Method Article

الكشف عن تعدد الإرسال للتعبير الجيني في دماغ ذبابة الفاكهة السليم باستخدام التألق التكراري بمساعدة التمدد في التهجين الموضعي

DOI:

10.3791/67656

⸱

May 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Project Technical Resources, Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, 2Project Pipeline Support', Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التمدد التكراري التهجين في الموقع (EASI-FISH) هو تقنية قوية تجمع بين الفحص المجهري التوسعي والتهجين الموضعي الفلوري (FISH) للكشف عن التعبير عن جينات متعددة في الأنسجة السميكة. يحدد هذا البروتوكول التطورات الحديثة في الطريقة وتكييفها لتسمية ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي السليم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم التعبير الجيني أمرا ضروريا لفك تشفير الوظائف الخلوية. ومع ذلك ، تظل طرق تحليل التعبير عن العديد من الجينات في الموقع داخل نسيج معين محدودة. تم تكييف بروتوكول EASI-FISH الموصوف هنا للكشف عن التعبير عن عشرات الجينات في ذبابة الفاكهة البالغة السليمة (CNS) باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا. يتضمن هذا البروتوكول تركيبة هلامية جديدة تعزز متانة الهلام، مما يتيح جولات متعددة من التهجين ويسمح بتضمين أدمغة متعددة لكل هلام. يزيد هذا التحسين من الإنتاجية ، ويسهل المقارنة المثلى للظروف التجريبية ، ويقلل من تكاليف الكاشف. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال استخدام نظام GAL4-UAS للكشف المشترك عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، يمكن تصور التعبير الجيني في أنواع معينة من الخلايا العصبية أو الدبقية. والجدير بالذكر أن الدقة العالية التي تم تحقيقها من خلال الفحص المجهري التوسعي ، جنبا إلى جنب مع حساسية الطريقة ، تسمح بالكشف عن نصوص الحمض النووي الريبي الفردية. يدمج هذا النهج بشكل فعال جودة الصورة العالية مع الإنتاجية العالية ، مما يجعله أداة قوية لدراسة التعبير الجيني في جميع أنحاء دماغ الذبابة السليم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH تم استخدامه لأول مرة في ذبابة الفاكهة منذ أكثر من 40 عاما لرسم خريطة للجينات على كروموسومات البوليتين< فئة sup = "xref">1،2. اليوم ، FISH أحادي الجزيء هو المعيار الذهبي لتحديد المكانية وقياس نصوص mRNA في الأنسجة السليمة < فئة sup = "xref" >3. ومع ذلك ، نظرا لقضايا سلامة العينة وفقدان الحمض النووي الريبي ، فإن تقنيات FISH ذات الجزيء الفردي الكامل في ذبابة الفاكهة اقتصرت على عدد قليل من الجينات التي يمكن تحليلها في نفس العينة< فئة الدعم = "xref">4،5،6،7. في حين أن التطوير الأخير للترميز الشريطي (على سبيل المثال < sup class = "xref" >8,< sup class = "xref" >9,10) يزيد من عدد النصوص التي يمكن اكتشافها حتى عدة مئات حتى في الأنسجة السميكة < sup class = "xref" > 11 ، < sup class = "xref" >12 ، فإن إنشاء مثل هذه البروتوكولات يتطلب استثمارا كبيرا للموارد ، مما قد يكون عقبة أمام التنفيذ. في الواقع ، لا تنتشر العديد من تقنيات النسخ المكاني المبتكرة أبدا خارج مؤسساتها الأصلية< فئة التجميع = "xref" >13. لذلك ، فإن طريقة مباشرة وغير مكلفة نسبيا للكشف عن التعبير عن عشرات الجينات في نفس الدماغ السليم من شأنها أن تسهل أهداف البحث المختلفة: التحقق من صحة تسلسل الحمض النووي الريبي وبيانات أطلس الخلية ، ورسم خرائط لأنواع الخلايا الجزيئية عبر الجهاز العصبي المركزي ، وتحديد الاختلافات التنموية أو الجنسية أو الخاصة بالأنواع في التعبير الجيني ، أو قياس التغيرات في التعبير الجيني الناجم عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من الاضطرابات الجينية أو البيئية المتوفرة في ذبابة الفاكهة.

الفحص المجهري التمدد هو تقنية تسمح للباحثين بمراقبة الأنسجة بدقة أعلى عن طريق توسيعها في طبقة هيدروجيل قابلة للانتفاخ < sup class = "xref">14. يجمع EASI-FISH بين الفحص المجهري التمدد و RNA FISH < sup class = "xref" > 15 ، والذي يستخدم تفاعل سلسلة التهجين (HCR) ، وهي تقنية غير إنزيمية للكشف عن ربط مسبار oligo < فئة sup = "xref" >16. تم تطوير EASI-FISH لأول مرة كنهج بديل للأنسجة الرقيقة FISH لرسم خريطة لأنماط التعبير لعشرات الجينات في شرائح الأنسجة السميكة (300 ميكرومتر) من منطقة ما تحت المهاد الجانبية للفأر < فئة sup = "xref" >17. هذه الطريقة مثالية للتطبيق على أدمغة الذباب البالغة ، نظرا لأن هذا النسيج أقل من 300 ميكرومتر ، وقد تم وصف نموذج أولي لبروتوكول EASI-FISH للذبابة مؤخرا< sup class = "xref">18. هنا ، يتم تضمين أدمغة ذبابة الفاكهة التشريح والثابت في هيدروجيل منتفخ ، حيث يتم تثبيت mRNA والبروتينات تساهميا في بوليمر الهلام مع عوامل الألكلة Melphalan-X و Acryloyl-X (Ac-X) ، على التوالي. بعد هضم البروتين ، والذي يسمح بالتوسع المتناحي للدماغ ، يتم تهجين مجسات الحمض النووي oligo الخاصة بالجين إلى mRNA في الأنسجة لتحديد النصوص ذات الأهمية. ثم تتم إضافة دبابيس شعر الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت في خطوة التهجين الثانية. تتبلمر جزيئات دبوس الشعر المتعددة في تفاعل HCR لتشكيل بوليمرات DNA مستقرة فوقا. يؤدي هذا إلى تضخيم الإشارة للنصوص الفردية ، والتي يمكن اكتشافها كنقاط مضيئة بواسطة ورقة ضوئية أو فحص مجهري متحد البؤر.

إن التثبيت التساهمي ل mRNA والبروتين في مصفوفة الهلام والهضم المحلل للبروتينات بعد تكوين الهلام يخلق بيئة تكون فيها نصوص mRNA مستقرة نسبيا ومن المحتمل أن تكون أكثر سهولة لربط المسبار. يسمح استقرار mRNA والهلام بجولات متعددة من إعادة الفحص والتصوير ، مع تجريد مجسات الحمض النووي ومنتج HCR عن طريق الحضانة باستخدام إنزيم DNase1 بين الجولات < فئة الدعم = "xref" >15 ، < sup class = "xref">17. علاوة على ذلك ، فإن توسيع العينة يقلل من التألق الذاتي وتشتت الضوء عن طريق إزالة الازدحام الجزيئي ويزيد بشكل فعال من دقة الصورة < فئة sup = "xref" >14. لذلك ، يمكن حل نصوص mRNA الفردية بسهولة أكبر.

يحافظ GFP على الإجراء بما يكفي ليظل قابلا للاكتشاف عن طريق التألق أو ربط الأجسام المضادة بعد التمدد. لذلك ، يمكن استخدام هذا المراسل لتمييز أنواع الخلايا ذات الأهمية وتقسيمها. بالاقتران مع العديد من خطوط تشغيل الانقسام GAL4 الخاصة بالخلايا العصبية المتاحة (على سبيل المثال ، < sup class = "xref" >19 ، < sup class = "xref" >20) ، فإن هذا يفتح إمكانية اكتساب مزيد من التبصر في الهوية الجزيئية لنوع عصبي أو تحديد الأنواع الفرعية الجزيئية التي لا يمكن تمييزها بسهولة من خلال تشريحها.

الموصوفة هنا هي نسخة محدثة من النموذج الأولي للذبابة EASI-FISH protocol18 التي تتميز باحتفاظ ممتاز بالحمض النووي الريبي المرسال ، وإزالة الصعوبات الفنية ، ومتانة أكبر للهلام. تشمل التعديلات زيادة تركيز PFA ، وخفض درجة حرارة التثبيت ، وتسهيل تحضير العينة عن طريق تركيب الأدمغة قبل الحضانة باستخدام Melphalan-X و Ac-X. يشتمل هذا البروتوكول أيضا على وصفة جل جديدة لزيادة متانة الجل ، مما يقلل بشكل فعال من تلف الجل عند إجراء العديد من جولات FISH والتصوير. تجعل هذه التعديلات البروتوكول أكثر وضوحا في التنفيذ ، مما يقلل من وقت المعالجة واستخدام الكاشف ، ويعزز الثقة في النتائج المتسقة. الأهم من ذلك ، تزداد قدرة تعدد الإرسال بحيث يمكن فحص عشرات الجينات في نفس الدماغ على مدى أشهر. يتضح ذلك من خلال أنماط التعبير عن العديد من الجينات العصبية في دماغ ذبابة الفاكهة البالغ عبر مجموعة من مستويات التعبير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا البروتوكول على إناث ذبابة الفاكهة السوداء البالغة (5-6 أيام) ، ولكن أي جنس أو ذبابة الفاكهة ينطبق على ذلك. للحصول على وصفات مرساة الجل ، انظر الجدول التكميلي 1 ؛ لوصفة الجل ، الجدول التكميلي 2 ؛ وبالنسبة لكواشف EASI-FISH الأخرى ، الجدول التكميلي 3. للحصول على دليل يومي للمواد والكواشف ، انظر الجدول التكميلي 4. للحصول على حامل جل المجهر الورقي الخفيف ، انظر الملف التكميلي 1. <فئة قوية = "xfig">يوضح الشكل 1A-C تصويرا تخطيطيا لتضمين الأدمغة في المواد الهلامية قبل التوسع وتهجين المسبار (الخطوات من 2.1 إلى 3.8). <فئة قوية = "xfig">الشكل 1D عبارة عن صورة فوتوغرافية للأدمغة المضمنة ، <فئة قوية = "xfig">يوضح الشكل 1E حامل هلام للفحص المجهري للورقة الضوئية ، و <فئة قوية = "xfig">يوضح الشكل 1F الجدول الزمني لتجربة نموذجية. وترد التفاصيل التجارية للكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

< p class = "jove_title" >1. تشريح الدماغ الذبابي وتثبيته

  1. تشريح أدمغة الذباب أو الجهاز العصبي المركزي في وسط S2 البارد (لمزيد من تفاصيل التشريح ، انظر المرجع < فئة الدعم = "xref">21)
  2. لإصلاح الأدمغة ، أضف ما يصل إلى 20 دماغا أو 10 جهاز عصبي مركزي إلى 2 مل من البرودة 4٪ PFA / PBS واحتضانها طوال الليل على مغذيات عند 4 درجات مئوية
    تنبيه: PFA ضار إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه ، ومهيج للجلد والعينين ، وقد يكون مسرطن.
  3. اشطف العينة (1x) ب 2 مل من PBT البارد (0.5٪ ، انظر الجدول التكميلي 4) ، ثم اغسل العينة ب 2 مل من PBT البارد (4x) لمدة 15 دقيقة على مغذي عند 4 درجات مئوية.
  4. اشطف العينة (1x) ب 2 مل من EtOH البارد 70٪. قم بتخزين الأدمغة في 2 مل 70٪ EtOH عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
< ص الفئة = "jove_title" >2. تركيب الأدمغة وإضافة روابط الحمض النووي الريبي والبروتين (اليوم 1)

ملاحظة: ارتد القفازات في جميع الأوقات وامسح المعدات ومساحة العمل باستمرار باستخدام RNase Away. القفازات مطلوبة (1) لإبعاد RNases عن العينات و (2) كحماية من العديد من الكواشف التي تشكل خطرا على الصحة.

  1. قم بإعداد غرف الجل عن طريق مسح شريحة غير مشحونة باستخدام كاشف إزالة التلوث RNase. قم بإزالة الفيلم غير الشفاف الذي يحمي المادة اللاصقة من حشية السيليكون، وألصق الحشية (التي تحتوي على ما يصل إلى 4 غرف) بالشريحة ، وقم بتغطية كل سطح حجرة ب 1 ميكرولتر بولي ليسين باستخدام طرف ماصة P20. يجفف في الهواء ويكرر العملية.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوة 2.1 في اليوم السابق.
  2. انقل الأدمغة إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل (حتى 4 أدمغة لكل أنبوب) وأعد الترطيب لمدة (2x) 5 دقائق في 150 ميكرولتر من PBT (0.1٪) و (2x) لمدة 5 دقائق في PBS.
  3. لتركيب الأدمغة ، أضف 40 ميكرولتر من PBS لكل غرفة ، ثم قم بلصق الأدمغة برفق على التوالي في وسط الغرفة باستخدام ملاقط دقيقة ، مع ترك بعض المسافة بين الأدمغة (انظر <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 د). من الممكن تركيب ما يصل إلى 6 أدمغة أو 2 جهاز عصبي مركزي لكل غرفة.
  4. قم بإزالة PBS وأضف على الفور 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت 20 ملي مولار MOPS. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. بينما تتوازن الأدمغة في المخزن المؤقت MOPS ، قم بإذابة حلول مخزون Melphalan-X و Ac-X وقم بإعداد 75 ميكرولتر من محلول Melphalan-X / Ac-X لكل غرفة (قم بتخفيف مخزون Melphalan-X 1: 1 مع المخزن المؤقت MOPS وإضافة Ac-X عند 1: 100). دوامة وتدور لفترة وجيزة لجمع الحل ؛ حدد وقت التحضير بحيث يكون المحلول جاهزا في نهاية وقت الحضانة البالغ 30 دقيقة ، وليس قبل ذلك.
    تنبيه: Melphalan-X ضار إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه ، ومهيج للجلد والعينين ، وقد يكون مسببا للسرطان.
  6. قم بإزالة جميع المخزن المؤقت MOPS وأضف 50 ميكرولتر من محلول Melphalan-X / AC-X.
  7. قم بتغطية الغرفة عن طريق وضع غطاء في الأعلى ، لكن لا تستخدم لاصق الحشية لإغلاقها. ضع الغرفة في صندوق مرطب واحتضانها محميا من الضوء طوال الليل في RT.
فئة < ص = "jove_title" >3. هضم الهلام والبروتيناز K (اليوم 2)

  1. قم بإزالة الغطاء بعناية و Melphalan-X / AC-X ، واغسل الأدمغة المثبتة (2x) لمدة دقيقتين مع 100 ميكرولتر من PBT (0.1٪) و (1x) لمدة دقيقتين مع 100 ميكرولتر من PBS.
  2. قم بإذابة محلول TREx-1000 و 4HT و TEMED و APS واستمر في وضع الثلج.
    ملاحظة: يمكن أن يترسب TREx-1000 عند -20 درجة مئوية ؛ الدوامة جيدا لتذوب تماما بعد الذوبان.
    تنبيه: هذه الكواشف ضارة أو سامة عند ابتلاعها أو استنشاقها ، وكذلك مهيجات الجلد والعين.
  3. قم بإعداد محلول الجل عن طريق خلط TREx-1000 مع 4HT و TEMED و APS بنسبة 94: 2: 2: 2. دوامة والحفاظ على الجليد. لكل غرفة ، قم بإعداد 150 ميكرولتر من محلول الجل.
  4. قم بإزالة PBS من الغرفة بطرف ماصة وقم بإزالة أي PBS متبقي بعناية بمنديل خال من النسالة. لكل غرفة ، أضف على الفور 40 ميكرولتر من محلول الجل فوق الدماغ. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. قم بإزالة محلول الجل وأضف 40 ميكرولتر من محلول الجل الطازج ، واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق أخرى < br / > ملاحظة: اجمع محلول نفايات الهلام في أنبوب طرد مركزي دقيق وبلمرته قبل التخلص منه.
  6. قم بإزالة محلول الجل وقشر الطبقة الواقية الشفافة من المادة اللاصقة السطحية للحشية. أضف 45 ميكرولتر أخرا من محلول الجل الطازج ، ضع غطاء برفق فوق الحجرة ، وتجنب حبس أي فقاعات هواء. اضغط على الغطاء لإغلاق الغرفة واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق (ليصبح المجموع 30 دقيقة من التوازن عند 4 درجات مئوية).
  7. بلمرة الجل عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  8. بمجرد أن تتماسك المواد الهلامية ، اتركها تبرد على المقعد لبضع دقائق. انزع الغطاء بعناية وقم بإزالة حشية السيليكون بشفرة حلاقة جديدة. بعد ذلك ، قم بقص الجل إلى مستطيل وقم بقص الزاوية العلوية اليمنى لتتبع اتجاه العينة.
  9. قم بإزالة المواد الهلامية من الشريحة باستخدام فرشاة رسم دقيقة مبللة بكمية صغيرة من ProK Buffer وانقلها بشكل فردي إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل.
  10. احتضان كل هلام ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ProK و 5 ميكرولتر من إنزيم ProK (1: 100) عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
< p class = "jove_title" >4. هضم الحمض النووي وتهجين المسبار (اليوم 3)

  1. اغسل المواد الهلامية (3x) لمدة 10 دقائق باستخدام 1 مل من PBS في RT.
    ملاحظة: استخدم ماصات نقل ذات أطراف دقيقة لتجنب إتلاف الجل عند استبدال المحاليل.
  2. احتضان المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في 1 مل من المخزن المؤقت DNase1 عند 37 درجة مئوية.
  3. أضف 50 ميكرولتر من إنزيم DNase1 إلى 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت DNase. تخلط بلطف ، لكن لا تدوام. احتضان كل هلام في 500 ميكرولتر من DNase1 لمدة 2 ساعة و 37 درجة مئوية. اغسل (4x) لمدة 15 دقيقة ب 1 مل من PBS عند RT.
    ملاحظة: يمكن تخزين المواد الهلامية في 5x SSC عند 4 درجات مئوية قبل أو بعد هضم / غسل DNase لعدة أسابيع.
  4. ذوبان التهجين (hyb) ومخزن غسيل المسبار. احتضان المواد الهلامية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت اللامع بدون مجسات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية < br / > تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت لغسيل المسبار والمسبار على الفورماميد، الذي يشتبه في أنه يسبب السرطان.
  5. قم بتخفيف المجسات 1: 100 في المخزن المؤقت (10 نانومتر) ، مع تحضير 300 ميكرولتر لكل هلام. احتضان المواد الهلامية باستخدام عازلة hyb والمجسات طوال الليل عند 37 درجة مئوية. احتفظ بمخزن غسيل المسبار و PBS عند 37 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >5. يغسل المسبار (اليوم 4)

  1. اغسل المواد الهلامية (3x) لمدة 30 دقيقة باستخدام 750 ميكرولتر من مخزن غسيل المسبار عند 37 درجة مئوية.
  2. اغسل المواد الهلامية (3x) لمدة 30 دقيقة ، ثم (3x) لمدة ساعة واحدة مع 1 مل من PBS عند 37 درجة مئوية.
  3. اغسل المواد الهلامية في 2 مل من PBS في RT طوال الليل أو 4 درجات مئوية خلال عطلة نهاية الأسبوع.
< p class = "jove_title" >6. تفاعل التهجين المتسلسل (HCR) مع دبابيس الشعر الفلورية (اليوم 5)

ملاحظة: للحصول على مبدأ HCR، راجع المرجع22.

  1. احتضان المواد الهلامية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم (أمبير) لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. قم بتسخين دبابيس الشعر الفلورية عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية في جهاز PCR وتبرد بسرعة إلى 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. لكل مسبار ، قم بتخفيف أزواج دبابيس الشعر المطابقة (h1 و h2) 1:50 في المخزن المؤقت أمبير ، مع تحضير 300 ميكرولتر لكل هلام ودوامة.
  4. احتضن المواد الهلامية بخليط دبوس الشعر لمدة 3 ساعات في RT في الظلام.
  5. اغسل المواد الهلامية (2x) لمدة 15 دقيقة باستخدام 750 ميكرولتر من 5x SSCT و (2x) لمدة 30 دقيقة مع 1 مل من 0.5x SSCT في RT.
  6. إذا كانت الأدمغة تعبر عن GFP ، فقم بتلطيخ 500 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل GFP-AF488 (1: 500) في PBT (0.1٪) الذي يحتوي على 5 مجم / مل من BSA عالي النقاء واحتضانه طوال الليل (أو خلال عطلة نهاية الأسبوع) عند 4 درجات مئوية.
< p class = "jove_title" >7. تركيب المواد الهلامية والتصوير (اليوم 6)

  1. بعد حضانة الأجسام المضادة ، اشطف المواد الهلامية مرة واحدة واغسلها (1x) لمدة 30 دقيقة باستخدام 1 مل من PBT (0.1٪) ، متبوعا ب (3x) لمدة 30 دقيقة مع 1 مل من PBS.
    ملاحظة: سيؤدي الغسيل في PBS إلى توسيع 2x ؛ للتوسع 3x ، اغسل باستخدام 0.05x SSC.
  2. أثناء الغسيل ، قم بتغطية سطح ملحق الجل لحامل جل المجهر الخفيف مرتين ب 1 ميكرولتر من بولي لايسين ، مما يسمح له بالجفاف عند 37 درجة مئوية بين الطبقات. وبالمثل ، للتصوير متحد البؤر ، قم بتغطية منطقة ربط الجل في طبق زجاجي القاع بالتطبيقات المتكررة للبولي لايسين.
  3. قم بتلطيخ المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة عند RT في 1 مل من 5 ميكروغرام / مل DAPI / PBS أو DAPI / 0.05x SSC ، أو بدلا من ذلك ، قم بتلطيخ الملابس طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. لتركيب الجل على حامل الجل (مجهر الورقة الخفيفة) أو الطبق السفلي الزجاجي (المجهر متحد البؤر) ، ضع الجل على غطاء وجفف الحواف بعناية بمنديل خال من النسالة. تأكد من أن الجل موجه بحيث يكون النسيج أقرب إلى الهدف. باستخدام فرشاة الرسم ، ضع الجل برفق على سطح بولي ليسين بحركة واحدة. للتصوير ، استحم الجل في PBS (أو 0.05x SSC إذا تم التوسع إلى 3x).
    ملاحظة: بعد التصوير ، يمكن إزالة المواد الهلامية برفق من سطح البولي ليسين باستخدام فرشاة رسم مبللة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
  5. لإعادة التحقيق الفوري ، انتقل إلى اليوم 7. للتخزين على المدى الطويل (من أسبوع إلى 6 أشهر) ، قم بتخزين المواد الهلامية في 1 مل من 5x SSC عند 4 درجات مئوية. عندما تكون جاهزا للاستخدام ، اغسل المواد الهلامية (3x) لمدة 10 دقائق مع 1 مل من PBS قبل المتابعة.
    ملاحظة: مدى التمدد متسق بشكل عام في المخازن المؤقتة الموضحة (~2x في PBS و ~3x في 0.05x SSC). للتحقق من عامل التمدد ، قم بقياس حجم الدماغ قبل وبعد التمدد في الصور الملتقطة بمجهر مجسم فلوري. لتصور الدماغ بعد التمدد ، قم بتلطيخه لفترة وجيزة باستخدام DAPI. عامل التمدد التقريبي هو حجم ما بعد التمدد مقسوما على حجم ما قبل التمدد.
< p class = "jove_title" >8. تجريد المجسات ودبابيس الشعر لتعدد الإرسال (اليوم 7)

  1. احتضان المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في 1 مل من المخزن المؤقت DNase1 عند 37 درجة مئوية.
  2. أضف 50 ميكرولتر من DNase1 إلى 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت DNase. تخلط بلطف ، لكن لا تدوام. احتضان المواد الهلامية في 500 ميكرولتر من DNase1 لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
  3. اغسل (4x) لمدة 15 دقيقة باستخدام 1 مل من PBS في RT. المواد الهلامية جاهزة الآن للجولة التالية من التهجين (اليوم 3 ، الخطوة 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر أداء بروتوكول EASI-FISH المعدل هذا من خلال الكشف عن التعبير عن العديد من الجينات المختلفة المرتبطة بالناقل العصبي والببتيد العصبي عبر دماغ ذبابة الفاكهة البالغ على مدى جولات متعددة. عادة ، تم تهجين الأدمغة المتبلور والموسعة بمجسين أو ثلاثة مجسات في كل جولة ، تليها HCR مع أزواج دبابيس الشعر المقترنة ب Alexa Fluor (AF) 488 (ما لم يتم التعبير عن GFP) ، AF546 ، و AF647 أو Janelia Fluor (JF) 669. تم إجراء التصوير في الغالب على مجهر الألواح الضوئية ، حيث اكتسبت مكدس z واحد أو بلاطات متعددة تم خياطتها معا لتشمل ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح بروتوكول EASI-FISH الموصوف للجهاز العصبي ذبابة الفاكهة السليم اكتشاف عشرات النصوص في نفس الدماغ أو الجهاز العصبي المركزي. إنه قوي ومباشر وحساس ، ويمكن دمجه مع اكتشاف GFP لتحديد مجموعات فرعية من الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية. نظرا لأن هذه الطريقة سهلة التنفيذ ، فمن المفترض أن تسهل البحث من قبل مختبرات ذبابة الفاكهة مع الاهتمام برسم خرائط وقياس التعبير الجيني في دماغ الذبابة السليمة.

يوفر EASI-FISH العديد من المزايا مقارنة ببروتوكولات FISH السابقة التي لا تشمل الفحص ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بول تيلبرغ على النصيحة حول ديناميكيات الفحص المجهري التوسعي ، وكريستينا كريستوفورو للمساعدة في تشريح الدماغ ، وجيفري مايسنر على التعليقات النقدية. كما نشكر تانيا وولف وجيري روبن ، وكذلك جيفري مايسنر ووايت كورف ، على السماح لنا بتضمين النتائج التي تم إنشاؤها كجزء من دراستين أكبر. تم تنفيذ جميع الأعمال في حرم Janelia Research Campus وبدعم من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال الأموال لفرق مشروع MultiFISH و Fly-eFISH ، و Gerry Rubin ، والموارد الفنية للمشروع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 مل أنابيب PCR الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1402-4700
0.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء اللولبي ، AmberUSA Scientific   ؛1405-9707
0.5M EDTA, PH 8, RNase freeInvitrogenAM9260G
10M NaOHSigma72068
10x PBS فيشرBP 3994
20x SSCThermoFisherAM 9763
40٪ أكريلاميد  بيو1610140
4-هيدروكسي تيمبو (4HT)سيجما176141
5 م كلوريد الصوديوم خالي من الرنيز ثيرموفيشرAM97060G
5 مل Transfer Pipet- طرف ناعمGlobal Scientific 134070-S20
6 لوحة سفلية زجاجية جيدة CellvisP06-1.5H-N
أسيتونيتريل ، لامائي   ؛ThermoFisher042311-K7
حمض الأكريليكTCIA0141
Acryloyl-X & nbsp ؛بيرسلفات الأمونيوم ThermoFisherA20770
(APS)SigmaA3678
التضخيم العازلة الأدوات الجزيئيةhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
اللامائية DMSOInvitrogenD12345
AstA_B2الأدوات الجزيئيةPRR477
ChAT_B1الأدوات الجزيئيةPRG115
Crz_B5الأدوات الجزيئيةPRR480
DAPISigmaD9542
فيجيhttps://imagej.net/software/fiji/مفتوح
المصدر FMRFa_B2الأدوات الجزيئيةPRR487
GAD1_B5الأدوات الجزيئيةRTE581
GFP الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21311
الأدواتالجزيئية العازلة للتهجينhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Imaris StitcherOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris ViewerOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE Tocris6420
MelphalanCaymen Chemicals16665
MOPs BufferFisherBP308-100
N ، N Methylene-Bis-acrylamide   ؛Bio-Rad1610142
N ، N ، N '، N '-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED)SigmaT22500
Nuclease Free Water   ؛AmbionAM9932
Oligo Probes الأدوات الجزيئيةhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
بارافورمالدهيد (PFA) EMS15710
PBSFisher & nbsp ؛BP24384
Photoflo-200 EMS74257
بولي إل ليسين هيدروبروميد (بولييسين)سيجماP1524
مسبار غسيلالأدوات الجزيئيةالعازلة https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
بروتيناز K & nbsp ؛NEBP8107S
QIAquick Removal Nucleotide KitQiagen28306
RNase Away ThermoFisher7003 ، كاشف
RNase خال من DNase1Qiagen79254
S2 حشواتسيليكون 21720024
المتوسطة InvitrogenP24743
Tdc2_B5الأدوات الجزيئيةRTE880
Tk_B5الأدوات الجزيئيةPRR484
UltaPure 10٪ SDSThermofisher15553027
فائقة النقاء BSAThermoFisherAM2616
غير مترافقة وأليكسا دبابيس الشعر المترافقة بالفلورالأدواتالجزيئيةhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
VAChT_B1الأدوات الجزيئيةRTA904
vGLUT_B2الأدوات الجزيئيةRTB212
Zeis Z7 Gel Holder Janelia ملفات CAD متوفرة عند الطلب
Zeiss LSM 980 مجهر مقلوب متحد البؤرZeisshttps://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
Zeiss Z7 مجهر ورقة ضوئيةZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html
راد إزالة التلوثThermoFisher

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).
  2. Gall, J. G. The origin of in situ hybridization - A personal history. Methods. 98, 4-9 (2016).
  3. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).
  4. Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain. Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).
  5. Yang, L., et al. Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains. Methods. 126, 166-176 (2017).
  6. Meissner, G. W., et al. Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization. Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).
  7. Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems. Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).
  8. Eng, C. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).
  9. Zhang, M., et al. Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH. Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).
  10. Janssens, J., et al. Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles. eLife. 13, RP92618(2024).
  11. Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. bioRxiv. , (2024).
  12. Fang, R., et al. Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues. eLife. 12, RP90029(2023).
  13. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  14. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  15. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  16. Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), 199847(2021).
  17. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. Cell. 184, 6361-6377 (2021).
  18. Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. protocols.io. , (2022).
  19. Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. bioRxiv. , (2024).
  20. Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. bioRxiv. , (2024).
  21. FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2025).
  22. HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: https://www.molecularinstruments.com/technology (2025).
  23. Wolff, T., et al. Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation. eLife. 14, RP104764(2025).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation. eLife. 12, RP92380(2024).
  26. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, e73775(2022).
  27. Xu, S., et al. Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles. Science. 370 (6514), abb2494(2020).
  28. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. GitHub. , (2021).
  29. Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. protocols.io. , (2023).
  30. Bahry, E., et al. RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection. Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).
  31. Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. protocols.io. , (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene ExpressionDrosophila BrainExpansion MicroscopyIn Situ HybridizationEASI FISHMultiplex DetectionConfocal MicroscopyLight Sheet MicroscopyNeuropeptide ExpressionSingle RNA Detection

Related Articles