منهجية محسنة لتوصيل السوائل إلى رئة الفأر: التنبيب باستخدام منظار الأذن للمستهلك

ملخص

يعرض هذا البروتوكول كيف يتيح وضع الفأر على النحو الأمثل وإدخال منظار الأذن القائم على الكاميرا عبر الفم تصور المزمار ، والتنبيب السريع مع الحد الأدنى من صدمة الأنسجة ، وتوصيل السوائل بشكل ثابت إلى الرئتين.

الملخص

يعد التوصيل المستمر للسوائل ، بما في ذلك العلاجات المحتملة ، إلى الرئتين أمرا بالغ الأهمية لنمذجة الأمراض الرئوية والتطوير العلاجي قبل السريري. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية المستخدمة في الفئران - مثل الشفط الفموي البلعومي بطريقة سحب اللسان - يمكن أن تؤدي إلى ولادة متغيرة. هنا ، نصف استخدام منظار الأذن المضاء الميسور التكلفة المرتبط بالهاتف المحمول لتصور المزمار والسماح بالتلقيح المباشر في مجرى الهواء. نحن نفصل تقنية التدريج المحسنة مع الإضاءة المناسبة ومساعدات تحديد المواقع. كما يتم وصف كيفية إجراء التنبيب بشكل موثوق باستخدام قسطرة مرنة 20 جم مع أو بدون ضوء ألياف ضوئي. تقلل هذه التقنية بشكل كبير من التباين في الولادة داخل الرئة وتزيد من حجم السائل الذي يتم توصيله إلى الرئتين. نظرا لانخفاض التباين ، يمكن استخدام أحجام أتراب الأصغر عند استخدام هذه الطريقة بدلا من التقطير الفموي البلعومي بطريقة سحب اللسان. ما يلي هو طريقة للتنبيب الفعال والسريع والمتسق للفئران وتوصيلها إلى الرئتين ، بما في ذلك التأكيد القوي لوضع الأنبوب الرغامي. مع هذه المنهجية المحسنة ، أصبح التنبيب المتسق والآمن والتوصيل الفعال والقابل للتكرار إلى الرئتين في متناول اليد.

المقدمة

على الصعيد العالمي ، تعد أمراض الجهاز التنفسي القاتل الأول للأطفال دون سن 5 سنوات وهي سبب رئيسي للمراضة والوفيات لدى^{البالغين 1}. في عام 2021 ، كانت عدوى SARS-CoV2 هي السبب الرئيسي الثالث للوفاة في الولايات المتحدة². غالبا ما تستخدم نماذج الفئران لدراسة أمراض الرئة ، بما في ذلك الربو والالتهاب الرئوي والأمراض الرئوية الاقتحامية المزمنة والتليف الرئوي. تتطلب جميع هذه النماذج تقريبا توصيل عوامل سائلة إلى الرئتين. يمكن القيام بذلك عن طريق القنطرة المباشرة للقصبة الهوائية (عادة تحت التصور المباشر باستخدام تقنية القطع الجراحي) ، أو الولادة داخل الأنف ، أو الشفط الفموي البلعومي بطريقة سحب اللسان^{الراسخة 3،4،5}. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات كلها لها عيوب. تكوين الأنسجة الندبية بعد تقنية القطع الجراحي يجعلها غير مناسبة للدراسات التي تتطلب الإعطاء المتكرر للعوامل في الرئة ، ويمكن أن تؤدي الطريقتان الأخيرتان إلى توصيل متغير للرئة. علاوة على ذلك ، عند استخدام طريقة سحب اللسان ، يمكن نطق صدمة الأنسجة في اللسان ، وتعتمد كفاءة التوصيل على الباحث الذي يقوم بالإجراء ، انظر الشكل 1.

الشكل 1: يؤدي التنبيب الموجه وتقطير تكنولوجيا المعلومات إلى تحسين التوصيل إلى الرئة وتقليل التباين عند مقارنته بسحب اللسان. (أ) قدم ثلاثة باحثين مختلفين 50 ميكرولتر من الحبر الهندي المخفف عن طريق سحب اللسان ، وهي الطريقة المعمول بها لإدارة البلعوم الفموي (OP). قام باحثان أيضا بتسليم الحبر إلى الرئة باستخدام التنبيب كما هو موصوف. (ب) استئلت الرئتان بعد 1-4 ساعات من الولادة وتم تصويرهما بتكبير 2 مرة. تم تقييم الصور الفوتوغرافية للمنطقة الملطخة باستخدام ImageJ. (ن = 6 (التنبيب) أو 9 (إدارة المرجع) ، نتائج من 2 أو 3 تكرارات مستقلة بواسطة 2-3 باحثين مختلفين ، ص <0.0001 اختبار ويلش تي) (ج) تم حساب التباين في إعطاء الرئة أيضا كنسبة مئوية من الانحراف عن المتوسط. كانت إدارة البروتوكول الاختياري أكثر تنوعا بكثير. (ص = 0.0317 ، اختبار T الويلزي ، GraphPad Prism 10.2.3 جميع الإحصائيات والرسوم البيانية) (تم استخدام C57BL / 6J من الذكور والإناث من الفئران ، وكانت ~ 10 أسابيع من العمر.) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تشريح الفئران يجعل التنبيب صعبا ويستغرق وقتا طويلا. الفم صغير ، وقد يعيق النسيج الشدقي رؤية الباحث للمزمار^{ريما 6}. علاوة على ذلك ، فإن الطيات الصوتية صغيرة جدا ، وقد يكون من الصعب رؤيتها لأنها تقع بالقرب من قاعدة اللسان. أخيرا ، من الصعب تأكيد الوضع المناسب للأنبوب الرغامي لأن حجم المد والجزر الصغير غالبا ما يفشل في تعفير المرآة⁷. شجعت هذه الصعوبات مجموعة من التقنيات المبتكرة لتنبيب الفئران. تشمل هذه الطرق المحسنة استخدام منظار الحنجرة والأسلاك لحديثي الولادة لإدخال قسطرة إلى القصبة الهوائية^8،9 ، واستخدام مصدر ضوء الألياف الضوئية لتوجيه وتقوية القسطرة^{10 ، 11} ، واستخدام بث فيديو مباشر⁶. في الآونة الأخيرة ، ساعد استخدام منظار الأذن السريري في التنبيب¹². استخدم آخرون transillumination لتصور المزمار وتنبيب الفئران^7،13،14. ومع ذلك ، هناك العديد من الجوانب السلبية لهذه الأساليب. إن استخدام عوامل إزالة الشعر على عنق الفأر وقرب من مصدر الضوء الساخن يجعل التحويل نهجا أقل من مثالي. استخدام الإبرة داخل القسطرة أو إدخال أدوات حادة في الفم يعني أن بعض الطرق لتقوية القسطرة تضع في خطر لا داعي له. أخيرا ، فإن إجراء شق على القصبة الهوائية لتأكيد وضعه يمثل جوانب سلبية كبيرة ، بما في ذلك الحاجة إلى العقم وتراكم الأنسجة الندبية. حتى هذه النقطة ، ثبت أن التقطير داخل القصبة الهوائية عن طريق التنبيب صعب للغاية لاعتماده على نطاق^{واسع 15} وظلت التطورات في التطوير المنهجي منعزلة وغير مستخدمة من قبل العديد من المختبرات¹⁵. ركزت دراسات أخرى على اختيار التخدير أثناء الولادة ، ووجدت أن الكيتامين قد يكون له مزايا على الأيزوفلوران⁵. ومع ذلك ، فإن الأيزوفلوران ، الذي ليس مادة خاضعة للرقابة ويتلاشى بسرعة عند الانتهاء من الإجراء ، قدم فوائد جذابة ، لذلك استخدمنا هذا النوع من التخدير مع تحسين الجوانب الأخرى لهذه المنهجية^16،17.

تتغلب الطريقة التي نصفها على تحديات التصور التي حاول الآخرون معالجتها ، وتخفف من المخاطر التي تتعرض لها التجارب ، وتقلل من الوقت اللازم لغرس كميات صغيرة داخل القصبة الهوائية عبر أنبوب القصبة الهوائية ، وتزيد من حجم السائل الذي يصل إلى الرئة ، وتوفر طريقة محسنة لتأكيد وضع الأنبوب الرغامي. باستخدام حامل تعليق ، تسمح أيدي المساعدة المغناطيسية (مشابك التمساح على أذرع مرنة مثبتة على قاعدة) ، والإضاءة الأكثر إشراقا للباحث الفردي بأداء التوصيل الفعال داخل القصبة الهوائية. أصبح التصور أسهل باستخدام منظار الأذن "في المنزل" مع اتصال WIFI. هذا الجهاز ميسور التكلفة أكثر من أدوات التنبيب التجارية. علاوة على ذلك ، يسمح اتصال WIFI بتغذية فيديو متزامنة على جهاز محمول (مثل الهاتف المحمول) ، مما يجعله مناسبا للتدريب. يمكن أن يستخدم التنبيب إما مصدر ضوء ألياف ضوئية مترابطة من خلال قسطرة مرنة (PTFE) مقاس 20 جم × 1 بوصة (تمت إزالة الإبرة) أو القسطرة بدون ضوء. يتم التحكم في العمق بطريقتين - إضافة إسفين أمان التنبيب (واقي مخروطي على القسطرة) ومراقبة العمق في تغذية الفيديو. تم تأكيد وضع أنبوب القصبة الهوائية باستخدام "طريقة الفقاعة" لتصور حجم المد والجزر بشكل أكثر وضوحا من طريقة ضباب المرآة^{التقليدية 18}. هذا أقل إرهاقا للحيوان من الاعتماد على انسداد القصبة الهوائية لتعديل إلحاح الجهاز التنفسي¹⁰ لتأكيد التنسيب. الاستخدام المشترك لأنابيب التمديد المقترنة بالقسطرة لتأكيد التنبيب الناجح (المشار إليه فيما يلي باسم طريقة الفقاعة) ، مبسط من Watanabe et. AL⁷ ، ومنظار الأذن بالفيديو للمستهلك في إجراء واحد يجعل التنبيب طريقة عملية للتوصيل العلاجي إلى الرئة وتحسن واضح في طريقة سحب اللسان (انظر الشكل 1). إذا كنت تبحث عن طريقة موثوقة ومتسقة وبأسعار معقولة لتوصيل السوائل غير الجراحية إلى رئتي الفئران ، خاصة بدون استخدام مواد خاضعة للرقابة (مثل الكيتامين) أو معدات باهظة الثمن ، فقد تكون الطريقة التالية مثالية.

البروتوكول

من الضروري مراجعة هذه الإجراءات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) ، المدرجة في البروتوكول ، واستشارة الموظفين البيطريين قبل المتابعة. وافقت IACUC في مؤسستنا على البروتوكول قبل بدء التجربة وراجعت محتوى الفيديو قبل تقديمه. تم تلقي الدعم والتدريب من خلال قسم الطب المقارن في تولين لضمان أعلى مستوى من الرعاية لجميع المختبر لدينا.

1. الإعداد

ملاحظة: انظر الشكل 2 للإعداد.

الشكل 2: المحطة المستخدمة للتنبيب الموجه معدة كما هو موضح. من اليسار: ماصات للولادة ، أنبوب فقاعة لتأكيد وضع أنبوب القصبة الهوائية المناسب ، ملقط ، ملعقة ، منظار أنف للأطفال (تمت مناقشته ولكن ليس ضروريا لهذا الإجراء) ، مساعدة الأيدي ، ضوء مكبر ، حامل الفأر مع مخروط الأنف ، مسبار الألياف البصرية ، غرفة تحريض التخدير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. قم بتنظيف إسفين الأمان المرفق مع مجموعة التنبيب باستخدام وسادة تحضير الأيزوبروبانول. حرك إسفين الأمان النظيف (أخضر في الفيديو) على القنية المرنة 20 جم وتخلص من الإبرة المتوفرة بأمان.
   ملاحظة: تتضمن مجموعة تنبيب القوارض (جدول المواد) المستخدمة أسافين أمان التنبيب. هذه أكمام مخروطية صغيرة تناسب أكثر من قسطرة مرنة 20 جم × 1 بوصة. أنها تمنع القسطرة من إتلاف الكارينا.
2. اجمع الأدوات الأخرى اللازمة ، بما في ذلك الهاتف المحمول ، ومنظار الأذن التجاري ، وحامل الماوس مع مخروط الأنف ، والملقط المنحني المسنن بدقة ، والأنبوب الرغامي المحضر (من 1.1) ، وضوء الألياف البصرية في حالة استخدامه. نظف كل هذه الفوط باستخدام ضمادات تحضير الأيزوبروبانول قبل الاستخدام.
3. خذ ما يقرب من 20 سم من الأنابيب المرنة. قم بثنيها على شكل حرف U ، وأضف وصلة قفل Luer على أحد طرفيها ، وثبتها بربطة عنق ملتوية. أضف 200-300 ميكرولتر من الماء المصفى المعقم أو الحبر الهندي إلى الأنبوب. فيما يلي ، يشار إلى هذا التجميع باسم "أنبوب الفقاعة".
4. اصنع حلقة خياطة عن طريق ربط ~ 13 سم من خياطة الحرير المضفر بحجم 0 في دائرة. ضع هذه الحلقة في الجزء العلوي من الحامل وتأكد من تأمين جانبي الخيط ، وأن الحامل نظيف. ضع حامل الماوس أعلى قاعدة الضوء المكبر المعدني. ضع الأيدي المساعدة حول مكان فم الفأر.
   ملاحظة: يصنع العديد من البائعين حوامل قابلة للتبديل (انظر جدول المواد) ، ويمكن صنع أحدها داخل المختبر بثمن بخس^4،7،14. تم استخدام خياطة الحرير المضفر بالحجم 0 لتعليق. ومع ذلك ، فقد تم وصف استخدام مواد أخرى لنفس الغرض^4،13.
5. ضع الفأر في غرفة تحريض التخدير. استخدم معدل التدفق الثابت O₂ عند 0.8 لتر / دقيقة و 2٪ إيزوفلوران. تخدير بشكل كاف (انظر الملاحظة) حتى لا يستيقظ أثناء وضع مخروط الأنف. لا تمنع معدل تنفس الفأر بشكل كبير. تساعد الأنفاس المنتظمة في تقدير الطيات الصوتية.
   ملاحظة: يجب أن يكون معدل تنفس الفأر طبيعيا. يستخدم هذا المعيار لتحديد العمق المناسب للتخدير. قد يختلف هذا بين وقد يتجاوز 200 نفس / دقيقة. على هذا النحو ، ليس من العملي أو الضروري حساب التنفس أو استخدام قرصة إصبع القدم.
   تنبيه: يمكن إجهاض هذا الإجراء عند الضرورة. ومع ذلك ، يجب ألا تبقى في غرفة الحث لفترة أطول مما هو ضروري للغاية.
6. قم بتوصيل منظار الأذن بهاتف محمول وتأكد من استقرار موجز الفيديو.
   تنبيه: لتقليل تعرض الباحثين للأيزوفلوران أثناء هذا الإجراء ، استخدم جهاز تنفس كيميائي في حالة إجراء عمليات تنبيب متعددة أو تدريب على هذه الطريقة. بدلا من ذلك ، قم بإجراء العملية في غطاء الدخان.

2. التدريج الحيواني

1. بمجرد أن ينام الأول ، أخرجه من غرفة الحث ، وقم بتجقيفه ، وضع أسنانه العلوية على طول الخياطة. ضع توترا خفيفا على للحفاظ على موضع الخيط أثناء وضع الماوس مرة أخرى على الحامل.
   ملاحظة: في المتوسط ، يتم تخدير لمدة 2 دقيقة بما في ذلك الحث. هذا يقلل بشكل كبير من المخاطر على ، ويزيل الحاجة إلى تزييت العيون ، ويمنع تراكم اللعاب. اعمل على الحفاظ على مخدرة لأقل وقت ممكن.
2. اضبط زاوية الرقبة للخلف قليلا (ضع الرقبة في امتداد طفيف ، 5 درجات -15 درجة). ادفع مخروط الأنف برفق فوق الأنفاد. لا تدفع المخروط لأسفل بقوة ، لأنه يمكن أن يتداخل مع الخيط ، مما يؤدي إلى تعليق الماوس.
3. أمسك اللسان بإحكام بالقرب من الشفة السفلية قدر الإمكان ، باستخدام ملقط كبير مثني مسنن بدقة. اسحبه لأسفل وبعيدا عن الأسنان العلوية إلى جانب واحد من الأسنان السفلية.
   تنبيه: يمكن أن يؤدي الجر لفترات طويلة أو التوتر المفرط أو سحق اللسان إلى الإضرار بصحة. يرجى مراقبة اللسان بحثا عن علامات الصدمة (كدمات أو نزيف أو تورم أو جفاف) ، وإذا لوحظ ، فقم بإجهاض الإجراء وتنبيه الطاقم البيطري.
4. إذا كنت تستخدم أيدي المساعدة ، ادعم الملقط في هذا الوضع. اعتمادا على خبرة الباحث وحدة البصر ، قد تساعد العدسة المكبرة المضاءة في وضع بشكل مناسب.
5. قم بتغذية ضوء الألياف الضوئية (في حالة الاستخدام) من خلال القسطرة المرنة مع إسفين أمان التنبيب (الأخضر في الفيديو) في مكانه.
   ملاحظة: لا تقم بتأمين كابل الألياف الضوئية بمصدر الضوء بإحكام شديد. الضغط بقوة تجعل من الصعب إزالة الضوء مع ترك الأنبوب الرغامي في مكانه.

3. التقدير البصري للأحبال الصوتية والتنبيب

1. مع وجود منظار الأذن في اليد غير المهيمنة ، اضغط عليه برفق على اللسان. بعد ذلك ، قم بزاوية الكاميرا ومصدر الضوء الخاص بها لتصور الحبال الصوتية بالقرب من قاعدة اللسان.
   ملاحظة: يمكن أن تجعل الاختلافات الطفيفة في علم التشريح ولون الأنسجة توجيه الذات أمرا صعبا. استخدم الحركة المرتبطة بالتنفس لتأكيد التحديد الهيكلي.
2. مع إضاءة ضوء الألياف الضوئية (في حالة الاستخدام) ، قم بتغذية القنية بجانب الجزء العلوي من منظار الأذن ، مما يجعل ملامسة الضوء لقاعدة اللسان أو جزء الشفة من منظار الأذن كمرجع. قم بتقديمه إلى فم الفأر بين البليت الناعم وشفة منظار الأذن.
   ملاحظة: إذا لم يتم استخدام ضوء الألياف الضوئية ، فيمكن توصيل "أنبوب الفقاعة" الموصوف في الخطوة 4 بالقسطرة في هذه المرحلة. الإضاءة الساطعة والمركزة في فم الماوس ضرورية لهذا التعديل على الإجراء.
3. اضبط زاوية الاقتراب بحيث تكون القسطرة ضحلة جدا. مباشرة بعد إدخال القسطرة (أقل من 1 مم خارج الطيات الصوتية) ، ارفع طرف القسطرة ، بحيث تكون موازية تقريبا للطاولة هذا يمنع لسان المزمار من إجبار القسطرة ظهريا على دخول المريء. خاصة أثناء التدريب ، عند مواجهة صعوبة ، أو في وقت مبكر من تجربة المرء ، فإن استخدام موجز الفيديو لا يقدر بثمن في وضع الأنبوب الرغامي بين الطيات الصوتية.
   ملاحظة: لا يعيق إنتاج اللعاب رؤية الطيات الصوتية أثناء إكمال هذا الإجراء. ومع ذلك ، فإن استخدام قضيب قطني بطرف الرمح لإزالة اللعاب المسدد موصوف ، في المنشورات السابقة ، عند تنبيب الفئران¹⁹. قد تكون هذه الطريقة مفيدة إذا أصبح اللعاب مشكلة.
   1. إذا واجهت مقاومة ، فقم بإزالة القسطرة على الفور واترك التنفس يعود إلى طبيعته. إذا لوحظ نزيف ، استشر الطاقم البيطري.
      ملاحظة: يجب ألا تكون هناك مقاومة تقريبا عند تقدم القسطرة.

4. تأكيد وضع أنبوب القصبة الهوائية

1. تأكد بصريا من أن الأنبوب الرغامي في المكان الصحيح باستخدام منظار الأذن. علاوة على ذلك ، تأكد من الموضع الصحيح للأنبوب من خلال الأخذ في الاعتبار أن القصبة الهوائية توفر مقاومة أقل أثناء التنسيب من المريء. لاحظ أنه في الموضع المناسب ، يكون الأنبوب الرغامي ~ 5 مم خارج الطيات الصوتية. ابحث عن الضوء من مصدر الألياف البصرية الساطع عبر جلد الرقبة للتحقق مرة أخرى من صحة الموضع.
   ملاحظة: يجب أن يمنع إسفين أمان التنبيب إدخال الأنبوب الرغامي بعيدا جدا. إسفين الأمان يمنع صدمة الكارينا. ومع ذلك ، لا يجب أن يمنع التقدم. يجب استخدامه كميزة أمان وغالبا ما يكون العمق الأمثل أقل عمقا مما يسمح به الإسفين.
2. ثم ، أثناء تثبيت الأنبوب الرغامي في مكانه ، قم بإزالة ضوء الألياف الضوئية. تأكد من وضع القسطرة بشكل مناسب باستخدام "طريقة الفقاعة" (المفصلة أدناه) بدلا من تعفير المرآة.
3. استرجع أنبوب الفقاعة المعد في الخطوة 1.3. قم بإعداده قبل الإجراء وإعادة استخدامه لجميع.
   تنبيه: يجب عدم شفط 200-300 ميكرولتر من الماء أو الحبر الموجود في أنبوب الفقاعة. لتجنب ذلك ، تأكد من أن السائل بعيد عن قفل Luer.
4. مع وضع الأنبوب الرغامي في مكانه ، قم بتثبيت أنبوب الفقاعة في مكانه باستخدام قفل Luer. يجب أن يكون حجم المد والجزر واضحا على الفور. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فإن الأنبوب الرغامي في غير محله. قم بإزالته بسرعة واترك معدل التنفس الطبيعي للماوس بالعودة.
   تنبيه: سيؤدي وضع القسطرة في المريء في وضع خاطئ إلى ضغط القصبة الهوائية ، مما يمنع التنفس الكافي. غالبا ما يكون الوضع الخاطئ مصحوبا بصعوبة في التنفس (بما في ذلك مساهمة ملحوظة من العضلات الوربية) و / أو انخفاض كبير في معدل التنفس. علاوة على ذلك ، قد يؤدي تقنب المريء إلى تشنج عضلي يجعل التنبيب اللاحق أكثر صعوبة. ننصح باستخدام متعددة أثناء التدريب لهذا السبب.

5. التسليم داخل القصبة الهوائية

تنبيه: يشبه إلى حد كبير طريقة سحب اللسان للولادة الفموية والبلعومية ، فإن الولادة عن طريق التنبيب تخاطر بإغراق. في الفئران المراهقة والبالغة ، 50 ميكرولتر هو حجم آمن بشكل عام من السوائل لتوصيله وهو كاف للانتشار في جميع أنحاء الرئتين.

1. في حالة استخدام حقنة للإدارة: افصل أنبوب الفقاعة وقفل Luer عن القسطرة ، وقم بتوصيل حقنة Luer المحملة ، واضغط على المكبس لتوصيل الحجم المطلوب (50 ميكرولتر كحد أقصى).
2. في حالة استخدام ماصة للإعطاء: قم بوضع الحجم المطلوب (50 ميكرولتر كحد أقصى) مباشرة في القسطرة واسمح للفأر باستنشاق المحلول.
   ملاحظة: في حالة التدريب ، ضع في اعتبارك استخدام مؤشر مثل الحبر المخفف أو الهندي المصفى أو الميثيلين الأزرق.
3. لضمان التوصيل المنتشر إلى الرئتين ، اغسل السائل الذي يتم توصيله إلى الرئتين بما يصل إلى 500 ميكرولتر من الهواء²⁰. يمكن القيام بذلك إما باستخدام حقنة قفل Luer سعة 0.5 مل محملة مسبقا ، أو ماصة P1000 مزودة بطرف مرشح ، وكلاهما ثبت موثوقيتهما. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إجراء انخفاضات متعددة في الماصة دون المخاطرة بالشفط السلبي للسائل الذي يتم توصيله.
   تنبيه: في حالة تلقيح باستخدام هذه الطريقة ، ضع في اعتبارك تقليل تركيز اللقاح بسبب زيادة كفاءة التوصيل بالنسبة للشفط الفموي البلعومي أو الولادة داخل الأنف.
   ملاحظة: قد يكون استخدام أكثر من حجم المد والجزر (~ 200 ميكرولتر) ضروريا عند غسل اللقاح بالهواء. ومع ذلك ، فإن استخدام 500 ميكرولتر لا يخاطر بالرضوح الضغطي لأنه لا يمثل سوى نصف السعة الحيوية²¹. تتمتع الفئران البالغة بسعة احتياطية للشهيق تبلغ حوالي ~ 800 ميكرولتر ، لذلك حتى لو كان الفأر قد ألهم مباشرة قبل التنظيف ، فإن الرضح الضغطي لا يحدث²¹. ضع في اعتبارك ما إذا كانت أحجام تدفق الهواء المنخفضة قد تناسب احتياجاتك لتوزيع اللقاح (تم اقتراح 100-200 ميكرولتر).

6. تقييم التسليم

ملاحظة: يتم ذلك فقط إذا كان المرء يتدرب أو يمارس الإجراء.

1. القتل الرحيم للحيوان بشكل إنساني وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد. تم هنا استخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون 2 كطريقة أولية للقتل الرحيم وخلع عنق الرحم كطريقة تأكيدية للقتل الرحيم.
2. افتح جدار الصدر وأزل الرئتين. افعل ذلك عن طريق فتح الصفاق ، والوصول إلى الحجاب الحاجز من الجانب الذيلي وثقبه بمقص صغير حيث يمكن رؤية القلب. سيؤدي ذلك إلى تراجع الرئتين وإعطاء مساحة أكبر لفتح تجويف الصدر عن طريق قطع الأضلاع.
   ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى التروية لتقليل الدم في الرئتين ، فقم بإجراء العملية من خلال البطين الأيمن للقلب في هذه المرحلة.
3. اشطف الرئتين لفترة وجيزة باستخدام 1 مل من PBS المعقم بعد الإزالة. ضعها بشكل مسطح على سطح أبيض (مثل الإسفنجة الجراحية) لكشف المساحة القصوى مع الحفاظ على وضع الفص النسبي.
4. قم بتصوير الرئتين خارج الجسم الحي (استخدمنا هاتفا محمولا) ، وافتح الصور في ImageJ ، وحدد المناطق الملطخة وغير الملوثة عن طريق تتبع الخطوط العريضة لواجهة الصبغة. حدد المنطقة الملطخة باستخدام باحث مستقل أعمى لتجنب التحيز.
   ملاحظة: في حالة استخدام اللمعان و IVIS ، كما هو موضح في الشكل 3 ، يجب إجراء التصوير الحي في الجسم الحي بدلا من الخطوة 6.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 3 ، أدى التلقيح داخل الرئة باستخدام طريقة سحب اللسان التقليدية (الولادة الفموية البلعومي) إلى توزيع حبر غير متسق غير مكتمل وتباين أكبر بين الباحثين. في المقابل ، أدى تقطير تكنولوجيا المعلومات بعد التنبيب إلى توصيل أكثر اتساقا لكل من الرئتين اليمنى واليسرى وكان أقل تغيرا (الأشكال 1C والشكل 3D). في رئتي التي تعطى الحبر عن طريق الشفط الفموي البلعومي باستخدام سحب اللسان ، يكون الحبر دقيقا ولا يوجد إلا بالقرب من الشعب الهوائية الكبيرة للحيوانات (الشكل 1 أ). في المقابل ، عندما تم استخدام التنبيب الموجه لتوصيل الحبر ، انتشر أكثر بكثير في الأنسجة التي تشير إلى مساحة أكبر بكثير من الرئتين. عندما تمت مقارنة مساحة سطح الرئة الملطخة بالحبر بين الطرق ، أثبتت طريقة التنبيب أنها متفوقة بشكل كبير على سحب اللسان (الشكل 1 ب). كان التباين في كمية توصيل الحبر أقل بشكل كبير في حالة التنبيب (الشكل 1 ج). تشير زيادة مساحة الرئة الملطخة والتباين المنخفض في كمية السائل التي تصل إلى الرئتين بقوة إلى أن توصيل تكنولوجيا المعلومات يتفوق على سحب اللسان.

كما هو موضح في الفيديو 1 ، فإن المناظير الداخلية التقليدية (كما تم نشرها سابقا) لها طول بؤري طويل جدا ، لتقدير الطيات الصوتية وتوجيه وضع الأنبوب الرغامي^6،19. في المقابل ، كانت صور الفيديو التي تم التقاطها باستخدام منظار الأذن للمستهلك (الشكل S1 والطوابع الزمنية: 6:34 و 7:05 في الفيديو) بدقة أفضل بكثير مما أدى إلى تحسين تصور المزمار.

تتضمن طريقة التنبيب هذه عمليات تحقق متعددة لوضع الأنبوب في القصبة الهوائية. كان حجم المد والجزر للفأر واضحا بسهولة عند استخدام طريقة الفقاعة (الشكل S2 والطابع الزمني: 8:25) ويعمل كتأكيد نهائي على أن أي سائل يتم توصيله سيدخل الرئتين.

لإجراء مزيد من التقييم لتباين طريقتي التوصيل ، قمنا بتقييم التعبير الجيني المعدل في أنسجة الرئة بعد تلقيح الفئران ب 1 × 10¹¹ vg من AAV6.2-Luciferase باستخدام الطريقتين المختلفتين (التقطير الفموي البلعومي بطريقة سحب اللسان أو الولادة داخل القصبة الهوائية بعد التنبيب الموجه). بعد سبعة أيام من إعطاء النواقل ، تم أخذ قياسات التلألؤ باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) (الشكل 3 أ). بعد ذلك ، قمنا بحساب متوسط الإشعاع عبر كلتا الرئتين. قبل 10 دقائق من التصوير (التعرض لمدة 30 ثانية) ، تم حقنهم (تحت الجلد) ب 200 ميكرولتر من لوسيفيرين (15 مجم / مل). كما هو موضح في الشكل 3 ب ، فإن التي أعطيت الناقل عن طريق التقطير الفموي البلعومي كان لها إشارة مضيئة تم توزيعها على نطاق واسع في كل من منطقة الصدر والأنف. في المقابل ، أظهرت التي أعطيت الناقل عن طريق التوصيل داخل القصبة الهوائية باستخدام التنبيب الموجه تلألؤ مركز في الرئتين. كان متوسط الإشراق في المننبة أكبر بكثير مقارنة بالولادة الفموية البلعومية ، مما يشير إلى تحسين كفاءة توصيل النواقل إلى الرئتين وانخفاض التباين في الولادة ، محسوبة باستخدام الفرق عن المتوسط (الشكل 3C والشكل 3D).

كانت النتائج الإيجابية لطريقة التنبيب هي التقطير القابل للتكرار حتى 50 ميكرولتر في رئتي الفأر (تم إجراؤه في الشكل 1 والشكل 3) ، مع توزيع منتشر في جميع أنحاء الرئة (كما يتضح من الشكل 1) وليس في مناطق أخرى (مثل مجرى الهواء العلوي / الأنف كما هو موضح في الشكل 3).

أي ضرر يلحق بالحيوان ، أو الإجهاد غير المبرر ، أو انخفاض حجم السائل الذي يصل إلى الرئتين ، أو سوء توزيع اللقاح في الرئتين ، أو احتياجات التدريب المطولة كان سيشكل نتيجة سلبية ، لكنه لم يحدث.

فيديو 1: منظر التنظير الداخلي التقليدي للبلعوم الفموي والطيات الصوتية خارج نطاق التركيز ويصعب استخدامه بشكل فعال. يعني البعد البؤري البالغ 3 سم لهذا المنظار أنه من الصعب تقدير الطيات الصوتية والاتجاه. اللسان في أسفل اليسار. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الشكل 3: ينتج عن التنبيب توصيل أكبر للرئة مع تقلبات أقل بالنسبة إلى O.P. الشفط. (أ) تم إعطاء جرعات من إناث الفئران القديمة من 6 إلى 10 أسابيع مع 1 × 10¹¹ vg من AAV6.2-Luciferase ، (Penn Vector Core) ، ثم تم تقييمها بالتصوير الحيوي في الجسم الحي (IVIS) بعد 7 أيام. قبل 10 دقائق من التصوير (التعرض لمدة 30 ثانية) ، تم حقنهم (تحت الجلد) ب 200 ميكرولتر من لوسيفيرين (GoldBio ، 15 مجم / مل). (تم إنشاؤه باستخدام biorender.com) (ب) صور IVIS التمثيلية للفئران التي تتلقى AAV6.2-Luciferase عن طريق شفط OP (سحب اللسان ، يسار) أو توصيل تكنولوجيا المعلومات (التنبيب ، يمين). المناطق ذات الأهمية لها نفس الحجم ، ويظهر متوسط الإشعاع داخل المنطقة في الصورة. (ج) القياس الكمي لإشارة لوسيفيراز في شفط OP (ن = 7) مقابل التنبيب (ن = 5) الفئران. p<0.0001 بواسطة اختبار t الويلزي غير المزاوج مع بعد تحويل السجل لبيانات لوسيفيراز الأول. (د) الانحراف عن المتوسط كنسبة مئوية من متوسط الإشعاع. (ص = 0.0381 ، اختبار T الويلزي) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل S1: يتم عرض أمثلة على الصور من منظار الأذن للمستهلك المستخدم في البروتوكول الموصوف للتنبيب الموجه (يسار) ومنظار داخلي بتكلفة وتوافر مماثلين (على اليمين). لاحظ الاختلافات الواضحة في التركيز بين الصور. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل S2: مثال على الصورة توضح أنبوب الفقاعة قيد الاستخدام. يحرك حجم المد والجزر بسرعة القطرة في أنبوب الفقاعة عدة سنتيمترات. تتحرك القطرة قليلا جدا إذا كان الأنبوب في المريء. يمكن تقدير معدل التنفس وحجم المد والجزر بهذه الطريقة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل S3: مجموعة إضاءة أساسية تلغي الحاجة إلى شراء مجموعة إضاءة ألياف ضوئية مكلفة. تم دفع إبرة 20 جم من خلال كابل ألياف ضوئية مخروطي بسعة 50 مل ، وتم شراء كابل ألياف ضوئية 0.75 مم بثمن بخس (وبكميات كبيرة) وقطعها إلى الطول (~ 1 متر) بشفرة حلاقة وتسجيلها في مكانها. كان تثبيت القسطرة في مكانها غير ضروري بسبب الملاءمة المريحة لكابل الألياف البصرية. يؤدي تثبيت الغطاء المخروطي فوق مصباح يدوي للهاتف المحمول إلى نقل ضوئي كاف لإجراء التنبيب في غرفة مظلمة. يقلل هذا التجميع أيضا من التكاليف التي يتحملها المختبر الذي يتضمن هذه التقنية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

التنبيب والتقطير داخل القصبة الهوائية هما أفضل الطرق لتوصيل السوائل إلى الرئة ، لكن التحديات الوفيرة التي يقدمها تشريح الفئران حالت دون التبني على نطاق واسع في مختبرات أبحاث الرئة¹⁵. على الرغم من أنه يضمن التوصيل الفعال لللقاح إلى الرئة ، إلا أن الجانب السلبي المحتمل لتوصيل تكنولوجيا المعلومات من خلال هذه التقنيات وغيرها من تقنيات التنبيب هو تجاوز مجرى الهواء العلوي. الولادة داخل الأنف هي طريقة مجربة لا تتجاوز مجرى الهواء العلوي. على الرغم من أن التوصيل داخل الأنف غالبا ما يستخدم في مختبرات علم الفيروسات الرئوية وقد يكون أكثر فعالية في بعض الحالات²² ، إلا أنه لا يعكس مسار التعرض الطبيعي²³ لبعض العوامل المستنشقة ، وينتج عنه كميات أكثر تنوعا من اللقاح في الرئة²⁴ ، ويكون أقل فعالية عند استخدام الأيزوفلوران كمخدر⁵. على هذا النحو ، تم القيام بعمل مكثف على أجهزة الهباء الجوي ومقارنتها بتقنيات التوصيل الرئوي^{الأخرى 25} ، لكن هذه الطرق تمثل مخاطر مرتبطة بالهباء الجوي وتميل إلى أن تكون باهظة الثمن. أدت كل هذه الصعوبات إلى تقطير البلعوم الفموي عن طريق سحب اللسان²⁶ ، كونها الطريقة المفضلة لتوصيل السائل الرئوي في العديد من المختبرات. كما أوضحنا ، هذه الطريقة أكثر تغيرا بكثير من التقطير داخل القصبة الهوائية بعد التنبيب. علاوة على ذلك ، لا يمكن تقييم التوصيل بطريقة سحب اللسان أثناء الإعطاء ، وقد تحدث صدمة لا داعي لها لسان الفأر بسبب التوتر اللازم لمنع البلع. يتم تثبيت اللسان أيضا في التنبيب الموجه وتقنية التقطير في تكنولوجيا المعلومات. ومع ذلك ، نظرا لأن موجز الفيديو يظهر المزمار ، فإن الباحث الذي يستخدم طريقتنا لا يحتاج إلى فرض وضع الحنجرة عن طريق وضع توتر كبير على اللسان. يؤدي هذا الجر المنخفض إلى تقليل صدمة الأنسجة. ومع ذلك ، على الرغم من المزايا الكبيرة التي يوفرها التنبيب وغرس تكنولوجيا المعلومات ، فقد وقفت التحديات في طريق استخدامه في بعض المختبرات. على سبيل المثال: يمكن أن يؤدي ضغط القصبة الهوائية بسبب القنية الخاطئة للمريء إلى إعاقة التنفس وزيادة معدل الوفيات. قد يؤدي إدخال الأنبوب الرغامي بعمق شديد إلى تلف القصبة الهوائية أو الشعب الهوائية الرئيسية. وأخيرا ، يستغرق تنبيب الفئران بالطرق التقليدية وقتا طويلا مما يجعله غير عملي بالنسبة لمعظم الباحثين الذين يبحثون عن ولادة رئوية موثوقة. تعالج طريقتنا الصعوبات المرتبطة بتنبيب الفئران ، حتى التغلب على الحواجز التشريحية أمام تنبيب الفئران.

تم اقتراح عدة طرق للتغلب على التحديات التشريحية لتنبيب الفئران من خلال تنفيذ الوسائل البصرية. على سبيل المثال ، تم اقتراح استخدام المنظار الداخلي التقليدي⁶. ومع ذلك ، فإن العمق البؤري الطويل للأداة غير مناسب تماما لاستخدامه في تنبيب الفئران (الشكل S1). يتضح هذا أيضا بسهولة في الفيديو 1 ، حيث يمكن رؤية الطيات الصوتية ولكنها ضبابية. كما تم استخدام مناظير الأذن السريرية لتنظير الحنجرة المباشر¹². ومع ذلك ، فإن تكلفة مناظير الأذن السريرية وعدم وجود موجز فيديو يجعلها غير قابلة للوصول لمعظم المختبرات وغير مناسبة للتدريب. أدى استخدام منظار الأذن المتاح على نطاق واسع إلى تحسين التطبيق العملي للتنبيب الموجه بشكل كبير. يسمح البعد البؤري الأقصر والجسم الأصغر والشفة الخافضة الممتدة بتغذية فيديو أكثر وضوحا ، وقدرة أفضل على المناورة ، وتحديد المواقع ، ويمكن استخدام شفة منظار الأذن للضغط على قاعدة اللسان ، مما يحسن الوصول إلى rima glottidis. بالإضافة إلى هذه الوسائل البصرية ، تم استخدام Transillumination أيضا لتصور المزمار بنجاح وتنبيب الفئران^7،13،14. ومع ذلك ، قد تتطلب الأساليب القائمة على transillumination عوامل إزالة الشعر على المنطقة التي تتراكب مع عنق الفأر ، والقرب من مصدر الضوء الساخن ، واستخدام الإبرة داخل القسطرة ، وإدخال أدوات حادة في فم الفأر ، و / أو إجراء شق صغير فوق القصبة الهوائية لتأكيد وضعه. الطريقة الموضحة هنا تتجنب هذه المخاطر وتبني على أفضل جوانب هذه الطرق المنشورة. بالإضافة إلى التغلب على الحواجز التشريحية أمام التنبيب ، تم أخذ اعتبارات التكلفة في الاعتبار في طريقتنا.

إن استخدام الأيدي المساعدة ، وحامل الماوس ، ومنظار الأذن ، وضوء الألياف الضوئية معا يجعل التنبيب أسهل في التعلم وأسرع بكثير في الأداء ، بتكلفة مخفضة للمختبرات. يمكن تجنب تكلفة حامل التنبيب المتاح تجاريا باستخدام حامل التنبيب المصنوع يدويا²⁷. يمكن تحمل تكلفة تجميع ضوء الألياف الضوئية عن طريق شراء كابل الألياف الضوئية بشكل منفصل (بتكلفة أقل بكثير ، ~ 9 دولارات مقابل 218 دولارا علميا - في وقت كتابة هذا التقرير). لإكمال مصدر ضوء الألياف الضوئية ، يمكن استخدام غطاء مخروطي 50 مل مع ثقب وشريط لجمع الضوء من مصباح يدوي للهاتف المحمول (انظر الشكل S3 ، وجدول المواد). داس وآخرون. AL وصف جهاز مماثل¹¹. بالنسبة لبعض المختبرات ، قد تجعل التكلفة المنخفضة لهذا الحل طريقتنا إجراء يسهل الوصول إليه. بالإضافة إلى التكاليف ، جعلت صعوبة تأكيد وضع الأنبوب الرغامي تنبيب الفئران أمرا شاقا.

في الماضي ، للتأكد من أن الأنبوب الرغامي في وضع مناسب ، اعتمد الباحثون على تعفير المرآة عن طريق حمل مرآة الأسنان فوق الأنبوب الرغامي¹⁸. ومع ذلك ، فإن حجم المد والجزر الصغير والاختلافات في درجة حرارة الغرفة غالبا ما يمنع تعفير المرآة ويؤدي إلى أخطاء في الحكم. في حالة تنبيب الفئران ، يشكل هذا خطرا جسيما للإصابة. لجأ آخرون إلى إحداث ضيق تنفسي عن طريق انسداد الأنبوب الرغامي¹⁰. هذا يسبب ضغطا شديدا للحيوان ويوفر معلومات أقل من "طريقة الفقاعة". علاوة على ذلك ، فإن إدخال علاجات الرئة والهواء في المعدة بسبب عدم كفاية تأكيد وضع الأنبوب الرغامي قد يسبب ضائقة بالإضافة إلى إعاقة فعالية العامل المعطى. يوفر استخدام "طريقة الفقاعة" تأكيدا بصريا أسرع وأكثر موثوقية لوضع الأنبوب الرغامي وهو تحسن طفيف على طريقة مماثلة موصوفة سابقا²⁸. تمكن "طريقة الفقاعة" الباحث أيضا من تقدير معدل التنفس وحجم المد والجزر للحيوان تقريبا.

يعد وضع وتصور الطيات الصوتية أمرا أساسيا لهذه التقنية. وجدنا أن منظار أنف الأطفال كان كبيرا جدا ومرهقا بحيث لا يمكن إبقاء الفم مفتوحا والخدين بعيدا عن الطريق أثناء التنبيب ، لكنها كانت مفيدة للغاية أثناء التدريب لأنها سمحت للباحث بإثبات وضع منظار الأذن. من الصعب توجيه المتدرب للتعرف على التشريح ذي الصلة ، وكان تحسين الرؤية في فم الفأر أمرا أساسيا ، والذي ساعده بشكل كبير استخدام منظار الأذن التجاري. يعد التدريج باستخدام عدسة مكبرة مضاءة والأيدي المساعدة جزءا لا يتجزأ من مساعدة المشغلين عديمي الخبرة في التنبيب ، على الرغم من أنها قد لا تكون بالغة الأهمية للمشغلين ذوي الخبرة.

أثناء التدريب على هذه الطريقة ، قد يكون من الضروري استكشاف الأخطاء وإصلاحها. إذا كان الأنبوب الرغامي يدخل المريء بشكل متكرر ، فقد يكون المزمار قد تشنج ، وقد يكون الحنك الرخو ملتهبا ، وقد يكون التثبيت الصحيح أكثر صعوبة. في هذه الحالة ، اسمح للحيوان بالتعافي لعدة دقائق قبل محاولة التنبيب مرة أخرى. وينبغي تحديد عدد مرات إعادة المحاولات في بروتوكول اللجنة الدائمة المشتركة بين الوكالات والالتزام به دائما. إذا كنت تواجه مشكلة في رؤية الطيات الصوتية ، فقد يتم قمع معدل التنفس بسبب الكثير من التخدير ، أو قد يكون وضع الفأر غير مناسب (غالبا ما يميل الرأس إلى الخلف بعيدا جدا). في هذه الحالة ، أعد وضع واتركه يتعافى من التخدير قبل المحاولة مرة أخرى. يجب أن يوضح أنبوب الفقاعة بوضوح حجم المد والجزر للحيوان. إذا كانت الفقاعة تتحرك قليلا فقط ، فقد يتسبب اللهاث بسبب الضغط الذي يوضع على القصبة الهوائية بواسطة أنبوب داخل القصبة الهوائية في غير محله في هذه الحركة. في هذه الحالة ، راجع الطابع الزمني: 8:25 والشكل S3 لمعرفة مدى وضوح حجم المد والجزر عند استخدام "أنبوب الفقاعة" على أنبوب داخل القصبة الهوائية الموضوع بشكل صحيح. إذا كان الأنبوب الرغامي في غير محله ، فقم بإزالته على الفور واسمح للحيوان بالتعافي قبل محاولة الإجراء مرة أخرى.

على الرغم من أن التنبيب والتقطير داخل القصبة الهوائية أفضل بكثير من الطرق الأخرى ، إلا أنه كان من الصعب جدا من الناحية الفنية اعتمادها على نطاق واسع. الطرق الموضحة هنا تجعل التقطير داخل القصبة الهوائية والتنبيب الفئران متاحا وعمليا. على الرغم من أن التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية تعتمد بشكل كبير على ما يتم توصيله إلى الرئتين وفي أي سياق يتم إعطاؤهم طريقة سهلة وموثوقة تمهد الطريق للعديد من التطورات في بيولوجيا الرئة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
البصرية LightiFiber Optic Lighting Kit ، Mouse	Kent Scientific   ؛	ETI-12ETI-MSE-02	أحد مكونات مجموعة الألياف الضوئية ، متوافق مع الأضواء الأخرى وكابل الألياف الضوئية البديل أدناه
مجموعة الألياف البصرية البديلة	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	بديل ، لم تتم مناقشته (لكننا لا نرى أي سبب لعدم عمله)
تجميع الألياف البصرية البديل	جهاز هارفارد	72-9075	بديل ، لم تتم مناقشته (لكننا لا نرى أي سبب لعدم عمله)
مجموعة الألياف البصرية البديلة	مصنوعة يدويا من قبل المختبر	N / A	التعليمات الموجودة هنا باستخدام سدادة مطاطية: DOI 10.3791 / 50318
مجموعة الألياف البصرية البديلة	مصنوعة يدويا من قبل المختبر	N / A (المواد المدرجة أدناه)	مصنوعة من غطاء مخروطي 50 مل وشريط وحامل تنبيب ألياف ألياف ضوئية 0.75
مم ، ماوس	كينت علمي & nbsp ؛	ETI-MSE-01	حامل قابل للتعديل للتنبيب ، تتوفر العديد من الإصدارات ذاتية الصنع ، ورفوف الأطراف والمنصات الخشبية المستخدمة ، وبعض البدائل أدرجت العديد من البدائل المناسبة المتاحة.
تقف التنبيب البديلة	Braintree Scientifuc	RIS 100	بديل ، لم تتم مناقشته (لكننا لا نرى أي سبب لعدم نجاحه)
تقف التنبيب البديلة	Natsume Seisakusho	KN-1014	بديل ، لم تتم مناقشته (لكننا لا نرى أي سبب لعدم نجاحه)
تقف التنبيب البديلة	Vetland	000A3467	بديل ، لم تتم مناقشته (لكننا لا نرى أي سبب لعدم نجاحه)
حوامل التنبيب البديلة	مصنوعة يدويا من قبل المختبر	N / A	مصنوعة من 3 حلقات رابطة هنا: DOI 10.3791 / 60844 (تم نشر عدة طرق بديلة)
خياطة حرير مضفرة غير قابلة للامتصاص ، مقاس 0	أدوات العلوم الدقيقة   ؛	18020-00	أي أطول من 1 بوصة سوف تتلف carina   ؛
قسطرة Safelet IV 20G × 1 "	Nipro	NPRCI + 2025	أو ما شابه
ذلك RS-5358 ملقط تشريح دقيق	فيشر	RS-5358	أو ما شابه ذلك ، بما في ذلك مساعدة الأيدي   ؛
عدسة مكبرة مع ضوء وحامل ، يد المساعدة المغناطيسية المرنة EOOKU ، 5X & 10X 12V 108pcs LED الخرز مصباح مكبر, 3 أوضاع قابل للتعديل دوارة معقوفة الذراعين & لوحة قاعدة شديدة التحمل	أمازون	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-مرن-قابل للتعديل-معقوفة / dp / B0C5MC6QNW / ref = sr_1_5?crid = F4 PZY6UOCEE9& dib = eyJ2IjoiMSJ9. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfyga. SMgW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew< / > . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& الكلمات الرئيسية = التكبير + الزجاج + مع + ضوء + EOOKU + 3 + في + 1 & QID = 1709661 709 & sprefix = تكبير + زجاج + مع + ضوء + eooku + 3 + في + 1٪ 2 أغطية٪ 2C98 & sr = 8-5	أو ما شابه ذلك ، أي ملقط مسنن منحني بدقة سيعمل   ؛
إزالة شمع الأذن - أداة مزيل شمع الأذن مع طقم أذن 8 قطع - منظف أذن مع كاميرا - طقم إزالة شمع الأذن مع ضوء - كاميرا أذن مع 6 ملاعق أذن - منظف الأذن لنظامي التشغيل iOS و أندرويد (أسود)	أمازون	https://www.amazon.com/Ear-Wax- إزالة مزيل Android٪ EF٪ BC٪ 88Black٪ EF٪ BC٪ 89 / dp / B0 9KZ8TS7L / ref = pd_lpo_sccl_1 / 147 -1203879-4147304?pd_rd_w = Lt8 Ta& معرف المحتوى = AMZN1.SYM.1AD20 66F-97D2-4731-9356-36B3edF1AE 04 & pf_rd_p = 1AD2066F-97D2-4731 -9356-36B3EDF1AE04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg = ja4H2 & pd_rd_r = 52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& PSC = 1	أو ما شابه ذلك ، العديد من العلامات التجارية المتاحة   ؛
AZIMOM PMMA البلاستيك نهاية توهج الألياف البصرية كابل 0.75 مم (0.02 بوصة) 100 م (328 قدما) / لفة لسقف السماء النجمية جميع أنواع محرك الصمام الخفيف مصدر سائق	الأمازون	https://www.amazon.com/AZIMOM -البلاستيك القابل للقص السقف - 1 قطعة 0-00 98in328ft / dp / B07WC9JV5N / ref = sr _1_9?dib = eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.. AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& الكلمات الرئيسية = fiber٪ 2Boptic ٪ 2Blight ٪ 2Bstrands & amp QID = 1722619884 & SR = 8-9 & th = 1	أو ما شابه ذلك ، يتم استخدام الألياف لبناء جهاز في الخط 7
50 مل أنبوب مخروطي	للخلية	229421	أي غطاء مخروطي بلاستيكي غير شفاف 50 مل يجب أن يعمل. لا يتلامس أو يقترب من لذلك لا حاجة للعقم
Isoflurane	VetOne	Consult Veternary Staff
Innoculum	غير متاح	خاص بأطراف الماصة التجريبية
(الفلتر) N	/ A	مرشح معقم p100 و p1000 نصائح مستخدمة	العلامة التجارية / المورد غير ذي صلة
غرفة التعريف:	N / A	كما هو متاح في مؤسستك	العلامة التجارية / المورد غير ذي صلة
وسادات الأيزوبروبانول الإعدادية N	/ A	لتنظيف الأدوات	العلامة التجارية / المورد غير ذي صلة
الأنابيب	N / A	الأنابيب المرنة ذات القطر الصغير ستعمل	لبناء "أنبوب الفقاعة"  (قطرنا ~ 3 مم وتم أخذه من خط IV)
قفل لور	N / A	ليناسب الأنبوب الخاص بك أعلاه	لبناء "أنبوب الفقاعة"
جهاز تنفس نصف قناع للوجه	3M 3M	17-986-9B	للحد من التعرض للغاز
Twist Tie	N / A	N / A	للحفاظ على شكل U لأنبوب الفقاعة