التمدد التكراري التهجين في الموقع (EASI-FISH) هو تقنية قوية تجمع بين الفحص المجهري التوسعي والتهجين الموضعي الفلوري (FISH) للكشف عن التعبير عن جينات متعددة في الأنسجة السميكة. يحدد هذا البروتوكول التطورات الحديثة في الطريقة وتكييفها لتسمية ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي السليم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن تعدد الإرسال للتعبير الجيني في دماغ ذبابة الفاكهة السليم باستخدام التألق التكراري بمساعدة التمدد في التهجين الموضعي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد فهم التعبير الجيني أمرا ضروريا لفك تشفير الوظائف الخلوية. ومع ذلك ، تظل طرق تحليل التعبير عن العديد من الجينات في الموقع داخل نسيج معين محدودة. تم تكييف بروتوكول EASI-FISH الموصوف هنا للكشف عن التعبير عن عشرات الجينات في ذبابة الفاكهة البالغة السليمة (CNS) باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا. يتضمن هذا البروتوكول تركيبة هلامية جديدة تعزز متانة الهلام، مما يتيح جولات متعددة من التهجين ويسمح بتضمين أدمغة متعددة لكل هلام. يزيد هذا التحسين من الإنتاجية ، ويسهل المقارنة المثلى للظروف التجريبية ، ويقلل من تكاليف الكاشف. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال استخدام نظام GAL4-UAS للكشف المشترك عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، يمكن تصور التعبير الجيني في أنواع معينة من الخلايا العصبية أو الدبقية. والجدير بالذكر أن الدقة العالية التي تم تحقيقها من خلال الفحص المجهري التوسعي ، جنبا إلى جنب مع حساسية الطريقة ، تسمح بالكشف عن نصوص الحمض النووي الريبي الفردية. يدمج هذا النهج بشكل فعال جودة الصورة العالية مع الإنتاجية العالية ، مما يجعله أداة قوية لدراسة التعبير الجيني في جميع أنحاء دماغ الذبابة السليم.
المقدمة
FISH تم استخدامه لأول مرة في ذبابة الفاكهة منذ أكثر من 40 عاما لرسم خريطة للجينات على كروموسومات البوليتين< فئة sup = "xref">1،2. اليوم ، FISH أحادي الجزيء هو المعيار الذهبي لتحديد المكانية وقياس نصوص mRNA في الأنسجة السليمة < فئة sup = "xref" >3. ومع ذلك ، نظرا لقضايا سلامة العينة وفقدان الحمض النووي الريبي ، فإن تقنيات FISH ذات الجزيء الفردي الكامل في ذبابة الفاكهة اقتصرت على عدد قليل من الجينات التي يمكن تحليلها في نفس العينة< فئة الدعم = "xref">4،5،6،7. في حين أن التطوير الأخير لل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ هذا البروتوكول على إناث ذبابة الفاكهة السوداء البالغة (5-6 أيام) ، ولكن أي جنس أو ذبابة الفاكهة ينطبق على ذلك. للحصول على وصفات مرساة الجل ، انظر الجدول التكميلي 1 ؛ لوصفة الجل ، الجدول التكميلي 2 ؛ وبالنسبة لكواشف EASI-FISH الأخرى ، الجدول التكميلي 3. للحصول على دليل يومي للمواد والكواشف ، انظر الجدول التكميلي 4. للحصول على حامل جل المجهر الورقي الخفيف ، انظر الملف التكميلي 1. <فئة قوية = "xfig">يوضح الشكل 1A-C تصويرا تخطيطيا لتضمين الأدمغة في المواد الهلامية قبل التوسع وتهجين المسبار (الخطوات من 2.1 إلى 3.8). <فئة قوية = "xfig">....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم إثبات أداء بروتوكول EASI-FISH المعدل هذا من خلال الكشف عن تعبير العديد من الجينات المختلفة المرتبطة بالنواقل العصبية والببتيدات العصبية عبر دماغ ذبابة Drosophila البالغة على جولات متعددة. وعادةً ما يتم تهجين الأدمغة المجلدة والموسعة باستخدام مسبارين أو ثلاثة مسابير في كل جولة، يتبع ذلك إجراء HCR باستخدام أزواج من دبابيس الشعر المقترنة بـ Alexa Fluor (AF) 488 (ما لم يكن GFP معبراً عنه)، و AF546، و AF647 أو Janelia Fluor (JF) 669. وقد أُجري التصوير في الغالب باستخدام مجهر الورقة الضوئية، حيث تم الحصول على مصفو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتيح بروتوكول EASI-FISH الموصوف للجهاز العصبي ذبابة الفاكهة السليم اكتشاف عشرات النصوص في نفس الدماغ أو الجهاز العصبي المركزي. إنه قوي ومباشر وحساس ، ويمكن دمجه مع اكتشاف GFP لتحديد مجموعات فرعية من الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية. نظرا لأن هذه الطريقة سهلة التنفيذ ، فمن المفترض أن تسهل البحث من قبل مختبرات ذبابة الفاكهة مع الاهتمام برسم خرائط وقياس التعبير الجيني في دماغ الذبابة السليمة.
يوفر EASI-FISH العديد من المزايا مقارنة ببروتوكولات FISH السابقة التي لا تشمل الفحص ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر بول تيلبرغ على النصيحة حول ديناميكيات الفحص المجهري التوسعي ، وكريستينا كريستوفورو للمساعدة في تشريح الدماغ ، وجيفري مايسنر على التعليقات النقدية. كما نشكر تانيا وولف وجيري روبن ، وكذلك جيفري مايسنر ووايت كورف ، على السماح لنا بتضمين النتائج التي تم إنشاؤها كجزء من دراستين أكبر. تم تنفيذ جميع الأعمال في حرم Janelia Research Campus وبدعم من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال الأموال لفرق مشروع MultiFISH و Fly-eFISH ، و Gerry Rubin ، والموارد الفنية للمشروع.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.2 مل أنابيب PCR | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1402-4700 | |
| 0.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء اللولبي ، Amber | USA Scientific ؛ | 1405-9707 | |
| 0.5M EDTA, PH 8, RNase free | Invitrogen | AM9260G | |
| 10M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 10x PBS | فيشر | BP 3994 | |
| 20x SSC | ThermoFisher | AM 9763 | |
| 40٪ أكريلاميد | بيو | 1610140 | |
| 4-هيدروكسي تيمبو (4HT) | سيجما | 176141 | |
| 5 م كلوريد الصوديوم خالي من الرنيز | ثيرموفيشر | AM97060G | |
| 5 مل Transfer Pipet- طرف ناعم | Global Scientific | 134070-S20 | |
| 6 لوحة سفلية زجاجية جيدة | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| أسيتونيتريل ، لامائي ؛ | ThermoFisher | 042311-K7 | |
| حمض الأكريليك | TCI | A0141 | |
| Acryloyl-X & nbsp ؛ | بيرسلفات الأمونيوم ThermoFisher | A20770 | |
| (APS) | Sigma | A3678 | |
| التضخيم العازلة | الأدوات الجزيئية | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| اللامائية DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| AstA_B2 | الأدوات الجزيئية | PRR477 | |
| ChAT_B1 | الأدوات الجزيئية | PRG115 | |
| Crz_B5 | الأدوات الجزيئية | PRR480 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| فيجي | https://imagej.net/software/fiji/ | مفتوح | |
| المصدر FMRFa_B2 | الأدوات الجزيئية | PRR487 | |
| GAD1_B5 | الأدوات الجزيئية | RTE581 | |
| GFP الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21311 | |
| الأدوات | الجزيئية العازلة للتهجين | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| Imaris Stitcher | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher | |
| Imaris Viewer | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer | |
| JF-669, SE | Tocris | 6420 | |
| Melphalan | Caymen Chemicals | 16665 | |
| MOPs Buffer | Fisher | BP308-100 | |
| N ، N Methylene-Bis-acrylamide ؛ | Bio-Rad | 1610142 | |
| N ، N ، N '، N '-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED) | Sigma | T22500 | |
| Nuclease Free Water ؛ | Ambion | AM9932 | |
| Oligo Probes | الأدوات الجزيئية | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| بارافورمالدهيد (PFA) EMS | 15710 | ||
| PBS | Fisher & nbsp ؛ | BP24384 | |
| Photoflo-200 | EMS | 74257 | |
| بولي إل ليسين هيدروبروميد (بولييسين) | سيجما | P1524 | |
| مسبار غسيل | الأدوات الجزيئية | العازلة https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| بروتيناز K & nbsp ؛ | NEB | P8107S | |
| QIAquick Removal Nucleotide Kit | Qiagen | 28306 | |
| RNase Away | ThermoFisher | 7003 ، كاشف | |
| RNase خال من DNase1 | Qiagen | 79254 | |
| S2 حشوات | سيليكون 21720024 | ||
| المتوسطة | Invitrogen | P24743 | |
| Tdc2_B5 | الأدوات الجزيئية | RTE880 | |
| Tk_B5 | الأدوات الجزيئية | PRR484 | |
| UltaPure 10٪ SDS | Thermofisher | 15553027 | |
| فائقة النقاء BSA | ThermoFisher | AM2616 | |
| غير مترافقة وأليكسا دبابيس الشعر المترافقة بالفلور | الأدوات | الجزيئيةhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| VAChT_B1 | الأدوات الجزيئية | RTA904 | |
| vGLUT_B2 | الأدوات الجزيئية | RTB212 | |
| Zeis Z7 Gel Holder | Janelia | ملفات CAD متوفرة عند الطلب | |
| Zeiss LSM 980 مجهر مقلوب متحد البؤر | Zeiss | https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980 | |
| Zeiss Z7 مجهر ورقة ضوئية | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html |
المراجع
- Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).
- Gall, J. G. The origin of in situ hybridization - A personal history. Methods. 98, 4-9 (2016....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
