يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فصل وتجزئة بروتينات الترشيح المزروعة (CFPs) من المتفطرة السلية

880 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67679

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول زراعة وحصاد وتركيز البروتينات المفرزة من المتفطرة السلية. يتم تحديد بروتينات ترشيح الثقافة (CFPs) ، وفصلها إلى 20 جزءا عن طريق التركيز متساوي الكهرباء ، ويتم حلها إلى 30 جزءا باستخدام SDS-PAGE التحضيري ونظام الشطف الكهربائي.

الملخص

تلعب البروتينات المفرزة من المتفطرة السلية (M. tuberculosis) دورا مهما في التسبب في السل والتعديل المناعي وتطور المرض. يعد فهم تكوينها ووظيفتها أمرا ضروريا لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة التي يمكن أن تساعد في تشخيص السل وتطوير اللقاحات والتدخلات العلاجية. تركز هذه الدراسة على العزل المنهجي وتجزئة وتوصيف بروتينات الترشيح المزروعة (CFPs) لتمكين التحليلات المناعية والبروتينية الشاملة. تم الحصول على CFPs من M. tuberculosis H37Rv مزارع المزروعة في ظروف محددة كيميائيا لضمان التحكم في التعبير عن البروتين. تم تنقية المادة الطافية المزروعة من خلال الترشيح وتركيزها باستخدام نظام ألياف مجوفة للاحتفاظ بالبروتينات التي تزيد عن 10 كيلو دالتون. تم تحقيق التجزئة من خلال التركيز متساوي الكهرباء في المرحلة السائلة ، وفصل البروتينات بناء على نقاطها متساوية الكهرباء إلى 20 جزءا متميزا. تم إجراء تحليل آخر باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ، متبوعا بالشحط الكهربائي ، مما أدى إلى 30 جزءا من البروتين. توفر البروتينات المجزأة التي تم الحصول عليها من خلال هذا النهج موردا قيما للتنميط المناعي والتحليلات البروتينية القائمة على قياس الطيف الكتلي. من خلال عزل وتوصيف البروتينات المفرزة بشكل منهجي ، تساهم هذه الدراسة في تحديد المؤشرات الحيوية للبروتين الخاصة بمرض السل ، والتي يمكن أن تحسن دقة التشخيص وتعزز فهمنا للتسبب في مرض السل .

المقدمة

سلطت الأبحاث المكثفة الضوء على الدور الهام للبروتينات المفرزة في النمو والتفاعلات المناعية لمتفطرة السل1. يحتوي الترشيح المزروعي ل M. tuberculosis على مجموعة معقدة من مكونات البروتين وغير البروتينية ، مما يجعله موردا قيما لفهم بيولوجيته وخصائصه المناعية. حددت الدراسات البروتينية المبكرة ما يقرب من 450 بروتينا في مزرعة الترشيح2 ، يلعب العديد منها دورا مهما في استنباط الاستجابات المناعية ضد السل. يعد تحديد هذه المستضدات ذات الصلة مناعية أمرا ضروريا لتطوير تشخيصات ولقاحات مبتكرة لمرض السل. ومع ذلك ، فإن التقدم في هذا المجال يواجه تحديا بسبب تعقيد الاستجابة المناعية لعدوى المتفطرة السلية والقيود التقنية لطرق التنقية الكيميائية الحيوية المستخدمة لعزل البروتينات الفطرية.

تم استخدام تقنيات فصل مختلفة لحل بروتينات المتفطرة السلية ، مما يسهل الكشف عن البروتينات الثانوية ولكن ذات الأهمية الوظيفية وتوسيع نطاق الدراسات البروتينية. تعمل طريقة الفصل المثالية على حل مخاليط البروتين المعقدة بشكل فعال إلى عدد محدود من الكسور المميزة. هناك طريقتان مستخدمتان على نطاق واسع لفصل بروتينات البكتيريا الفطرية هما الطرق القائمة على الكروماتوغرافيا والطرق القائمة على الرحلانالكهربائي 1،2.

كانت تقنيات الكروماتوغرافيا ، بما في ذلك التقارب والتبادل الأيوني والكروماتوغرافيا ذات الطور العكسي ، حجر الزاوية في تجزئة البروتين لأكثر من عقد من الزمان. تم استخدام هذه الطرق على نطاق واسع لفصل بروتينات M. tuberculosis 3. ومع ذلك ، فهي محدودة بعوامل مثل انخفاض إنتاجية البروتين والتداخل من المكونات غير البروتينية ، مما قد يعقد التحليلات المناعية اللاحقة. تحد هذه العيوب من فائدة الكروماتوغرافيا لتحديد المستضدات ذات الصلة من الناحية المناعية.

لمعالجة هذه القيود ، تم اعتماد طريقة فصل ثنائية الأبعاد قائمة على الرحلان الكهربائي. في البعد الأول ، يتم فصل البروتينات بناء على تركيزها متساوي الكهرباء (IEF) باستخدام نظام IEF التحضيري ، والذي يفصل البروتينات وفقا لنقاطها متساوية الكهرباء. في البعد الثاني ، يتم حل البروتينات بشكل أكبر عن طريق الوزن الجزيئي باستخدام SDS-PAGE التحضيري ، متبوعا بالشطف باستخدام أداة إزالة الهلام الكامل.

يوفر هذا النهج ثنائي الأبعاد العديد من المزايا. يقلل بشكل كبير من تعقيد بروتينات ترشيح الثقافة (CFP) عن طريق تقسيمها إلى 600 جزء مميز. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكسور مناسبة للتحليل المناعي المباشر لأن عملية الشطف لا تقدم مكونات تتداخل مع المقايسات المناعية الخلوية4،5،6.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل تحضير وفصل بروتينات ترشيح الثقافة للتحليل المناعي6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. نمو المتفطرة السلية وتحضير بروتينات الترشيح المزروعة (CFPs)

  1. تحضير وسط سوتون السائل
    1. امزج المكونات التالية في 950 مل من الماء المقطر: الجلسرين ، 30.0 مل ؛ أورثوفوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2PO4) ، 0.5 جم ؛ كبريتات المغنيسيوم ، 0.5 جم ؛ حامض الستريك ، 2.0 جم ؛ الكازين المائي ، 0.5 جم ؛ كبريتات الأمونيوم الحديديك ، 0.05 جم ؛ غلوتامات الصوديوم ، 4.0 جم.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام 40٪ هيدروكسيد البوتاسيوم (حوالي 5 مل / لتر).
    3. اصنع الحجم إلى 1 لتر والأوتوكلاف عند 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة.
  2. تحضير معلق الفطريات
    1. نقل مستعمرات المتفطرة السلية H37Rv (ATCC 27294) المزروعة على منحدرات Lowenstein-Jensen (LJ) إلى 2 مل من وسط Sauton السائل.
    2. قم بتفتيت كتل البكتيريا الفطرية عن طريق الرج القوي بالخرز الزجاجي في ظل ظروف معقمة.
  3. بدء نمو البكتيريا الفطرية
    1. انقل المعلق البكتيري إلى زجاجة مكارتني تحتوي على 10 مل من وسط سوتون السائل.
    2. احتضن الزجاجة عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
  4. توسيع نطاق الثقافة
    1. انقل المزرعة المزروعة إلى 200 مل من وسط Sauton في زجاجة سعة 1 لتر.
    2. احتضن على شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع.
    3. انقل ثقافة طور السجل إلى قارورة سعة 4 لتر تحتوي على 2 لتر من وسط ساوتون.
    4. قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة لمدة 4 أسابيع إضافية حتى تتشكل القشرة السطحية.
  5. حصاد بروتينات ترشيح المزرعة (CFPs)
    1. حصاد المزرعة عن طريق الطرد المركزي عند 1,000-1,500 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بتصفية المادة الطافية من خلال نظام ترشيح فراغي 0.45 ميكرومتر.
    3. قم بتركيز المرشح المحتوي على CFP باستخدام نظام ترشيح التدفق العرضي مع قطع 10 كيلو دالتون.
  6. تخزين CFP المحصود
    1. قم بتقدير محتوى البروتين باستخدام مجموعة مقايسة BCA المتوفرة تجاريا.
    2. قم بإضافة البروتينات ، وأضف أزيد الصوديوم إلى التركيز النهائي بنسبة 0.2٪ ، وخزنها عند -80 درجة مئوية.

2. التركيز المتساوي الكهربي للطور السائل التحضيري (IEF)

  1. تحضير عينة البروتين
    1. إذابة المتفطرة السلية CFP في 60 مل من المخزن المؤقت لفصل IEF يحتوي على 8 M من اليوريا ، 1 ملي مولار من dithiothreitol (DTT) ، 5٪ جلسرين ، 2٪ ديجيتونين ، 2٪ أمفوليتات (درجة الحموضة 3.0-10.0 ودرجة الحموضة 4.0-6.0 بنسبة 1: 4).
  2. إعداد نظام IEF
    1. املأ حجرة الأنود بحمض الفوسفوريك 0.1 M وغرفة الكاثود ب 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. قم بتجميع خلية IEF التحضيرية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  3. أداء IEF
    1. قم بتحميل ما يصل إلى 350 مجم من البروتين على نظام IEF.
    2. تركيز البروتينات عند 4 درجات مئوية مع نظام مياه الدورة الدموية للتبريد.
    3. قم بتطبيق طاقة ثابتة تبلغ 12 واط حتى يستقر الجهد عند 1400 فولت تقريبا ، ثم استمر لمدة 30 دقيقة إضافية.
  4. جمع الكسور وتحليلها
    1. حصاد كسور IEF وتحديد درجة الحموضة الخاصة بها.
    2. قم بتحليل كل حصة بواسطة SDS-PAGE وتصور البروتينات باستخدام تلطيخ الفضة.

3. SDS-PAGE التحضيري وشطف الجل الكامل

  1. إعداد عينات ل SDS-PAGE
    1. امزج كسور IEF مع المخزن المؤقت لعينة 6x SDS-PAGE المتوفرة تجاريا.
    2. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تشغيل SDS-PAGE التحضيري
    1. قم بتحميل ما يصل إلى 10 مجم من البروتين في جل بولي أكريلاميد مقاس 16 سم × 20 سم مع جل تكديس بنسبة 4٪ وهلام قابل للحل بنسبة 12.5٪.
    2. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي بتيار ثابت يبلغ 50 مللي أمبير حتى تصبح مقدمة الصبغة على بعد 2 سم من الأسفل.
  3. بروتينات مسحبة من الجل
    1. قم بموازنة الجل في المخزن المؤقت للشطف (60 ملي مولار من تريس ، 40 ملي مولار من CAPS، درجة الحموضة 9.4) لمدة 10 دقائق.
    2. انقل الجل إلى أداة الحذف الهلامية الكاملة.
    3. البروتينات الرقيقة عن طريق تطبيق تيار ثابت يبلغ 250 مللي أمبير لمدة 1 ساعة.
  4. جمع الكسور وتحليلها
    1. قم بتقطيع البروتينات المنفصلة إلى 30 جزءا فرديا ، كل منها بحجم 2.5 مل.
    2. حدد تركيز البروتين باستخدام طريقة تقدير بروتين BCA باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. قم بتحليل 10 ميكروغرام من البروتين من كل جزء بواسطة SDS-PAGE وتصوره باستخدام تلطيخ الفضة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 1 مدى تعقيد بروتينات ترشيح الثقافة (CFP) المحضرة. في البداية ، تم إخضاع 100 ميكروغرام من CFP لتحليل صفحة 2D-SDS لتقييم مدى تعقيدها. كشف هذا التحليل عن وجود ما يقرب من 100 بقعة بروتينية مميزة في CFP (الشكل 1).

تم تحليل الكسور ال 20 التي تم جمعها من كل تشغيل بواسطة SDS-PAGE. من بين هذه ، تظهر ثلاثة كسور تمثيلية من ثلاثة أشواط مختلفة في الشكل 2.

يوضح

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تمثل بروتينات الترشيح المزروعة (CFPs) من المتفطرة السلية مزيجا معقدا من مكونات البروتين المتنوعة الموجودة بتركيزات متفاوتة. حددت الدراسات البروتينية ما يصل إلى 1,314 بروتينات داخل CFP 4,5. وقد سلطت العديد من التحقيقات الضوء على الدور الحاسم لمركبات الكربون الكلورية المتكاملة في تعديل الاستجابات المناعية. على وجه التحديد ، تلعب CFPs دورا لا غنى عنه في كل من المناعة الخلوية ، التي تتميز باستجابات الخلايا التائية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Ä نظام ترشيح التدفق العرضي KTA   ؛سيتيفا29038437
الأمفوليت (درجة الحموضة 3.0 إلى 10.0)بيو راد1632094
الأمفوليت (درجة الحموضة 4.0 إلى 6.0)بيو راد1631143
مقايسة بروتين BCA   ؛ميرك71285-م
قبعاتميركج2632
تحلل الكازينميرك65072-00-6
حامض الستريكميركج 0759
ديجيتونينميرك300410
DTTميركD9779
كبريتات الأمونيوم الحديديكهيميدياGRM10944
الجلسرينميركجي 5516
الجلسرين   ؛ميرك252859
Lowenstein-Jensen يميل  هيميدياSL001
كبريتات المغنيسيومميركم 7506
نظام ترشيح الفراغ Millipore Stericup سريع الإصدارميركS2HVU11RE
حمض الفوسفوريك   ؛ميرك695017
أورثوفوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيومميركص 0662
هيدروكسيد البوتاسيوم ميرك484016
خلية IEF التحضيرية (Rotofor) بيو راد170-2986 
أزيد الصوديوم   ؛ميركس2002
غلوتامات الصوديومميرك49621
هيدروكسيد الصوديومهيميدياMB095
تريسميرك252859
يورياميركيو 5128
جهاز جل Eluter الكامل   ؛بيو راد1651250

المراجع

  1. Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
  2. de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
  3. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  4. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
  5. Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
  6. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  7. Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
  8. Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
  9. Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
  10. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  11. Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
  12. Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
  13. Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
  14. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تجزئة البروتينالتركيز المتساوي التكهربالفصل الكهربائي للهلام بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE)المؤشرات الحيوية البروتينيةالتنميط المناعيالترشيح بالتدفق المماسيالتحليل البروتوميمستضدات الخلايا التائية
فصل وتجزئة بروتينات الترشيح المزروعة (CFPs) من المتفطرة السلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.