تحديد أربعة مكونات في نظام توصيل الحمض النووي الريبي للجسيمات الدهنية بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة جنبا إلى جنب مع كاشف تشتت الضوء التبخيري

الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) هي واحدة من أكثر أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية تقدما ، وتستخدم بشكل أساسي لتوصيل أدوية الحمض النووي ، مثل قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى ، والنيوكليوتيدات الصغيرة المتداخلة ، و mRNA ، وما إلى^{ذلك 1،2،3}. يتكون LNP بشكل عام من أربعة مكونات: الدهون المؤينة ، والدهون المعدلة بالبولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، والفوسفوليبيدات ، والكوليسترول. المكون الرئيسي هو الدهون المؤينة ، والتي تعد العامل الحاسم في كفاءة توصيل أدوية الحمض النووي. يمكن للمكونات الثلاثة الأخرى أن تزيد من استقرار LNP وتقلل من التعرف على جهاز المناعة^4،5،6.

يمكن أن تؤثر النسب المتفاوتة للمكونات الأربعة في LNP بشكل كبير على عملية التجميع الذاتي للجسيمات النانوية ، مما يؤثر على خصائص مثل كفاءة تغليف المكون الصيدلاني النشط (API) ، وفعالية توصيله ، ومعدل الإطلاق في الجسم الحي^7،8،9. لذلك ، من الضروري إنشاء طريقة تحليل كمي لمكونات LNP ، وبالتالي تسهيل توليف نظام توصيل LNP الأمثل^10،11.

الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي تقنية تحليلية معاصرة تستخدم على نطاق واسع في التحليل الصيدلاني وتحظى بتقدير لكفاءتها العالية وحساسيتها وقدراتها على الأتمتة. يشمل HPLC العديد من أجهزة الكشف ، بما في ذلك كاشفات الأشعة فوق البنفسجية التقليدية (UV) ، بالإضافة إلى أجهزة الكشف للأغراض العامة مثل كاشفات معامل الانكسار (RID) ، وكاشفات تشتت الضوء التبخيري (ELSD) ، وكاشفات الهباء الجوي المشحونة (CAD) ، وكاشفات الترددات الراديوية الانتقائية للغاية (RF) ، من بين أمور أخرى¹².

في حالة تحليل المكونات الأربعة ل LNP ، والتي تفتقر إلى مجموعات مميزة لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية وبالتالي لا تنتج أي استجابة في كاشفات الأشعة فوق البنفسجية ، تم النظر في استخدام أجهزة الكشف للأغراض العامة. على الرغم من أن RID هو أحد هذه الخيارات ، إلا أنه غير مناسب لتحليل التدرج ويوفر حساسية أقل نسبيا مقارنة بالكاشفين الآخرين للأغراض العامة. ومن ثم ، لم يتم اختياره¹². علاوة على ذلك ، في حين أن كاشفات CAD تتميز بحساسية عالية ، فإن تكلفتها الباهظة تجعلها أقل جاذبية¹².

وبالتالي ، تم اختيار كاشف ELSD. يتميز هذا الكاشف بخيار وضع كسب مميز - الوضع "العريض" - والذي يتيح التحليل المتزامن لكل من التركيز العالي ومكونات التتبع ، مما يعزز الحساسية ويوسع النطاق الخطي.

تستخدم هذه المقالة نظام HPLC مقترنا ب ELSD ، مما يحقق فصلا فعالا وتحليلا كميا للمكونات الأربعة ل LNP من خلال تحسين الأعمدة الكروماتوغرافية ، وشطف التدرج للمراحل المتحركة ، وشروط أخرى¹³.

1. تحضير الأداة

1. إعداد الصك
   1. قم بإعداد نظام HPLC مقترنا ب ELSD.
2. تركيب العمود
   1. قم بتثبيت العمود الكروماتوغرافي (C4-300 ؛ 150 مم × 4.6 مم ID ، 5 ميكرومتر) ، باتباع اتجاه السهم على العمود ، مع توصيل أحد طرفيه بمخرج جهاز أخذ العينات الآلي والآخر بمدخل ELSD.
3. إعداد المرحلة المتنقلة
   1. تحضير المراحل المتنقلة: مرحلة ، محلول مائي 10 ملي مولار TEAA (الرقم الهيدروجيني = 7.0) ، والمرحلة B ، محلول ميثانول TEAA 10 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني = 7.0).
   2. لتحضير المرحلة A ، قم بوزن 1.01 جم بدقة من ثلاثي إيثيل أمين ، ثم قم بإذابته في 1000 مل من الماء ، واخلطه جيدا ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 مع حمض الخليك.
   3. لتحضير المرحلة B ، قم بإذابة 1.01 جم من ثلاثي إيثيل أمين في 1000 مل من الميثانول ، واخلطه واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الخليك.
4. تحرير الطريقة
   1. قم بتشغيل مفاتيح الطاقة لكل وحدة من وحدات LC-ELSD وقم بتشغيل برنامج LabSolutions . ثم افتح نافذة التحليل في الوقت الفعلي .
   2. انقر فوق ملف وحدد جديد لإنشاء ملف طريقة جديد. قم بتعديل وقت إيقاف LC في الطريقة إلى 15 وانقر فوق تطبيق على كل وقت الاستحواذ.
   3. ثم انقر فوق مضخة لتعديل معلمات المضخة. حدد وضع التحليل ك تدرج ثنائي عالي الضغط (B.GE) واضبط معدل التدفق على 1.0 مل / دقيقة.
   4. بعد ذلك ، اضبط تركيز المضخة B الأولي (٪ B) على 80٪ وقم بتعديل تدرج الطور المتحرك: عند 3 دقائق ، ٪ B هو 80٪ ، في 4 دقائق ، ٪ B هو 85٪ من 5.5 دقيقة إلى 12 دقيقة ، ٪ B هو 100٪ ، عند 12.1 دقيقة ، ٪ B ترجع إلى 80٪.
   5. بعد ذلك ، انقر فوق Column Oven واضبط درجة حرارة الفرن على 55 درجة مئوية. أخيرا ، انقر فوق ELSD لتعديل درجة حرارة أنبوب الانجراف إلى 40 درجة مئوية. احفظ الطريقة.
      ملاحظة: يرد ملخص المعلمات في الجدول 1.
5. ابدأ الأداة وقم بتوازنها.
   1. انقر فوق تنزيل وبدء التشغيل لبدء تشغيل الأداة وموازنتها.

2. تحضير الحلول والعينات القياسية

1. إعداد الحلول القياسية
   1. تزن بدقة 10.0 مجم من المواد القياسية الأربع المكونة ل LNP بشكل منفصل ، وتذوب في 1 مل من الميثانول ، ودوامة حتى تذوب تماما للحصول على محاليل مخزون بتركيز 10 مجم / مل لكل مكون.
   2. باستخدام ماصة، انقل بدقة 100 ميكرولتر من كل محاليل من محاليل المخزون الأربعة إلى قارورة عينة، ثم أضف 600 ميكرولتر من الميثانول. تخلط جيدا لتحضير محلول وسيط مختلط 1 بتركيز 1000 ميكروغرام / مل.
   3. انقل بدقة 20 ميكرولتر من كل محاليل من محاليل المخزون الأربعة إلى قارورة عينة ، ثم أضف 920 ميكرولتر من الميثانول. تخلط جيدا لتحضير محلول وسيط مختلط 2 بتركيز 200 ميكروغرام / مل.
   4. بعد ذلك ، قم بإعداد سلسلة من المحاليل القياسية بتركيزات 5 ميكروغرام / مل ، و 10 ميكروغرام / مل ، و 20 ميكروغرام / مل ، و 50 ميكروغرام / مل ، و 100 ميكروغرام / مل ، و 200 ميكروغرام / مل ، و 250 ميكروغرام / مل عن طريق التخفيف التسلسلي وفقا للجدول 2.
2. تحضير العينات
   1. باستخدام ماصة ، انقل بدقة 100 ميكرولتر من العينة إلى قارورة عينة ، ثم أضف 900 ميكرولتر من الميثانول واخلطها جيدا. في هذه المرحلة ، تأكد من تخفيف تركيز LNP في العينة 10 أضعاف وفصل LNP عن عقار الحمض النووي.

3. الحصول على البيانات

1. ضع المحاليل القياسية ومحاليل العينات في جهاز أخذ العينات التلقائي للكروماتوجراف السائل.
2. انقر فوق Realtime Batch في شريط أدوات المساعد في نافذة Realtime Analysis . بعد ذلك، انقر فوق جديد في القائمة ملف لإنشاء جدول دفعي جديد.
3. في جدول الدفعات، أدخل القارورة# واسم الدرج وملف البيانات ووحدة تخزين الحقن للحلول القياسية والعينة، وحدد ملف الطريقة المحفوظ في الخطوة 1.4. انقر فوق حفظ ملف دفعي في القائمة ملف لحفظ الملف الدفعي.
4. انتظر حتى يصبح ضغط الكروماتوجراف السائل وخط الأساس للكروماتوجرام مستقرين. ثم انقر فوق بدء دفعة الوقت الفعلي في شريط أدوات المساعد لبدء الحصول على البيانات.

4. تحليل البيانات

1. إنشاء منحنيات المعايرة
   1. افتح نافذة المستعرض الخاصة ببرنامج LabSolutions واسحب بيانات الحل القياسية إلى عرض النتائج الكمية لإنشاء منحنى معايرة. بعد ذلك ، قم بتعديل معلمات معالجة البيانات. انقر فوق تحرير في طريقة عرض الطريقة.
   2. في نافذة معلمات التكامل ، قم بتغيير قيمة الميل إلى 10000. بعد ذلك ، في معلمات التعريف ، قم بتغيير طريقة التعريف إلى النطاق وقم بتعيين النطاق الترددي الافتراضي على 0.1 دقيقة.
   3. بعد ذلك ، قم بتعديل المعلمات الكمية. قم بتغيير الطريقة الكمية إلى معيار خارجي ، واضبط # مستوى المعايرة على 7. حدد نوع منحنى المعايرة على أنه أضعافيا مضاعفة. بعد ذلك ، قم بتعديل المركب.
   4. أدخل الأسماء وتركيزات المحلول القياسية لمكونات LNP الأربعة. انقر نقرا مزدوجا فوق قمة الذروة لتحديث أوقات الاستبقاء. أخيرا ، انقر فوق عرض لإكمال تعديل معلمات معالجة البيانات.
   5. قم بتعديل نوع العينة في طريقة عرض النتائج الكمية إلى معيار (نقطة التجميع). وفقا للتركيزات ، اضبط مستويات المحلول القياسي من 1-7. بمجرد إنشاء منحنيات المعايرة ، انقر فوق ملف في شريط القائمة واحفظ ملف الأسلوب.
2. التحليل الكمي للعينات
   1. اسحب بيانات العينات إلى عرض النتائج الكمية في نافذة المستعرض، والتي ستعرض نتائج تركيز مكونات LNP الأربعة في العينات.

حقق تحليل الحل القياسي LNP باستخدام هذه الطريقة درجة فصل أكبر من 1.5 للمكونات الأربعة ، مما أدى إلى تحقيق فصل خط الأساس. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي بقايا في المحاليل القياسية عالية التركيز ، كما هو موضح في الشكل 1. تم إنشاء منحنى معايرة ضمن نطاق تركيز يتراوح من 5 إلى 250 ميكروغرام / مل ، يظهر معاملات ارتباط تتجاوز جميعها 0.999 ، مما يشير إلى نطاق خطي واسع وخطية ممتازة. يتم توضيح منحنى المعايرة في الشكل 2.

لفحص قابلية استنساخ الطريقة ، تم حقن محلول قياسي بتركيز 10 ميكروغرام / مل وتحليله بشكل متكرر ست مرات. كان الانحراف المعياري النسبي (RSD) لوقت الاستبقاء أقل من 0.1٪ ، وكان RSD لمنطقة الذروة أقل من 2٪ ، مما يدل على قابلية عالية للتكرار. يتم عرض الكروماتوغرامات المقابلة في الشكل 3.

لتحليل عينات LNP الفعلية ، تم تخفيف العينات 10 مرات بالميثانول لتسهيل تفكك LNP عن الدواء. بعد ذلك ، تم تحليل محتويات المكونات الأربعة في LNP ، بتركيزات مقاسة تتراوح من 150 ميكروغرام / مل إلى 1500 ميكروغرام / مل. باستخدام هذه الطريقة لتحليل عينات LNP من العديد من الشركات المصنعة ، تم تحقيق فصل وحساسية عالية باستمرار. يتم عرض الكروماتوغرامات المحددة لهذه العينات في الشكل 4.

الشكل 1: الكروماتوغرامات للمحلول القياسي والمحلول الفارغ. يقارن هذا الرسم البياني الحل القياسي (الذي يحتوي على حد تركيز الكشف) بالمحلول الفارغ ، ويكشف عن نقطتين رئيسيتين: أولا ، تم حل المكونات الأربعة ل LNP بشكل كامل ، مما يدل على الفصل الفعال. ثانيا ، لا توجد بقايا تم اكتشافها في المحلول الفارغ ، مما يشير إلى الحد الأدنى من التداخل أو التلوث. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: منحنيات معايرة LNP. يعرض هذا الرسم البياني منحنيات المعايرة للمكونات الأربعة ل LNP ، بما في ذلك معلمات مثل معادلاتها الخطية ومعاملات الارتباط الخطية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: كروماتوجرام متكرر للمحلول القياسي 10 ميكروغرام / مل. يوضح هذا الشكل الكروماتوغرامات التي تم الحصول عليها من التحليلات المتكررة للحلول القياسية التي تهدف إلى فحص قابلية تكرار الطريقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مخطط كروماتوجرام لعينات LNP. تم استخدام هذه الطريقة لتحليل عينات LNP من مختلف الشركات المصنعة ، والتي أثبتت أنها قابلة للتطبيق عالميا. يمثل الكروماتوجرام الموضح هنا نتيجة تحليل إحدى عينات LNP هذه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الكروماتوجرام للمحلول القياسي والفارغ الذي تم الحصول عليه بواسطة عمود C18. يوضح هذا الكروماتوگرام تحليل عينة LNP باستخدام عمود C18 ، ويكشف أن الذروة المقابلة لمكون الدهون الفوسفورية الأكثر احتفاظا به في خليط LNP قد تم توسيعها ، ويتم اكتشاف بقايا في الفراغ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: معلمات الطريقة. يوضح هذا الجدول بالتفصيل المعلمات المحددة للطرق الآلية ، بما في ذلك جوانب مثل التدرج المتحرك للطور السائل ، ودرجة حرارة الكاشف ، وضغط الغاز ، والمزيد.

الجدول 2: إعداد الحلول القياسية. يوضح هذا الجدول بالتفصيل خطوات تحضير المحاليل القياسية بتركيزات مختلفة.

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.