مقالة منهجية

تحديد أربعة مكونات في نظام توصيل الحمض النووي الريبي للجسيمات الدهنية بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة جنبا إلى جنب مع كاشف تشتت الضوء التبخيري

DOI:

10.3791/67711

⸱

مايو 30, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نؤسس طريقة تحليل كمي لأربعة مكونات في نظام توصيل الحمض النووي الريبي للجسيمات الدهنية النانوية (LNP) باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء جنبا إلى جنب مع كاشف تشتت الضوء التبخيري (ELSD). تتميز الطريقة بفصل جيد وحساسية عالية وكفاءة عالية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة طريقة لتحليل مكونات الجسيمات النانوية الدهنية (LNP). يتكون LNP ، الذي يعمل كناقل محوري للأدوية القائمة على الحمض النووي الريبي ، بشكل أساسي من الكوليسترول ، و PEG مع التعديلات ، والدهون المؤينة ، والدهون المساعدة. تظهر هذه المكونات قطبية ضعيفة ، مما يؤدي إلى الاحتفاظ القوي وصعوبة الفصل باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي ، فضلا عن افتقارها إلى خصائص امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المميزة. من أجل مواجهة هذا التحدي ، تم إقران نظام الكروماتوغرافيا السائلة بكاشف تشتت الضوء التبخيري (ELSD). من خلال الضبط المنهجي لنوع العمود الكروماتوغرافي وتحسين برنامج شطف التدرج للمرحلة المتنقلة ، تم إنجاز فصل خط الأساس السريع والكامل للمكونات الأربعة الحرجة. أدى استخدام أحدث تقنيات ELSD إلى تحسين حساسية الكشف بشكل كبير وتوسيع النطاق الخطي للطريقة. أظهرت النتائج التجريبية أنه ضمن نطاق تركيز من 5 ميكروغرام / مل إلى 250 ميكروغرام / مل ، أظهرت المكونات الأربعة للناقلات الطبيعية الخطية ممتازة مع معاملات ارتباط أكبر من 0.999 ، وتراوحت الدقة من 94.2٪ إلى 108.0٪. في التجارب الدقيقة ، كانت الانحرافات المعيارية النسبية لكل من وقت الاستبقاء ومنطقة الذروة لمحلول قياسي 10 ميكروغرام / مل أقل من 0.1٪ و 2٪ على التوالي. عند استخدام هذه الطريقة لتحليل عينات LNP المختلفة ، يتم فصل جميع المكونات بنجاح ، ويتم تحديد محتوياتها بدقة ، مما يسلط الضوء على القدرة القوية على التكيف لهذا النهج التحليلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) هي واحدة من أكثر أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية تقدما ، وتستخدم بشكل أساسي لتوصيل أدوية الحمض النووي ، مثل قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى ، والنيوكليوتيدات الصغيرة المتداخلة ، و mRNA ، وما إلىذلك 1،2،3. يتكون LNP بشكل عام من أربعة مكونات: الدهون المؤينة ، والدهون المعدلة بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، والفوسفوليبيدات ، والكوليسترول. المكون الرئيسي هو الدهون المؤينة ، والتي تعد العامل الحاسم في كفاءة توصيل أدوية الحمض النووي. يمكن للمكونات الثلاثة الأخرى أن تزيد من استقرار LNP وتقلل من التعرف على جهاز المناعة4،5،6.

يمكن أن تؤثر النسب المتفاوتة للمكونات الأربعة في LNP بشكل كبير على عملية التجميع الذاتي للجسيمات النانوية ، مما يؤثر على خصائص مثل كفاءة تغليف المكون الصيدلاني النشط (API) ، وفعالية توصيله ، ومعدل الإطلاق في الجسم الحي7،8،9. لذلك ، من الضروري إنشاء طريقة تحليل كمي لمكونات LNP ، وبالتالي تسهيل توليف نظام توصيل LNP الأمثل10،11.

الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي تقنية تحليلية معاصرة تستخدم على نطاق واسع في التحليل الصيدلاني وتحظى بتقدير لكفاءتها العالية وحساسيتها وقدراتها على الأتمتة. يشمل HPLC العديد من أجهزة الكشف ، بما في ذلك كاشفات الأشعة فوق البنفسجية التقليدية (UV) ، بالإضافة إلى أجهزة الكشف للأغراض العامة مثل كاشفات معامل الانكسار (RID) ، وكاشفات تشتت الضوء التبخيري (ELSD) ، وكاشفات الهباء الجوي المشحونة (CAD) ، وكاشفات الترددات الراديوية الانتقائية للغاية (RF) ، من بين أمور أخرى12.

في حالة تحليل المكونات الأربعة ل LNP ، والتي تفتقر إلى مجموعات مميزة لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية وبالتالي لا تنتج أي استجابة في كاشفات الأشعة فوق البنفسجية ، تم النظر في استخدام أجهزة الكشف للأغراض العامة. على الرغم من أن RID هو أحد هذه الخيارات ، إلا أنه غير مناسب لتحليل التدرج ويوفر حساسية أقل نسبيا مقارنة بالكاشفين الآخرين للأغراض العامة. ومن ثم ، لم يتم اختياره12. علاوة على ذلك ، في حين أن كاشفات CAD تتميز بحساسية عالية ، فإن تكلفتها الباهظة تجعلها أقل جاذبية12.

وبالتالي ، تم اختيار كاشف ELSD. يتميز هذا الكاشف بخيار وضع كسب مميز - الوضع "العريض" - والذي يتيح التحليل المتزامن لكل من التركيز العالي ومكونات التتبع ، مما يعزز الحساسية ويوسع النطاق الخطي.

تستخدم هذه المقالة نظام HPLC مقترنا ب ELSD ، مما يحقق فصلا فعالا وتحليلا كميا للمكونات الأربعة ل LNP من خلال تحسين الأعمدة الكروماتوغرافية ، وشطف التدرج للمراحل المتحركة ، وشروط أخرى13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الأداة

  1. إعداد الصك
    1. قم بإعداد نظام HPLC مقترنا ب ELSD.
  2. تركيب العمود
    1. قم بتثبيت العمود الكروماتوغرافي (C4-300 ؛ 150 مم × 4.6 مم ID ، 5 ميكرومتر) ، باتباع اتجاه السهم على العمود ، مع توصيل أحد طرفيه بمخرج جهاز أخذ العينات الآلي والآخر بمدخل ELSD.
  3. إعداد المرحلة المتنقلة
    1. تحضير المراحل المتنقلة: مرحلة ، محلول مائي 10 ملي مولار TEAA (الرقم الهيدروجيني = 7.0) ، والمرحلة B ، محلول ميثانول TEAA 10 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني = 7.0).
    2. لتحضير المرحلة A ، قم بوزن 1.01 جم بدقة من ثلاثي إيثيل أمين ، ثم قم بإذابته في 1000 مل من الماء ، واخلطه جيدا ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 مع حمض الخليك.
    3. لتحضير المرحلة B ، قم بإذابة 1.01 جم من ثلاثي إيثيل أمين في 1000 مل من الميثانول ، واخلطه واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الخليك.
  4. تحرير الطريقة
    1. قم بتشغيل مفاتيح الطاقة لكل وحدة من وحدات LC-ELSD وقم بتشغيل برنامج LabSolutions . ثم افتح نافذة التحليل في الوقت الفعلي .
    2. انقر فوق ملف وحدد جديد لإنشاء ملف طريقة جديد. قم بتعديل وقت إيقاف LC في الطريقة إلى 15 وانقر فوق تطبيق على كل وقت الاستحواذ.
    3. ثم انقر فوق مضخة لتعديل معلمات المضخة. حدد وضع التحليل ك تدرج ثنائي عالي الضغط (B.GE) واضبط معدل التدفق على 1.0 مل / دقيقة.
    4. بعد ذلك ، اضبط تركيز المضخة B الأولي (٪ B) على 80٪ وقم بتعديل تدرج الطور المتحرك: عند 3 دقائق ، ٪ B هو 80٪ ، في 4 دقائق ، ٪ B هو 85٪ من 5.5 دقيقة إلى 12 دقيقة ، ٪ B هو 100٪ ، عند 12.1 دقيقة ، ٪ B ترجع إلى 80٪.
    5. بعد ذلك ، انقر فوق Column Oven واضبط درجة حرارة الفرن على 55 درجة مئوية. أخيرا ، انقر فوق ELSD لتعديل درجة حرارة أنبوب الانجراف إلى 40 درجة مئوية. احفظ الطريقة.
      ملاحظة: يرد ملخص المعلمات في الجدول 1.
  5. ابدأ الأداة وقم بتوازنها.
    1. انقر فوق تنزيل وبدء التشغيل لبدء تشغيل الأداة وموازنتها.

2. تحضير الحلول والعينات القياسية

  1. إعداد الحلول القياسية
    1. تزن بدقة 10.0 مجم من المواد القياسية الأربع المكونة ل LNP بشكل منفصل ، وتذوب في 1 مل من الميثانول ، ودوامة حتى تذوب تماما للحصول على محاليل مخزون بتركيز 10 مجم / مل لكل مكون.
    2. باستخدام ماصة، انقل بدقة 100 ميكرولتر من كل محاليل من محاليل المخزون الأربعة إلى قارورة عينة، ثم أضف 600 ميكرولتر من الميثانول. تخلط جيدا لتحضير محلول وسيط مختلط 1 بتركيز 1000 ميكروغرام / مل.
    3. انقل بدقة 20 ميكرولتر من كل محاليل من محاليل المخزون الأربعة إلى قارورة عينة ، ثم أضف 920 ميكرولتر من الميثانول. تخلط جيدا لتحضير محلول وسيط مختلط 2 بتركيز 200 ميكروغرام / مل.
    4. بعد ذلك ، قم بإعداد سلسلة من المحاليل القياسية بتركيزات 5 ميكروغرام / مل ، و 10 ميكروغرام / مل ، و 20 ميكروغرام / مل ، و 50 ميكروغرام / مل ، و 100 ميكروغرام / مل ، و 200 ميكروغرام / مل ، و 250 ميكروغرام / مل عن طريق التخفيف التسلسلي وفقا للجدول 2.
  2. تحضير العينات
    1. باستخدام ماصة ، انقل بدقة 100 ميكرولتر من العينة إلى قارورة عينة ، ثم أضف 900 ميكرولتر من الميثانول واخلطها جيدا. في هذه المرحلة ، تأكد من تخفيف تركيز LNP في العينة 10 أضعاف وفصل LNP عن عقار الحمض النووي.

3. الحصول على البيانات

  1. ضع المحاليل القياسية ومحاليل العينات في جهاز أخذ العينات التلقائي للكروماتوجراف السائل.
  2. انقر فوق Realtime Batch في شريط أدوات المساعد في نافذة Realtime Analysis . بعد ذلك، انقر فوق جديد في القائمة ملف لإنشاء جدول دفعي جديد.
  3. في جدول الدفعات، أدخل القارورة# واسم الدرج وملف البيانات ووحدة تخزين الحقن للحلول القياسية والعينة، وحدد ملف الطريقة المحفوظ في الخطوة 1.4. انقر فوق حفظ ملف دفعي في القائمة ملف لحفظ الملف الدفعي.
  4. انتظر حتى يصبح ضغط الكروماتوجراف السائل وخط الأساس للكروماتوجرام مستقرين. ثم انقر فوق بدء دفعة الوقت الفعلي في شريط أدوات المساعد لبدء الحصول على البيانات.

4. تحليل البيانات

  1. إنشاء منحنيات المعايرة
    1. افتح نافذة المستعرض الخاصة ببرنامج LabSolutions واسحب بيانات الحل القياسية إلى عرض النتائج الكمية لإنشاء منحنى معايرة. بعد ذلك ، قم بتعديل معلمات معالجة البيانات. انقر فوق تحرير في طريقة عرض الطريقة.
    2. في نافذة معلمات التكامل ، قم بتغيير قيمة الميل إلى 10000. بعد ذلك ، في معلمات التعريف ، قم بتغيير طريقة التعريف إلى النطاق وقم بتعيين النطاق الترددي الافتراضي على 0.1 دقيقة.
    3. بعد ذلك ، قم بتعديل المعلمات الكمية. قم بتغيير الطريقة الكمية إلى معيار خارجي ، واضبط # مستوى المعايرة على 7. حدد نوع منحنى المعايرة على أنه أضعافيا مضاعفة. بعد ذلك ، قم بتعديل المركب.
    4. أدخل الأسماء وتركيزات المحلول القياسية لمكونات LNP الأربعة. انقر نقرا مزدوجا فوق قمة الذروة لتحديث أوقات الاستبقاء. أخيرا ، انقر فوق عرض لإكمال تعديل معلمات معالجة البيانات.
    5. قم بتعديل نوع العينة في طريقة عرض النتائج الكمية إلى معيار (نقطة التجميع). وفقا للتركيزات ، اضبط مستويات المحلول القياسي من 1-7. بمجرد إنشاء منحنيات المعايرة ، انقر فوق ملف في شريط القائمة واحفظ ملف الأسلوب.
  2. التحليل الكمي للعينات
    1. اسحب بيانات العينات إلى عرض النتائج الكمية في نافذة المستعرض، والتي ستعرض نتائج تركيز مكونات LNP الأربعة في العينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حقق تحليل الحل القياسي LNP باستخدام هذه الطريقة درجة فصل أكبر من 1.5 للمكونات الأربعة ، مما أدى إلى تحقيق فصل خط الأساس. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي بقايا في المحاليل القياسية عالية التركيز ، كما هو موضح في الشكل 1. تم إنشاء منحنى معايرة ضمن نطاق تركيز يتراوح من 5 إلى 250 ميكروغرام / مل ، يظهر معاملات ارتباط تتجاوز جميعها 0.999 ، مما يشير إلى نطاق خطي واسع وخطية ممتازة. يتم توضيح منحنى المعايرة في الشكل 2.

لفحص قابلية استنساخ الطريقة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر جميع المكونات الأربعة للأنابيب العصبية العصبية ضعيفة نسبيا. عند تحليلها باستخدام عمود C18 ، تظهر المركبات المستهدفة احتفاظا قويا داخل العمود ، مما يؤدي إلى توسيع ذروة الدهون الفوسفورية للمكونات المحتجزة بقوة. علاوة على ذلك ، بعد تحليل المحاليل عالية التركيز ، تتراكم البقايا في رأس العمود C18 ، مما قد يضر بدقة القياس الكمي. يظهر الكروماتوجرام في الشكل 5.

لتحسين الطريقة ، تم تحديد عمود C4 مع كراهية ماء أضعف بدلا من ذلك. كان الا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شكر شركات الأدوية الحيوية على توفير عينات LNP للتجربة ، والامتنان لشركة Shimadzu (شنغهاي) Global Laboratory Consumables Co.، Ltd لتوفير عمود الكروماتوغرافيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الخليكANPEL Laboratory Technologies (شنغهاي) Inc.CAEQ-4-000319-0050
التوازنShimadzu (شنغهاي) العالمية مختبر المواد الاستهلاكية المحدودةAP135W
العمودShimadzu (شنغهاي) العالمية مختبر المواد الاستهلاكية المحدودةShimNex WP C4 (380-01235-74) ELSD
Shimadzu (الصين) المحدودةELSD-LT الثالث (228-65900-46) LabSolutions
SoftwareShimadzu (الصين) المحدودة
LCShimadzu (الصين) المحدودةLC40D XR
الميثانولANPEL تقنيات المختبر (شنغهاي) Inc.CAEQ-4-003302-4000
ماصة -100 وميكرو ؛ LShimadzu (شنغهاي) العالمية مختبر المواد الاستهلاكية المحدودة00-NAR-100
ماصة -1000 & مايكرو ؛ LShimadzu (شنغهاي) العالمية مختبر المواد الاستهلاكية المحدودة00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (شنغهاي) Inc.CAEQ-4-012190-0250
نظام المياه فائق النقاءMilliporeZIQ7000T0C
Vortex MixerANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة