مقالة منهجية

البيولوجيا الهيكلية ومناهج الكيمياء التحليلية لتوصيف إنزيمات التمثيل الغذائي C-glycoside في ميكروبات الأمعاء البشرية

1.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67629

⸱

مايو 23, 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تسلط الدراسات الحديثة الضوء على أدوار إنزيمات الجراثيم في الأمعاء البشرية في استقلاب جليكوسيدات. هنا ، نقدم منهجية شاملة تدمج تقنيات الكيمياء التحليلية (LC-MS / MS و NMR) مع مناهج البيولوجيا الهيكلية لتوصيف سلاسل التفاعل الهيكلي والأنزيمي لإنزيمات استقلاب C-glycoside بشكل منهجي.

الملخص

ظهرت ميكروبات الأمعاء كمغير رئيسي لصحة المضيف ، لا سيما بسبب قدرتها على استقلاب الجليكوسيدات الغذائية. بينما تظهر جليكوسيدات C استقرارا كيميائيا فائقا ومقاومة للانقسام الأنزيمي مقارنة ب O-glycosides ، يمكن لبكتيريا الأمعاء المتخصصة استقلابها بشكل انتقائي ، مما يحسن توافرها البيولوجي. منذ تحديد إنزيمات C-glycosidase الميكروبية ، تظل آليات التفاعل الدقيقة غير مفهومة تماما ، ولا تزال المنهجيات الموحدة لدراسة هذه العمليات غير راسخة. لمعالجة هذه الفجوة ، قدمنا نهجا متكاملا متعدد التخصصات يجمع بين البيولوجيا الهيكلية وعلم الإنزيمات والتقنيات التحليلية ، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) والرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، لتوصيف هذه الأنشطة الأنزيمية بشكل منهجي. يتيح هذا النهج الشامل التوصيف الدقيق لعملية التمثيل الغذائي ل C-glycoside على المستويات الجزيئية والأنزيمية والتمثيل الغذائي.

المقدمة

في الآونة الأخيرة ، اكتسبت الجراثيم في الأمعاء البشرية اهتماما كبيرا لدورها الحاسم في دعم صحةالمضيف 1،2. تقوم هذه المجتمعات الميكروبية باستقلاب المركبات المشتقة من المضيف ، وتنتج مستقلبات نشطة بيولوجيا1،2،3. على سبيل المثال ، توجد مركبات الفلافونويد ، من بين أكثر المركبات الطبيعية وفرة في نظامنا الغذائي اليومي ، بشكل أساسي على شكل جليكوسيدات O أو C ، والتي يتم امتصاصها بشكل سيئ في أمعاء الإنسان4. ومع ذلك ، يمكن لميكروبات الأمعاء تحويل هذه الجليكوزيدات إلى مشتقات أكثر نشاطا بيولوجيا ، مثل الجليكوسيدات الثانوية أو الأجليكونات ، مما يقلل من قابليتها للذوبان ويعزز امتصاصها ، وبالتالي تحسين أنشطتها الحيوية مقارنة بأشكالهاالأصلية 5،6.

تاريخيا ، تمت دراسة آليات التحلل المائي ل O-glycosides على نطاق واسع7،8. تظهر جليكوسيدات C ، التي تتميز بروابطها الجليكوسيدية C-C ، استقرارا كيميائيا أكبر ومقاومة للانقسام9،10. على الرغم من ذلك ، طورت بعض بكتيريا الأمعاء القدرة على إزالة جليكوزيزلات C-glycosides11،12. في عام 1988 ، أظهر Hattori et al. لأول مرة أن بعض بكتيريا الأمعاء يمكن أن تزيل مجموعات الجليكوسيل من C-glycosides13. عزلت الدراسات اللاحقة أول سلالة بكتيرية قادرة على هذا النشاط ، مما مكن من مزيد من استكشاف آليات شق C-glycoside14. ومع ذلك ، حتى الآن ، تم تحديد عدد محدود فقط من السلالات البكتيرية المعوية وإنزيمات استقلاب C-glycoside وتمييزها 14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26. أظهرت الدراسات الحديثة أن إنزيمات deglycosylation puerarin (daidzein-8-C-glucoside) (DgpA / B / C) في سلالة PUE قادرة على شق البويرارين في دايدزين والجلوكوز من خلال عمليات من خطوتين: DgpA ، وهو من عائلة Gfo / Idh / MocA oxidoreductase ، يؤكسد البويرارين إلى 3 بوصات-oxo-puerarin ، والذي يخضع بعد ذلك لتفاعل التخلص β بوساطة مركب DgpB / C لإنتاج الجليكون والجلوكوز 10 ، 26. ومع ذلك ، فإن الخصائص الهيكلية والوظيفية لإنزيمات استقلاب جليكوسيد C ، ولا سيما نظام DgpA / B / C ، لا تزال غير مفهومة تماما ، وهناك حاجة إلى منهجيات أكثر تقدما ، لا سيما تكامل الاستراتيجيات البيولوجية والكيميائية ، للنهوض بالبحث في هذاالمجال 24.

لمعالجة هذه الفجوة ، نستخدم مناهج متكاملة متعددة التخصصات للتحقيق في تفاعل التمثيل الغذائي المحفز في الأمعاء البشرية DgpA / B / C. في هذا التفاعل ، يحفز DgpA أكسدة الجليكوزيدات ل C-glycosides ، وبالتالي ، يشكل DgpB و DgpC مركب DgpB / C الذي يشق على وجه التحديد منتجات C-glycoside المؤكسدة10،26،27. أجرينا أولا التعبير المؤتلف وتنقية DgpA و DgpB / C بشكل منفصل. ثم تم تبلور بروتينات DgpA و DgpB / C المنقاة ، وتم تحديد هياكلها ثلاثية الأبعاد بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية. أخيرا ، قمنا بإعادة تشكيل وظيفة انقسام C-glycoside باستخدام نظام إنزيم DgpA / B / C الكامل ، مع تحليل شامل للمنتج الأيضي يتم إجراؤه عبر التحليل الطيفي LC-MS / MS و NMR27. بناء على هذه الأساليب ، درسنا استقلاب C-glycoside المحفز بواسطة نظام إنزيم DgpA / B / C.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إنتاج البروتين وتنقية

  1. بناء متجه التعبير
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تعمل جينات DgpA و DgpB و DgpC من ميكروبات الأمعاء البشرية ، سلالة PUE ، كنظام نموذجي. تتضمن الخطوة الأولى استخدام البلازميدات التعبيرية لإنتاج البروتينات المؤتلفة المقابلة.
    1. احصل على تسلسل مجموعة الجينات DgpA / B / C (GenBank: LC422372.1) من NCBI. بعد ذلك ، قم بتصنيع الحمض النووي DgpA / B / C تجاريا واستنساخ جينات DgpA و DgpB و DgpC بشكل فردي في ناقل pET-28a معدل ، والذي سينتج البروتين المستهدف باستخدام N - terminal SUMO و 6×علامته (علامة His-SUMO) 28.
    2. قم بتحويل كل من بلازميدات DgpA أو DgpB أو DgpC إلى بكتريا قولونية BL21 (DE3) خلايا مختصة. بعد ذلك ، زراعة البكتيريا في وسط LB مع 50 ميكروغرام / مل كاناميسين عند 37 درجة مئوية.
    3. أضف 0.2 ملي مولار IPTG إلى الوسط عندما تصل الكثافة البكتيرية (OD600) إلى 0.6. استزراع البكتيريا عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    4. جهاز طرد مركزي لكل من DgpA و DgpB و DgpC يعبر عن الثقافة البكتيرية عند 4,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من Buffer A (الجدول 1) لكل 1 لتر من الثقافة البكتيرية.
  2. تنقية البروتين
    ملاحظة: تعتبر الكميات الكافية عالية النقاء من الإنزيمات المؤتلفة ضرورية للتوصيف الوظيفي ودراسات البيولوجيا الهيكلية. يشكل DgpB و DgpC مركبا بروتينا مستقرا (يشكل تلقائيا مركب DgpB / C أثناء إجراء التحلل) للوظيفة10،26. ثم يتم إجراء تنقية بروتين DgpA ومركب DgpB / C.
    1. أضف 1 ملي مولار PMSF إلى إعادة التعليق البكتيري. امزج المعلق البكتيري DgpB و DgpC من الخطوة 1.1.4 معا ثم قم بتحلل التعليق البكتيري DgpA أو خليط DgpB و DgpC (لتشكيل مركب DgpB / C وظيفي) باستخدام معطل الخلايا بالموجات فوق الصوتية.
    2. جهاز الطرد المركزي للمحللات البكتيرية عند 48,000 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. احتفظ بالمادة الطافية التي تحتوي على البروتين وتخلص من الحبيبات البكتيرية.
    3. قم بتنقية مركب DgpA أو DgpB / C من المادة الطافية باستخدام عمود كروماتوغرافيا تقارب النيكل (Ni-NTA). قم بإزالة البروتينات المرتبطة عن طريق تطبيق تدرج تركيز إيميدازول من 0 إلى 50٪ باستخدام Buffer A و Buffer B (الجدول 1) في جهاز تنقية ÄKTA.
    4. خذ 10 ميكرولتر من العينات المخففة واخلطها مع 2 ميكرولتر من صبغة البروتين 5 × ، ثم قم بإجراء الرحلان الكهربائي SDS-PAGE عند 220 فولت لمدة 45 دقيقة باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الرأسي ، متبوعا بتلوين Coomassie Blue لتصور نطاقات البروتين. جمع الكسور التي تحتوي على DgpA أو مركب DgpB / C بناء على تحليل SDS-PAGE للاستخدام في المستقبل.
      ملاحظة: يهاجر نطاق DgpA (44 كيلو دالتون) بعلامة His-SUMO (17 كيلو دالتون) عند حوالي 61 كيلو دالتون (الشكل 2 دالتون) ، بينما يهاجر DgpC (33 كيلو دالتون) بعلامة His-SUMO (17 كيلو دالتون) حوالي 50 كيلو دالتون ، و DgpB (15 كيلو دالتون) بعلامة His-SUMO (17 كيلو دالتون) يهاجر حوالي 33 كيلو دالتون (الشكل 2J)..
    5. غسيل الكلى من العينات المعقدة DgpA أو DgpB / C من الخطوة 1.2.3 باستخدام غشاء غسيل الكلى المقطوع بالوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون ضد العازلة C لإزالة الإيميدازول ، وباستخدام البروتياز الشبيه باليوبيكويتين 1 (ULP1; جدول المواد) إنزيم لإزالة علامة His-SUMO29.
    6. قم بتحميل عينة البروتين المحللة في Buffer C (الجدول 1) من خلال عمود كروماتوغرافيا التبادل الأيوني (عمود Q). بعد ذلك ، قم بإخراج البروتين المرتبط من العمود باستخدام تدرج تركيز كلوريد الصوديوم الذي يتراوح من 100 ملي مولار إلى 600 ملي مولار ، المحضر باستخدام Buffer C و Buffer D (الجدول 1) في جهاز تنقية ÄKTA.
    7. قم بإجراء تحليل SDS-PAGE لمركب DgpA و DgpB / C المخرج من عمود Q كخطوة 1.2.3 ، مع ملاحظة الأوزان الجزيئية: علامة His-SUMO (17 كيلو دالتون) ، DgpA (44 كيلو دالتون) ، نطاقات قليلة الدالتون من DgpA (أعلى من 95 كيلو دالتون) (الشكل 2 ه) ، DgpB (15 كيلو دالتون) ، DgpC (33 كيلو دالتون) ، نطاقات قليلة الدالتون من DgpB و DgpC (بين 53 كيلو دالتون و 95 كيلو دالتون) (الشكل 2 ك).
    8. قم بتنقية البروتين باستخدام عمود استبعاد الحجم (SEC) باستخدام Buffer E (الجدول 1). قم بإجراء تحليل SDS-PAGE باستخدام البروتينات من جزء الشطف ، متبوعا بتلوين Coomassie Blue لتصور نطاقات البروتين. اجمع الكسور التي تحتوي على مركب البروتين المستهدف DgpA أو DgpB / C بعد التحليل بواسطة SDS-PAGE.
      ملاحظة: يظهر نطاق DgpA عند حوالي 44 كيلو دالتون مع نطاق DgpA قليل الدالتون أعلى من 95 كيلو دالتون (الشكل 2F) ، بينما DgpC عند حوالي 33 كيلو دالتون ، و DgpB عند حوالي 15 كيلو دالتون مع DgpB و DgpC قليل الدالتون (بين 53 كيلو دالتون و 95 كيلو دالتون) (الشكل 2L).
    9. قم بقياس تركيز البروتين لمركب DgpA أو DgpB / C باستخدام قطرة نانوية عند 280 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتركيز مركب DgpA أو DgpB / C إلى حوالي 20 مجم / مل باستخدام أنابيب الترشيح الفائق ، وقم بتقطيعها ، وقم بتجميدها بالنيتروجين السائل. قم بتخزين مركب DgpA أو DgpB / C عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
  3. جمع بيانات طيف ازدواج اللون الدائري (CD)
    ملاحظة: نظرا لأن أكسدة الجليكوسيل المحفزة بواسطة DgpA تعمل كخطوة بدء حاسمة في مسار التمثيل الغذائي ، فقد تم استخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط على وجه التحديد للتحقق من حالة الطي المناسبة والسلامة الهيكلية الثانوية ل DgpA. هذه المعلمات الهيكلية مهمة للغاية لكل من النشاط الأنزيمي وتبلور البروتين الناجح.
    1. تمييع بروتين DgpA إلى 0.2 مجم / مل مع 1 × مخزن مؤقت PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) (الجدول 1).
    2. قم بتحميل 1x PBS buffer (درجة الحموضة 7.4) في كوفيت كوارتز وسجل طيف القرص المضغوط الأساسي أكثر من 200 - 260 نانومتر باستخدام مطياف القرص المضغوط للكشف بحساسية عن الهيكل الثانوي واختلافات حالة الطي27.
    3. استبدل الكوفيت العازلة بعينات بروتين من 1.3.1 ، وسجل طيف القرص المضغوط أكثر من 200 - 260 نانومتر ، واطرح خط الأساس للمخزن المؤقت للحصول على طيف القرص المضغوط لعينة البروتين.
    4. اجمع ثلاث عمليات مسح للتأكد من دقتها وحلل البيانات لميزات الهيكل الثانوي وحالة طي البروتين (الشكل 3G ، 3H).

2. علم البلورات البروتيني وتحديد الهيكل

ملاحظة: بعد التأكد من أن DgpA حافظت على سلامة الطي والهيكل المناسبة ، تم استخدام مناهج البيولوجيا الهيكلية لتحديد الهياكل ثلاثية الأبعاد لكل من DgpA. بالنظر إلى أن الكفاءة التحفيزية لمركب DgpB / C قد تم تأكيدها كيميائيا حيويا من خلال المقايسات الوظيفيةالسابقة 10،26،27 ، فقد تم حذف خطوة التحقق الطيفي للقرص المضغوط.

  1. نمو بلورات البروتين وتحسينه
    1. امزج 0.5 ميكرولتر من DgpA المنقى (20 مجم / مل) أو مركب DgpB / C (20 مجم / مل) بحجم متساو (0.5 ميكرولتر) من محلول الخزان من مجموعات التبلور على ألواح بلورية مكونة من 48 بئرا بطريقة الجلوسوالإسقاط 30. انقل الألواح البلورية إلى 16 درجة مئوية لنمو البلورات.
      ملاحظة: راقب قطرات الجلوس هذه بالمجهر لتحديد الظروف (بما في ذلك تركيز البروتين والرواسب ، مثل PEG 3350 ، وفورمات المغنيسيوم ، وما إلى ذلك) لنمو البلورات المعقدة DgpA أو DgpB / C.
    2. قم بإجراء تحسين التبلور لكل من DgpA ومركب DgpB / C باستخدام طريقة نشر بخار القطرة المعلقة30.
    3. بالنسبة إلى DgpA، ابدأ بالشرط المحدد في الخطوة 2.1.1 (فورمات المغنيسيوم 20 ملليمتر، PEG3350 في المائة 20) وقم بتطبيق نهج التحسين المتعامد عن طريق اختبار ستة تدرجات تركيز PEG3350 (17٪ و 18٪ و 19٪ و 20٪ و 21٪ و 22٪) مقابل أربعة تدرجات تركيز فورمات المغنيسيوم (16 ملي مولار و18 ملي مولار و20 ملي مولار و22 ملليمتر)30.
    4. تحضير قطرات التبلور عن طريق خلط 0.8 ميكرولتر من محلول بروتين DgpA (10 أو 20 مجم / مل) مع 0.8 ميكرولتر من محلول الخزان على أغطية زجاجية سيليانية. ثم اقلب الغطاء فوق ألواح تبلور 24 بئرا واحتضانه عند 16 درجة مئوية لنمو البلورات.
    5. لتحسين مركب DgpB / C ، اتبع نفس النهج: امزج 0.8 ميكرولتر من مركب البروتين (10 أو 20 مجم / مل) مع 0.8 ميكرولتر من محلول الخزان الذي يحتوي على أسيتات المغنيسيوم (16 أو 18 أو 20 أو 22 ملليمتر) و PEG 8000 (8٪ ، 9٪ ، 10٪ ، 11٪ ، 12٪ أو 13٪). وبالمثل ، قم بإعداد قطرات معلقة على أغطية سيلانية فوق ألواح 24 بئرا واحتضانها عند 16 درجة مئوية.
    6. دع بلورات البروتين لمركب DgpA و DgpB / C تنمو إلى الحجم الكامل حتى تتوقف عن النمو ، ثم انقل البلورات إلى محلول نقع يحتوي على عازلة الخزان و 5 ملي مولار من مركبات الركيزة (الجلوكوز والبويرين) لمركب DgpA و DgpB / C عند 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    7. انقل البلورات ، بما في ذلك DgpA (مع الجلوكوز أو الخالي من الركيزة) ومركب DgpB / C (خال من الركيزة) ، إلى محلول حاجز بالتبريد يحتوي على حالة المخزن المؤقت للنقع المكملة بنسبة 25٪ من الجلسرين وتخزينها على الفور في النيتروجين السائل لجمع البيانات.
      ملاحظة: على الرغم من أن كلا من البلورات المعقدة DgpA و DgpB / C كانت غارقة في الركائز (الجلوكوز والبويراين) ، إلا أنه تم دمج الجلوكوز فقط بنجاح في المركز التحفيزي ل DgpA. وبالتالي ، تم الحصول على ثلاثة أشكال بلورية متميزة للتحليل الهيكلي: DgpA مع الجلوكوز (الشكل 3E) ؛ DgpA خال من الركيزة (الشكل 3B-C) ؛ ومركب DgpB / C الخالي من الركيزة (الشكل 3 د). يحمي محلول الواقي من التبريد بلورات البروتين عن طريق منع تكوين الجليد أثناء التبريد الوميض في النيتروجين السائل ، وبالتالي الحفاظ على سلامتها الهيكلية وتقليل الضرر الناجم عن الإشعاع. عادة ما يتم صياغته باستخدام الخمور الأم كقاعدة ، ويتم استكمال المحلول بتركيزات محسنة من المواد البردية (على سبيل المثال ، الجلسرين أو الإيثيلين جلايكول).
  2. جمع البيانات وتحديد هيكلها
    1. اجمع بيانات حيود الأشعة السينية للبلورة ل DgpA مع الجلوكوز أو في أشكال خالية من الركيزة ، ومركب DgpB / C في شكل خال من الركائز في مرفق شنغهاي للإشعاع السنكروترون (SSRF) التابع لمرفق شنغهاي الوطني لعلوم البروتين (NFPS) بطول موجي ساقط يبلغ 0.978 Å.
    2. قم بمعالجة المجموعات الثلاث من بيانات حيود الأشعة السينية ، بما في ذلك مركب DgpA و DgpB / C ، باستخدام برنامج معالجة البيانات البلورية31. أولا ، قم بتحميل البيانات الأولية ، ثم قم بتنفيذ وظائف الفهرس والتكامل والقياس بالتتابع بالنقر فوق الأزرار المقابلة في البرنامج. قم بإنشاء ملف إخراج معالج (output.sca) مناسب لتحديد الهيكل اللاحق.
    3. حدد هياكل DgpA مع الجلوكوز أو في أشكال خالية من الركيزة (الشكل 3B-C ، 3E) ، ومركب DgpB / C في خال من الركيزة (الشكل 3D) باستخدام طريقة الاستبدال الجزيئي (جدول المواد). ثم قم بتحسين الهياكل وخرائط الإلكترون من خلال دمج الروابط ذات الصلة (مثل الجلوكوز ، Mn2+ ، H2O ، إلخ.)31.

3. مراقبة نشاط التفاعل وتحديد المعلمات الحركية

ملاحظة: يتوسط نظام DgpA / B / C تحولات C-glycoside من خلال سلسلة محددة من خطوتين: يبدأ DgpA في التحفيز عن طريق أكسدة جزء السكر ، مما يولد وسيطا يقوم مركب DgpB / C لاحقا بشق أو إيزومرات10،26،27. في هذه الدراسة ، يشير DgpA / B / C إلى الإنزيمات المسؤولة عن سلسلة التفاعل هذه ، بينما تجدر الإشارة إلى أنه لا يحدث تفاعل مباشر بين DgpA ومركب DgpB / C. يمكن قياس هذا النشاط المقترن بدقة باستخدام ثلاثة طرق تكميلية: تحليل منتج HPLC ، أو فحوصات القياس الطيفي المقترنة ب DCPIP التي تراقب نقل الإلكترون ، أو التوصيف الحركي التفصيلي لمعلمات التفاعل27،32. على وجه التحديد ، تم تحليل منتجات انقسام C-glycoside (daidzein) الناتجة عن تحفيز DgpA / B / C بواسطة HPLC (اكتشاف الأشعة فوق البنفسجية عند 265 نانومتر). تم تحديد تكوين المنتج باستخدام منحنى معايرة قياسي (تم وصف طريقة إنشاء المنحنى القياسي بالتفصيل في الملاحظة الواردة في الخطوة 3.3.2.) ، وتم تحديد المعلمات الحركية من خلال ملاءمة معدلات تكوين المنتج مع نموذج Michaelis-Menten من خلال تحليل الانحدار غير الخطي27،32. قدم مقايسة التثبيط التي تقيس تأثير الجلوكوز على انقسام رابطة الجليكوزيدية في البورارين دليلا داعما على أن السكريات يمكن أن تكون بمثابة ركائز ل DgpA. بعد ذلك ، يراقب مقايسة DCPIP تفاعلات أكسدة السكر عن طريق قياس اختزال 2،6-ثنائي كلورو فينوفينوفينول أزرق اللون (DCPIP) إلى leuco-DCPIP عديم اللون لأنه يقبل الإلكترونات من السكريات المؤكسدة33 ، مما يعكس النشاط التحفيزي ل DgpA.

  1. مراقبة نشاط DgpA / B / C بواسطة HPLC
    1. قم بإجراء انقسام C-glycoside المحفز DgpA / B / C أو تفاعل الأيزومرية في 500 ميكرولتر من Buffer F (الجدول 1) الذي يحتوي على 20 ميكرومتر DgpA و DgpB / C مركب (من الخطوة 1.2.7) ، و 0.1 ملي مولار من أي من: البويرارين أو الجينيستين -8-C-glucoside لتفاعلات الانقسام ، أو دايدزين أو جينيستين لتفاعلات الأيزومرة27. قم بإجراء التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعات وقم بإنهائها بإضافة 1.5 مل من الميثانول إلى خليط التفاعل.
    2. جهاز الطرد المركزي لمحلول التفاعل عند 16,000 × جم لمدة 15 دقيقة لإزالة راسب البروتين المتكون بسبب تمسخ الإنزيم الناجم عن الميثانول. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر.
    3. قم بإجراء تحليل HPLC مع شطف التدرج ، بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة بحجم حقن 10 ميكرولتر وطول موجة للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية 265 نانومتر.
      ملاحظة: كانت المراحل المتنقلة هي الأسيتونيتريل (المرحلة المتنقلة أ) وحمض الأسيتيك المائي 0.1٪ (المرحلة المتنقلة ب) ، مع شطف التدرج. يكون تدرج شطف الطور المتحرك كما يلي: 5٪ -20٪ A في 0-5 دقائق ، 20٪ -45٪ A في 5-15 دقيقة ، 45٪ -52٪ A في 15-18 دقيقة ، 52٪ -55٪ A في 18-19 دقيقة ، 55٪ -5٪ A في 19-21 دقيقة ، و 5٪ A في 21-23 دقيقة. يظهر نظام إنزيم DgpA / B / C كفاءات تحفيزية مختلفة بشكل ملحوظ تجاه ركائز مثل daidzin و genistin ، مما يؤدي إلى اختلافات كبيرة في معدلات تكوين المنتج الخاصة بها. لتقييم حركية تحويل الركيزة وديناميكيات تراكم المنتج كميا ، تم إجراء تحليل شامل للمسار الزمني باستخدام HPLC على فترات 0 و 2 و 4 و 6 و 12 و 16 و 20 و 24 و 36 و 48 ساعة.
  2. مراقبة نشاط DgpA باستخدام مقايسة 2،6 -ثنائي كلورو فينول إندوفينول (DCPIP)
    ملاحظة: يراقب اختبار DCPIP أكسدة السكر عن طريق قياس اختزال DCPIP الأزرق إلى leuco-DCPIP عديم اللون لأنه يقبل الإلكترونات من السكريات المؤكسدة33. هنا ، تم استخدام اختبار مراسل DCIPIP لتسجيل نشاط أكسدة DgpA تجاه مركبات غليكوزيلات مختلفة أو السكريات الأحادية أو السكريات الثنائية أو السكريات الثنائية. تم استخدام Wildtype DgpA والطفرات المعيبة المرتبطة بالسكر بما في ذلك D182A و Δ (308-316) و Δ (311-316)27.
    1. احتضان 0.8 ملي مولار DCPIP ، 50 ميكرومتر بروتين بما في ذلك النوع البري DgpA والطفرات المعيبة الثلاثة المرتبطة بالسكر (DgpA D182A ، DgpA Δ (308-316) ، أو DgpA Δ (311-316)) ، مع ركائز 10 ملي مولار بما في ذلك البورارين ، الفيتكسين ، الجينيستين ، النشا القابل للذوبان ، المالتوتريوز ، اللاكتوز ، السكروز ، الجلوكوز ، أو المالتوز في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4).
    2. بعد 20 ساعة من التفاعل ، سجل تغيير امتصاص DCPIP عند 600 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة33.
  3. تحديد معدل تثبيط الجلوكوز على تفاعل انقسام الرابطة الجليكوزيدية C للبيورارين
    ملاحظة: ينتمي DgpA إلى عائلة إنزيم السكر أوكسيديدوريدوكتاز ، القادر على أكسدة جزء السكر من C-glycosides. يوضح الشكل 3E أن الجلوكوز مرتبط بالمركز التحفيزي DgpA ، ويتم تفصيل بروتوكول تحديد بنية DgpA في الخطوة 2.2.3. لفحص الارتباط التنافسي ل DgpA بين الجلوكوز و C-glycoside puerarin, تم إجراء التجارب التالية.
    1. قم بإجراء التفاعل في 1 × PBS buffer (الرقم الهيدروجيني 7.4). أضف تركيزات مختلفة من الجلوكوز (1 ملي مولار ، 5 ملي مولار ، 10 ملي مولار ، 20 ملي ، 50 ملي ، 80 ملي مولار ، 100 ملم) إلى نظام تفاعل الانقسام C-glycoside (puerarin) كما هو موضح في الخطوة 3.1. قم بإجراء التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
    2. إجراء تحليل كمي للمنتج (daidzein) باستخدام منحنى معايرة HPLC للمركب المرجعي (daidzein القياسي). احسب معدل التثبيط عن طريق تحديد الفرق في إنتاجية المنتج أولا بين التفاعلات التي تحتوي على تركيزات مختلفة من الجلوكوز وتفاعلات انقسام جليكوسيد C غير المقيدة (بدون الجلوكوز) ، ثم قسمة هذا الفرق على عائد المنتج من التفاعل غير المقيد.
      ملاحظة: لإنشاء منحنى معايرة للتحليل الكمي ل HPLC ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي لمعيار مرجعي (على سبيل المثال ، puerarin أو daidzein) عبر نطاق تركيز (على سبيل المثال ، 0.1-1 ملي مولار ، بزيادات 0.1 ملي). قم بتحليل كل تركيز بواسطة HPLC ، وسجل مناطق الذروة ، ورسمها مقابل التركيزات القياسية المقابلة. قم بإجراء تحليل الانحدار الخطي (y = mx + b ، حيث y = منطقة الذروة ، x = التركيز) لإنشاء المنحنى القياسي. يمكن بعد ذلك استخدام معادلة الانحدار لاستعاب تركيزات العينة غير المعروفة من مناطق الذروة المقاسة.
  4. تحديد المعلمات الحركية
    ملاحظة: يتم التعرف على المعلمات الحركية على نطاق واسع على أنها معايير ذهبية مهمة لتقييم الكفاءة التحفيزية الأنزيمية كميا. لتقييم التفاعلات المحفزة DgpA / B / C كميا ، تم تحديد المعلمات الحركية لتفاعلات الانقسام البويراري C-glycoside المحفزة بواسطة DgpA / B / C.
    1. قم بإعداد تدرجات تركيز الركيزة C-glycoside (puerarin) (تتراوح من 0.01 إلى 4 ملي مولار بزيادات 2 ضعف) لتفاعل انقسام C-glycoside المحفز DgpA / B / C.
    2. قم بإجراء التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعات وفقا للطريقة الموضحة في الخطوة 3.1. قم بإجراء تحليل كمي للمنتج (daidzein) باستخدام منحنى معايرة HPLC للديدزين القياسي. ثم احسب معدل التفاعل (معدل تكوين المنتج) بقسمة الكمية الكمية على وقت التفاعل.
    3. حدد المعلمات الحركية للقط KM و k من خلال ملاءمة معدل التفاعل المحسوب وتركيز الركيزة مع نموذج Michaelis-Menten باستخدام برنامج إحصائي (جدول المواد).

4. تحضير وكشف المنتج الوسيط للتفاعل

ملاحظة: بالإضافة إلى نشاط انقسام جليكوسيد C ، يحفز DgpA / B / C أيضا أزومير O-glycosides إلى C-glycosides. لذلك ، عند استخدام O-glycosides كركائز ل DgpA / B / C ، سيتم إنتاج المنتجات الوسيطة على شكل جليكوسيدات C الأيزومية. لتوصيف المنتج الوسيط (puerarin) ، تم تنقية المركب الوسيط وتحليله لاحقا باستخدام أدوات الكيمياء التحليلية ، بما في ذلك LC-MS / MS والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.

  1. تحضير المنتج الوسيط للتفاعل في تفاعل أزومرة جليكوسيد المحفز DgpA / B / C 27
    1. قم بإعداد تفاعل الأيزمرة المحفز DgpA / B / C O- إلى C-glycoside باستخدام 0.2 ملي مولار O-glycoside (daidzin) كركائز و 20 ميكرومتر DgpA و DgpB / C في حجم تفاعل 90 مل ، باتباع البروتوكول الموضح في الخطوة 3.1 أعلاه.
    2. قم بتنقية المنتج الوسيط C-glycoside (puerarin) باستخدام HPLC التحضيري عند استراتيجية الشطف المتدرج (NOTE).
      ملاحظة: كانت المراحل المتنقلة هي الأسيتونيتريل (المرحلة المتنقلة أ) وحمض الأسيتيك المائي 0.1٪ (المرحلة المتنقلة ب) ، مع شطف التدرج. يكون تدرج شطف الطور المتحرك كما يلي: 5٪ -20٪ A في 0-5 دقائق ، 20٪ -45٪ A في 5-15 دقيقة ، 45٪ -52٪ A في 15-18 دقيقة ، 52٪ -55٪ A في 18-19 دقيقة ، 55٪ -5٪ A في 19-21 دقيقة ، و 5٪ A في 21-23 دقيقة.
    3. احسب تركيز المنتج الوسيط المنقى باستخدام منحنى HPLC للمعايرة القياسية في الخطوة 3.3.2 ، واحصل على حوالي 6 مجم بورارن في نظام تفاعل 90 مل في الخطوة 4.1.1 ، ثم جفف المنتجات الوسيطة المنقاة باستخدام مكثف طرد مركزي فراغي للاستخدام في المستقبل.
  2. توصيف المنتج الوسيط للتفاعل باستخدام LC-MS / MS
    1. اجمع المنتجات الوسيطة المجففة من الخطوة 4.1.3. قم بوزن 100 ميكروغرام من المواد الوسيطة المشتقة من الدايدزين ، ثم قم بإذابتها في 2 مل من الميثانول لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام / مل. جهاز طرد مركزي عند 13,500 × جم لمدة 10 دقائق وجمع المادة الطافية لتحليل LC-MS / MS.
    2. استخدم نفس برنامج الشطف المتدرج HPLC في الخطوة 4.1.2 لتحليل LC-MS / MS بحجم حقن 5 ميكرولتر.
  3. توصيف المنتج الوسيط للتفاعل مع الرنين المغناطيسي النووي
    1. قم بإذابة 4 مجم من المنتجات الوسيطة المنقاة من تفاعل دايدزين في 340 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد -د 6 لمدة 1ساعة و 13درجة مئوية التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. اضبط معلمات الأداة على النحو التالي: درجة الحرارة عند 298 كلفن ، والرقائق 3 مرات ، وعرض النبضة 18 ميكرو ثانية ، وتأخير الاسترخاء 1.5 ثانية ، 48 عملية مسح ، مع معلمات أخرى في الإعدادات الافتراضية27.
    2. اجمع طياف الرنين المغناطيسي النووي 1H و 13C باستخدام جهاز NMR 600 ميجاهرتز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اتباع الإجراءات الموضحة في الشكل 1، عبرنا أولا عن جينات DgpA و DgpB و DgpC في E. coli خلايا BL21 (DE3). نظرا لأن DgpB و DgpC يشكلان مركب إنزيم مستقر (مركب DgpB / C)10,26,27,34، تم دمج الخلايا التي تعبر عن هذين البروتينين للتنقية المشتركة. بعد تحلل الخلية ، تم جمع المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 48,000 ×g ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حاليا ، لا تزال الخصائص الهيكلية والوظيفية لإنزيمات التمثيل الغذائي C-glycoside في هذا المجال غير واضحة ، وتفتقر طرق البحث المناسبةإلى 10،24،26. من خلال الاستفادة من المزايا الهامة للكيمياء والتكنولوجيا الحيويةالمدمجة 40،41،42،43،4...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

يتم تمويل هذه الدراسة من خلال برنامج صندوق الشركات الناشئة في جامعة بكين للطب الصيني (BUCM) (90011451310011) إلى WM ، وصندوق الطوارئ ضد برنامج COVID-19 في BUCM (1000061223476) إلى W.M. ، وفريق الابتكار وبرنامج تنمية المواهب للإدارة الوطنية للطب الصيني التقليدي (ZYYCXTD-C-202006) إلى W.M. ومشروع البحث المستقل لطلاب الدراسات العليا في BUCM (ZJKT2023012) إلى HP. نشكر جميع أعضاء المختبر في مختبر Wenfu Ma على المناقشة المفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2،6-ثنائي كلورو إندوفينول (DCPIP)Solarbio للعلوم والتكنولوجياD6350
2-Mercaptoethanol (& beta ;-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 & صبغ تحميل البروتينسانغون التكنولوجيا الحيويةC508320
حمض الخليكشنغهاي ماكلينA111247
أسيتونيتريلثيرمو فيشر العلمي والتجارة؟ InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 ميغاهيرتز مطياف الرنين المغناطيسيالنووي BrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 ميجاهرتز
جهاز طرد مركزي 5424REppendorf022620601
Chirascan & trade; بالإضافة إلى مطياف القرص المضغوطالفيزياء الضوئية التطبيقيةChirascan & trade;  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) الخلايا المختصةThermo Fisher Scientific & trade;؟ InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlucoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad Softwareالإصدار؟ المنشور 9احسب Km< / sub> و kcat< / sub> المعلمات الحركية
HiLoad Superdex 200 pg أعمدة SEC الإعداديةCytiva28989335
HisTrap HP أعمدة تنقية البروتين الخاصة بهCytiva17524802
HiTrap Q FF عمود كروماتوغرافيا تبادل الأنيونCytiva17515601
HKL-3000HKL Research Inc  الإصدار 723
HPLC العمود TC-C18 (2) ، 170 Å ؛ 5 µ ؛ م ، 4.6 × 250 ممAgilent Technologies518925-902
الأيزوبروبيل & بيتا ؛ -D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد؟ IPTG)سيجما ألدريتشPHG0010
اللاكتوزسيجما ألدريتش17814
LC-20AT ، كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداءShimadzuLC20AT
مالتوزسيجما ألدريتش47288
مالتوتريوزسيجما ألدريتش443713
كلوريد المنغنيزشنغهاي يواني التكنولوجيا الحيويةS31112
الميثانولالحرارية فيشر العلمية والتجارة;؟ InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Olympus SZX12 مجهر ستيريوأوليمبوس  SZX7
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)سيجما ألدريتشP7626   ؛
فينيكسفريق تطويرفينيكس 1.21.2فينيكس عبارة عن مجموعة برامج شاملة لتحديد بنية بلورات البروتين ، تتضمن طرق SAD (التشتت الشاذ أحادي الطول الموجي) و MR (الاستبدال الجزيئي) مع برنامج Phaser.
الكروماتوجراف السائل عالي الأداء التحضيريWaters2545/2998
طقم فحص كريستال البروتينهامبتون للأبحاثHR2-110 / HR2-112 / HR2-144 / HR2-126 / HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
حاضنة اهتزازShanghai Zhichu Instrument Co.، Ltd& nbsp ؛ ZQZY-AF8
SnakeSkin & التجارة ؛ غشاء غسيل الكلى ، 10 كيلو دالتون MWCO ، 35 ممثيرمو فيشر العلمي والتجارة؟ Invitrogen88245
النشا القابل للذوبانSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 جهاز طرد مركزي فائق السرعةThermo Fisher Scientific & Trade ؛75006590
SpectraMax i3x قارئ صفيحة دقيقة متعدد الأوضاعالأجهزة الجزيئيةSpectraMax i3x & nbsp ؛
SpectraMax QuickDrop مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الصغير مواصفاتالأجهزة الجزيئيةQuickDrop
السكروزسيجما ألدريتشS5016
SunFire C18 OBD الإعدادية العمودالمياه186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific & trade;؟ InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
البروتياز الشبيه ب Ubiquitin 1Thermo Fisher Scientific & trade ;? Invitrogen12588018
فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغايةثيرمو فيشر Scientific905GP-ULTS
مكثف الطرد المركزي الفراغيBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513

المراجع

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell. 187 (11), 2717-2734.e33 (2024).
  4. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), (2022).
  5. Zhang, S. -J., Guo, J. -R., Kang, A., Di, L. -Q. Advance in studies on gut microbiota in de-glycosylation of traditional Chinese medicine glycosides. Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo Zhongyao ZazhiChina Journal of Chinese Materia Medica. 38 (10), 1459-1466 (2013).
  6. Xie, G. -Z., Hui, H. -Y., Peng, M. -J., Tan, Z. -J. Biotransformation of glycosides in herbal medicine by gut microbiota. World Chinese Journal of Digestology. 26 (4), 221(2018).
  7. Vuong, T. V., Wilson, D. B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 195-205 (2010).
  8. Davies, G., Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3 (9), 853-859 (1995).
  9. Ito, T., Fujimoto, S., Shimosaka, M., Taguchi, G. Production of C-glucosides of flavonoids and related compounds by Escherichia coli expressing buckwheat C-glucosyltransferase. Plant Biotechnology. 31 (5), 519-524 (2014).
  10. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104, 1883-1890 (2020).
  11. Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain. Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).
  12. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).
  13. HATTORI, M., et al. Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria. Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).
  14. Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1. Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).
  15. Braune, A., Blaut, M. Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium. Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).
  16. Braune, A., Blaut, M. Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides. Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).
  17. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  18. Kim, D. -H., et al. Intestinal bacterial metabolism of flavonoids and its relation to some biological activities. Arch Pharm Res. 21, 17-23 (1998).
  19. Kim, M., Lee, J., Han, J. Deglycosylation of isoflavone C-glycosides by newly isolated human intestinal bacteria. J Sci Food Agric. 95 (9), 1925-1931 (2015).
  20. Tao, Z., et al. Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides. J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).
  21. Wang, S., et al. A newly isolated human intestinal strain deglycosylating flavonoid C-glycosides. Arch Microbiol. 204 (6), 310(2022).
  22. Xu, J., et al. Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to determine the metabolites of orientin produced by human intestinal bacteria. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 944, 123-127 (2014).
  23. Zheng, S., et al. A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties. Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).
  24. Braune, A., Engst, W., Blaut, M. Identification and functional expression of genes encoding flavonoid O-and C-glycosidases in intestinal bacteria. Environ Microbiol. 18 (7), 2117-2129 (2016).
  25. Kumano, T., et al. FAD-dependent C-glycoside-metabolizing enzymes in microorganisms: Screening, characterization, and crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (40), e2106580118(2021).
  26. Nakamura, K., Zhu, S., Komatsu, K., Hattori, M., Iwashima, M. Deglycosylation of the isoflavone C-glucoside puerarin by a combination of two recombinant bacterial enzymes and 3-oxo-glucose. Appl Environ Microbiol. 86 (14), e00607-e00620 (2020).
  27. He, P., et al. Structural mechanism of a dual-functional enzyme DgpA/B/C as both a C-glycoside cleaving enzyme and an O- to C-glycoside isomerase. Acta Pharm Sin B. 13 (1), 246-255 (2023).
  28. Wang, Z., et al. Pro isomerization in MLL1 PHD3-bromo cassette connects H3K4me readout to CyP33 and HDAC-mediated repression. Cell. 141 (7), 1183-1194 (2010).
  29. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  30. Delucas, L. J., et al. Protein crystallization: virtual screening and optimization. Prog Biophys Mol Biol. 88 (3), 285-309 (2005).
  31. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  32. Li, M., et al. An efficient C-glycoside production platform enabled by rationally tuning the chemoselectivity of glycosyltransferases. Nat Commun. 15 (1), 8893(2024).
  33. Peters, B., et al. Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (14), 6397-6412 (2013).
  34. Nasseri, S. A., et al. An alternative broad-specificity pathway for glycan breakdown in bacteria. Nature. 631 (8019), 199-206 (2024).
  35. Rose, J. P., Wang, B. C. SAD phasing: History, current impact and future opportunities. Arch Biochem Biophys. 602, 80-94 (2016).
  36. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  37. Taberman, H., Parkkinen, T., Rouvinen, J. Structural and functional features of the NAD(P) dependent Gfo/Idh/MocA protein family oxidoreductases. Protein Sci. 25 (4), 778-786 (2016).
  38. Jahn, B., et al. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays. J. Biol. Inorg. Chem. 25, 199-212 (2020).
  39. Yu, L., et al. Biotransformation of puerarin into puerarin-6 ″-O-phosphate by Bacillus cereus. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (2), 299-305 (2012).
  40. Lin, H., et al. Lysineless HiBiT and NanoLuc tagging systems as alternative tools for monitoring targeted protein degradation. ACS Med Chem Lett. 15 (8), 1367-1375 (2024).
  41. Ma, K., et al. A Widespread Radical-Mediated Glycolysis Pathway. J Am Chem Soc. 146 (38), 26187-26197 (2024).
  42. Yang, L., Lei, S., Xu, W. Rising above: exploring the therapeutic potential of natural product-based compounds in human cancer treatment. Tradit Med Res. 10 (3), 18(2025).
  43. Zhu, C., Cook, S. P. A concise synthesis of (+)-artemisinin. J Am Chem Soc. 134 (33), 13577-13579 (2012).
  44. Schade, A. E., et al. AKT and EZH2 inhibitors kill TNBCs by hijacking mechanisms of involution. Nature. , 1-9 (2024).
  45. Karpinska, K., et al. Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC. J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LC MS NMR

مقالات ذات صلة