Method Article

القياس الكمي لذبابة الفاكهة سوداء البطن سلوك الاستمالة لتقييم الأنماط الظاهرية للعناية المفرطة

DOI:

10.3791/67708

⸱

March 21st, 2025

 , 
1Simmons University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتضمن الطريقة المعروضة هنا التعليق التوضيحي اليدوي للقطات التي تم الحصول عليها من ذبابة الفاكهة السوداء لسلوكيات العناية الشخصية المحددة. يسمح بتحديد عدد نوبات الحلاقة والوقت الإجمالي الذي تقضيه في الاستمالة لتقييم الأنماط الظاهرية غير النمطية للعناية الذاتية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تطبيق التغييرات التي يمكن ملاحظتها في الاستمالة النمطية بشكل مترجم في الكائنات الحية النموذجية. تمثل هذه التغييرات الأمراض التي تثير انحرافات مماثلة في السلوك البشري. على سبيل المثال ، يعمل الاستمالة المفرطة كبديل لسلوكيات الوسواس والقهري الموجودة في حالات مثل متلازمة توريت أو اضطراب الوسواس القهري. يسمح اختبار الاستمالة المقدم بتقييم الأنماط الظاهرية غير الطبيعية للعناية الذاتية في ذبابة الفاكهة السوداء. يتم تسجيل الذباب لمدة 10 دقائق ، ويتم ملاحظة هذه التسجيلات وتعليقها بشكل أعمى لسلوكيات الحلاقة المحددة مسبقا. يمكن الحصول على المقاييس الكمية لكل من تكرار نوبات الاستمالة والوقت المستغرق في الانخراط في الاستمالة الذاتية عن طريق التعليق التوضيحي يدويا على اللقطات. الاختبار غير مكلف نسبيا ، ويتطلب القليل من المواد غير المتوفرة بالفعل في بيئات المختبر ، ويمكن تكييفه بسهولة ليناسب الاحتياجات المحددة لأي دراسة معينة تهدف إلى مراقبة الاستمالة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المستوى المنخفض من المهارة اللازمة لإجراء الفحص ، مقارنة بالأساليب الآلية الثقيلة في علوم الكمبيوتر ، يجعل البروتوكول مناسبا تماما للمختبرات الصغيرة والطلاب. نناقش بالتفصيل الخطوات المطلوبة لإجراء هذا الاختبار وحدوده الحالية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة السوداء هو كائن حي نموذجي راسخ في الدراسات السلوكية والبيولوجية العصبية ، مما يوفر نظرة ثاقبة للآليات التي تقود السلوكيات البشرية المماثلة. الاستمالة الذاتية في هذا الكائن الحي هي سلوك منظم للغاية ومحدد جيدا ، باتباع أنماط نمطية يمكن تمييزها بسهولة عن بعضهاالبعض 1. يمكن تصنيف سلوكيات الاستمالة المنفصلة التي تظهرها الذبابة بشكل عام حسب المنطقةالتشريحية 2 ، ويمكن تعريفها بسهولة على أنها خلفية أو أمامية. سيركز ذبابة الفاكهة في البداية على المنطقة الأمامية ثم ينتقل لاحقا إلى النهاية الخلفية3. في ظل الظروف النموذجية ، يظهر الذباب سلوكيات العناية الشخصية للحفاظ على النظافة (على سبيل المثال ، عن طريق إزالة الغبار) ويحدث استجابة للتعرض لمنبهات خارجية ضارة محتملة مثل الميكروبات المسببة للأمراض4.

تم استخدام التشوهات في سلوك الاستمالة ، وتحديدا الاستمالة الوسواسية العفوية ، في أنظمة نموذجية مختلفة كمؤشر على السلوك الوسواسي و / أو القهري. أعطت النتائج الانتقالية التي تراقب سلوكيات الاستمالة الوسواسية في الكائنات الحية مثل القوارض والطيور والأنياب نظرة ثاقبة للحالات التي تثير سلوكا قهريا مشابها لدىالبشر 5. وتشمل هذه حالات مثل هوس نتف الشعر واضطراب الوسواس القهري ومتلازمة توريت6. كما تم استخدام سلوك الاستمالة المفرط كمعيار في تقييم الأنماط الظاهرية السلوكية في نماذج حالات النمو العصبي المماثلة في ذبابة الفاكهة السوداء. لوحظت سلوكيات الاستمالة الوسواسية في نماذج الذباب لمتلازمة X الهشة (FSX) واضطراب طيف التوحد المرتبط بها (ASD). يحدث الاستمالة العفوية الزائدة في ظل طفرات dfmr1 ، وهو تقويم العظام للجين المرتبط ب ASD و FSX FMR17. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تغيير ملحوظ في توزيع الاستمالة بين الأطراف الخلفية والأمامية في هذهالطفرات 8. يتم تفسير هذه التغييرات على أنها تعكس السلوكيات الوسواسية والقهرية التي تركز على الجسم التي يظهرها بعض المرضى الذين يعانون من هذه الحالات. باستخدام مقايسة الاستمالة الموصوفة هنا ، لاحظنا سلوكيات الاستمالة في الذباب بعد ضربة قاضية بوساطة الحمض النووي الريبي لجين ذبابة الفاكهة Atg8a الذي تنتجه برامج تشغيل GAL4 المتاحة تجاريا وخطوط UAS-RNAi9.

تتضمن هذه الطريقة التعليق التوضيحي اليدوي للقطات التي تم التقاطها للذباب لسلوكيات العناية الشخصية المحددة. الدراسات السابقة التي تهدف إلى تقييم سلوك الاستمالة ، مثل تلك التي تستخدم طرقا غير مباشرة مثل الأصباغ ، على الرغم من فعاليتها في تحديد فعالية الاستمالة ، إلا أنها لا تسمح بقياس مدة الحلاقة أو التردد10. ومع ذلك ، يسمح هذا الاختبار بالقياس الكمي لتردد ذبابة الفاكهة ومدتها ، بشكل عام وحسب المنطقة التشريحية. تقدم الطريقة المفصلة هنا بعض المزايا مقارنة بالطرق الآلية الحالية ، حيث يمكن تعديلها بسهولة ويمكن إجراؤها من قبل الأفراد الذين يفتقرون إلى خلفية حسابية. مع توفر المعدات المطلوبة بسهولة في معظم المختبرات ، نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة لتقييم وجود نمط ظاهري مفرط للعناية الذاتية (انظر جدول المواد). هذا يجعل الطريقة في متناول المؤسسات الجامعية في المقام الأول ويمكن تكييفها بسهولة مع بيئات التدريب أو مختبرات التدريس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1.

1. التحضير للتصوير

  1. ضع أربعة أطباق من ثلاثة آبار جنبا إلى جنب على سطح أبيض ، وقم بتغطية كل منها بشريحة زجاجية.
  2. ضع الكاميرا (هنا ، نظام Raspberry Pi ، ولكن أي كاميرا قادرة على تصوير فيديو عالي الدقة كافية) فوق الأطباق.
    1. تحقق للتأكد من أن جميع الأطباق في الإطار والتركيز.
    2. تحقق للتأكد من عدم وجود وهج على الشرائح يحد من رؤية الذباب في الطبق. تخلص من الوهج عن طريق ضبط موضع اللوحة أو تعتيم الأضواء في مساحة التسجيل.
    3. استخدم دقة عالية (1920 × 1080 بكسل كحد أدنى) لتصور أطراف الذباب بدقة.
  3. حدد موضع الأطباق والكاميرا على المقعد حيث يتم التسجيل.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى الحد من الوقت المستغرق في الخطوة 2 في الاستخدام المستقبلي للجهاز. سيؤدي إجراء المقايسات في نفس الوقت وفي نفس المكان إلى الحد من التباين في السلوك بناء على عوامل تتجاوز التلاعب المقصود.
  4. قم بتخدير الذباب البالغ من العمر 4-9 أيام برفق مع البرد على كتلة ثلجية مغطاة بالبارافيلم ومنشفة ورقية (سيكون للتخدير CO2 تأثير كبير على السلوك).
    1. اضغط على الذباب على الكتلة ، وبمجرد تخديره ، انقل الذباب إلى غرف المراقبة في أسرع وقت ممكن باستخدام فرشاة الرسم.
      ملاحظة: يجب أن يحدث هذا النقل في أسرع وقت ممكن ، حيث يمكن أن يؤثر التعرض المفرط للتخدير من أي نوع سلبا على الذباب.
  5. ضع ذبابة واحدة في كل بئر.
  6. اسمح للملفات بالتأقلم مع بيئتها الجديدة لمدة 30 دقيقة بعد التخدير. لا تلمس أو تزعج الآبار التي تحتوي على الذباب بعد هذه النقطة ، لأن الضغوطات المضافة ستؤثر على السلوك.

2. تسجيل الذباب

  1. بعد التأقلم لمدة 30 دقيقة ، سجل الذباب باستخدام الكاميرا.
  2. استخدم كاميرا Raspberry Pi التي يتم تشغيلها من خلال PiSpy11 لجمع البيانات السلوكية.
    ملاحظة: البرنامج مجاني ومتاح على GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy) ، ويمكن بسهولة إعداد نظام Pi بأقل من 300 دولار. الكاميرات الأخرى ، إذا كانت متوفرة بالفعل ، كافية أيضا لتسجيل اللقطات
  3. ابدأ التسجيل باستخدام Pi باستخدام تدفق الأوامر التالي.
    1. افتح الجهاز واكتب cd PiSpy. ثم اكتب python3 PiSpy.py ، وأدخل طول التسجيل المطلوب ، وأدخل معدل الإطارات المطلوب. حدد الدقة المطلوبة وانقر فوق Quick Capture.
    2. استخدم وظيفة معاينة الكاميرا للتأكد من أن الذباب في بؤرة التركيز ومرئية بشكل كاف.
  4. سجل الذباب لمدة 10 دقائق بمعدل إطارات موصى به يبلغ 24 إطارا في الثانية واحفظ الملف (يحفظ PiSpy تلقائيا في مجلد مقاطع الفيديو).

3. تحليل الفيديو (الشكل 2)

  1. لتحليل الفيديو ، قم باستيراد الملف إلى برنامج Elan 6.812.
    ملاحظة: هذا البرنامج ، على الرغم من أنه تم تطويره في الأصل للمشنقة اللغوية النفسية للتعليق التوضيحي التفصيلي لمقاطع الفيديو والتحليل المتعمق لسلوكيات الاستمالة
  2. قم بتعيين كل صف كما هو موضح أدناه للتعليق على لقطات الأفراد يدويا.
    1. قم بذلك باستخدام تدفق الأمر التالي: الطبقة > إضافة طبقة جديدة > اكتب الموقع في الطبق على اسم الطبقة > إضافة.
  3. اعتمادا على احتياجات الدراسة ، لاحظ وحدد العديد من السلوكيات المحددة (الاستمالة الأمامية والخلفية ، والمشي ، والنوم ، والوقوف).
    1. قم بعمل التعليقات التوضيحية باتباع الخطوات أدناه.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق الطبقة المراد إضافة تعليقات توضيحية. انقر بزر الماوس الأيمن واسحبه على طول الطبقة المحددة لفترة يتم فيها عرض نوبة حلاقة واحدة. انقر بزر الماوس الأيسر، وحدد تعليق توضيحي جديد وانقر نقرا مزدوجا فوق الفترة الزمنية المميزة حديثا. اكتب اختصار السلوك المعروض في تلك النقطة الزمنية.
    2. راقب مقاطع الفيديو ببطء ، وافركها بالماوس ، وقم بالتعليق عليها. قم بتكبير بئر ذبابة واحدة أثناء التعليق التوضيحي لمنع التحديد الخاطئ للسلوكيات. يمكن أن يشمل ذلك النقر على حافة الزجاج بواسطة الذبابة أو تحريك الساقين ، والتي قد تبدو في البداية وكأنها حلاقة.
  4. بمجرد إضافة تعليق توضيحي بالكامل إلى الفيديو ، احصل على تفصيل لكل سلوك. تأكد من استخدام نفس الاختصار أو التعليق التوضيحي في جميع أنحاء مقاطع الفيديو لاستخدام هذه الميزة.
    ملاحظة: سيوفر Elan 6.8 عدد المرات التي يحدث فيها السلوك ، والمدة الإجمالية للسلوكيات ، ومتوسط الوقت المستغرق في كل سلوك.
    1. حدد نوبات الحلاقة على أنها 2 ثانية من الاستمالة دون انقطاع. حدد كل سلوك لوحظ على النحو التالي. تحديد معلمات المناطق التشريحية قبل إجراء الفحص.
      1. الاستمالة الأمامية: تحديد الاستمالة التي يتم إجراؤها في المنطقة الأمامية من جسم الذبابة على أنها حلاقة أمامية.
        ملاحظة: سيتضمن هذا السلوك دائما حركة فرك على جزء أمامي ، مثل الرأس أو خرطوم ، مع الساقين الأماميتين للذبابة.
      2. الاستمالة الخلفية: تحديد الاستمالة التي يتم إجراؤها في الطرف الأمامي الخلفي لجسم الذبابة على أنها حلاقة خلفية.
        ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك ، تم تضمين الأجنحة في المنطقة الخلفية من أجل البساطة. سيتضمن هذا السلوك دائما حركة فرك مع مجموعة الساقين المركزية والخلفية أثناء التنقل. من المؤشرات الجيدة على حدوث الاستمالة الخلفية أنه للوهلة الأولى ، قد تبدو الذبابة كما لو كانت تفتقد أرجلها الخلفية ، كما هو موضح في الشكل 2 د.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينتج هذا الاختبار بيانات كمية تقيس وقت وتواتر سلوكيات الاستمالة من اللقطات المشروحة. يتم توضيح صورة تمثيلية للإعداد وكيفية تعريف السلوكيات في الشكل 2. بالنظر إلى الذاتية التي أدخلها تحليل الفيديو ، يجب تعمية جميع التعليقات التوضيحية لمقاطع الفيديو عن الباحث الذي يقوم بالتحليل.

تم استخدام هذه الطريقة لتقييم دور ذبابة الفاكهة الجين Atg8a في تطوير سلوك الاستمالة. Atg8a متعامد للجين البشري GABARAP ، والذي أظهر انخفاضا في التعبير في ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بشكل عام ، يسمح هذا الاختبار القابل للتنفيذ بسهولة والفعال من حيث التكلفة بتوصيف قوي لذبابة الفاكهة السوداء سلوك الاستمالة. تعطي هذه التقنية نظرة ثاقبة على التردد والوقت المستغرق في الانخراط والتوزيع التشريحي لعدد كبير من سلوكيات الحلاقة التي تم تحديدها مسبقا. من المؤشرات الجيدة على حدوث الاستمالة أو جارية التغييرات في وضع الساق ، وتحديدا رفع أي من الأرجل الست. يمكن أن يساعد ملاحظة السلوكيات بعد حركة الساق على وجه التحديد في تحديد سلوك الاستمالة. يسمح هذا الاختبار بالتعليقات الت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شكرا لجون يونغ على التعليقات على التصميم التجريبي ، وإريك لوث لمراجعة المخطوطة ، ومادلين هاتفيلد للمساعدة في تصميم الشكل. تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة سيمونز وقسم علم الأحياء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16 جيجابايت بطاقة Micro SDAdafruit1294للاستخدام في تقديم شاشة نظام التشغيل
Adafruit3578أي شاشة يمكن توصيلها بواسطة HDMI أو كابل فليكس كافية
ذبابة الفاكهة Atg8a-RNAi خط UASBloomington Stock Center34340الخط المستخدم في البيانات التمثيلية
ذبابة الفاكهة Ok6 سائقN / AN /A الخط المستخدم في البيانات التمثيلية
شرائح زجاجيةفيشر Scientific12-550-A3تحافظ على الذباب في الاحتواء
خافضات الحرارةAdafruitتمنع ارتفاع درجة حرارة الكمبيوتر
عدسةAdafruit4563تستخدم مع كاميرا عالية الدقة فقط
PiCameraAdafruit4561تم استخدام الإصدار عالي الدقة هنا ولكن يمكن استخدام الكاميرا القياسية في ظل قيود الميزانية
Raspberry pi 4يتم تشغيل Adafruit4292Computer PiSpy على
كابل RibbionAdafruit1648للاستخدام في توصيل مكونات الكاميرا والعرض
SB CaseAdafruit4301يحمي الكمبيوتر
لوحة بقعةFisher ScientificS99406إصدارات Pyrex متاحة بالفعل لاستخدامنا ولكن أطباق زراعة الخلايا أو الألواح الموضعية البلاستيكية كافية أيضا
Best Buy6355959لتعليق الكاميرا وتحديد موقعها ، فإن أي جهاز قادر على ذلك كاف
C Power SupplyAdafruit1995يوفر الطاقة للكمبيوتر
كانت USB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mueller, J. M., Zhang, N., Carlson, J. M., Simpson, J. H. Variation and variability in Drosophila grooming behavior. Front Behav Neurosci. 15, 769372(2022).
  2. Szebenyi, A. L. Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 17 (4), 641-651 (1969).
  3. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).
  4. Ringo, J. M. How do flies keep clean? Head grooming in Drosophila. J Ethol. 38, 167-172 (2020).
  5. Feusner, J. D., Hembacher, E., Phillips, K. A. The mouse who couldn't stop washing: pathologic grooming in animals and humans. CNS Spectr. 14 (9), 503-513 (2009).
  6. Berridge, K. C., et al. Sequential super-stereotypy of an instinctive fixed action pattern in hyper-dopaminergic mutant mice: a model of obsessive compulsive disorder and Tourette's. BMC Biol. 3, 4(2005).
  7. Russo, A., Diantonio, A. Wnd/DLK is a critical target of FMRP responsible for neurodevelopmental and behavior defects in the Drosophila model of Fragile X syndrome. Cell Rep. 28, 2581-2593.e5 (2019).
  8. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  9. Tian, Y., et al. GABA- and acetylcholine-related gene expression in blood correlate with tic severity and microarray evidence for alternative splicing in Tourette syndrome: a pilot study. Brain Res. 1381, 228-236 (2011).
  10. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. 125, e55231(2017).
  11. Morris, B. I., et al. PiSpy: an affordable, accessible, and flexible imaging platform for the automated observation of organismal biology and behavior. PLoS One. 17 (10), e0276652(2022).
  12. ELAN (Version 6.8) [Computer software]. Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. , Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. At https://archive.mpi.nl/tla/elan" (2024).
  13. Müller, N. Tourette's syndrome: clinical features, pathophysiology, and therapeutic approaches. Dialogues Clin Neurosci. 9 (2), 161-171 (2007).
  14. Southall, T. D., Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system: a versatile toolkit for gene expression in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  15. Hatfield, T., Johnson, S. Knockdown of the GABARAP ortholog Atg8a elicits deficits in learning and promotes obsessive behaviors in Drosophila melanogaster. MicroPubl Biol. 2024, (2024).
  16. Bartholomew, N., et al. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  17. Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. Automated forelimb tasks for rodents: current advantages and limitations, and future promise. Neurorehabil Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).
  18. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila GroomingGrooming BehaviorExcessive GroomingManual AnnotationBehavioral QuantificationAtg8a KnockdownNeurodevelopmental DisordersTourette Syndrome ModelELAN SoftwareRNAi Mutants

Related Articles