مقالة منهجية

التصوير الحجمي وتحليل الأهداب الأولية في الأنسجة العضلية الهيكلية باستخدام نموذج الفأر ARL13B-CENTRIN-2

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67693

⸱

مارس 28, 2025

 ,  , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, 2School of Biological Sciences, University of Southampton

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الطريقة استغلال الإشارة الذاتية في نموذج الفأر المعدل وراثيا ARL13B-CENTRIN-2 لتصوير الأهداب الأولية في الموقع ، في ثلاثة أبعاد عبر مساحات كبيرة من الأنسجة المعدنية ، من جمع الأنسجة إلى تحليل تنظيم الأهداب. يمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا على أنواع أخرى من الأنسجة.

الملخص

الأهداب الأولية عبارة عن عضية انفرادية غير متحركة يتم تجميعها بواسطة معظم أنواع الخلايا. إنه ضروري لتطوير الهيكل العظمي وتوازنه وفي تنسيق استجابات الخلية للإشارات الكيميائية الحيوية والميكانيكية من البيئة المحيطة بها. نظرا لحجمه على مقياس ميكرومتر ، فإن الأهداب الأولية يصعب تصويرها في الموقع لتوصيفها في الأنسجة ، بطريقة إنتاجية عالية وبدون تحيزات بصرية. سيكون فهم تنظيمها في بيئتها ثلاثية الأبعاد في الجسم الحي مفتاحا لفهم الأدوار الهدبية في علم وظائف الأعضاء والمرض. يقدم خط الفأر ARL13B-CENTRIN-2 علامة mCherry على بروتين المحور الهدبي ARL13B وعلامة بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) على بروتين المنتز CENTRIN-2 ، الموضعية في قاعدة الأهداب. يسمح خط الماوس هذا بتصوير الأهداب الأولية دون الحاجة إلى تلطيخ ، مما يقلل من عدد الخطوات في جمع الصور ويتنقل حول المشكلات المتعلقة بالإشارة إلى الضوضاء. يصف هذا المنشور بروتوكولا خطوة بخطوة لتصوير الأهداب الأولية في الأنسجة العضلية الهيكلية مع الحفاظ على إشارة الفلورسنت. كما يصف خط أنابيب تحليل الصور القابل للتطبيق عالميا ، مما يتيح القياس الكمي غير المتحيز لميزات الأهداب ، مثل الطول والاتجاه ثلاثي الأبعاد.

المقدمة

الأهداب الأولية هي عضية أساسية في تطور وتوازن العديد من الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك الهيكل العظمي. أثناء نمو ما بعد الولادة ، ينظم تمعدن الغضروف أثناء التعظم الغضروفي1. في البشر ، تسبب الطفرات الجينية التي تؤثر على البروتينات المرتبطة بالأهداب مجموعة من الأمراض واضطرابات النمو ، والمعروفة باسم اعتلال الأهداب. يعد فهم تنظيم الأهداب الأولية داخل الأنسجة أمرا مهما في فهم كيفية تنظيمها للسلوك الخلوي على مستوى الأعضاء. ثبت أن حدوث الأهداب الأولية وطولها واتجاهها تختلف داخل الأنسجة وبينها ، مما يشير إلى دور تنظيم الأنسجة في وظيفتها2،3،4. صفيحة النمو ، وهي طبقة الغضروف في نهاية العظام الطويلة حيث يحدث معظم نمو العظام بعد الولادة من الحياة المبكرة وحتى المراهقة ، هي نسيج عالي التنظيم مع خلايا غضروفية مرتبة في أعمدة. في صفيحة النمو ، تمر الخلايا الغضروفية بمراحل من التمايز ، من الراحة إلى التكاثر إلى الضخام.

يتم فقدان هذا التنظيم الخلوي في بعض الاعتلال الهدبي ، مما يشير إلى أن الأهداب الأولية قد تلعب دورا في تنسيق هذا التنظيم الخلوي و / أو ، على الأقل ، مرتبطة بالاستقطاب الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن اتجاه الأهداب الأولية يلعب دورا في وظيفتها الحسية الميكانيكية ، مع ملاحظة الاختلافات بين المناطق الحاملة وغير الحاملة في الغضروفالمفصلي 4. أشارت دراساتنا الحديثة إلى أدوار تفاضلية داخل مناطق مختلفة من الغضروف المفصلي ولوحة النمو5،6. اقتصرت الدراسات السابقة التي صورت الأهداب الأولية في صفيحة النمو على 2D ، والتي تفقد المعلومات المتعلقة بتنظيم الأهداب في الأنسجة أو تقتصر على عدد صغير من الخلايا في 3D ، مما يقلل من حجم وقوة التحليل7،8.

من بين التحديات التي تواجه تصوير الأهداب الأولية حجمها على مقياس ميكرومتر وعدم خصوصية الأجسام المضادة للكيمياء المناعية. يضمن استخدام إشارة الفلورسنت الأصلية توطين وخصوصية قوية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون من الصعب تصوير إشارات الفلورسنت الأصلية في الأنسجة المعدنية ، حيث يمكن أن تؤدي عملية إزالة الكلس الطويلة لتضمين الأنسجة في البارافين إلى فقدان الإشارة. تمنع عينات التقطيع بالتبريد المجمدة في الحالة الأصلية هذه الخسارة عن طريق تسريع عملية التضمين والتقسيم.

لتصوير الأهداب الأولية في الموقع ، تم إنشاء خط فأر مزدوج معدل وراثيا بواسطة Bangs et al. ، والذي يعبر عن البروتين الشبيه بعامل الريبوسيلاتاسیون ADP (ARL13B) المدمجة في mCherry و CENTRIN-2 المدمجة في GFP9. ARL13B عبارة عن GTPase صغير مترجم في غشاء الأهداب الأولي ، و CENTRIN-2 هو بروتين مركزي مترجم في الجسيمين المركزيين في قاعدة الأهداب10،11. لذلك ، يسمح خط الفأر هذا بتصوير الأهداب الأولية المصنفة بالفلورسنت دون الحاجة إلى الكيمياء المناعية.

يستخدم البروتوكول الموصوف هنا هذا الخط المعدل وراثيا لتصوير الأهداب الأولية ثلاثية الأبعاد في ألواح نمو الفئران بعد الولادة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، مما يتطلب فقط تلطيخا إضافيا 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). يمكن تصوير مئات الأهداب الأولية في مئات الخلايا وتحليلها بشكل جماعي في سياق الأنسجة. يقيس خط أنابيب تحليل الصور لاحقا حدوث الأهداب الأولية وطولها واتجاهها في المناطق المختلفة من لوحة النمو. خط الأنابيب قادر أيضا على تحديد هذه الميزات للمريكزات. يتم تقديم مخطط تفصيلي للخطوات الواردة في البروتوكول في الشكل 1.

البروتوكول

أجريت تربية والتجارب وفقا للأطر الأخلاقية لجامعة أكسفورد وبموجب ترخيص المشروع الممنوح من قبل وزارة الداخلية البريطانية. تم تنفيذ هذا البروتوكول على الفئران التي تتراوح أعمارها بين 2 و 10 أسابيع ولكنه سيعمل في غضروف الفئران بعد هذا العمر.

1. جمع الأنسجة

  1. قتل الفئران عن طريق ملء صندوق يحتوي على الفئران بثاني أكسيد الكربون بنسبة تصل إلى 80٪ من حيث الحجم والحفاظ على تركيزه لمدة 5 دقائق. إجراء خلع عنق الرحم.
  2. تشريح الأنسجة ذات الأهمية.
    ملاحظة: يوجد أدناه بروتوكول لتشريح ركبتي الساق الخلفية ، بما في ذلك صفائح نمو الظنبوبك والفخذ والغضاريف المفصلية.
    1. شق الجلد عند القدم وقصه إلى أعلى الفخذ. قم بإزالة الجلد من خط الشق بالملقط.
    2. تقليم العضلات والأنسجة الدهنية من الساقين.
    3. لفصل الساق عن الجسم ، قم بقطع عظم الفخذ بشكل نظيف في الجزء العلوي من الورك. قطع القدم في الجزء السفلي من الساق.
    4. قم بإزالة أي أنسجة عضلية ودهنية زائدة متبقية على الساق.

2. تثبيت الأنسجة وتضمينها

ملاحظة: طوال البروتوكول ، احرص على إبقاء الأنسجة في الظلام لتجنب فقدان إشارة الفلورسنت.

  1. ثبت الأنسجة في 10٪ فورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
  2. انقل الأنسجة إلى 2.5٪ فورمالين عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. انقل الأنسجة إلى 30٪ سكروز في الماء المقطر (dH2O) ، وقم بتدويرها برفق في درجة حرارة الغرفة طوال الليل أو لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية. املأ الأنابيب إلى الأعلى لضمان الغمر الكامل للأنسجة أثناء الدوران. بعد هذه الحضانة ، سوف تغرق الأنسجة في قاع الأنبوب.
  4. ضع كمية صغيرة من الثلج الجاف في صندوق منفصل وضع التبريد في الأعلى. تتبع خطا من وسط التبريد الفائق (SCEM) وضع الطرف على طوله، بحيث تكون الرضفة متجهة لأسفل وتفتح الساق وعظم الفخذ بعيدا عن بعضهما البعض لتكون الساق مسطحة قدر الإمكان. ثبت في مكانه باستخدام ملقط حتى يبدأ SCEM في التصلب ولم يعد الطرف يتحرك عند عدم الضغط عليه.
  5. قم بتغطيتها بالكامل ب SCEM ، واملأ القالب إلى الأعلى. ضع العينة في صندوق الثلج الجاف ، مع الحفاظ على العينة مسطحة لتجنب حركة الأنسجة ، حتى تصلب SCEM تماما.
  6. نقل إلى -20 درجة مئوية.

3. التقسيم

  1. قم بإزالة الكتلة من القالب وقم بقصها إلى الحجم الذي يناسب ظرف ناظف البرد. قم بتوصيل الكتلة بالظرف عن طريق تطبيق SCEM على الظرف ووضع الكتلة في الأعلى.
  2. اتركيه ليتصلب لمدة 5 دقائق على الأقل عند -20 درجة مئوية في ناظم البرد.
  3. قم بتوصيل ظرف الظرف بحامل العينة وشفرة بحامل الشفرة.
  4. تقليم الكتلة حتى يتم الوصول إلى لوحة نمو الظنبوب. من الناحية المثالية ، قم بتقسيم الساق الذي يشير إلى الأعلى.
  5. قم بقص شريط الفيلم المبرد بحجم يناسب العينة مع وجود مساحة كافية تحيط به. قم بتركيب الأغشية البردية على السطح المقطوع ، مما يضمن التصاق محكم للأغشية البردية باستخدام أداة مناسبة. قطع أقسام بسمك 40-60 ميكرومتر للحصول على أقسام سميكة من خليتين. اجمع الشريط باستخدام ملقط وضعه على شريحة ، وجانب العينة لأعلى ، ولوحة نمو الظنبوب بما يتماشى مع الشريحة القصيرة للشريحة.
  6. قم بتخزين شرائح العينة عند -20 درجة مئوية.

4. إعداد الشريحة وتركيبها

  1. قم بإذابة الشريحة أفقيا في درجة حرارة الغرفة.
  2. اغسل الشريحة بقطرة من PBS لمدة 3 × 5 دقائق لإزالة SCEM.
  3. وصمة عار مع 10 ميكرومتر DAPI لمدة 1 دقيقة.
  4. اغسل الشريحة بقطرة من PBS لمدة 2 × 5 دقائق.
  5. قم بالتركيب ، وقم بتغطيته بغطاء ، واتركه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. أغلق حواف الغطاء بمادة مانعة للتسرب من الغطاء.
  6. الصورة في اليوم التالي.

5. التصوير بالفحص المجهري متحد البؤر

ملاحظة: دقة الهدف 40x/1.4 على المجهر متحد البؤر المستخدم هي 240 نانومتر.

  1. قم بإعداد المجهر.
    1. قم بتشغيل المجهر وافتح البرنامج. انقر فوق الزر "النظام".
    2. ضمن علامة التبويب اكتساب ، انقر فوق الإعداد الذكي لإعداد القنوات. حدد قنوات GFP وmCherry وDAPI وأضفها. حدد خيار Airyscan ووظيفة SR8Y في مثلث Airyscan (بين الدقة ومضاعفة السرعة 8Y). انقر فوق أفضل إشارة | حسنا (الشكل التكميلي S1A).
    3. في علامة التبويب تحديد الموقع، ضمن التحكم في المجهر، حدد الهدف 40x/1.4 مع الغمر بالزيت.
  2. حدد موقع منطقة الاهتمام.
    1. ضع الشريحة في حامل الشريحة وارفع الهدف لأعلى حتى يلامس الزيت الغطاء.
    2. ضع لوحة النمو أو أي منطقة أخرى ذات أهمية أسفل مسار الضوء.
    3. في علامة التبويب تحديد الموقع ، انقر فوق التألق ، وحدد DAPI ، وباستخدام العدسة ، حرك حامل الشريحة باستخدام عصا التحكم لوضع لوحة النمو أو منطقة الاهتمام أسفل مجال الرؤية.
    4. في علامة التبويب اكتساب ، ابدأ بتحديد قناة DAPI فقط.
    5. انقر فوق مستمر لعرض صورة تلك القناة على الشاشة والتأكد من أن لوحة النمو معروضة.
    6. افتح عارض اللوحات بالنقر فوق إظهار العارض في علامة التبويب المربعات. أضف عدد المربعات المطلوبة (عادة 1 بلاطة في الاتجاه x و 3-5 في اتجاه y) وانقر فوق معاينة وابدأ (الشكل التكميلي S1B).
    7. تأكد من أن البلاط يغطي المناطق الثلاث لراحة لوحة النمو والانتشار والتضخم. اضبط موضع البلاط ورقمه كما هو مطلوب.
  3. قم بإعداد معلمات التصوير.
    1. انقر فوق مستمر في علامة التبويب الاستحواذ . في علامة التبويب القنوات ، اضبط الكسب (الرئيسي) وطاقة الليزر لعرض النوى بوضوح على الشاشة. اسمح لكاشف Airyscan بالمحاذاة. افتح نافذة Airyscan Detector Adjustment بالنقر فوق رمز الوردة المبلطة في أسفل النافذة ؛ بمجرد محاذاته ، ستتحول جميع المربعات إلى اللون الأخضر (الشكل التكميلي S1C).
    2. حدد قنوات GFP و mCherry بشكل فردي وكرر هذه الخطوات لضبط Gain (Master) وطاقة الليزر ومحاذاة كاشف Airyscan.
    3. حدد القنوات الثلاث وانقر على Continuous. اسمح لكاشف Airyscan بالمحاذاة.
    4. في علامة التبويب وضع الاكتساب، حدد قيم حجم الصورة والبكسل والحجم وحجم الإطار والسرعة والمتوسط. انظر الشكل التكميلي S1D ، E لمعرفة قيم إعدادات وضع الاستحواذ ، والكسب (الرئيسي) ، وطاقة الليزر للقنوات المستخدمة.
  4. الحصول على الصور.
    1. في علامة التبويب اكتساب ، انقر فوق خانة الاختيار Z-Stack .
    2. مع تحديد قناة DAPI فقط ، انقر فوق مستمر لعرض الصورة على الشاشة. حرك الهدف لأسفل إلى أقرب مستوى ليتم تصويره. في علامة التبويب Z-Stack ، انقر فوق تعيين المستوى الأول ، وركز بعيدا على آخر مستوى ليتم عرضه ، وانقر فوق تعيين المستوى الأخير . صورة 30-40 ميكرومتر z-stacks.
    3. اضبط الفاصل الزمني على 0.15 ميكرومتر.
    4. انتقل إلى مركز مكدس z. في علامة التبويب المربعات ، ضمن مناطق البلاط ، انقر فوق التحقق وانقر فوق تعيين Z والانتقال إلى التالي.
    5. ضمن علامة التبويب استراتيجية التركيز، تحقق من تعيين استراتيجية التركيز إلى استخدام قيم Z/سطح التركيز المحدد في إعداد اللوحات
    6. انقر فوق بدء التجربة لبدء الحصول على الصورة.
  5. معالجة الصور
    1. في علامة التبويب معالجة، حدد الوضع الفردي أو الدفعي . حدد معالجة Airyscan. ضع علامة على المعالجة ثلاثية الأبعاد وحدد التصفية التلقائية القياسية. حدد الصورة الأولية التي تم الحصول عليها وابدأ المعالجة (الشكل التكميلي S2A).
    2. بمجرد اكتمال معالجة Airyscan ، حدد خياطة في طرق المعالجة. حدد إخراج جديد ومربعات الصمامات والتظليل الصحيح والكل حسب المرجع، مع المرجع ك DAPI. حدد الصورة التي تمت معالجتها Airyscan وابدأ المعالجة (الشكل التكميلي S2B).
    3. احفظ الصور الأولية والمعالجة المزدوجة. يتم حفظ هذا الأخير تلقائيا في وضع الدفعات .

6. تحليل الصور

ملاحظة: تم تخصيص خط أنابيب التحليل المستخدم هنا لأغراض هذه الدراسة. يتم عرض تفاصيل عمليات خط الأنابيب في الشكل التكميلي S3.

  1. قم باستيراد ملف صورة czi إلى البرنامج. افتح لوحة التحليل. في القائمة المنسدلة ، حدد خط أنابيب جديد ...
  2. لإنشاء مسار الكشف عن الخلايا، قم باستيراد Cellpose Python Segmenter إلى البنية الأساسية لبرنامج ربط العملياتالتجارية 12. اضبط Model_Name على الخلوي2 ، Input_channel إلى 2 ، Second_channel إلى 3 ، Diameter_in_ ميكرومتر إلى 10 ، Flow_threshold إلى 0.4 ، و Cellprob_threshold إلى 0. أضف كائنات مستند الاستيراد (تمت إعادة تسميته إلى استيراد التسميات اليدوية) من قبل وعامل تصفية ميزات الكائن (تمت إعادة تسميته إلى عامل تصفية الحجم) بعد خط الأنابيب بالنقر فوق + إضافة عملية. راجع الشكل التكميلي S3A لمعرفة قيم إعدادات خط الأنابيب.
    1. نقل المشاهد إلى المستوى الأول من الاهتمام
    2. انقر فوق أيقونة أداة رسم الكائنات
    3. انقر فوق أيقونة وضع المضلع
    4. رسم منطقة لتحليلها
    5. نقل المشاهد إلى آخر مستوى من الاهتمام
    6. منطقة الرسم المراد تحليلها
    7. انقر فوق العلامة الخضراء تطبيق التغييرات
    8. انقر فوق أيقونة إظهار جدول الكائنات
    9. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الكائن الذي تم إنشاؤه وحدد إعادة تسمية الكائن لإعادة تسمية الكائن إلى اسم مناسب. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الكائن الذي تم إنشاؤه وانقر فوق إضافة علامة. أضف علامة تسمى منطقة التحليل.
  3. قم بتشغيل هذا المسار بالنقر فوق السهم الأزرق للأمام في الجزء العلوي من لوحة التحليل .
  4. لإنشاء خط أنابيب أساسي للكشف عن الأهداب والمريكز، افتح لوحة التحليل، في القائمة المنسدلة حدد خط أنابيب جديد.... أضف عوامل التشغيل التالية إلى خط الأنابيب: استيراد كائنات المستند (تمت إعادة تسميته إلى استيراد التسميات اليدوية) ، واثنين من عوامل تجزئة عتبة الكثافة (تمت إعادة تسميته إلى عتبة Cilia و Centriole Threshold) ، والتقسيم (تمت إعادة تسميته إلى تقسيم Centriole) ، وعامل تصفية ميزات الكائن (تمت إعادة تسميته إلى مرشح حجم تقسيم Centriole) و Compartment (تمت إعادة تسميته إلى Compartment - Cell). راجع الشكل التكميلي S3B لمعرفة قيم إعدادات خط الأنابيب.
  5. قم بتشغيل هذا المسار بالنقر فوق السهم الأزرق للأمام في الجزء العلوي من لوحة التحليل.
  6. افتح نافذة الكائنات. انقر فوق Im / Export ...، وحدد Excel Export .... حدد الميزات التالية للحفظ: # الأطفال، الاسم، أسماء الأصل، الحدود الموجهة ثلاثية الأبعاد الجانب القصير، الجانب الأوسط، الجانب الطويل، الزاوية XY، الزاوية XZ، الزاوية YZ، المربع المحيط X1، X2، Y1، Y2، Z1، Z2، SizeX، SizeY، SizeZ، مركز الهندسة X، Y، Z، المستوى أولا، الأخير، العدد، الكروية (الشبكة)، الحجم (الشبكة)، مساحة السطح (الشبكة).

النتائج

تم تصوير صفيحة نمو الفأر البالغ من العمر 6 أسابيع باستخدام البروتوكول الموصوف وتنظيم الأهداب الأولية المعينة في الأنسجة. تم التقاط صورة لجميع المناطق الثلاث من صفيحة النمو - الراحة ، والتكاثرية ، والضخامية - وتشغيلها عبر خط أنابيب التحليل (الشكل 2 أ). يمكن التعرف على الخلايا الفردية من خلال تلطيخ DAPI ، مع محور عصبي هدبي باللون الأحمر ومريكزاتها باللون الأخضر. الدقة التي تستخدم هذه الطريقة عالية بما يكفي للتمييز بين المريكزات الفردية (الشكل 2 ب). في هذا الدقة ، يمكن تصور الأهداب في بيئتها ثلاثية الأبعاد ، مشيرا إلى اتجاهات مختلفة (الفيديو 1).

يمكن أيضا التقاط صور منخفضة الدقة ، مع أهداف تكبير أعلى ، لتصور الأهداب الأولية عبر منطقة أكبر من الأنسجة. ومع ذلك ، فهذه ليست مناسبة لتحليل اتجاه الأهداب في 3D. على سبيل المثال ، تم تصوير الأهداب الأولية في الغضروف المفصلي بهدف 20x ، مما يدل على أن الطريقة تعمل أيضا على الأنسجة الأخرى (الشكل 2 ج). في هذا القرار ، يمكن تحديد المحاور الهدبية باللون الأحمر ، ولكن يصعب تمييز المريكزات. يميل العظم تحت الغضروف إلى تقديم الكثير من إشارات خلفية GFP ، مما يجعل تحديد المريكز صعبا في هذا الأنسجة.

يمكن لخط الأنابيب اكتشاف الخلايا الفردية والأهداب الأولية والمريكزات ، ويعمل مع ألواح النمو الشابة عالية التنظيم وألواح النمو القديمة حيث تكون الأعمدة أقل تحديدا ، كما هو الحال في الفئران البالغة من العمر 10 أسابيع (الشكل 3). يتم الكشف عن الخلايا والأهداب في 3D ، كما يمكن رؤيته عبر z-stack.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل التجريبي. مخطط انسيابي للخطوات المختلفة في البروتوكول من جمع الأنسجة إلى تحليل الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: أهداب أولية في أنسجة الفئران للفأر ARL13B-CENTRIN-2. (أ) صفيحة نمو عمرها 6 أسابيع ، مع DAPI باللون الأبيض ، و CENTRIN-2 باللون الأخضر ، و ARL13B باللون الأحمر ، تم تصويرها بهدف 40x. (ب) تكبير هداب أولي فردي ومراكزه. (ج) الغضروف المفصلي والعظام تحت الغضروفي لفأر يبلغ من العمر 4 أسابيع ، تم تصويره بهدف 20x. (د) كلية فأر يبلغ من العمر 6 أسابيع تم تصويرها باستخدام نفس خط الأنابيب الخاص بالأنسجة العضلية الهيكلية. (ه) تكبير الصندوق الأبيض في D يظهر أهداب أولية فردية وممرکزاتها في الكلى. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر (A ، D) ، 4 ميكرومتر (B) ، 60 ميكرومتر (C) ، 6 ميكرومتر (E). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: خط أنابيب الكشف عن الخلايا والأهداب. مثال على تطبيق خط أنابيب تحليل الصور على لوحة نمو عمرها 10 أسابيع. (أ) الصورة المفتوحة في البرنامج. (ب) نتيجة خط أنابيب الكشف عن الخلايا. (ج) نتيجة خط أنابيب الكشف عن الأهداب والمريكز. الأهداب باللون الوردي والمريكزات باللون الأخضر. يوضح المنظر الجانبي أن الدقة عالية بما يكفي للتمييز بين الأهداب الموجهة في اتجاهات مختلفة في 3D. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فيديو 1: إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للوحة نمو عمرها 6 أسابيع من الماوس ARL13B-CENTRIN-2. تم إجراء إعادة البناء ثلاثية الأبعاد في برنامج Imaris وتم تسجيلها كفيديو رسوم متحركة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الشكل التكميلي S1: إعدادات الحصول على الصور على نظام المجهر. (أ) نافذة الإعداد الذكي لإضافة القنوات واختيار وضع Airyscan . (ب) عارض البلاط لتحديد ومعاينة المربعات إلى صورة. (ج) نافذة ضبط كاشف Airyscan ، حيث يتم تأكيد محاذاة كاشفات Airyscan بمجرد تحول جميع البلاط إلى اللون الأخضر. (د) إعدادات الليزر للقنوات الثلاث. (ه) إعدادات وضع الاكتساب وZ-Stack. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: إعدادات معالجة الصور على نظام المجهر. (أ) إعدادات معالجة Airyscan. (ب) إعدادات الخياطة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: مسارات تحليل الصور المخصصة. (أ) خط أنابيب الكشف عن الخلايا باستخدام قنوات GFP و DAPI. (ب) خط أنابيب الكشف عن الأهداب الأولية والمريكز باستخدام قناتي mCherry و GFP ، على التوالي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، من الضروري المضي قدما في خطوات معالجة الأنسجة وتضمينها فور جمعها. ومع ذلك ، يمكن الاحتفاظ بكتل وشرائح الأنسجة لمدة 3 أشهر على الأقل عند -20 درجة مئوية. يمكن تعديل عدة خطوات في هذا البروتوكول لتناسب التطبيقات المختلفة ، على وجه الخصوص ، سمك المقطع والتكبير ومعلمات z-stack. سيؤثر هذا على عمق التصوير والدقة التي تم الحصول عليها. يمكن استخدام التغييرات في الفتحة العددية ووضع الدقة للحصول على دقة أعلى وتقليل حجم الفاصل الزمني للمكدسات z. ومع ذلك ، فإن هذا من شأنه أن يزيد من وقت التصوير أو يقلل من حجم مجال الرؤية الذي يمكن تصويره. معلمات التصوير الموصوفة هي الحد الأدنى من المتطلبات المحددة للتحليل ثلاثي الأبعاد لاتجاه الأهداب الأولي.

يعد اختيار وسيط التركيب أمرا مهما للحصول على دقة عالية. يجب أن يكون معامل الانكسار لوسيط التركيب مشابها لمعامل وسط الغمر لتقليل تدهور الصورة في z-stack. معامل الانكسار للحامل وزيت الغمر المستخدم هنا لهما معامل انكسار 1.52 و 1.518 على التوالي. توفر وظيفة Airyscan على المجهر متحد البؤر المستخدم هنا صورا فائقة الدقة. يمكن استخدام مجاهر أخرى فائقة الدقة ؛ ومع ذلك ، وجدنا أن الوضع متحد البؤر فقط لم يكن كافيا للحصول على الدقة المطلوبة لحجم المناطق المصورة. وتبلغ الدقة القصوى لوضع Multiplex SR-8Y Airyscan 120/160 نانومتر في x/y و450 نانومتر في z، والحد الأقصى لعدد الإطارات/ثانية 47.5. وجدنا وضع Multiplex SR-4Y Airyscan ، والذي يقدم دقة قصوى تبلغ 140 نانومتر في x / y و 450 نانومتر في z ولكن الصور بنصف السرعة مع الحد الأقصى لعدد الإطارات / الثانية 25 ، لا يمثل فرقا كبيرا في تصوير الأهداب الأولية في 3D. وبالمثل ، فإن وضع Airyscan فائق الدقة (SR) ، الذي يوفر أعلى دقة على هذا المجهر - 120 نانومتر في x / y و 350 نانومتر في z - سيستغرق وقتا أطول للتصوير ، حيث أن الحد الأقصى لعدد الإطارات / الثانية هو 4.713.

يمكن ملاحظة إشارة GFP في الخلفية في الأنسجة الأخرى مثل العضلات. لتقليل ذلك ، يمكن تضييق نطاق الليزر لتقليل التداخل مع الأطوال الموجية الأخرى. تم استخدام هذا الخط سابقا لتصوير الأهداب الأولية في الجنين ، ومزارع الخلايا الأولية ، وألياف العضلات ، وظهارة صبغة الشبكية9،14،15. لقد نجحنا في تصوير الأهداب الأولية في أنسجة الكلى والغضاريف والعظام. من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى بعض التحسين لإعدادات التصوير للأنسجة المختلفة. ومع ذلك ، يجب أن يضمن بروتوكول القطع بالتبريد هذا الحفاظ على الإشارة.

الأقسام السميكة المكونة من خليتين (40-60 ميكرومتر) كافية للحصول على معلومات الاتجاه ثلاثية الأبعاد في لوحة النمو ، حيث يسمح ذلك بتصوير الخلايا الكاملة وأهدابها الأولية. بالنسبة للأنسجة الأخرى التي تكون فيها الخلايا أكبر من الخلايا الغضروفية ، مثل الخلايا الشحمية ، قد تكون هناك حاجة إلى أقسام أكثر سمكا لجمع بيانات سكان الخلايا. اعتمادا على دقة عمق المجهر المستخدم ، قد لا يكون من الممكن التصوير بعمق في أقسام أكثر سمكا. من المحتمل أن تؤدي تقنيات إزالة الأنسجة إلى فقدان إشارة mCherry و GFP الداخلية بسبب الوقت الذي تتطلبه. تم استكشاف ذلك ، حيث تم استخدام طرق المقاصة للتصوير الآخر في الطرف ولكن لم يتم العثور على ذلك ضروريا في هذا السياق. اقترحت تجربتنا مع CD31-RFP الذاتية أن تقنيات المقاصة ستحتاج إلى تحسين دقيق ومخصص للعينة.

يمكن عبور خط ARL13B-CENTRIN-2 هذا مع خطوط الفئران الأخرى لدراسة تنظيم الأهداب الأولية في الأنسجة. على سبيل المثال ، لقد عبرناه مع aggrecan-Cre IFT88fl / fl للقضاء بشكل مشروط على IFT88 ، وهو بروتين أهداب أولي يمنع حذفه الهدبية ، في الخلايا الشفط عن التراكم (الخلايا الغضروفية بعد الولادة) 5،6. يمكن بعد ذلك استخدام إشارات الفلورسنت ARL13B و CENTRIN-2 لقياس كفاءة الاضطرابات الجينية على مستوى التركيب الهدبي في الأنسجة وأي تغييرات مرتبطة بها في التنظيم الهدبي. العمل الجاري يقوم حاليا بهذا بالضبط. سيكون هدفنا الأول هو تحديد تأثير حذف IFT88 على انتشار الأهداب ، باستخدام هذه المنهجية الأكثر قوة. في السابق ، قمنا بقياس ذلك باستخدام التألق المناعي وقدرنا أن هذا يمثل انخفاضا بنسبة 20٪6. يمكن أيضا دمج هذه الطريقة مع الكيمياء المناعية لتصوير الأهداب الأولية مع بروتينات أخرى ، على سبيل المثال ، بروتين غشاء الخلية.

قد يكون للجين المعدل على ARL13B تأثير على تعبير ARL13B وطول الأهداب الأولية. قامت الدراسات السابقة بقياس أطوال أهداب أولية مختلفة باستخدام خط ARL13B-CENTRIN-2 مقارنة ب ARL13B غير المعدل وراثيا في مناطق معينة من دماغ الفأر ، مع عدم وجود فرق في مناطق أخرى16. لاحظت دراسة أخرى اختلافات في طول الأهداب الأولية في خط الفأر ARL13B الموسوم ب GFP مقارنة ب ARL13B غير الموسوم في الخلايا الليفية الجنينية للفأر10. يتمثل العمل المستمر في التحقق من أي تغييرات في طول الأهداب الأولية في صفيحة النمو والأنسجة الأخرى من خلال مقارنة النتائج باستخدام خط الفأر ARL13B-CENTRIN-2 مع تلطيخ الأجسام المضادة ضد ARL13B غير المعدلة وراثيا.

تم تصميم خط أنابيب تحليل الصور في هذا البروتوكول لقياس النسبة المئوية للهدب والطول والاتجاه ثلاثي الأبعاد للأهداب الأولية ، بالإضافة إلى عدد المريكز والموضع في لوحة النمو. يسمح برنامج تحليل الصور بإجراء خطوط أنابيب مخصصة عن طريق تغيير الخطوات المتضمنة. ناتج خط الأنابيب هذا عبارة عن جدول بيانات يحتوي على مقاييس الميزات المختارة للخلايا والأهداب والمريكزات المكتشفة. يمكن بعد ذلك إجراء التحليل اللاحق في R أو برامج أخرى وفقا لأغراض الدراسة. كما هو الحال مع إعدادات التصوير ، يمكن تغيير خطوات خط الأنابيب والإعدادات المحددة للعمل على صور مختلفة ووفقا لأهداف الدراسة. بشكل عام ، تسمح هذه الطريقة بتحليل عالي الإنتاجية للأهداب الأولية مما تم نشره سابقا في لوحة النمو. يسمح عدد الخلايا والأهداب المرتبطة بها التي يمكن دراستها بإجراء قياسات أكبر وأكثر موثوقية.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نشكر جميع أعضاء فريق BSU في معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم ، وخاصة ألبرتينو بونيفاسيو ، على تربية. نشكر مركز أكسفورد-زايس للتميز في التصوير الطبي الحيوي للمساعدة في استخدام المجهر ، ولا سيما الدكتور جاكي (كا لونج) كو للمساعدة في تطوير خط أنابيب تحليل الصور. تم دعم هذا العمل من قبل منحة كينيدي لأبحاث أمراض الروماتيزم (جونسون) ومجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC ، BB / X007049 / 1).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
22 × 50 مم غطاء زلاتFisherScientific   ؛12373128
arivis Vision4D softwareZeissN / AImage analysis software 
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ZeissZeiss 980 Airyscan 2
CoverGrip Coverslip Sealant البيوتيوم 23005
Cryofilm type 3C (16UF) (نوع الورقة) عرض 2.0 سممختبر القسمC-FUF303ليتم شراؤها من مختبر القسم مباشرة
CryostatLeicaCM1900 UV
DAPIinvitrogenD1306
قوالب قاعدة يمكن التخلص منها   ؛epredia58952
Dulbecco's Fossil Buffered Salinegibco14190
FormalinSigma20260630
Imaris software أكسفورد إنسترومنتس برنامج تحليل الصور غيرمتاح لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد 
زيت الغمر 518FZeissISO 8036  
شفرات MicrotomeFeather02.075.00.006
SlowFade Glass Antifade Mountant invitrogenS36917
SucroseSigmaS9378
Super Cryoembedding Medium (SCEM)Section-labC-EM001ليتم شراؤها من مختبر القسم مباشرة
Superfrost Plus Microscope slidesavantor631-0108
Zen softwareZeissN / AFreeware للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر

المراجع

  1. Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. Expression of primary cilia in mammalian cells. Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).
  2. Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon. J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).
  3. McGlashan, S. R., et al. Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length. Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).
  4. Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space. Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).
  5. Coveney, C. R., et al. The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis. Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).
  6. Coveney, C. R., et al. Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces. J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).
  7. Andrea, C. E. D., et al. Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma. Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).
  8. Ascenzi, M. -G., et al. Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization. J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).
  9. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).
  10. Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins. Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).
  11. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).
  12. arivis. Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D. , 1-20 (2021).
  13. Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes. Nat Methods. , (2019).
  14. Ning, K., et al. Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium. Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).
  15. Palla, A. R., et al. Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging. Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).
  16. Brewer, K. K., et al. Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain. Cells. 13 (3), 259-277 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ARL13B CENTRIN 2 Z Stack
التصوير الحجمي وتحليل الأهداب الأولية في الأنسجة العضلية الهيكلية باستخدام نموذج الفأر ARL13B-CENTRIN-2
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.