تعد الطريقة السريعة والدقيقة للكشف عن الملوية البوابية واختبار مقاومة الأدوية مهمة جدا للقضاء على بكفاءة في الممارسة السريرية. يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم منهجية محددة تتضمن تفاعل البوليميراز الكمي للغشاء المخاطي في المعدة (qPCR) للكشف السريع عن الملوية البوابية ومقاومة المضادات الحيوية.
مقالة منهجية
تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للغشاء المخاطي في المعدة للكشف عن هيليكوباكتر بيلوري ومقاومة المضادات الحيوية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هيليكوباكتر بيلوري هو أحد مسببات الأمراض الرئيسية التي تصيب ما يقرب من نصف سكان العالم وتهدد الصحة العامة بسبب مقاومتها المتزايدة للمضادات الحيوية. إلى جانب ذلك ، فإن هيليكوباكتر بيلوري مسؤول أيضا عن التهاب المعدة المزمن وقرحة المعدة والاثني عشر وسرطان المعدة وسرطان الغشاء المخاطي للأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي في المعدة (MALT). لذلك ، من الضروري إجراء تشخيص دقيق وفي الوقت المناسب لملوية البوابية وتحديد مقاومتها للمضادات الحيوية. في الوقت الحاضر ، تشمل الطرق الحالية لتشخيص الملوية البوابية بشكل أساسي اختبار اليورياز السريع (RUT) ، واختبار تنفس اليوريا (UBT) ، واختبار الأجسام المضادة في الدم ، واختبار المستضد ، وتنظير المعدة ، والثقافة البكتيرية. ومع ذلك ، لا يمكن استزراع البكتيريا من خلال طرق الكشف الخمس الأولى ، ناهيك عن الكشف عن مقاومة الأدوية. تستغرق الثقافة البكتيرية وقتا طويلا ، ولا يمكن إجراء اختبارات حساسية المضادات الحيوية بسرعة وبشكل روتيني. في البيئات السريرية ، يعد التعرف السريع والدقيق على الملوية البوابية وقابليتها للتأثر بالمضادات الحيوية أمرا بالغ الأهمية للتخلص منه بشكل فعال. الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد نهج مستهدف يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) على عينات الغشاء المخاطي في المعدة لتسريع تشخيص الملوية البوابية وتقييم مقاومتها للعوامل المضادة للميكروبات. تم استغلال qPCR للكشف عن جين ureA لعدوى الملوية البوابية والطفرات في جينات 23S rRNA و gyrA المرتبطة بمقاومة الكلاريثرومايسين والكينولونات ، على التوالي. حاليا ، لا تزال هناك تحديات في الغشاء المخاطي في المعدة qPCR بسبب عدم وجود إجراءات تشغيل قياسية. لذلك ، من الضروري مشاركة المنهجيات مع التفاصيل التجريبية لضمان الاتصال الدقيق للإجراءات التجريبية ، مما يساهم في بروتوكولات المعيار الذهبي التي تتيح قدرا أكبر من الشفافية. بشكل عام ، يقدم هذا البروتوكول بديلا اقتصاديا وسريعا للطرق التقليدية لتقييم عدوى الملوية البوابية وماوومتها للمضادات الحيوية من خلال تطبيق تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).
المقدمة
بكتيريا الملوية البوابية هي بكتيريا سالبة الجرام يمكنها البقاء على قيد الحياة في وجود مستوى منخفض من الأكسجين. ينتمي الكائن الحي إلى العديد من التجمعات الجينية المتميزة ويظهر تنوعا جينيا عاليا. على الرغم من أن الكائن الحي عادة ما يكون حلزونيا ، إلا أنه يمكن تغييره إلى قضيب1. إنه عامل ممرض رئيسي يصيب ما يقرب من 50٪ من سكان العالم2. في الغالب ، تحدث العدوى عندما يظل المرضى حاملين أصحاء أثناء الطفولة ، وتظهر الأعراض في وقت لاحق من مرحلة البلوغ. تم الإبلاغ عن أنه مرتبط بالتهاب المعدة المزمن وقرحة المعدة والاثني عشر وسرطان المعدة والأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي في المعدة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت الدراسة الحالية وفقا للاعتبارات الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الأخلاقية لمستشفى الشعب بمقاطعة قوانغدونغ ، الجامعة الطبية الجنوبية ، قوانغتشو ، الصين (رقم الموافقة: KY2024-1115-01). تم تسجيل المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 18 و 60 عاما في هذه الدراسة. في هذه الدراسة ، تم استبعاد المشاركين إذا كانوا قد تناولوا مؤخرا المضادات الحيوية أو العلاجات العشبية المضادة للبكتيريا أو مثبطات مضخة البروتون (PPIs) أو مضادات مستقبلات H2 خلال أسبوعين قبل الاختبار. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأفراد الذين خضعوا للعلاج المضاد ل H. pylori خلال الأشهر الثلاثة الماضية ، أو أولئك الذين يعانون من مشاكل قلبية أو كبدية أو كلوية كبيرة أو اعت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقييم عدوى الملوية البوابية ومقاومة المضادات الحيوية في أنسجة المعدة عن طريق qPCR
تم إجراء فحوصات qPCR لتحديد الملوية البوابية عن طريق استهداف جين ureA ، وتم التأكد من مقاومة المضادات الحيوية من خلال فحص طفرات محددة في جينات 23S rRNA و gyrA (الجدول 1). وتقع بيانات ضمان الجودة، ممثلة بقيم التصوير المقطعي المحوسب عبر المجموعات الثلاث، ضمن الحدود المقبولة، مما يدل على أن العينات كانت في حالة قياسية وقت الاختبار، مما ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم استغلال الاختبارات التقليدية مثل RUT و UBT والأنسجة والاستزراع وكذلك الأمصال للكشف عن الملوية البوابية. يقدم كل نهج تشخيصي مزايا مميزة ويواجه تحديات محددة اعتمادا على السياق السريري17. غالبا ما تعتبر زراعة الملوية البوابية من خزعات الغشاء المخاطي في المعدة معيارا للتشخيص. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تتطلب عمالة مكثفة ، ودقتها مقيدة بالتحديات التقنية ، والظروف المطلوبة للحضانة ، وإمكانية انخفاض التركيزات البكتيرية. من ناحية أخرى ، يتميز الفحص ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج حضانة NSFC التابع ل GDPH (8220080645) ومشروع صندوق أبحاث العلوم والتكنولوجيا الطبية بمقاطعة قوانغدونغ (A2024108).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حاضنة الحمام | ALLSHENG | MK2000-2 | توفير بيئة درجة حرارة ثابتة |
| خزانة السلامة الحيوية | Haier | HR1500- B2 | |
| جهاز طرد مركزي | ثيرمو فيشر Scientific | THERMO ST16R | الطرد المركزي السائل المتبقي من جدار الأنبوب. |
| Chelex-100 | سيجما | C7901 | المعدة الراتنج |
| بوسطن العلمية كوربوريشن | أخذ عينات من الغشاء المخاطي في المعدة | ||
| هيليكوباكتر بيلوري 23S جين rRNA ومجموعة طفرات الجينات gyrA | Jiangsu Mole Bioscience | CFDA 20223400137 | مجموعة الكشف عن qPCR ل H. البوابية < / em> والجينات المقاومة للأدوية (كلاريثرومايسين وكينولونات) |
| كاشف استخراج الحمض النووي | Jiangsu Mole Bioscience | SEDA 20150076 | لاستخراج الحمض النووي |
| SDS Software | Applied Biosystems | 7300/7500 | تحليل البيانات |
| Thermocylcer | Thermo Fisher Scientific | ABI 7500 | للكشف عن qPCR من H. pylori والجينات المقاومة للأدوية (كلاريثرومايسين والكينولونات) |
| خلاط دوامة | JOANLAB | VM-5005 | لخلط الكاشف |
المراجع
- Sharndama, H. C., Mba, I. E. Helicobacter pylori: an up-to-date overview on the virulence and pathogenesis mechanisms. Braz J Microbiol. 53 (1), 33-50 (2022).
- Ravikumara, M. Helicobacter pylori in children: think before you kill the bug. T....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن