مقالة منهجية

توصيف الحويصلات خارج الخلية من السوائل البيولوجية

DOI:

10.3791/67699

⸱

فبراير 28, 2025

 ,  ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 3Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نوضح طريقة توصيف الحويصلات خارج الخلية (EVs) التي تم جمعها من السوائل البيولوجية ، مثل الدموع واللعاب ، للبشر. الماسح الضوئي المستخدم في هذه الطريقة قادر على اكتشاف النمط الظاهري والحجم والعدد الكلي للجسيمات للمركبات الكهربائية من 1 ميكرولتر من العينة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي هياكل يتم إنتاجها من الخلايا وتشارك في الاتصال بين الخلايا عن طريق نقل الجزيئات الحيوية من خلية إلى أخرى. ثبت أن المركبات الكهربائية تسافر لمسافات قصيرة وبعيدة في الجسم وهي خاصة بالأنسجة. لا توجد المركبات الكهربائية في الأنسجة فحسب ، بل يمكن العثور عليها أيضا في جميع سوائل الجسم تقريبا ، مثل الدموع واللعاب والسائل النخاعي الدماغي والدم وما إلى ذلك. على الرغم من أنه يمكن جمع المركبات الكهربائية بشكل غير جراحي من الدموع واللعاب ، إلا أنه يمكن جمع كميات صغيرة فقط في وقت واحد ، مما قد يتسبب في حدوث مشكلات في الحصول على ما يكفي من المركبات الكهربائية لتحليل البروتينات. الماسح الضوئي الذي تمت مناقشته في هذه الورقة هو محلل للجسيمات النانوية يوفر حلا لهذه المشكلة ، مما يسمح لنا بتوصيف ودراسة النمط الظاهري والحجم والعدد الكلي للجسيمات للمركبات الكهربائية من أقل من 1 ميكرولتر من السائل البيولوجي. سيعمل هذا البروتوكول على توسيع معرفة المركبات الكهربائية من كميات صغيرة من العينات التي يصعب استخراجها من المرضى. يمكن أن يعزز ذلك راحة المريض وربما تحديد أهداف علاجية جديدة لمجموعة من الأمراض والاضطرابات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتواصل الخلايا مع الخلايا المجاورة من خلال آليات إشارات مختلفة ، بما في ذلك إطلاق الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، والتي تلعب دورا رئيسيا في الاتصال بين الخلايا. تشارك المركبات الكهربائية في الاتصال بين الخلايا عن طريق تمرير البضائع الجينية ، مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات ، من خلية إلى أخرى1،2،3،4،5. حاليا ، هناك ثلاث فئات من المركبات الكهربائية: الإكسوسومات ، والحويصلات الدقيقة ، والأجسام موت الخلايا المبرمج ، والتي تتميز بحجمها. الإكسوسومات هي الأصغر ، حيث يبلغ قطرها 30-150 نانومتر6،7،8 ، وتتشكل من نظام الغشاء الداخلي9،10،11 (الشكل 1). الحويصلات الدقيقة أكبر من الإكسوسومات من حيث أنها تتراوح من 100-1000 نانومتر12،13،14 والبراعم من غشاء البلازما11،12،13 (الشكل 1). الأجسام موت الخلايا المبرمج هي أكبر المركبات الكهربائية وتتراوح من 1000-5000 نانومتر12،14،15 ، كما أنها تنبثق من غشاء البلازما12،16،17 (الشكل 1). بصرف النظر عن الحجم ، يمكن تصنيف المركبات الكهربائية بناء على الخصائص الفيزيائية الحيوية الأخرى ، والتي تشمل الكثافة والعلامات الجزيئية مثل CD63 و CD81 و CD9 وكذلك آلية التكوينالحيوي 18. يمكن للمركبات الكهربائية السفر لمسافات قصيرة بين الخلايا المجاورة ومسافات طويلة في جميع أنحاء الجسم19،20،21،22،23. يمكن العثور على المركبات الكهربائية في السوائل البيولوجية مثل الدم24،25،26 ، والسائل الشوكي الدماغي27،28،29 ، والدموع30،31،32 ، واللعاب33،34،35 ، على سبيل المثال لا الحصر.

حتى الآن ، يعد الطرد المركزي الفائق أحد أشهر الطرق لعزل المركبات الكهربائية من العينات36،37،38. تتطلب هذه الطريقة جولات متعددة من الطرد المركزي والطرد المركزي الفائق والتي يمكن إجراؤها عن طريق زيادة السرعة لعزل المركبات الكهربائية عن الخلايا وحطام الخلايا. يمكن أن تبدأ هذه الطريقة بسرعة منخفضة مع خلايا الحبيبات التي ستتبعها سرعة متوسطة للتخلص من الحويصلات الأكبر حجما, وأخيرا خطوة الطرد المركزي الفائق إلى بيليه EVs18. في حين أن الطرد المركزي الفائق يعتبر أفضل طريقة للعزل ، إلا أن بعض القيود لا تزال موجودة من حيث أنه يغير مورفولوجيا المركبات الكهربائية39،40،41. تقنية أخرى تستخدم لعزل المركبات الكهربائية هي قياس التدفق الخلوي ، والذي يسلط الضوء على مزايا تقييم النقاط الزمنية المتعددة ونقطة النهاية وتحليل EV الفردي عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن قيود قياس التدفق الخلوي تشمل على سبيل المثال لا الحصر ، انسداد المسام والإشارات الضعيفة. هناك نهج آخر مستخدم وهو الطرد المركزي المتدرج ، والذي يستخدم مواد ذات كثافات مختلفة ليتم طردها بالمركبات الكهربائية ويسمح بفصل أفضل للمركبات الكهربائية مقارنة بالطرد المركزي الفائق. على الرغم من أن هذه التقنية تحسن الفصل ، إلا أنها تتطلب عمالة مكثفة وتستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تؤدي إلى فقدان كبير للعينة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام هطول الأمطار والترشيح لعزل المركبات الكهربائية. كلتا الطريقتين بسيطتان وسريعتان ، لكن كلاهما يمكن أن يؤدي إلى تلوث العينة. في حين أن هناك العديد من التقنيات لعزل المركبات الكهربائية ، فإن كل تقنية لها مزاياها وقيودها ، وهي مدرجة أدناه (الجدول 1) 42،43،44،45،46،47،48،49،50،51،52،53،54 ،55 ، 56،57،58،59،60،61،62،63،64،65،66،67.

بمجرد عزل المركبات الكهربائية ، يمكن إجراء فحوصات جزيئية لتوصيف المركبات الكهربائية. البقع الغربية هي اختبار شائع للبحث عن تعبير البروتين السطحيوالبضائع 68،69،70 ويستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتعبير miRNA 71،72،73 للمركباتالكهربائية 74،75،76. تم إنشاء هذه المقايسات ويمكن أن تولد نتائج مثيرة للاهتمام. يتمثل أحد قيود هذه الطرق في أنها تتطلب كمية كبيرة من البروتينات أو الحمض النووي الريبي من المركبات الكهربائية للحصول على قراءة77 ، وهي مشكلة بالنسبة للعينات التي لها حجم صغير أو تركيز EV ، لتبدأ.

يسمح محلل الجسيمات النانوية الذي تمت مناقشته في هذه الورقة للمستخدم بالتغلب على العديد من القيود المذكورة في الجدول 1 والجدول 2 78،79،80،81،82،83،84،85،86،87،88،89،90. لا تتطلب هذه الطريقة استخدام تقنيات العزل ، مما سيساعد في التغلب على انخفاض إنتاجية المركبات الكهربائية. تسمح هذه الطريقة أيضا للمستخدم بتحليل بروتينات السطح والبضائع ، وإجمالي عدد المركبات الكهربائية ، وحجم EV من حجم عينة لا يقل عن 1 ميكرولتر. يتم ذلك باستخدام رقائق التتراسبانين التي توفرها الشركة التي تستخدم مصفوفة دقيقة للأجسام المضادة مع الأجسام المضادة رباعي السبانين ، CD63 و CD81 و CD9 ، لتحديد المركبات الكهربائية في محلول ، كما هو موضح في الشكل 2. تؤكد الأجسام المضادة الفلورية وجود المركبات الكهربائية بالإضافة إلى منع الجسيمات الملوثة من تحريف النتائج.

الهدف العام لهذه التقنية هو توفير طريقة أقل استهلاكا للوقت لتحليل المركبات الكهربائية وكذلك تحليل المركبات الكهربائية من حجم صغير من العينة. يتيح استخدام محلل الجسيمات النانوية هذا للمستخدمين تحليل الحجم وعدد الجسيمات الإجمالي والبروتينات السطحية من أقل من 1 ميكرولتر من العينة ، وهو مثالي للسوائل البيولوجية مثل الدموع واللعاب.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الدراسات الموصوفة التزمت بإعلان هلسنكي. تم الحصول على موافقة خطية من كل موضوع قبل إدراجه في الدراسة. تم استلام موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) من مستشفى جامعة آرهوس (1-10-72-77-14) ومعهد دين ماكجي (1576837-2) وفقا للإرشادات الفيدرالية والمؤسسية. قبل المعالجة ، تم إلغاء تحديد جميع عينات المسيل للدموع واللعاب. تمت مراجعة جميع الدراسات والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية الإقليمي لشمال تكساس (# 2020-030). يلتزم البروتوكول التالي بجميع الإرشادات وقد تمت الموافقة عليه ، كما هو مذكور أعلاه.

1. اليوم 1: تحضير العينة والحضانة

  1. اجمع عينة (عينات) السوائل البيولوجية ، أي الدموع واللعاب من شخص (عينات) أو قم بإذابة العينة (العينات) من الفريزر.
    1. الدموع: اجمع الدموع بشكل سلبي من الغضروف المفصلي الجانبي باستخدام أنبوب شعري زجاجي.
      1. ضع الأنبوب الشعري الزجاجي على الجفن السفلي ، مع الحرص على عدم لمس القرنية.
      2. اجمع حجما قدره 10 ميكرولتر من الدموع في غضون 10 دقائق.
      3. استخدم الدموع على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    2. اللعاب: اجمع اللعاب من سيلان اللعاب السلبي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل
      1. اسمح للمتبرع بتجميع اللعاب في فمه.
      2. اطلب من المتبرع أن يسيل لعابه في الأنبوب بقمع.
      3. استخدم اللعاب على الفور أو خزنه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. ضع شريحة (رقاقة) التتراسبانين في لوحة غسالة الرقائق لمدة 15 دقيقة قبل إضافة عينات للسماح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة. أثناء وضع الرقائق في البئر ، تأكد من أن الأرقام على الجانب السفلي متجهة لأعلى وأن الشريحة (الشرائق) لا تلمس الجدران الجانبية للبئر (البئر).
  3. سجل رقم المعرف ورقم الشريحة في دفتر الملاحظات لتتبع الشريحة (الشريحة).
  4. قم بتوصيل الناقل التسلسلي العالمي (USB) الذي يأتي مع المجموعة، وقم باستخراج المجلد الذي يحتوي على رقم المجموعة المقترن وحفظه في منطقة معينة من اختيارك.
  5. الماصة 99 ميكرولتر من المحلول B في أنبوب سعة 1.5 مل.
  6. أضف 1 ميكرولتر من السائل البيولوجي إلى أنبوب 1.5 مل المحضر في الخطوة السابقة.
  7. تدور الأنابيب.
  8. خذ 70 ميكرولتر من المحلول من الخطوة 1.6 وقم بوضع الماصة على شريحة التتراسبانين.
  9. ضع الفيلم على لوح غسيل الرقائق لمنع العينة من التبخر.
  10. احتضن لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) على مقعد خال من الاهتزاز.

2. اليوم 2: غسل الرقائق

  1. قم بتشغيل غسالة الرقائق.
  2. قم بإزالة الفيلم من الخطوة 1.9 من اللوحة.
  3. ضع اللوحة في غسالة الرقائق ، وتأكد من تثبيتها في مكانها ، وأغلق الغطاء.
    ملاحظة: لن تتحرك اللوحة بسهولة إذا تم تثبيتها في مكانها بشكل صحيح.
  4. اضغط على خيار CW-TETRA v0 في غسالة الرقائق.
  5. حدد صف البداية وعدد الصفوف المراد غسلها.
  6. اضغط على متابعة في الغسالة ذات الرقائق.
  7. أثناء غسل الشريحة (الشرائق) ، قم بإعداد محلول الحجب الذي يحتوي على الأجسام المضادة في أنبوب على النحو التالي:
    1. تحضير 300 ميكرولتر من محلول الحجب لكل شريحة.
    2. أضف 0.6 ميكرولتر أو كل جسم مضاد لكل شريحة (الدوامة والأجسام المضادة للدوران قبل إضافتها إلى محلول الحظر)
    3. دوامة محلول الحجب + كوكتيل الأجسام المضادة.
      ملاحظة: قم بتغطية محلول الحجب + كوكتيل الأجسام المضادة من الضوء لضمان استقرار الجسم المضاد. يجب أن يتم ذلك في يوم الاستخدام.
  8. عندما تغرد غسالة الرقائق ، أضف 250 ميكرولتر من محلول الحجب + كوكتيل الأجسام المضادة أعلى الشريحة (الشريحة).
  9. أغلق الغطاء واضغط على متابعة.
    ملاحظة: ستقوم غسالة الرقائق الآن بعمل حضانة 1-h جنبا إلى جنب مع عدة جولات إضافية من الغسيل والشطف.
  10. عندما تغرد غسالة الرقائق ، قم بإزالة لوحة غسيل الرقائق وحرك الشريحة (الشرائق) لأعلى المنحدر.
  11. ضع اللوحة مرة أخرى في غسالة الرقائق ، وتأكد من تثبيتها في مكانها. أغلق الغطاء واضغط على متابعة.
  12. عندما تكمل غسالة الرقائق البرنامج ، قم بإزالة اللوحة وضع الشريحة (الشرائح) على منشفة ورقية. قم بتغطية الشريحة (الشرائق) من الضوء.

3. اليوم 2: مسح الشريحة (الشريحة)

  1. قم بتشغيل الماسح الضوئي وافتح برنامج المسح.
    ملاحظة: سيخضع الماسح الضوئي لفحوصات ذاتية للإشارة إلى ما إذا كانت هناك أي أخطاء أو ما إذا كان يمكن متابعة المسح.
  2. حدد حفظ المجلد واختر الموقع لحفظ الملفات.
  3. حدد مجلد ChipFile واختر المجلد المحفوظ في الخطوة 1.4.
  4. حدد خيار القائمة المنسدلة لاختيار كل شريحة وتحديد موقعها في موضع الرقاقة على الظرف. كرر هذه الخطوة لجميع الرقائق التي تحتاج إلى مسحها ضوئيا.
  5. قم بتشغيل التألق بالنقر فوق المربعات الثلاثة أسفل موضع الشريحة. ستتحول المربعات إلى اللون الأصفر والأزرق والأحمر على التوالي.
  6. قم بإزالة غطاء الظرف بالضغط على الغطاء لأسفل واسحبه.
  7. ضع الشريحة (الشريحة) على الظرف ، مع التأكد من تأمينها بإحكام.
  8. ضع غطاء الظرف مرة أخرى عن طريق وضع الأوتاد في الثقوب ، واضغط لأسفل ، وحرك الغطاء لتثبيته في مكانه.
  9. ضع الظرف على المسرح ، وتأكد من تثبيته في مكانه.
  10. حدد Scan Chips.
  11. حدد موافق.
  12. بمجرد أن تنتقل المرحلة بالكامل إلى الجهاز ، أغلق الباب.
    ملاحظة: يستغرق مسح شريحة واحدة حوالي 12 دقيقة.
  13. بمجرد الانتهاء من البرنامج ، قم بمسح الشريحة (الشريحة) ، افتح الباب لإخراج فحص المرحلة لمعرفة ما إذا كانت عمليات الفحص ناجحة.
    1. إذا نجحت عمليات المسح ، فتخلص من الشريحة (الشريحة) وضع المجموعة التالية من الرقائق على الظرف ، أو أعد ظرف الظرف الفارغ إلى المسرح. ثم اخرج من البرنامج وقم بإيقاف تشغيل الجهاز عند الانتهاء.
    2. إذا لم تنجح عمليات الفحص ، فابحث عن رمز الخطأ وقم بتصحيح الخطأ.

4. معالجة البيانات

  1. افتح برنامج التحليل.
  2. حدد Prescan Data واختر المجلد الذي يحتوي على الفحص من اليوم 2 الخطوة 3.2.
  3. حدد التالي.
  4. قم بتسمية الشريحة (الشريحة) في عمود اسم العينة باسم العينة بالنقر فوق الخلية وكتابة معرف العينة.
  5. بعد ذلك ، قم بتسمية tetraspanins في عمود اسم القناة . أحمر = CD63 ، أخضر = CD81 ، وأزرق = CD9.
  6. حدد التالي.
  7. حدد High CV من مجموعة Select Spot لفحص المربع المنسدل وإيقاف تشغيل السير الذاتية العالية لكل شريحة عن طريق تعطيل نقطة أو نقطتين.
  8. بعد ذلك، حدد ارتفاع العدد وحاول إيقاف تشغيل تحذيرات العدد المرتفع.
    ملاحظة: قد تحتوي بعض العينات على عدد كبير جدا ، ولكن لا يزال من الممكن تحليلها.
  9. حدد جميع البقع من القائمة المنسدلة ، وحدد Spot Montage ، وتحقق بصريا من كل شريحة بحثا عن أي تشوهات أو خدوش قد تكون موجودة.
  10. حدد التالي.
  11. في قناة CD63 ، اضبط الحد الأدنى على 300 للتخلص من الخلايا الحمراء في صف متوسط ٪ مضمنة ؛ الخلايا الصفراء جيدة ، وتنتقل إلى قناة CD81. إذا لم يؤد تعيين الحد الأدنى للقيمة إلى 300 إلى تغيير الخلية الحمراء إلى اللون الأصفر أو الأبيض، فانتقل إلى الخطوة 4.14 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
  12. في قناة CD81 ، اضبط الحد الأدنى على 300 للتخلص من الخلايا الحمراء في صف متوسط ٪ مضمنة ؛ الخلايا الصفراء جيدة ، وتنتقل إلى قناة CD9. إذا لم يؤد تعيين الحد الأدنى للقيمة إلى 300 إلى تغيير الخلية الحمراء إلى اللون الأصفر أو الأبيض، فانتقل إلى الخطوة 4.14 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
  13. في قناة CD9 ، اضبط الحد الأدنى على 400 للتخلص من الخلايا الحمراء في صف متوسط ٪ مضمنة ؛ الخلايا الصفراء جيدة ، وانتقل إلى الخطوة 4.15. إذا لم يؤد تعيين الحد الأدنى للقيمة إلى 400 إلى تغيير الخلية الحمراء إلى الأصفر أو الأبيض، فانتقل إلى الخطوة 4.14 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
  14. استكشاف الاخطاء
    1. زيادة الحد الأدنى للقيمة بمقدار 100 وحدة.
    2. إذا لم تنجح الخطوة 4.14.1 ، فحدد الشريحة في قسم Pick Chips to Work on واختر الشريحة. حدد عدد الجسيمات وقم بتعطيل النقطة (البقع) التي تحتوي على عدد جسيمات مرتفع. حدد Intensity/Size، وحدد All Chips، وتحقق مما إذا كان هذا يحل المشكلة.
    3. إذا لم تنجح الخطوة 4.14.2 ، فحدد الشريحة الموجودة في قسم Pick Chips to Work on واختر الشريحة. حدد Single-Chip-Breakoffs وقم بزيادة الحد الأدنى بمقدار 100 وحدة. ثم حدد جميع الرقائق لمعرفة ما إذا كانت الخلية الحمراء صفراء الآن. إذا لم يفلح ذلك، كرر هذه الخطوة حتى تصبح الخلية المضمنة في المتوسط الآن صفراء أو بيضاء.
  15. حدد التالي.
  16. قم بإلغاء تحديد قناة المراسلة الفورية.
  17. قم بتعيين قيمة خريطة التمثيل اللوني في الزاوية اليمنى السفلية لتضمين جميع الجسيمات وحدد إضافة مخطط إلى التقرير.
    1. اضبط الحد الأقصى للرقم في المربع المنسدل وأدخل قيمة يدويا.
  18. بعد ذلك ، حدد القائمة المنسدلة في المنتصف العلوي ضمن Capture Probes وحدد CD63.
  19. حدد إضافة مخطط إلى التقرير لإضافة إجمالي عدد الجسيمات إلى التقرير.
  20. حدد القائمة المنسدلة ضمن وضع التحليل، واختر Colocalization، وإضافة مخطط إلى التقرير.
  21. بعد ذلك، حدد الحجم، وحدد تغيير طريقة العرض إلى المخطط، وحدد إضافة مخطط إلى التقرير.
  22. أخيرا ، حدد الصور وحدد إضافة مؤامرة إلى التقرير.
  23. كرر الخطوات من 4.18 إلى 4.22 ل CD81 و CD9 ، مع التأكد من إلغاء تحديد قناة المراسلة الفورية في كل مرة.
  24. بمجرد إضافة كافة العناصر إلى التقرير، حدد تصدير التقرير، وتأكد من حفظه في الملف الصحيح، وحدد المجلد.
    ملاحظة: تم إنشاء ملفات وصور Excel ويمكن استخدامها الآن لمزيد من التحليل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند تحليل البقع الموجودة على الرقائق ، استهدف التركيز الأمثل للمركبات الكهربائية من خلال مراقبة المركبات الكهربائية المصنفة بالفلورسنت في قنوات CD63 و CD81 و CD9 ، ويجب أن تظل قناة MIgG30،91 سوداء ، حيث أن هذه هي قناة التحكم كما هو موضح في الشكل 3 أ. سيتم تقليل CD81 للسوائل البيولوجية. إذا لم يكن هناك مضان في قنوات CD63 و CD81 و CD9 ، فهناك غياب للمركبات الكهربائية (الشكل 3 ب). احرص على عدم الإفراط في تشبع الرقاقة (الشكل 3 ج). سيجعل هذا من الصعب على برنامج التحليل حساب دقة الحجم وإجمالي عدد الجسيمات والأنماط الظاهرية للمركبات الكهربائية. من نقاط التركيز الأمثل ، سيكون برنامج التحليل قادرا على قياس الحجم (50-200 نانومتر) ، وإجمالي عدد الجسيمات ، وتعبير رباعي السبانين للمركبات الكهربائية (الشكل 4) وسيتم تصديره إلى جداول بيانات فردية لمزيد من التحليل. سيشمل تحليل التتراسبانين تحديد موقع البروتينات السطحية على المركبات الكهربائية. وسيمثل التحديد المشترك بحرف "/"، على سبيل المثال، "CD63/CD81". هذا لا يعني أن CD63 و CD81 مجتمعان. هذا يعني أن كلا من CD63 و CD81 يقعان على سطح EV.

ستوفر هذه النتائج نظرة ثاقبة بين العينات السليمة والمريضة. سنكون قادرين على تحديد ما إذا كانت العينات الصحية أو العينات المريضة تنتج المزيد من المركبات الكهربائية ، والمركبات الكهربائية الأكبر أو الأصغر ، والنمط الظاهري للمركبات الكهربائية. يمكن أن تلعب أي من هذه الخصائص أو جميعها دورا في التكوين الحيوي للمرض و / أو تطوره. بهذه النتائج ، سنكون قادرين على معرفة ما إذا كان هناك غياب أو زيادة في مستويات التتراسبانين ، والتي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لعمليات الخلايا وتشكيل المركبات الكهربائية.

figure-results-1
الشكل 1: أنواع وأحجام المركبات الكهربائية المختلفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تخطيطي لكيفية التقاط رقائق التتراسبانين للمركبات الكهربائية واكتشافها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحسين تركيزات المركبات الكهربائية. (أ) التركيز الأمثل للمركبات الكهربائية. (ب) النتيجة السلبية: لا توجد مركبات كهربائية. (ج) تشبع المركبات الكهربائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة محلل الجسيمات النانوية. (أ) حجم قطر EV يقاس بالنانومتر. (ب) إجمالي عدد الجسيمات للمركبات الكهربائية. (ج) النمط الظاهري المتمركز EV. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تقنيهمزاياالقيود
جهاز طرد مركزي فائقنقاء عالي42,43تغييرات مورفولوجيا EV42،44
التجانس42، 45يتطلب حجما كبيرا42,44,46
وظائف42,43غاليالثمن 42,43
قياس التدفق الخلويتقييم العينات في نقاط زمنيةمتعددة 47إشارة ضعيفة48,49
نقاط نهاية متعددة47,50انسداد المسام51
تحليل EV واحد عاليالإنتاجية 52,53
الطرد المركزي المتدرج للكثافةإنتاج عينات عالية النقاء54العمالة المكثفة55,56
مجموعة متنوعة من العينات55,57تستغرق وقتاطويلا 55,58 
خسارة كبيرة في الغلة54
ترسببسيط59,60التلوث36,44,61
سريع61,62غير محدد63
عائد مرتفع44،59،62
درجة الحموضة المحايدة36
الترشيحبسيط64 فخ الإكسوسومات65
سريع64أضرار الحويصلات الكبيرة36
غير مكلفة64فلتر كيك66,67
انسداد الإكسوسوم65

الجدول 1: مزايا وقيود تقنيات عزل المركبات الكهربائية. قائمة بالطرق المختلفة لعزل المركبات الكهربائية ، بما في ذلك مزاياها وقيودها.

تقنيهمزاياالقيود
تشتت الضوء الديناميكيقياس الجسيمات التي يتراوح حجمها من 1 نانومتر إلى 6 ميكرومتر78 غير مناسب لقياس عينات الإكسوسوم المعقدة ذات النطاق الكبير79 
الحد الأدنى هو 10 نانومتر مناسب لأنظمة التشتتالأحادي 79 غير قادر على التمييز بين البروتينات الملوثة والإكسوسومات79
الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM)لاحظ مورفولوجيا الإكسوسومات79،80 مستحضرات العينات المعقدة79 
مراقبة الهيكل الداخلي81 غير قادر على تمييز الإكسوسومات بناء على الحجم والشكل بسبب إشارات التألق المبالغ فيها82 
تحليل تتبع الجسيمات النانويةقياس تركيز وحجم وتوزيع الإكسوسومات في نطاق 10 نانومتر إلى 2 ميكرومتر78 لا يمكن التمييز بين المركبات الكهربائية ومجاميع البروتين والملوثات الأخرى83 
تحضير وقياس العينةبسرعة 78,84أداة NTA باهظةالثمن 85 
يمكن استرداد العينات في شكل أصلي84 حساسة للاهتزازات85
ويسترن بلات (WBs)يمكن تحليل بروتينات العلامات نوعيا وكميا79،86 معقدة وتستغرق وقتاطويلا 79 
تحليل الإكسوسومات من وسائط زراعة الخلايا79 قد تحتوي عزلات EV على بروتينات دهنية وملوثات أخرى86 
قياس التدفق الخلويحساسية أعلى وتصوير عالي الدقة لتستغرق وقتا طويلا وشاقة مع حد الكشف 400 نانومتر79,88 
تمييز الإكسوسومات الملطخة عن الاحتواء87 
تركيز العينة المنخفضالمطلوب 79 الإشارات الضوئية تعيق الدقة والدقة88 
إكسوفيوقياس رباعي الإسبانين (CD9 و CD63 و CD81) على الإكسوسومات89 لا يقيس أحجام المركبات الكهربائية الأكبر75
يقيس بروتينات شحن EV90

الجدول 2: مزايا وقيود تقنيات توصيف المركبات الكهربائية.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول في التأكد من تحقيق التركيز الأمثل للمركبات الكهربائية. يجب أن يكون هناك عدد كاف من المركبات الكهربائية للحصول على قراءة ، ولكن ليس هناك الكثير من المركبات الكهربائية التي ستفرط في تشبع الشريحة. أفضل طريقة لتحديد التركيز الأمثل للمركبات الكهربائية هي إجراء تشغيل تحسين باستخدام 1 ميكرولتر من العينة ومعرفة ما إذا كان التركيز بحاجة إلى تعديل. خطوة حاسمة أخرى هي معرفة ما إذا كانت هناك وفرة من بقايا الخلايا في العينة ، والتي يمكن تحديدها من خلال عرض أجزاء كبيرة على الرقائق في برنامج التحليل. إذا كانت العينة تحتوي على حطام خلية ، فإن الطرد المركزي البسيط أو التصفية للعينة يجب أن يحل هذه المشكلة.

تتمثل الخطوة الحاسمة الإضافية في التأكد من أن الشريحة (الشرائق) لا تلمس جدران البئر وتجنب ملامسة المنطقة المركزية للشريحة (الشرائق) عند وضعها في المنحدر. سيقرأ الماسح الضوئي من المربع الموجود في وسط الشريحة ، لذلك من الضروري تجنب لمس تلك المنطقة بالملقط لمنع تعطيل المركبات الكهربائية.

تحتوي هذه الطريقة على بعض القيود مثل عدم كفاية تركيز المركبات الكهربائية للكشف عنها بواسطة الأداة. يمكن تحسين التركيز إما عن طريق تجفيف العينة أو استخدام أنبوب مكثف. قيد آخر هو أن برنامج التحليل يقيس فقط المركبات الكهربائية في حدود 50-200 نانومتر ، باستثناء بعض الحويصلات الدقيقة وجميع أجسام موت الخلايا المبرمج من قياسات الحجم75.

هناك العديد من الطرق للعزل (الجدول 1 42،43،44،45،46،47،48،49،50،51،52 ، 53،54،55،56،57،58 ،59،60 ، 61،62،63،64،65،66،67) وتحليل المركبات الكهربائية (الجدول 2 78،79،80،81،82،83،84،85 ،86،87،88،89،90) ، والمعيار الذهبي الحالي لعزل EV هو الطرد المركزيالفائق 36،37،38لتكبيل الخلايا للمقايسات مثل Western Blots68،69،70و PCR71،72،73،74 ،75,76. في حين أن هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع العينات الكبيرة42،44،46 ، فإن الحصول على السوائل البيولوجية قد يكون أمرا صعبا ، وغالبا ما يمكن جمع كمية صغيرة فقط من العينات في وقت واحد ، وهو أمر غير مثالي للطرد المركزي الفائق. في المقابل ، يتيح استخدام محلل الجسيمات النانوية هذا للمستخدم إنشاء بيانات قيمة ، مثل الحجم وإجمالي عدد الجسيمات والنمط الظاهري للمركبات الكهربائية ، في أقل من 1 ميكرولتر من العينة ، مما يجعلها مثالية للسوائل البيولوجية. سنكون قادرين على توسيع المعرفة بالمركبات الكهربائية من كميات صغيرة من العينات التي يصعب استخراجها ، مما قد يزيد من راحة المريض وربما يجد أهدافا علاجية محتملة لمختلف الأمراض والاضطرابات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر المعاهد الوطنية للصحة على التمويل (EY031316 و EY034714). نود أيضا أن نشكر UNTHSC و NTERI على مساحة المختبر.

المواد

تقوم

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ChipWasher 100NanoViewEV-CW100باحتضان وغسل وشطف وتجفيف رقائق التتراسبانين. لم يعد هذا النموذج الحالي متاحا. السعر وقت الشراء: $9,995.00 
يقوم برنامج ExoView AnalyzerNanoViewN / Aبتحليل معلومات الرقاقة وإنتاج ملفات Excel لمزيد من التحليل. لم يعد متاحا.
ExoView R100NanoViewEV-R100يستخدم لمسح رقائق tetraspanin ب 3 أطوال موجية. لم يعد هذا النموذج الحالي متاحا. السعر وقت الشراء:  $110,000.00
برنامج ExoView ScannerNanoView N/ Aيقوم بمسح الرقائق في 3 أطوال موجية مختلفة. لم يعد متاحا.
مجموعات Tetraspanin البشريةمختبرات UnchainedEV-TETRA-Cتشتمل على 8 رقائق تتراسبانين ، ومحلول حضانة ، ومحلول حجب ، وجسم مضاد CD63 ، وجسم مضاد CD81 ، وجسم مضاد CD9 ، والمحلول A ، والمحلول B ، و USB ، وغطاء اللوحة.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Radler, J., Gupta, D., Zickler, A., Andaloussi, S. E. Exploiting the biogenesis of extracellular vesicles for bioengineering and therapeutic cargo loading. Mol Ther. 31 (5), 1231-1250 (2023).
  3. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 113961(2021).
  4. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  6. Zhang, H., et al. Exosome-induced regulation in inflammatory bowel disease. Front Immunol. 10, 1464(2019).
  7. Barzin, M., et al. Application of plant-derived exosome-like nanoparticles in drug delivery. Pharm Dev Technol. 28 (5), 383-402 (2023).
  8. Zhou, C., et al. Stem cell-derived exosomes: emerging therapeutic opportunities for wound healing. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 107(2023).
  9. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), aau6977(2020).
  10. Mondal, J., et al. Hybrid exosomes, exosome-like nanovesicles and engineered exosomes for therapeutic applications. J Control Release. 353, 1127-1149 (2023).
  11. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  12. Paul, N., Sultana, Z., Fisher, J. J., Maiti, K., Smith, R. Extracellular vesicles- crucial players in human pregnancy. Placenta. 140, 30-38 (2023).
  13. Zaldivia, M. T. K., McFadyen, J. D., Lim, B., Wang, X., Peter, K. Platelet-derived microvesicles in cardiovascular diseases. Front Cardiovasc Med. 4, 74(2017).
  14. Tamasi, V., Nemeth, K., Csala, M. Role of extracellular vesicles in liver diseases. Life (Basel). 13 (5), 1117(2023).
  15. Fu, Y., et al. Emerging understanding of apoptosis in mediating mesenchymal stem cell therapy. Cell Death Dis. 12 (6), 596(2021).
  16. Santavanond, J. P., Rutter, S. F., Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. H. Apoptotic bodies: Mechanism of formation, isolation and functional relevance. Subcell Biochem. 97, 61-88 (2021).
  17. Yu, L., et al. Apoptotic bodies: bioactive treasure left behind by the dying cells with robust diagnostic and therapeutic application potentials. J Nanobiotechnology. 21 (1), 218(2023).
  18. Momen-Heravi, F., Getting, S. J., Moschos, S. A. Extracellular vesicles and their nucleic acids for biomarker discovery. Pharmacol Ther. 192, 170-187 (2018).
  19. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  20. Grange, C., Bussolati, B. Extracellular vesicles in kidney disease. Nat Rev Nephrol. 18 (8), 499-513 (2022).
  21. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends Cell Biol. 25 (6), 364-372 (2015).
  22. Iannotta, D. A. A., Kijas, A. W., Rowan, A. E., Wolfram, J. Entry and exit of extracellular vesicles to and from the blood circulation. Nat Nanotechnol. 19 (1), 13-20 (2024).
  23. Saint-Pol, J., Gosselet, F., Duban-Deweer, S., Pottiez, G., Karamanos, Y. Targeting and crossing the blood-brain barrier with extracellular vesicles. Cells. 9 (4), 851(2020).
  24. Alberro, A., Iparraguirre, L., Fernandes, A., Otaegui, D. Extracellular vesicles in blood: Sources, effects, and applications. Int J Mol Sci. 22 (15), 8163(2021).
  25. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  26. Thangaraju, K., Neerukonda, S. N., Katneni, U., Buehler, P. W. Extracellular vesicles from red blood cells and their evolving roles in health, coagulopathy and therapy. Int J Mol Sci. 22 (1), 153(2020).
  27. Li, C., et al. Cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles after spinal cord injury promote vascular regeneration via PI3K/AKT signaling pathway. J Orthop Translat. 39, 124-134 (2023).
  28. Deng, Y., et al. Phosphoproteome analysis of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in primary central nervous system lymphoma. Analyst. 148 (15), 3594-3602 (2023).
  29. Hirschberg, Y., et al. Proteomic comparison between non-purified cerebrospinal fluid and cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles from patients with Alzheimer's, Parkinson's and Lewy body dementia. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12383(2023).
  30. Hefley, B. S., et al. Revealing the presence of tear extracellular vesicles in Keratoconus. Exp Eye Res. 224, 109242(2022).
  31. Cross, T., et al. RNA profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  32. Ma, H., et al. Metabolic signatures of tear extracellular vesicles caused by herpes simplex keratitis. Ocul Surf. 31, 21-30 (2024).
  33. Han, P., Bartold, P. M., Ivanovski, S. The emerging role of small extracellular vesicles in saliva and gingival crevicular fluid as diagnostics for periodontitis. J Periodontal Res. 57 (1), 219-231 (2022).
  34. Han, P., Li, X., Wei, W., Ivanovski, S. Saliva diagnosis using small extracellular vesicles and salivaomics. Methods Mol Biol. 2588, 25-39 (2023).
  35. Reseco, L., et al. Characterization of extracellular vesicles from human saliva: Effects of age and isolation techniques. Cells. 13 (1), 95(2024).
  36. Tiwari, S., Kumar, V., Randhawa, S., Verma, S. K. Preparation and characterization of extracellular vesicles. Am J Reprod Immunol. 85 (2), e13367(2021).
  37. Tomiyama, E., Fujita, K., Nonomura, N. Urinary extracellular vesicles: Ultracentrifugation method. Methods Mol Biol. 2292, 173-181 (2021).
  38. Xu, K., Jin, Y., Li, Y., Huang, Y., Zhao, R. Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research. Front Chem. 10, 844124(2022).
  39. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  40. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  41. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  42. Ansari, F. J., et al. Comparison of the efficiency of ultrafiltration, precipitation, and ultracentrifugation methods for exosome isolation. Biochem Biophys Rep. 38, 101668(2024).
  43. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  44. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  45. Le Roy, A., et al. AUC and small-angle scattering for membrane proteins. Methods Enzymol. 562, 257-286 (2015).
  46. Chhoy, P., Brown, C. W., Amante, J. J., Mercurio, A. M. Protocol for the separation of extracellular vesicles by ultracentrifugation from in vitro cell culture models. STAR Protoc. 2 (1), 100303(2021).
  47. McDorman, K. S., Chan, C., Rojko, J., Satterwhite, C. M., Morrison, J. P. Chapter 7 - Special Techniques in Toxicologic Pathology. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology (Third Edition). , Academic Press. (2013).
  48. Woud, W. W., et al. An imaging flow cytometry-based methodology for the analysis of single extracellular vesicles in unprocessed human plasma. Commun Biol. 5 (1), 633(2022).
  49. Gul, B., Syed, F., Khan, S., Iqbal, A., Ahmad, I. Characterization of extracellular vesicles by flow cytometry: Challenges and promises. Micron. 161, 103341(2022).
  50. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-based screening using high-throughput flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
  51. Safford, H. R., Bischel, H. N. Flow cytometry applications in water treatment, distribution, and reuse: A review. Water Res. 151, 110-133 (2019).
  52. Kobayashi, H., et al. Precise analysis of single small extracellular vesicles using flow cytometry. Sci Rep. 14 (1), 7465(2024).
  53. Welsh, J. A., et al. A compendium of single extracellular vesicle flow cytometry. J Extracell Vesicles. 12 (2), e12299(2023).
  54. Carnino, J. M., Lee, H. Extracellular vesicles in respiratory disease. Adv Clin Chem. 108, 105-127 (2022).
  55. Sun, Y., Sethu, P. Low-stress microfluidic density-gradient centrifugation for blood cell sorting. Biomed Microdevices. 20 (3), 77(2018).
  56. Strachan, B. C., Xia, H., Voros, E., Gifford, S. C., Shevkoplyas, S. S. Improved expansion of T cells in culture when isolated with an equipment-free, high-throughput, flow-through microfluidic module versus traditional density gradient centrifugation. Cytotherapy. 21 (2), 234-245 (2019).
  57. Malvezzi, H., Sharma, R., Agarwal, A., Abuzenadah, A. M., Abu-Elmagd, M. Sperm quality after density gradient centrifugation with three commercially available media: a controlled trial. Reprod Biol Endocrinol. 12, 121(2014).
  58. Sun, Y., Sethu, P. Microfluidic adaptation of density-gradient centrifugation for isolation of particles and cells. Bioengineering (Basel). 4 (3), 67(2017).
  59. Karttunen, J., et al. Precipitation-based extracellular vesicle isolation from rat plasma co-precipitate vesicle-free microRNAs. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1555410(2019).
  60. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  61. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  62. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  63. Konoshenko, M. Y., et al. Isolation of extracellular vesicles from biological fluids via the aggregation-precipitation approach for downstream miRNAs detection. Diagnostics (Basel). 11 (3), 384(2021).
  64. Drozdz, A., et al. Low-vacuum filtration as an alternative extracellular vesicle concentration method: A comparison with ultracentrifugation and differential centrifugation. Pharmaceutics. 12 (9), 872(2020).
  65. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  66. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  67. Helling, A., et al. Investigation of microbial cell deformability by filter cake compressibility using ultrafiltration membranes. Colloids Surf B Biointerfaces. 185, 110626(2020).
  68. Bagci, C., et al. Overview of extracellular vesicle characterization techniques and introduction to combined reflectance and fluorescence confocal microscopy to distinguish extracellular vesicle subpopulations. Neurophotonics. 9 (2), 021903(2022).
  69. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. van Maanen, J. C., et al. A combined western and bead-based multiplex platform to characterize extracellular vesicles. Tissue Eng Part C Methods. 29 (11), 493-504 (2023).
  71. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: Sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  72. Lee, H., He, X., Le, T., Carnino, J. M., Jin, Y. Single-step RT-qPCR for detection of extracellular vesicle microRNAs in vivo: a time- and cost-effective method. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (4), L742-L749 (2020).
  73. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  74. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  75. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. J Extracell Vesicles. 10 (10), e12130(2021).
  76. Salunkhe, S., Basak Dheeraj, M., Chitkara, D., Mittal, A. Surface functionalization of exosomes for target-specific delivery and in vivo imaging, tracking: Strategies and significance. J Control Release. 326, 599-614 (2020).
  77. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Adv Drug Deliv Rev. 179, 114001(2021).
  78. Gurunathan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the isolation, characterization, biological function, and multifarious therapeutic approaches of exosomes. Cells. 8 (4), 307(2019).
  79. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  80. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  81. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  82. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular vesicles: Composition, biological relevance, and methods of study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
  83. Kowkabany, G., Bao, Y. Nanoparticle tracking analysis: An effective tool to characterize extracellular vesicles. Molecules. 29 (19), 4672(2024).
  84. Li, H. Metastatic characteristics of SY86B human gastric carcinoma in athymic nude mice. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 10 (6), 421-423 (1988).
  85. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 2, 80-103 (2021).
  86. Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends Biotechnol. 38 (10), 1066-1098 (2020).
  87. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  88. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. J Extracell Vesicles. 4, 25530(2015).
  89. Breitwieser, K., et al. Detailed characterization of small extracellular vesicles from different cell types based on tetraspanin composition by ExoView R100 platform. Int J Mol Sci. 23 (15), 8544(2022).
  90. An, H. J., Cho, H. K., Song, D. H., Kee, C. Quantitative analysis of exosomes in the aqueous humor of Korean patients with pseudoexfoliation glaucoma. Sci Rep. 12 (1), 12875(2022).
  91. Hefley, B. S., McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Ciolino, J. B., Karamichos, D. Corneal epithelial-stromal constructs to study differences associated with diabetes mellitus. Exp Eye Res. 248, 110100(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Extracellular VesiclesBiological FluidsEV BiomarkersNanoparticle AnalyzerTetraspanin ChipTear SamplesNon Invasive BiomarkersFluorescence DetectionCD63 CD81 CD9Disease Monitoring

مقالات ذات صلة