق زجاجي أو حامل آمن للاستخدام في الميكروويف (تأكد من أن الغطاء مفكوك). الميكروويف على ارتفاع ، وتوقف كل 3-4 ثوان للدوران والخلط. توقف مؤقتا واخلط كثيرا لمنع خليط الاغاروز من الغليان.
      1. بعد ~ 1 دقيقة من وقت التسخين الإجمالي ، تحقق لمعرفة ما إذا كان هناك أي أغاروز مرئي لم يذوب في الخليط. إذا كان الخليط صافيا بشكل موحد ، اترك وسط الاغاروز يبرد إلى ~ 60 درجة مئوية لفترة وجيزة قبل إضافة أي أدوية أو أصباغ إضافية. قم بالتدوير برفق للخلط وتجنب تكوين فقاعات الهواء.
        ملاحظة: يمكن إضافة يوديد البروبيديوم (16 ميكرومتر ل P. aeruginosa أو 1.6 ميكرومتر للمكورات العنقودية الذهبية) لتصور عندما تفقد الخلايا قابليتها للحياة.
    4. تتحرك بسرعة لمنع وسائط الاغاروز من التصلب ، قم بإدخال الماصة 2 مل من وسائط الاغاروز في الغرفة باستخدام غطاء 30 مم. ضع برفق غطاء معقم 25 مم (# 1.5 سمك) فوق وسائط الاغاروز في فتحة الغرفة العلوية. يساعد ذلك على منع جفاف وسادة الاغاروز ويضمن سطحا علويا مستويا للأغاروز للحصول على تصوير مثالي لتباين الطور. اترك الوسادة تتصلب لمدة 1-2 ساعة.
    5. بعد أن تصلب الوسادة ، قم بإعداد الخلايا ليتم تصويرها عن طريق تخفيفها إلى كثافة متناثرة بشكل مناسب في PBS لتصور الخلايا المفردة. هنا ، يتم تخفيف الخلايا إلى OD600 0.01-0.05.
    6. على قسيمة الغطاء مقاس 25 مم ، استخدم علامة دائمة ذات طرف رفيع لتحديد مواقع / هويات كل عينة مصنفة على الوسادة. اقلب الغرفة بحيث تكون حلقة القاعدة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ متجهة لأعلى وأمسك بعناية ملحق البولي كربونات تحتها أثناء فك خيوط القاعدة. ضع القاعدة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ على الجانب. حرك الغطاء مقاس 30 مم بعناية من الوسادة وتخلص منه.
      ملاحظة: قم بإزالة زلة الغطاء مقاس 30 مم عن طريق الانزلاق أفقيا ، واحرص على عدم وضع مسافة بادئة لسطح الاغاروز. تجنب أيضا العمل على سطح الاغاروز المكشوف: أي غبار يسقط عليه سيؤثر على جودة الصورة ويمكن أن يلوث الوسادة.
    7. باستخدام العلامات الموجودة على الغطاء 25 مم للتوجيه ، ضع 5 ميكرولتر من الخلايا المخففة إلى المواقع المعنية على وسادة الاغاروز. أضف ثلاث بقع سعة 5 ميكرولتر (اضبط ذلك حسب الحاجة ، على سبيل المثال ، بقع 4 × 4 ميكرولتر ، إلخ). بمجرد أن تجف البقع تماما ، ضع غطاء جديد معقم مقاس 30 مم برفق فوق الوسادة.
    8. أمسك ملحق البولي كربونات بيد واحدة ، وباليد الأخرى ، أعد ربط قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ ببطء مرة أخرى فوق الغطاء الجديد. يكفي الخيوط حتى إحكام الإصبع لضغط حلقة السيليكون O وإغلاق الغرفة.
      ملاحظة: احرص على عدم الإفراط في الشد - إذا تم ضغط الغطاء مقاس 30 مم على سطح العينة بواسطة قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ ولفها بشكل متكرر ، يمكن أن تنتشر الخلايا في نمط شعاعي ، مما قد يتسبب في تلوث العينة.
    9. بمجرد إغلاق الغرفة ، لاحظ ما إذا كان الاغاروز يلامس سطح الغطاء 30 مم ؛ في هذه المرحلة ، عادة ما يكون هناك بعض التلامس السطحي ، ولكن ليس كاملا. استخدم الطرف الحاد لزوج من الملقط أو أداة مماثلة للضغط برفق على زلة الغطاء مقاس 25 مم حتى يلامس الاغاروز الغطاء 30 مم بالتساوي عبر السطح بالكامل.
      تنبيه: قد تؤدي هذه الخطوة إلى كسر انزلاق الغطاء مقاس 25 مم إذا تم استخدام القوة الزائدة.
    10. بمجرد ضغط الاغاروز جيدا على الغطاء 30 مم بحيث لا تبقى فقاعات هواء كبيرة ، تكون الوسادة جاهزة للتصوير.
  2. قم بإعداد المجهر والصورة.
    1. إعداد الضوابط البيئية للمجهر وغرفة التصوير. اضبط درجة حرارة الحاضنة العلوية وحاضنة الغرفة الكبيرة على 37 درجة مئوية وقم بتشغيل جهاز ترطيب الغرفة. ضع أحد مستحضرات وسادة الاغاروز في الحاضنة العلوية وأغلق غرفة الحضانة للسماح للعينة بالتوازن. يتم ترك غطاء ترطيب الحاضنة العلوي مفتوحا في هذه المرحلة لتجنب التكثيف على غطاء الغرفة مقاس 25 مم.
      ملاحظة: يمكن أن يتسبب انكماش/تمدد الوسادة بسبب التغيرات في درجات الحرارة في حدوث انحراف بين النقاط الزمنية التي تتجاوز نطاق المسح الضوئي لخوارزمية التركيز البؤري التلقائي. من الأهمية بمكان موازنة وسادة الاغاروز إلى درجة حرارة ثابتة قبل التصوير ، والتي تستغرق عادة 15 دقيقة على الأقل. يمنع الاحترار الكافي أيضا التكثيف على الغطاء العلوي عند وضع غطاء الترطيب في مكانه. كانت مكونات الأجهزة لنظام التصوير (جدول المواد): غرفة حضانة الخلايا الحية ، والمجهر المقلوب مع هدف Plan-Apochromat 63x / 1.40 Oil Ph3 M27 ، ومحرك إضاءة Spectra 7 LED ، وكاميرا sCMOS (حجم 6.5 ميكرومتر بكسل). يتم التحكم في المكونات الآلية للمجهر والحصول على الصور باستخدام تطبيق برمجي لتحليل الفحص المجهري.
    2. قم بإعداد البرنامج للحصول على الصور. قم بتعيين خوارزمية التركيز التلقائي المضمنة في MetaMorph (برنامج تحليل المجهر) لاستخدام قناة الطور أثناء الاستحواذ متعدد الأبعاد.
      1. في علامة التبويب المرحلة ، قم بتعيين مواضع مرحلية متعددة لكل عينة، بهدف مجالات الرؤية حيث يتم توزيع كثافة الخلايا بشكل موحد. في علامة التبويب اللقطات المتتابعة ، قم بتعيين المدة والتكرار المطلوبين (الفاصل الزمني) للصور المراد التقاطها. في علامات التبويب الأطوال الموجية ، اضبط القنوات المطلوبة للاقتناء واضبط أوقات التعريض الضوئي لشدة إشارة العينات.
        ملاحظة: يتم التقاط صور لكل موضع كل 10 دقائق لمدة تصل إلى 24 ساعة. للتصوير الفلوري للأصباغ / الفلوروفورات المذكورة في هذه المقالة ، تم استخدام إعدادات إثارة المحرك الخفيف التالية: يوديد البروبيديوم (Cy3 ؛ 555/15 نانومتر) و GFP (GFP / FITC ؛ 470/24 نانومتر). وقت التعرض للإثارة الفلورية النموذجي المستخدم هو 100 مللي ثانية. يتم استخدام مجموعة المرشحات 15 (Beamsplitter FT580 ، الانبعاث LP590) ليوديد البروبيديوم ومجموعة المرشحات 44 (Beamsplitter FT500 ، الانبعاثات BP 530/50) ل GFP.
    3. بعد تسخين وسادة الاغاروز في الغرفة ، أضف غطاء الترطيب إلى الحاضنة العلوية على المسرح. سيساعد ذلك على منع الوسادة من الجفاف والتحول أثناء التصوير.
    4. مع تشغيل غطاء الترطيب، قم بالتغيير من تباين التداخل التفاضلي (DIC) من الطور إلى تباين التداخل التفاضلي (DIC) واضبط غشاء مكثف وفتحة العدسة في المجهر للحصول على إضاءة Köhler المناسبة.
    5. بعد الضبط ، ارجع إلى المرحلة. انتقل إلى كل موضع مرحلة، واضبط التركيز، وأعد ضبط موضع المسرح إلى المستوى البؤري الجديد. الإعدادات موجودة الآن لبدء التصوير.
      ملاحظة: من المهم إعادة النظر في كل موضع مرحلة قبل بدء الاستحواذ للتأكد من أن الوسادة لم تتحرك. إذا كانت الخلايا خارج نطاق التركيز عند إعادة النظر في موضع مرحلة معين ، فأعد التركيز عليها وتجاوز موضع المرحلة السابقة. يستخدم إعداد خوارزمية التركيز التلقائي موضع z البؤري من آخر نقطة زمنية ± 3 ميكرومتر كنطاق بحث ، لذلك إذا تحولت اللوحة لأكثر من 3 ميكرومتر بعيدا ، فستفشل الخوارزمية في التركيز بشكل صحيح.
    6. ابدأ عملية الاستحواذ متعددة الأبعاد بالنقر فوق الزر "اكتساب ".
    7. بعد اكتمال التجربة، قم بتجميع الصور الفردية من كل قناة في مجموعة لعرضها كفيديو أو لتحليل آخر. قم بذلك باستخدام MetaMorph أو ImageJ.
      1. لتجميع الصور في MetaMorph (مفضل)، في تطبيق مراجعة البيانات متعددة الأبعاد ، حدد القنوات/الأطوال الموجية ذات الاهتمام وحدد جميع النقاط الزمنية لموضع مرحلة معين. انقر فوق تحميل الصور. ستظهر النوافذ لكل قناة / طول موجي. احفظ كل مجموعة مع اسم القناة الخاصة به كملف .tiff.
      2. للتحويل البرمجي في ImageJ ، افتح الملفات لجميع النقاط الزمنية لموضع مرحلة واحدة وقناة واحدة. التجميع باستخدام الصور المراد تكديسها.

5. إنشاء مقاطع فيديو بفاصل زمني باستخدام Fiji / ImageJ

ملاحظة: فيجي (فيجي هي مجرد ImageJ) هو برنامج متاح مجانا لمعالجة الصور وتحليلها ويمكن تنزيله هنا: "https://imagej.net/software/fiji/downloads32"32. تم استخدام Fiji/ImageJ2 1.54f لطرق معالجة الصور الموضحة أدناه.

  1. قم بتصحيح الظل لمكدس صور قناة الطور باستخدام BaSiC33. افتح مكدس صور الطور المطلوب في فيجي ، ثم حدد BaSiC من علامة التبويب Plugins . ستظهر المكدس المصحح للظل في نافذة منفصلة بعنوان Corrected:ImageName.
    ملاحظة: يمكن تنزيل BaSiC.jar هنا: "https://github.com/marrlab/BaSiC33"33. اتبع تعليمات المطور لتثبيت BaSiC بشكل صحيح في فيجي.
  2. ادمج مكدس قنوات الطور المصحح للظل مع أي قنوات/أطوال موجية أخرى باستخدام قنوات دمج > > Color . اضبط الخلفية وشدة الإشارة باستخدام Image > ضبط > السطوع/التباين لكل قناة. احفظ الملف المدمج كملف .tiff.
  3. بعد ذلك ، قم بتثبيت الصور باستخدام Correct 3D Drift. مع تحديد المكدس المصحح للظل ، انتقل إلى الإضافات > تسجيلات > الانجراف ثلاثي الأبعاد الصحيح. في نافذة الحوار التي تفتح، قم بتعيين قناة التسجيل إلى رقم القناة المقابل لمكدس المرحلة. سيتم تسمية المكدس الناتج بعد التصحيح بالنقاط الزمنية المسجلة. قم بالاقتصاص إلى مجال العرض المطلوب، ثم احفظ الملف المصحح كملف .tiff.
    ملاحظة: إذا تم استخدام MetaMorph لإنشاء مكدس الصور المترجم ، فهناك خطوة معالجة إضافية: انتقل إلى خصائص > الصورة وقم بتبديل الأرقام في حقلي الشرائح (z) والإطارات (t). يمكن لتصحيح الانجراف الآن تفسير كل إطار بشكل صحيح كنقطة زمنية وليس شريحة من مكدس z. يمكن استخدام ملف .tiff المصحح بالظل والمصحح بالانجراف في تحليلات الصور اللاحقة. هناك العديد من حزم البرامج المتاحة لقياس شدة إشارة الفلورسنت ، وتحديد الخصائص المورفولوجية ، وتتبع مصير الخلايا الفردية ، والمزيد. هناك برنامجان شائعان الاستخدام هما المكون الإضافي MicrobeJ لفيجي و Oufti 34,35.
  4. أضف الطوابع الزمنية والتسميات النصية إلى المكدس باستخدام Image > Stacks > Label.
  5. لإضافة شريط مقياس ، أولا ، تعرف على حجم بكسل الكاميرا وتكبير هدف المجهر. احسب نسبة البكسل: ميكرون كحجم بكسل مقسوما على التكبير. في مربع الحوار تحليل > تعيين المقياس ، أدخل نسبة البكسل:ميكرون في حقل المسافة المعروفة . بعد ذلك، أضف شريط مقياس إلى المكدس باستخدام تحليل أدوات > > شريط المقياس.
    ملاحظة: يجب معايرة المقياس الدقيق للمجهر باستخدام ميكرومتر المرحلة. ومع ذلك ، يمكن أن توفر العدسة الموضوعية المجهرية والكاميرا المستخدمة تقديرا تقريبيا للمقياس. على سبيل المثال ، تتميز كاميرا PCO sCMOS المستخدمة هنا بحجم بكسل يبلغ 6.5 × 6.5 ميكرومتر2 ، وتم استخدام الهدف 63x للتصوير ، وبالتالي فإن حجم البكسل مقسوما على التكبير هو 6.5 / 63 = 0.1032 ميكرومتر لكل بكسل. أدخل 0.1032 في حقل المسافة المعروفة لمربع الحوار تعيين المقياس .
  6. لتصدير مكدس الصور النهائي كفيديو يمكن تشغيله في QuickTime Player و Microsoft PowerPoint وما إلى ذلك ، احفظه كملف .avi.

النتائج

يشار إلى الإدخال الناجح للبلازميدات المراسلة في المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية من خلال النمو على المضادات الحيوية الانتقائية الصحيحة ويمكن تأكيدها عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل و / أو التسلسل. يجب التحقق من السلالات المعدلة كمراسلين نمطيين من خلال إخضاعهم للظروف التي من المعروف فيها أن الجين المعني مستحث ، ويمكن قياس التألق الناتج عن طريق قياس التدفق الخلوي أو قياس الطيف الضوئي أو الفحص المجهري للتألق (الشكل 1).

لتسهيل اختيار جرعة (جرعات) المضادات الحيوية التي سيتم استخدامها في التجارب اللاحقة ، قم بإجراء فحوصات ثابتة للمضادات الحيوية تعتمد على التركيز للمتصورة الزنجارية أو السلالات ذات الأهمية . عادة ما تؤدي المقايسات المعتمدة على التركيز إلى منحنى ثنائي الطور مع منحدر أولي حاد عند تركيزات أقل من المضادات الحيوية وهضبة أو منحدر أقل انحدارا عند تركيزات أعلى. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض أزواج أنواع المضادات الحيوية ، قد لا ينتج عن منحنى ثنائي الطور الواضح. على سبيل المثال ، منحنى S. aureus delafoxacin منحنى ثنائي الطور بشكل واضح (الشكل 3 أ) ، لكن منحنى P. aeruginosa levofloxacin ليس كذلك (الشكل 3 ب) 15. في هذا السيناريو ، سنختار تركيزا لا يقل عن 10 أضعاف الميكروفون (على سبيل المثال ، 5 ميكروغرام / مل ، وهو حوالي 15 ضعف الميكروفون ل P. aeruginosa)15. ومع ذلك ، نظرا لأن 15x levofloxacin MIC ينتج عنه ~ 0.001٪ فقط P. aeruginosa الناجين ، فإننا نستخدم 1 ميكروغرام / مل علاج الليفوفلوكساسين إذا أردنا أن نرى مثابرات عند تصوير الخلايا أثناء تعافيها على منصات الاغاروز الخالية من المضادات الحيوية (فيديو تكميلي 6) ؛ خلاف ذلك ، يصبح عدد حقول الرؤية اللازمة لتصوير العديد من الثباتات باهظا.

في بداية التصوير ، يجب أن تظهر العينة المثالية وإعداد وسادة الاغاروز مستوية في جميع أنحاء مجال الرؤية ، وخاليا من الحطام الكبير أو التجاعيد أو فقاعات الهواء ، ومع خلايا مفردة موزعة بالتساوي. قد يتطلب الحصول على خلايا مفردة جيدة التوزيع تحسين تخفيف العينة أو إعادة تعليقها. بالنسبة إلى المكورات العنقودية الذهبية ، تميل الخلايا إلى تكوين مجموعات صغيرة وتحتاج إلى دوامة كاملة قبل البذر في وسادة الاغاروز (الشكل 4 والشكل 5). بالنسبة إلى المتصورة الزنجارية، قد تشكل الخلايا مجاميع مغلفة في مصفوفة لزجة خارج الخلية معلقة. من الضروري ماصة هذه العينات جيدا وتعطيل الركام لتصوير الخلايا المفردة.

بعد الانتهاء من تجربة التصوير ، سيظهر فاصل زمني ناجح للصور في بؤرة ، مضاءة بثبات ، وبأقل قدر من الانجراف في مستوى x-y طوال التجربة. يمثل الفيديو التكميلي 7 اكتسابا مثاليا للصورة: t هي قناة الطور للفيديو التكميلي 4 قبل تصحيح الظل أو الانجراف. يمكن أن يحدث فقدان التركيز إذا تسبب التكثيف (من الإفراط في الترطيب أو عدم كفاية الاحترار في العينة) في تكوين قطرات ماء على زلة الغطاء العلوية 25 مم ، مما يؤدي إلى تشويه الضوء ودفع المستوى البؤري خارج نطاق البحث الأقصى لخوارزمية التركيز البؤري التلقائي (الفيديو التكميلي 8). يشير الاختلاف في الإضاءة عادة إلى عدم كفاية زيت الغمر في وقت التصوير. إذا تحركت المرحلة بسرعة كبيرة ، فقد يسحب الزيت الموجود على الهدف إلى الخلف ولا يزال يلحق بالركب عند الحصول على الصور. يمكن التخفيف من ذلك عن طريق ضبط عناصر التحكم في الاستحواذ لإبطاء سرعة الحركة أو إضافة توقف مؤقت بين الحركة إلى الموضع التالي واكتساب الصورة. سيبدو انجراف العينة الرئيسي مثل العديد من الخلايا التي تمتد عبر مجال الرؤية بينما يبقى بعضها في مكانه (فيديو تكميلي 9). يحدث هذا عادة في وقت لاحق من التجارب لأن وسادة الاغاروز قد أصيبت بالجفاف بسبب عدم كفاية التحكم في الرطوبة. تم تصميم تحضير وسادة الاغاروز المقدم في هذه الورقة لتسهيل استقرار العينة ، ولكن تسخين / ترطيب العينة والبيئة المحيطة بها بشكل صحيح أمر ضروري للحصول على الصورة المثلى.

figure-results-1
الشكل 1: تضيء سلالات مراسل الفلورسنت التعبير عن الجين ذي الأهمية. (أ) المكورات العنقودية الذهبية تم تحويله مع مراسل نسخ GFP لجين ذي أهمية وفقا للبروتوكول 1. تمت معالجة سلالة المراسل لمدة 24 ساعة بالمضادات الحيوية ، وغسلها باستخدام PBS ، ثم زرعها على وسادة الاغاروز المصنوعة من CA-MHB بالإضافة إلى يوديد البروبيديوم (1.6 ميكرومتر) والكلورامفينيكول (10 ميكروغرام / مل لصيانة بلازميد المراسل) للتصوير أثناء الشفاء (الفيديو التكميلي 1). (ب) P. aeruginosa تم تحويله مع بلازميد يحمل مراسلا انتقاليا مرتبطا ب mScarlet لبروتين ذي أهمية26. تمت معالجة سلالة المراسل لمدة 5 ساعات بالمضادات الحيوية ، وغسلها باستخدام PBS ، ثم زرعها على وسادة الاغاروز المصنوعة من BSM plus Tet (75 ميكروغرام / مل ؛ لصيانة بلازميد المراسل) للتصوير أثناء التعافي (الفيديو التكميلي 2). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إكثار وحصاد العاثيات. (أ) تظهر الألواح الست ستة كميات مختلفة من مخزون العاثيات المخفف في مروج S. aureus RN4220. تشير الخطوط العريضة الحمراء إلى الألواح الثلاث التي سيتم حصادها ، من اللوحة ذات الغالبية العظمى (مخطط أحمر غامق ؛ 1 × 109 PFU / مل) إلى التخفيفين التاليين (1 × 108 و 1 ×10 7 PFU / مل). تشير الأسهم السوداء إلى اللوحات الفردية. (ب) لحصاد العاثية من الألواح ، اكشط طبقة الأجار الناعمة (على اليسار) ، وانقل الملاط إلى لوحة التخفيف التالية (الوسط) ، وبعد تجميع الأجار الناعم من جميع الألواح الثلاثة معا ، اجمعها في أنبوب مخروطي الشكل للطرد المركزي (يمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: فحوصات المثابرة المعتمدة على التركيز التمثيلي. تم تقييم ثبات الفلوروكينولون المعتمد على التركيز في المرحلة الثابتة (أ) المكورات العنقودية الذهبية (ضد الديلافلوكساسين) و (ب) المتصورة الزنجارية (ضد الليفوفلوكساسين). تستخدم التجارب اللاحقة 5 ميكروغرام / مل ديلافلوكساسين (الدائرة الحمراء) لأن قتل المكورات العنقودية الذهبية قد استقر عند هذا التركيز. سيتم استخدام جرعة لا تقل عن 1 ميكروغرام / مل من الليفوفلوكساسين (الدائرة الحمراء) للتجارب اللاحقة مع المتصورة الزنجارية. لاحظ أن القتل البكتيري لا يستقر بالنسبة ل P. aeruginosa ، ولكن لا تزال هناك "مرحلة ثانية" أقل حدة من المنحنى ثنائي الطور تشير إلى وجود مجموعة سكانية فرعية مستمرة. تم تكييف اللوحة 3 باء بإذن من Hare et al.15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تصوير الأنماط الظاهرية البكتيرية أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. المرحلة الثابتة (A) المكورات العنقودية الذهبية و (ب) المتصورة الزنجارية تم زرعها على وسادات الاغاروز التي تحتوي على المضادات الحيوية الفلوروكينولون ومراقبتها أثناء العلاج: 5 ميكروغرام / مل ديلافلوكساسين للمكورات العنقودية الذهبية (الفيديو التكميلي 3) و 5 ميكروغرام / مل ليفوفلوكساسين ل P. aeruginosa (الفيديو التكميلي 4)15. تمت إضافة يوديد البروبيديوم (PI ؛ 16 ميكرومتر ل P. aeruginosa ، 1.6 ميكرومتر للمكورات العنقودية الذهبية) إلى الوسادات لتمييز الخلايا الميتة أو المحتضرة. تظل الخلايا المكورات العنقودية الذهبية سليمة إلى حد كبير وحية في وجود FQ ، في حين أن معظم المتصورة الزنجارية تخضع لتغيرات مورفولوجية جذرية ، بما في ذلك تكوين بلاستيدات كروية مستديرة ، قبل أن تتحلل وتموت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تتبع المثابرات أثناء الشفاء. (أ) المكورات العنقودية الذهبية و (ب) المتصورة الزنجارية تم زرعها على وسادات الاغاروز التي تحتوي على وسائط جديدة بعد معالجتها بالفلوروكينولونات (5 ميكروغرام / مل ديلافلوكساسين للمكورات العنقودية الذهبية و 1 ميكروغرام / مل من الليفوفلوكساسين ل P. aeruginosa) ومراقبتها أثناء تعافيها بعد العلاج (الفيديو التكميلي 5 والفيديو التكميلي 6). يشار إلى perisisters التي شوهدت بأسهم خضراء في الإطارين الأولين في كل لوحة ، وظلت سليمة وقابلة للحياة أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. بعد فترة تأخر أولية ، بدأ المثابرون في الانقسام وأدوا ذرية جديدة (يشار إليها بالدوائر الخضراء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تحضير عينة المجهر. (أ) تخطيطي لسير عمل إعداد العينة باستخدام طبق غطاء قابل للتبديل ("الغرفة"). (ب) صورة للغرفة المفككة ومكوناتها الفردية. (ج) صورة للدائرة المجمعة بالكامل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1: المكورات العنقودية الذهبية الثابتة. ملف فيديو يحتوي على الصور في الشكل 1 أ. باختصار ، S. aureus الذي يحمل مراسل نسخ GFP لجين ذي أهمية تمت معالجته لمدة 24 ساعة بالمضادات الحيوية ، وغسله باستخدام PBS ، ثم تم زرعه على وسادة الاغاروز المصنوعة من CA-MHB بالإضافة إلى يوديد البروبيديوم (1.6 ميكرومتر) وكلورامفينيكول (10 ميكروغرام / مل) للتصوير أثناء التعافي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 2: المتصورة الزنجارية ثابتة. ملف فيديو يحتوي على صور في الشكل 1 ب. باختصار ، P. aeruginosa الذي يحمل مراسلا متعددا مرتبطا ب mScarlet لبروتين ذي أهمية تمت معالجته لمدة 5 ساعات بالمضادات الحيوية ، وغسلها باستخدام PBS ، ثم تم زرعها على وسادة الاغاروز المصنوعة من BSM plus Tet (75 ميكروغرام / مل) للتصوير أثناء التعافي26. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 3: المكورات العنقودية الذهبية أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. تم زرع مزرعة المرحلة الثابتة من S. aureus المزروعة في وسائط غنية محددة كيميائيا في وسادات agarose مصنوعة من وسائط مكيفة خالية من الخلايا في المزرعة مع يوديد البروبيديوم (1.6 ميكرومتر) وديلافلوكساسين (5 ميكروغرام / مل). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 4: المتصورة الزنجارية أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. تم زرع مزرعة المرحلة الثابتة من P. aeruginosa المزروعة في BSM إلى وسادات agarose مصنوعة من وسائط مكيفة خالية من الخلايا من ثقافة P. aeruginosa المزروعة في BSM بالتوازي. احتوت وسادة الاغاروز أيضا على يوديد البروبيديوم (16 ميكرومتر) والليفوفلوكساسين (5 ميكروغرام / مل). تم تكييف هذا الفيديو بإذن من Hare et al.15. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 5: المكورات العنقودية الذهبية أثناء التعافي بعد المضادات الحيوية. نمت المكورات العنقودية الذهبية إلى مرحلة ثابتة في وسائط غنية محددة كيميائيا. عولجت مزارع المرحلة الثابتة ب 5 ميكروغرام / مل ديلافلوكساسين في أنابيب الاختبار لمدة 24 ساعة ، وغسلها باستخدام PBS ، ثم زرعت في وسادات الاغاروز CA-MHB الخالية من المضادات الحيوية التي تحتوي على يوديد البروبيديوم (1.6 ميكرومتر) للتصوير. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 6: المتصورة الزنجارية أثناء التعافي بعد المضادات الحيوية. عولجت مزرعة المرحلة الثابتة من المتصورة الزنجارية المزروعة في BSM ب 1 ميكروغرام / مل ليفوفلوكساسين في أنابيب اختبار لمدة 7 ساعات ، وغسلها باستخدام PBS ، ثم زرعت في وسادات أغروز BSM الخالية من المضادات الحيوية التي تحتوي على يوديد البروبيديوم (16 ميكرومتر) للتصوير. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 7: مثال على الحصول على الصورة الأمثل. هذا الفيديو هو قناة الطور للفيديو التكميلي 4 قبل معالجة الصور كمثال على اكتساب الفاصل الزمني الأمثل. لاحظ الحد الأدنى من الانجراف والإضاءة المستقرة والحفاظ على التركيز طوال التجربة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 8: مثال على الحصول على الصورة دون المستوى الأمثل بسبب التكثيف. يظهر هذا الفيديو جزءا من تجربة عندما تأثر الحصول على الصورة بضعف التركيز ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التكثيف على الغرفة بسبب التسخين غير السليم للعينة و / أو الإفراط في ترطيب بيئة التصوير. كانت العينة التي تم تصويرها معالجة بالليفوفلوكساسين المتصورة الزنجارية أثناء التعافي بعد المضادات الحيوية على وسادة الاغاروز BSM. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 9: مثال على الحصول على الصور دون المستوى الأمثل بسبب الانجراف. يظهر هذا الفيديو جزءا من تجربة عندما تأثر الحصول على الصورة بانجراف العينة ، على الأرجح بسبب الجفاف وتقلص / رفع وسادة الاغاروز من الغطاء. العينة التي تم تصويرها كانت P. aeruginosa على وسادة agarose تحتوي على ليفوفلوكساسين ويوديد البروبيديوم. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الملف التكميلي 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

لقد وجدنا أن نجاح تجربة الفحص المجهري بفاصل زمني يتوقف على جودة وسادات الاغاروز واستقرارها طوال فترة التصوير. تعتبر وسادات الاغاروز المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المحاطة بالغرفة سهلة التحضير نسبيا ، مما ينتج عنه عينات مستوية باستمرار يمكن تصويرها بثبات على مدى عشرات الساعات. يتيح ذلك تصوير عشرات الآلاف من الخلايا في تجربة واحدة ويزيد من احتمالية اكتشاف متغيرات النمط الظاهري النادرة ، مثل الخلايا المستمرة ، في مجموعة سكانية.

تقدم طريقة تحضير وسادة الاغاروز هذه بديلا قابلا للتنفيذ بسهولة للطرق المنشورة مسبقا. لا يتطلب بروتوكولنا الدقة التقنية لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة أو التلاعب الماهر بطرق "شطيرة" الاغاروز ، مما يسهل تحقيق استعدادات متسقة من التشغيل إلىالتشغيل 14،16،36. علاوة على ذلك ، فإن النظام فعال من حيث التكلفة. الغرفة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ قابلة للتعقيم وإعادة الاستخدام (على عكس الغرف البلاستيكية ذات الاستخدام الواحد) ولا يتطلب الإعداد معدات متخصصة16،37. تتناسب الغرفة بسهولة مع أنظمة الفحص المجهري المختلفة باستخدام إدخالات المرحلة المتاحة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن البكتيريا تجميد في الواجهة الزجاجية ذات الغطاء اللاغاروز ، فقد نجحنا في تتبع البكتيريا عالية الحركة مثل P. aeruginosa مع السماح بالتغييرات المورفولوجية (الشكل 4 ، الفيديو التكميلي 4). تقنيات التصوير الأخرى أحادية الخلية ، مثل "الآلة الأم" ، تحصر الخلايا في القنوات التي تمنع ملاحظة التغيرات المورفولوجية بخلاف الخيوط36.

للنجاح في هذا البروتوكول ، هناك بعض الخطوات والمعلمات الحاسمة التي يجب وضعها في الاعتبار. لتحضير الوسادة ، من المهم تسخين الاغاروز وإذابته جيدا ، لأن أي بلورات أغاروز متبقية ستسبب حيودا ضوئيا وتؤثر على جودة الصورة. وبالمثل ، يجب على المرء أن يحرص على ماصة الاغاروز في الغرفة دون إدخال فقاعات الهواء. لضمان بقاء سمك وسادات الاغاروز ثابتا والحد من انجراف العينة ، من المهم السماح للوسادة بالتوازن - عادة لمدة 15 دقيقة - في العلبة المرطبة التي يتم التحكم في درجة حرارتها قبل بدء التصوير. هناك عامل آخر يمكن أن يتسبب في سوء جودة الصورة وهو التحكم في الرطوبة: ستؤدي الرطوبة المنخفضة إلى جفاف وسادة الاغاروز وتقلصها ، في حين أن الرطوبة العالية (أو ارتفاع درجة حرارة العينة غير الصحيح في الغرفة) يمكن أن تتسبب في تكثيف الهواء الدافئ على العينة وتشويه التصوير. يمكن العثور على مثال على التصوير بفاصل زمني دون المستوى الأمثل بسبب التكثيف فيديو تكميلي 8.

يتمثل أحد قيود الإعداد الحالي في أنه لا يمكن تبادل وسائط الثقافة ، مما يمنع التتبع المستمر للبكتيريا الفردية قبل وأثناء وبعد العلاج بالمضادات الحيوية. نتوقع أن يؤدي اقتران وسادة الاغاروز بخلايا التدفق أو أجهزة الموائع الدقيقة التي تسمح بتبادل وسائط الاستزراع إلى تمكين تتبع السكان أثناء التغير الغذائي أو البيئي. معلمة أخرى للتصميم الحالي يمكن تحسينها هي تهوية العينة. يتيح الختم الدائري O، والتصميم العلوي اللولبي لطبق الغطاء القابل للتبديل تهوية أفضل للعينة مقارنة بالإعدادات التي تتطلب استخدام مادة مانعة للتسرب من الشمع أو الشحوم لإغلاق الوسادات16. ومع ذلك ، قد تظل التهوية في الغرفة المغلقة محدودة وقد لا تدعم نمو الأيروبيات الإلزامية ، على الرغم من أن هذا لا يزال يتعين اختباره.

يتيح بروتوكول تحضير عينة التصوير بفاصل زمني الذي نقدمه في هذه المقالة تتبع آلاف البكتيريا أثناء استجابتها للعلاج بالمضادات الحيوية أو التعافي منه. هذه الطريقة أيضا قابلة للتعميم بدرجة كبيرة ولها مجموعة متنوعة من التطبيقات المحتملة التي تتجاوز علم الأحياء المستمر. على سبيل المثال ، يسمح إعداد وسادة الاغاروز والمقسم ببذر عينات الخلايا المنفصلة مكانيا ولكنه يسمح بالاتصال بين الخلية والخلية عبر الانتشار من خلال وسادة الاغاروز. نحن نستكشف حاليا إمكانات هذا الإعداد لاختبار كيفية تأثير تبادل المنتجات المفرزة على نمو الخلايا في المجتمعات متعددة الأنواع. نتوقع أن يوفر هذا البروتوكول حاجزا منخفضا للدخول إلى الفحص المجهري بفاصل زمني للمحقق الجديد واختلافات غير محدودة لعالم الأحياء الدقيقة المتمرس لاستكشافها.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نشكر السيدة سوزان ستوروفسكي في مركز UConn الصحي لتحليل الخلايا ونمذجة مرفق الفحص المجهري على مساعدتها في تجارب الفحص المجهري. نشكر الدكتورة منى وو أور وورشة عمل أساسيات علم الوراثة والتمثيل الغذائي للمكورات العنقودية على بروتوكولاتهم ونصائحهم بشأن الاستنساخ في المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية ، على التوالي. تم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NIH; DP2GM146456-01 و 1R01AI167886-01A1 إلى W.W.K.M. ، 1F30DE032598-01A1 إلى P.J.H. ، و 1F31DK136259-01A1 إلى T.J.L.). لم يكن للممولين أي دور في تصميم تجاربنا أو إعداد هذه المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
البيولوجيا الجزيئية المعتمدة AgaroseBiorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
طبق غطاء زجاجي قابل للتبديلBioptechs190310-3535 ملم ICD لإعداد وسادات الاغاروز ؛ يأتي مع أغطية
30 مم (# 1.5)Lumencor Spectra 7 محرك إضاءة LEDLumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7 محرك إضاءة LED
MetaMorphMolecular Devicesالإصدار الأول 7.10.5
pco.edge 4.2 ثنائي sCMOSكاميرا Excelitashttps://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camerasCMOS
PeCon غرفة حضانة الخلايا الحيةpeConhttps://www.pecon.biz/
توماس ساينتفيك غطاء زجاجي دائري ، # 1.5 سمك ، 25 مم ، 100 عبوةفيشر ساينتفيكNC127277025 مم (# 1.5) أغطية
Zeiss Axiovert 200M مجهرZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.htmlمجهر مقلوب مع هدف Plan-Apochromat 63x / 1.40 Oil Ph3 M27 ، ومحرك إضاءة Lumencor Spectra 7 LED ، وكاميرا pco.edge 4.2 biCMOS (حجم بكسل 6.5 مم)
كاميرا

المراجع

  1. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).
  2. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nat Rev Microbiol. 17 (7), 441-448 (2019).
  3. Conlon, B. P. Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells. Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).
  4. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  5. Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. Ecology and evolution of antibiotic persistence. Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).
  6. Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication. ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).
  7. Mempin, R., et al. Release of extracellular ATP by bacteria during growth. BMC Microbiol. 13, 301(2013).
  8. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).
  9. Fauvart, M., De Groote, V. N., Michiels, J. Role of persister cells in chronic infections: clinical relevance and perspectives on anti-persister therapies. J Med Microbiol. 60 (pt 6), 699-709 (2011).
  10. Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters. FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).
  11. Levin, B. R., Rozen, D. E. Non-inherited antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).
  12. Davis, K. M., Isberg, R. R. Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches. Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).
  13. Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).
  14. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. 53, e3145(2011).
  15. Hare, P. J., Gonzalez, J. R., Quelle, R. M., Wu, Y. I., Mok, W. W. K. Metabolic and transcriptional activities underlie stationary-phase Pseudomonas aeruginosa sensitivity to levofloxacin. Microbiol Spectr. 12 (1), e0356723(2024).
  16. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
  17. Pang, Y. Y., et al. agr-Dependent interactions of Staphylococcus aureus USA300 with human polymorphonuclear neutrophils. J Innate Immun. 2 (6), 546-559 (2010).
  18. Bose, J. L., Fey, P. D., Bayles, K. W. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 79 (7), 2218(2013).
  19. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 73, 133-138 (1992).
  20. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  21. Krausz, K. L., Bose, J. L. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus: Broth-Based Method. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  22. Olson, M. E. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  23. Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), e00537-e00612 (2013).
  24. Coe, K. A., et al. Multi-strain Tn-Seq reveals common daptomycin resistance determinants in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 15 (11), e1007862(2019).
  25. Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4), 1648(1979).
  26. Shee, C., et al. Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells. eLife. 2, e01222(2013).
  27. Kowalska-Krochmal, B., Dudek-Wicher, R. The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance. Pathogens. 10 (2), 165(2021).
  28. Robinson, J. L., Jaslove, J. M., Murawski, A. M., Fazen, C. H., Brynildsen, M. P. An integrated network analysis reveals that nitric oxide reductase prevents metabolic cycling of nitric oxide by Pseudomonas aeruginosa. Metab Eng. 41, 67-81 (2017).
  29. Wolff, J. A., MacGregor, C. H., Eisenberg, R. C., Phibbs, P. V. Isolation and characterization of catabolite repression control mutants of Pseudomonas aeruginosa PAO. J Bacteriol. 173 (15), 4700-4706 (1991).
  30. Batchelder, J. I., Taylor, A. J., Mok, W. W. K. Metabolites augment oxidative stress to sensitize antibiotic-tolerant Staphylococcus aureus to fluoroquinolones. mBio. , e0271424(2024).
  31. Power, A. D., Mok, W. W. K. Agar and agarose used for Staphylococcus aureus biofilm cultivation impact fluoroquinolone tolerance. J Appl Microbiol. 135 (8), lxae191(2024).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nat Commun. 8, 14836(2017).
  34. Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).
  35. Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
  36. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
  37. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة