يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توصيل الجينات الفعال والآمن إلى كلية الفأر عن طريق الحقن البطيء للحوض الكلوي الرجعي لناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدة

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67716

⸱

أغسطس 1, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا التقرير بالتفصيل طريقة الحقن الموضعية لنواقل AAV عبر الحوض الكلوي لنقل الجينات بشكل فعال وآمن إلى كلية الفأر.

الملخص

يعد تطوير أدوات وطرق فعالة في الجسم الحي لتوصيل الجينات إلى الكلى أمرا بالغ الأهمية للنهوض بأبحاث الكلى الأساسية والعلاج الجيني لأمراض الكلى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الوعي المتزايد بأمراض الكلى أحادية الجين ، مدفوعا بالاختبارات الجينية المتقدمة ، يؤكد على إمكانات العلاج الجيني لعلاج أمراض الكلى الوراثية التي يصعب علاجها وحتى علاجها. في هذا الصدد ، حظيت نواقل الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) باهتمام متزايد كمنصة قوية لإيصال الجينات في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن الطريقة الأكثر فعالية والأكثر أمانا لتوصيل الجينات بوساطة ناقل AAV لكل نوع من أنواع الخلايا ذات الصلة علاجيا في الكلى لم يتم تحديدها بشكل كامل بعد. هنا ، يتم تفصيل طريقة حقن الحوض الكلوي البطيء (RP) لنواقل AAV ، ويتم توضيح قدرتها العالية على تحويل كلى الفئران عند استخدامها مع قفيصة AAV المختارة بشكل مناسب. علاوة على ذلك ، ثبت أن هذه الطريقة فعالة ليس فقط مع نواقل AAV المنقاة بالطرد المركزي الفائق بكلوريد السيزيوم (CsCl AAV) ولكن أيضا مع ناقلات AAV (CU AAV) المصغرة بالطرد المركزي (CU AAV) ، والتي يمكن تحضيرها بسرعة وبساطة باستخدام تقنيات لا تتطلب خبرة متخصصة في ناقلات AAV. على سبيل المثال ، توضح هذه الدراسة أن الحقن البطيء RP لكل من نواقل CsCl و CU AAV-KP3 يؤدي إلى نقل قوي للأنابيب القريبة في كلية الفأر دون تلف واضح للأنسجة ، على عكس الأساليب الهيدروديناميكية التي تم الإبلاغ عنها سابقا والتي تؤدي حتما إلى تلف الأنسجة. وبالتالي ، تسلط هذه الدراسة الضوء على أن الحقن البطيء RP الرجعي لنواقل مختارة مشتقة من قفيصة AAV هو طريقة فعالة وآمنة لتوصيل الجينات إلى الكلى. ستكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من أبحاث الكلى ، بما في ذلك دراسات العلاج الجيني. سيؤدي استخدام التحضيرات المصغرة لناقلات CU AAV إلى زيادة الإنتاجية بشكل كبير وتحسين الوقت وكفاءة التكلفة اللازمة لإنشاء بيانات أولية والحصول على رؤى مهمة.

المقدمة

توفر الطرق الفعالة والآمنة لتوصيل الجينات إلى الكلى في التجارب الصغيرة والكبيرة فرصا حاسمة للنهوض بأبحاث الكلى الأساسية واستكشاف الأساليب العلاجية المبتكرة. إن إنشاء مثل هذه الأساليب وثيق الصلة بشكل خاص بالعلاج الجيني لأمراض الكلى المختلفة. كشفت التطورات الحديثة في الاختبارات الجينية السريرية عن انتشار أعلى للاضطرابات الكلوية أحادية الجين مما كان متوقعا سابقا ، مما يؤثر على ما يقرب من 30٪ من المرضى الذين يعانون من أمراض الكلى المزمنة (CKDs) 1. يتميز مرض الكلى المزمن بتلف الكلوي التدريجي ، مما يؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي مع عدم وجود علاجات فعالة حقا لتعديل المرض. غسيل الكلى وزرع الكلى من العلاجات المتاحة حاليا. ومع ذلك ، فإن لديهم قيودا تضعف بشكل كبير نوعية الحياة للمرضى الذين يعانون من مرض الكلىالمزمن 2. وهكذا ، فإن العلاج الجيني ، وهو نهج قوي مثبت سريريا لعلاج الأمراض الوراثية ، قد حظي باهتمام كبير في السنوات الأخيرة كوسيلة جديدة للعلاج الفعال لأمراض الكلى الوراثية التي تؤدي إلى مرض الكلىالمزمن 3،4،5،6. يمكن لهذا النهج أن يعالج بشكل مباشر الأسباب الجذرية للأمراض ويحتمل أن يوفر علاجا.

على الرغم من التقدم المطرد في هذا المجال ، لا يزال توصيل الجينات إلى الكلى يمثل تحديا كبيرا في كل من البيئات البحثية والعلاجية. من الصعب استهداف خلايا الكلى بكفاءة بالجينات العلاجية بسبب البنية المعقدة للعضو والحواجز الفسيولوجية الفريدة ، بما في ذلك حاجز الترشيح الكبيبي ، الذي يتكون من الخلايا البطانية الكبيبية ، والغشاء القاعدي الكبيبي ، وعمليات القدم البودوسياتية. تم استكشاف استراتيجيات مختلفة لتوصيل الجينات المستهدفة للكلي ، بما في ذلك الحقن المباشر للقشرة الكلوية(RC) 7،8 ، وحقن الشريان الكلوي (RA)9،10،11 ، وحقن الوريد الكلوي (RV)12،13،14 ، وحقن الحوض الكلوي (RP)15،16،17،18،19،20، 21،22،23،24،25 والحقن الوريدي (IV)19،26،27،28،29،30 من ناقلات توصيل الجينات الفيروسية أو غير الفيروسية ، بالإضافة إلى الموجات فوق الصوتية وتوصيل الحمض النووي بوساطة الفقاعاتالدقيقة 31،32. أظهرت هذه الأساليب كفاءات متغيرة في التنبيغ أو نتائج وظيفية ، وغالبا ما تسفر عن نتائج غير متسقة يصعب التوفيق بينها (تمت مراجعتها في المراجع3 ، 33 ، 34 ، 35). لا يزال توصيل الجينات إلى الكلى متخلفا ، مما يجعل المقارنات المباشرة بين أنظمة النواقل والمنهجيات صعبة. ومع ذلك، فإن طرق التوصيل الموضعية، التي تسهل إعطاء العوامل عالية التركيز مباشرة إلى الكلى، حققت عموما نتائج أفضل من الولادة الوريدية الجهازية. بالإضافة إلى ذلك ، كانت نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة (AAV) ، بملامح السلامة القوية وسجلها الحافل بالترجمة السريرية36،37 ، هي الأكثر دراسة وتعتبر الخيار الرئيسي لنقل الجينات الكلوية.

أظهرت الأنماط المصلية الشائعة للقاصصات الوعلية والقفيصة المهندسة نقلا فعالا للخلايا الوسيطة واللحمة المتوسطة في الكلى بعد الحقن الوريدي في الفئران28،30،38. والجدير بالذكر أن الدراسات الحديثة أظهرت أن الإدارة الوريدية ل AAV9 يمكن أن تنقل بشكل فعال الخلايا البودوية في نماذج الفئران من المتلازمة الكلوية ومتلازمة ألبورت ، على الرغم من أن هذا التأثير لم يلاحظ في الكلى السليمة38،39 ، وأن الإدارة الوريدية لقفيصة AAV2 المصممة هندسيا يمكن أن تستهدف حصريا الخلايا البطانية الكبيبية في كل من الكلى السليمة والملتهبة في الفئران40. تاريخيا ، كان من الصعب تحويل الأنابيب الكلوية عبر الطريق الوريدي. ومع ذلك ، فقد تم اكتشاف مؤخرا أن حقن RP لقفيصات AAV مختارة ، مثل AAV-KP141 ، يمكن أن يحقق نقل الأنابيب القريبة عند مستويات أعلى من ترتيب من حيث الحجم من تلك التي تم تحقيقها باستخدام قفيصة AAV9المعيارية 38. على الرغم من الحاجة إلى مزيد من التحسينات ، إلا أن هذه التطورات تفتح طرقا جديدة لأبحاث الكلى الأساسية والعلاج الجيني ، مما يوفر فرصا لم يكن من الممكن تحقيقها في السابق.

في هذه المقالة ، تم تفصيل حقن RP البطيء إلى الوراء لنواقل AAV كطريقة فعالة وآمنة لتوصيل الجينات إلى كلية الفأر38. كمثال تمثيلي لهذه التقنية ، تم اختيار AAV-KP3 كقفيصة نموذجية بناء على اكتشاف أنه أحد القفيصات الستة (على سبيل المثال ، AAV-KP1 و AAV-KP2 و AAV-KP341 و AAV-DJ42 و AAV2G943 و AAV2.7m844) التي أظهرت نقلا كلويا محسنا مقارنة ب AAV9 بعد حقن RP في الفئران38. والجدير بالذكر أن أنسجة الكلى المحقونة بالخلايا الرجعية بطيئة لم تظهر أي تلف واضح في الأنسجة على عكس تلك التي عولجت بالأساليب الهيدروديناميكية التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 23،24. علاوة على ذلك ، حققت ناقلات AAV miniprep45 المنقاة بشكل فظ عن طريق الترشيح الفائق بالطرد المركزي السريع والبسيط (أي نواقل CU AAV) مستويات نقل كلوي تقريبا 70٪ من تلك التي يمكن تحقيقها بواسطة مستحضرات ناقلات AAV المنقاة بواسطة الطرد المركزي القياسي لكلوريد السيزيوم (CsCl) (أي نواقل CsCl AAV) عند إعطاؤها في نفس عيار جينوم المتجه. وبالتالي ، فإن الطريقة والملاحظات المعروضة هنا توفر موردا قيما وعمليا للباحثين الذين يسعون إلى تعزيز توصيل الجينات إلى الكلى في الفئران الأكبر حجما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة أوريغون للصحة والعلوم (OHSU) وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية في OHSU. في هذه الدراسة ، تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. إنتاج ناقلات AAV عن طريق تعداء البلازميد الخالي من الفيروسات الغدية

  1. زراعة الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293 خلية في وسط النسر المعدل (DMEM) - نسبة عالية من الجلوكوز (4.5 جم / لتر) من Dulbecco مع مصل بقري الجنين 10٪ (FBS) ، و 1٪ بنسلين ومزيج ستربتومايسين ، و 1 ملي مولار ل-جلوتامين ، في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
  2. في اليوم -2 (48 ساعة قبل التعدي) ، لوحة 4 × 106 HEK 293 خلية لكل قارورة T225 في 40 مل من وسط الاستزراع كما هو موضح في الخطوة 1.1. يصل هذا إلى ~ 95٪ التقاء في اليوم 0.
    ملاحظة: يمكن ضبط مقياس الثقافة بناء على التطبيق. بالنسبة للتحضير المصغر AAV (الخطوة 2) ، قم بإعداد عدد مناسب من القوارير بناء على العيار المستهدف وتركيز المتجه ، مع الأخذ في الاعتبار أن عملية التنقية تؤدي عادة إلى فقدان تقريبي بنسبة 50٪ من المواد. لتحقيق >6 × 1012 vg / mL من نواقل AAV9 و AAV-KP3 لحقن RP في الفئران بجرعة 3 × 1011 vg / فأر في محلول ناقل 50 ميكرولتر ، يوصى باستخدام قارورتين على الأقل. لإنتاج ناقلات AAV على نطاق أوسع ، مثل تلك الخاصة بناقلات AAV المنقاة بالتدرج بكثافة CsCl (CsCl AAVs) ، عادة ما يتم استخدام 25 قارورة أو أكثر.
  3. اليوم 0: تعداء الحمض النووي البلازميد
    1. التحضير للتعداء
      1. تأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى ~ 95٪ من التقاء.
      2. قم بتسخين DMEM مكمل بمزيج البنسلين والستربتومايسين 1٪ و 1 ملي مولار L-glutamine ولكن بدون FBS (أي وسط خال من المصل) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      3. اسمح لمحلول البولي إيثيلينيمين الخطي (PEI) للوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير خليط الحمض النووي البلازميد
      1. امزج البلازميدات (15 ميكروغرام لكل من pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap, و pHelper) في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون CaCl2 أو MgCl2 في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة 1.5 مل. الكمية الإجمالية للحمض النووي هي 45 ميكروغرام / قارورة.
        ملاحظة: يمكن تجاهل أحجام محلول الحمض النووي البلازميد إذا كانت ضئيلة. ومع ذلك ، ينصح بضبط الحجم إذا كان الحجم الكلي للمحلول ≥225 ميكرولتر. تسلسلات البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة متوفرة في الملف التكميلي 1.
    3. تعداء جزيرة الأمير إدوارد
      1. أضف 90 ميكرولتر من محلول PEI (1 مجم / مل) إلى 1 مل من PBS واخلطه مع مزيج PBS-plasmid DNA (المحضر على النحو الوارد أعلاه) في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل. الحجم النهائي حوالي 2 مل (حجم 5٪ من وسط الاستزراع).
      2. قم بتدوير الأنابيب لمدة 5 ثوان وقم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي لتجميع السائل إلى قاع الأنابيب.
    4. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتشكيل مجمعات البلازميد DNA-PEI.
    5. بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 15 دقيقة ، أضف 40 مل من الوسط الخالي من المصل المسخن مسبقا المحضر في الخطوة 1.3.1.2 إلى مجمعات البلازميد DNA-PEI. الحجم حوالي 42 مل.
    6. استبدل وسط استزراع قارورة T225 بمجمعات DNA-PEI البلازميد التي تحتوي على وسط خال من المصل الموصوف في الخطوة 1.3.4.
    7. حافظ على الخلايا في وسط التعداء هذا حتى الحصاد في اليوم 5 (لا يلزم تغيير متوسط).
    8. في اليوم 2 ، راقب الخلايا المنقولة بالبلازميد الذي يعبر عن بروتينات الفلورسنت (على سبيل المثال ، pAAV-CAG-tdTomato) تحت مجهر مضان مقلوب لتقييم كفاءة تعداء البلازميد.
      ملاحظة: عادة ما تؤدي الظروف الموضحة أعلاه إلى زيادة كفاءة التعداء 70٪. يمكن ملاحظة بعض التغييرات المورفولوجية (على سبيل المثال ، استطالة الخلية) ، على الأرجح بسبب البيئة الخالية من المصل.
    9. في الأيام من 3 إلى 5 ، استمر في زراعة الخلايا المنقولة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    10. في اليوم الخامس، اجمع كل من الخلايا والوسط المحتوي على الفيروسات في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل.
    11. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تنقية الترشيح الفائق بالطرد المركزي (CU) لنواقل AAV (AAV miniprep)

  1. قم بإذابة العينة المجمدة من الخطوة 1.3.11 في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. احتفظ ب 1 مل من المحللة الخام جانبا لفحص لطخة نقطة الحمض النووي (يستخدم ككسر 1).
  3. أضف 80 ميكرولتر من كلوريد المغنيسيوم 1M (MgCl2 ، التركيز النهائي 2 مل) ، و 160 ميكرولتر من 0.1M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم ، التركيز النهائي 0.4 مل) ، و 16 ميكرولتر من نوكلياز المغنيسيوم Serratia marcescens (التركيز النهائي 100 وحدة / مل) في أنبوب سعة 50 مل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. دوامة العينة كل 15 دقيقة أثناء الحضانة.
  4. اجمع عينة Serratia marcescens المعالجة بنوكلياز داخلي في زجاجة طرد مركزي سعة 250 مل وجهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 50 مل.
  6. قم بتصفية المادة الطافية لإزالة الحطام باستخدام مرشح حقنة PVDF 0.45 ميكرومتر. احتفظ ب 1 مل من عينة مفلحة بمقدار 0.45 ميكرومتر جانبا لمقايسة لطخة نقطة الحمض النووي (تستخدم ككسر 2).
  7. أضف 10 مل من الماء من الدرجة الجزيئية إلى أنبوب الترشيح الفائق بالطرد المركزي بسعة 100 كيلو دالتون (MWCO) وجهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة التدفق.
  8. أضف 15 مل من السوربيتول بنسبة 5٪ في PBS إلى أنبوب الترشيح الفائق بالطرد المركزي وجهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة التدفق.
  9. أضف ما يصل إلى 15 مل من عينة مفلحة بمقدار 0.45 ميكرومتر كما هو موضح في الخطوة 2.6 وأجهزة الطرد المركزي عند 2,000 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة للتركيز حتى يتحقق الحجم المستهدف البالغ حوالي 500 ميكرولتر. احتفظ ب 1 مل من التدفق جانبا لفحص لطخة نقطة الحمض النووي (يستخدم ككسر 3).
    ملاحظة: قبل كل عملية طرد مركزي، أعد تعليق المخزن باستخدام ماصة لتعطيل تدرج التركيز. لا تلمس الغشاء بطرف الماصة. إذا لم يتم الوصول إلى الحجم المستهدف بعد 15 دقيقة من الطرد المركزي ، فقم بتمديد الطرد المركزي حسب الحاجة عن طريق ضبط المدة بناء على الحجم المتبقي في الأنبوب.
  10. كرر الخطوة 2.9 حتى يتم تصفية العينة بأكملها ، لتصل إلى الحجم المستهدف البالغ حوالي 500 ميكرولتر. احتفظ ب 1 مل من التدفق من التكرارين الأول والثاني للخطوة 2.10 جانبا لمقايسة لطخة نقطة الحمض النووي (تستخدم ككسر 4 وكسر 5).
    ملاحظة: يمكن استخدام أنبوب ترشيح فائق طرد مركزي واحد لمعالجة العينات التي تم الحصول عليها من قارورتين أو أكثر.
  11. أضف 15 مل من السوربيتول بنسبة 5٪ في PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 2,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة حتى يتم تحقيق الحجم المستهدف البالغ حوالي 500 ميكرولتر. احتفظ ب 1 مل من التدفق جانبا لمقايسة لطخة نقطة الحمض النووي (تستخدم ككسر 6).
  12. كرر الخطوة 2.11 (تستخدم ككسر 7).
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى عيارات AAV أعلى للتجارب النهائية ، فيمكن تقليل الحجم المستهدف النهائي إلى 150 ميكرولتر.
  13. انقل ناقل AAV فائق الترشيح إلى أنبوب غطاء لولبي سعة 2 مل بحلقة O. احتفظ ب 10 ميكرولتر من متجه AAV فائق الترشيح جانبا لمقايسة لطخة نقطة الحمض النووي (تستخدم ككسر 8).
  14. تحديد عيار AAV عن طريق مقايسة بقعة نقطة الحمض النووي كما هو موضحسابقا 46.
    ملاحظة: تحتوي النواقل المنقاة بالنحاس (CU AAV) على مستويات أعلى من تلوث القفيصة الفارغة والشوائب المشتقة من الخلايا المضيفة مقارنة بالنواقل المنقاة CsCl (CsCl AAV). قد تؤثر هذه العوامل على كفاءة التحويل والاستجابات المناعية ، مما يتطلب دراسة متأنية في تفسير البيانات.

3. تنقية تدرج الكثافة CsCl لنواقل AAV

  1. قم بإذابة العينة المجمدة من الخطوة 1.3.11 في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة بقايا الخلية.
  3. اجمع المادة الطافية وتترسب نواقل AAV في المادة الطافية عن طريق إضافة البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG ، التركيز النهائي 8٪) وكلوريد الصوديوم (التركيز النهائي 500 مليمتر).
  4. احتضن على الجليد لمدة 3 ساعات.
  5. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة للحصول على الكريات المحتوية على AAV.
  6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الكريات ب 10 مل من Sarkosyl الذي يحتوي على عازلة لإعادة التعليق (50 ملي مولار HEPES ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1٪ ساركوسيل ، درجة الحموضة 8.0).
  7. انقل تعليق الحبيبات إلى أنبوب بولي بروبلين سعة 15 مل واحتفظ به عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  8. في اليوم التالي ، عالج معلق الحبيبات باستخدام نوكلياز داخلي Serratia marcescens (التركيز النهائي 200 وحدة / مل) و MgCl2 (التركيز النهائي 2 مل).
  9. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. اجمع المادة الطافية وأضف كلوريد السيزيوم (CsCl ، التركيز النهائي لمعامل الانكسار (RI) = 1.3710 +/- 0.0005) و EDTA (التركيز النهائي 20 مليمتر).
  12. قم بتحميل العينة في أنبوب طرد مركزي فائق سعة 29.9 مل وأضف محلول الطبقة العلوية (50 ملي مولار HEPES ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار EDTA ، CsCl (RI = 1.3710 +/- 0.0005) ، درجة الحموضة 8.0) حتى تمتلئ.
  13. جهاز طرد مركزي عند 41,000 × جم عند 12 درجة مئوية لمدة 22 ساعة.
  14. قم بعمل ثقوب في الجزء السفلي والجانبي من أنبوب الطرد المركزي الفائق لجمع ما مجموعه 15 جزءا من 2 مل لكل منهما.
  15. استخدم 10 ميكرولتر من كل جزء للتحقق من RI وإجراء مقايسة لطخة نقطة الحمض النووي46.
  16. بناء على نتائج فحص RI و DNA dot blot ، حدد أفضل 5 كسور تحتوي على نواقل AAV.
  17. اجمع بين أفضل 5 كسور (إجمالي حوالي 10 مل) واضبط RI على 1.3710 +/- 0.0005.
  18. قم بتحميل العينة في أنبوب طرد مركزي فائق سعة 11.2 مل وأضف محلول الطبقة العلوية حتى تمتلئ.
  19. جهاز طرد مركزي عند 65,000 × جم عند 12 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
  20. قم بعمل ثقوب في الجزء السفلي والجانبي من أنبوب الطرد المركزي الفائق سعة 11.2 مل لجمع ما مجموعه 18 جزءا من 0.5 مل لكل منهما.
  21. استخدم 10 ميكرولتر من كل جزء للتحقق من RI وإجراء مقايسة لطخة نقطة الحمض النووي46.
  22. بناء على نتائج فحص RI و DNA dot blot ، حدد أفضل 6 كسور تحتوي على نواقل AAV.
  23. اجمع بين أفضل 6 أجزاء (إجمالي حوالي 3 مل) وقم بتحميلها في شريط غسيل الكلى.
  24. قم بتعويم كاسيت غسيل الكلى في 1.3 لتر من المخزن المؤقت لغسيل الكلى (المخزن المؤقت PBS المكمل بنسبة 0.001٪ خافض للتوتر السطحي غير أيوني) مع قضيب تحريك لمدة ساعتين لإزالة CsCl.
  25. كرر الخطوة 3.24 مرتين (إجمالي 6 ساعات من غسيل الكلى).
  26. انقل الكاسيت إلى 500 مل من السوربيتول بنسبة 5٪ في المخزن المؤقت PBS المكمل بخافض للتوتر السطحي بنسبة 0.001٪ لمدة ساعتين للتبادل المؤقت
  27. اجمع العينة من كاسيت غسيل الكلى باستخدام حقنة وقم بتصفية العينة المجمعة باستخدام مرشح حقنة PVDF 0.22 ميكرومتر.
  28. تم تحديد عيارات AAV بواسطة مقايسة لطخة النقاط الكمية46.

4. تقييم جودة مستحضرات ناقلات AAV بواسطة SDS-PAGE متبوعا بتلطيخ الفضة

  1. امزج مستحضرات النواقل ، 1 × 1010 vg لنواقل CsCl AAV ، و 1 × 109 و 1 × 1010 vg لنواقل CU AAV ، مع 6x Laemmli buffer في المجموع 18 ميكرولتر (تحضير المتجه: 6x Laemmli = 15: 3) وتسخينها عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. قم بتحميل مستحضرات ناقلات AAV المعالجة حراريا على جل SDS-PAGE بنسبة 7.5٪ وقم بتفريغ العينات بالكهرباء عند 20 مللي أمبير باستخدام مخزن مؤقت تشغيل هلام Tris-glycine-SDS.
  3. قم بإزالة الجل من علبة الجل ، واشطفه بالماء فائق النقاء ، وقم بلطخه باستخدام مجموعة تلطيخ الفضة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. احتضان الجل المحمل بنواقل CsCl AAV في حل المطور لمدة 7 دقائق ، بينما احتضان الجل المحمل بنواقل CU AAV لمدة دقيقتين لتجنب تشبع الإشارة.
    ملاحظة: تحتوي مستحضرات ناقلات CU AAV على مستويات أعلى من شوائب البروتين مقارنة بناقلات CsCl AAV. لذلك ، تم فصل المواد الهلامية المحملة بنواقل CsCl AAV و CU AAV بعد تشغيل الجل وصبغها بالفضة بشكل منفصل لمنع تشبع الإشارة بسبب الحساسية العالية لطريقة التلوين.

5. تحديد بروتينات AAV VP في مستحضرات ناقلات CU AAV بواسطة اللطخة الغربية

  1. امزج 1 × 109 vg من مستحضرات ناقلات CU AAV مع 6x Laemmli buffer بإجمالي 18 ميكرولتر (تحضير الناقل: 6x Laemmli = 15: 3) وقم بتسخينها عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. قم بتحميل مستحضرات ناقلات AAV المعالجة حراريا على جل SDS-PAGE بنسبة 7.5٪ وقم بتفريغ العينات بالكهرباء عند 20 مللي أمبير باستخدام مخزن مؤقت تشغيل هلام Tris-glycine-SDS.
  3. بروتينات النقل الكهربائي في الجل على غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) ، يتم تنشيطه في الميثانول ، باستخدام نظام نقل شبه جاف.
  4. سد الغشاء بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن ب Tris مع Tween 20 (TBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  5. احتضان الغشاء المسدود بمحلول الأجسام المضادة الأولية (الجسم المضاد متعدد النسيلة للأرانب المضاد ل VP ، مخفف إلى 1: 1000 مع 5٪ حليب منزوع الدسم في 1x TBST) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  6. اغسل الغشاء ب 1x TBST لمدة 10 دقائق ، 3 مرات.
  7. احتضان الغشاء بمحلول الأجسام المضادة الثانوية (جسم مضاد IgG مضاد للأرانب للماعز مقترن ببيروكسيداز الفجل ، مخفف إلى 1: 5000 مع 5٪ حليب منزوع الدسم في 1x TBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  8. اغسل الغشاء ب 1x TBST لمدة 10 دقائق ، 3 مرات.
  9. تصور الإشارات على الغشاء باستخدام نظام تصوير اللطخة الغربية.

6. حقن الحوض الكلوي (RP)

  1. إعداد ما قبل الجراحة والتخدير
    1. قم بقياس وزن جسم كل فأر في دورق بلاستيكي على مقياس وزن دقيق يصل إلى 0.1 جرام.
    2. يتم تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ) تحت الجلد بناء على وزن الجسم لتوفير تسكين ما قبل الجراحة.
    3. قم بتخفيف محلول ناقل AAV إلى تركيز 6.0 × 1012 vg / مل مع 5٪ سوربيتول في PBS واحتفظ به على الجليد.
      ملاحظة: قم بإعداد محلول AAV بمقدار 40 ميكرولتر أكثر من إجمالي حجم الحقن (50 ميكرولتر × عدد الفئران المراد حقنها) لحساب المساحة الميتة في حقنة زجاجية محكمة الغلق وأنبوب بولي إيثيلين PE-10.
    4. ثني وقطع طرف الإبرة فقط من إبرة 30 جم باستخدام حامل إبرة.
    5. تحت المجهر المجسم ، قم بتوصيل طرف الإبرة 30 G ، و 15 سم من أنبوب PE-10 ، وإبرة 30 G ، وحقنة زجاجية محكمة الغلق بالغاز بهذا الترتيب من الطرف (الشكل 1D).
    6. ضع المحقنة الزجاجية المتصلة محكمة الغلق بالغاز على مضخة حقنة التسريب.
    7. استنشق 90 ميكرولتر من محلول ناقل AAV المحضر في الخطوة 6.1.3 في المحقنة الزجاجية محكمة الغلق باستخدام مضخة حقنة التسريب.
    8. اضبط وضع التسريب لمضخة الحقنة على النحو التالي: الحجم المستهدف البالغ 50 ميكرولتر ومعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة.
    9. ضع الفأر في حجرة بلاستيكية مملوءة ب 4٪ من الأيزوفلوران يتم توصيله بمعدل 100٪ أكسجين بمعدل تدفق من 1.5 إلى 3.0 لتر / دقيقة حتى يتم تخديره بالكامل.
    10. ضع خطم الفأر في مخروط الأنف مع تدفق الأيزوفلوران من 1.5٪ إلى 3.0٪. راقب عمق التخدير عن طريق منعكس إصبع القدم طوال العملية الجراحية.
    11. غطي العينين بمرهم للعيون باستخدام قضيب قطني لمنع جفاف القرنية.
    12. قم بإزالة الفراء من الجانب الخلفي الأيسر من الماوس باستخدام مزيل الشعر باستخدام قضيب قطني.
      ملاحظة: يجب إزالة كريم إزالة الشعر تماما عن طريق الشطف لمنع تهيج الجلد.
    13. ضع الماوس في وضع جانبي على وسادة حرارية مغلقة الحلقة متصلة بمضخة العلاج الحراري للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية (لا حاجة لتثبيته بشريط لاصق).
    14. تطهير المنطقة المحلوقة بثلاثة تطبيقات متناوبة من بوفيدون اليود و 70٪ إيثانول باستخدام قضيب قطني بحركة دائرية تبدأ من موقع الشق.
    15. قم بتغطية الماوس بستارة جراحية معقمة.
  2. حقن RP للكلية اليسرى
    1. اقرص الجلد بالملقط الأنسجي وقم بعمل شق بطول 1 سم تقريبا في طبقة الجلد بمقص جراحي على مستوى زاوية الغطاء في موقع الكلية اليسرى.
    2. بعد إجراء شق في الجلد ، قم بقطع طبقة العضلات بنفس الطول.
      ملاحظة: إذا كان طول الشق قصيرا جدا ، فلا يمكن تعريض الكلية ، وبدلا من ذلك ، قد يتعرض الطحال ، الأصغر حجما ، عن طريق الخطأ. من ناحية أخرى ، إذا كان طول الشق طويلا جدا ، فلن يتم الاحتفاظ بالكلية في مكانها بواسطة الشق نفسه وستنزلق باستمرار إلى البطن من خلال الشق.
    3. اضغط برفق على البطن بالأصابع ، دون لمس الكلى مباشرة ، بحيث تتعرض الكلية من خلال موقع الشق (الشكل 1 أ).
    4. قم بإزالة الدهون المحيطة بالحد الأدنى بحيث يظهر الحوض الكلوي كمنطقة بيضاء صغيرة.
    5. أولا ، قم بتثبيت الحالب بمشبك وعاء دموي صغير من النوع المستقيم ، ثم الشريان الكلوي والوريد الكلوي مع مشبك وعاء دموي صغير من النوع المنحني.
      ملاحظة: يتحول لون الكلى إلى اللون الأحمر الداكن ، مما يؤكد الحصار الناجح لتدفق الدم داخل وخارج الكلى (الشكل 1 ب).
    6. أدخل الإبرة 30 جم المتصلة بمضخة المحقنة حوالي 3 مم في تجويف الحوض باستخدام ملقط منحني وابدأ حقن 50 ميكرولتر من محلول ناقل AAV باستخدام مضخة حقنة التسريب بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة خلال دقيقة واحدة (الشكل 1C).
    7. احتفظ بالإبرة والمشبك لمدة 5 دقائق لزيادة تعرض الكلى المحقونة لناقل AAV.
      ملاحظة: قد يختلف وقت الإقامة المناسب ويعتمد على قفيصة AAV. وقد ثبت أن وقت الإقامة البالغ 5 دقائق كاف للنقل باستخدام ناقل AAV-KP1 أو AAV-KP3.
    8. بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 5 دقائق ، قم بإزالة المشابك.
      ملاحظة: يتغير لون الكلى على الفور من الأحمر الداكن إلى الأحمر الدموي ، مما يؤكد استعادة تدفق الدم في الكلى.
    9. اسحب إبرة الحقن بعناية وببطء ، مع وضع قضيب قطني على موقع الحقن بالضغط. تأكد من عدم وجود نزيف من موقع الحقن. لا يلزم تطبيق رقعة مرقئ.
    10. ضع الكلية برفق مرة أخرى في التجويف البريتوني.
    11. خياطة طبقة العضلات بخياطة قابلة للامتصاص 6-0 والجلد بخياطة أحادية الشعيرات 5-0.
    12. قم بإعطاء 1 مل من المحلول الملحي تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران لدعم السوائل.
    13. استبدل طرف الإبرة المستخدم 30 جم بآخر معد حديثا ، وتخلص من إبرة 30 G المستخدمة وفقا لإرشادات المؤسسة لإدارة النفايات الكيميائية الخطرة ، وقم بتحميل 50 ميكرولتر من محلول ناقل AAV باستخدام مضخة حقنة التسريب لإعطائها إلى الماوس التالي.
    14. كرر الخطوات 6.2.12-6.2.13 لجميع الفئران في المجموعة ، باستثناء الخطوة الأخيرة ، والتي لا يلزم فيها الخطوة 6.2.13.
    15. بعد الانتهاء من جميع الحقن المخطط لها ، تخلص من الإبر الملوثة وأنابيب البولي إيثيلين وفقا لإرشادات المؤسسة لإدارة النفايات الكيميائية الخطرة.
  3. مراقبة ورعاية ما بعد الجراحة
    1. يتم تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ) تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران لعلاج التسكين التالي للجراحة بعد 24 ساعة و48 ساعة من حقن RP.
    2. يجب تطبيق 1 مل من المحلول الملحي تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران لدعم السوائل بعد 24 ساعة من حقن RP.
    3. مراقبة وزن الجسم والمظهر العام للفئران المحقونة يوميا لمدة أسبوع واحد بعد الجراحة. في حالة حدوث فقدان لوزن الجسم بنسبة 10٪ ، قم بإعطاء 1 مل من المحلول الملحي تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران ثلاث مرات في الأسبوع لمدة أسبوع. إذا لم يلاحظ أي تحسن ، يتم قتل الفئران المصابة.

7. حصاد الأنسجة والتشريح بالتبريد

  1. تحضير محلول التثبيت والحماية بالتبريد.
    1. 0.2 م عازلة فوسفات (إجمالي 1 لتر)
      1. تحضير 800 مل من الماء فائق النقاء في دورق زجاجي سعة 1 لتر.
      2. أضف 6.4 جم من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH2PO4) و 21.8 جم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na2HPO4) إلى المحلول.
      3. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
      4. املأ بالماء فائق النقاء حتى 1 لتر.
      5. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    2. محلول بارافورمالدهيد 4٪ (إجمالي 40 مل)
      1. امزج 10 مل من 16٪ PFA ، و 20 مل من محلول الفوسفات 0.2M المحضر في الخطوة 7.1.1 ، و 10 مل من الماء عالي النقاء.
      2. Aliquot 10 مل في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل.
        ملاحظة: اصنع محلول PFA بنسبة 4٪ قبل الاستخدام مباشرة لتثبيت التروية.
    3. محلول سكروز 30٪ (إجمالي 40 مل).
      1. امزج 30 مل من PBS مع 12 جم من السكروز.
      2. بعد الذوبان تماما ، املأ ب PBS إلى 40 مل.
  2. تثبيت التروية وحصاد الأنسجة.
    تنبيه: يجب إجراء تثبيت التروية في غطاء الدخان لأن محلول PFA بنسبة 4٪ مادة كيميائية ضارة قوية إذا تم استنشاقه.
    1. قم بتخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران ، وضعه في وضع ضعيف ، وتأكد من الغياب التام للاستجابة عن طريق الضغط برفق على الأطراف.
    2. بمجرد تخدير الفأر ، قم بعمل شق باستخدام مقص جراحي من البطن الذيلية إلى الخنجري. بعد ذلك ، قم بعمل شقين جانبيين على جانبي القص وسحب جدار الصدر من الأمام لكشف القلب والأوعية الرئيسية.
    3. افتح الأذين الأيمن عن طريق تشريح حاد لفك ضغط الدورة الدموية. أدخل إبرة فراشة 25 جم في البطين الأيسر وقم بنقع 50 مل من PBS بمعدل 10 مل / دقيقة تقريبا ، مع توجيه التدفق نحو الشريان الأورطي الصاعد.
      ملاحظة: يعد التألق المناعي أمرا مهما للحصول على صور التألق المناعي (IF) عالية الجودة لأن الدم يظهر التألق الذاتي. لضمان الإزالة الكاملة للدم ، تم استخدام 50 مل من PBS في هذه الدراسة ، على الرغم من استخدام 20-30 مل بشكل شائع.
    4. قم ببث 20 مل من محلول PFA بنسبة 4٪ المحضر في الخطوة 7.1.2 بنفس المعدل ، مما يضمن عدم إدخال الهواء أثناء تبديل المحاليل.
    5. احصد الأنسجة واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية طوال الليل في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل مملوء بمحلول PFA بنسبة 4٪ للتثبيت اللاحق. عندما يتم التعبير عن البروتين الفلوري في الأنسجة المجمعة ، قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء.
  3. التثبيت بالتبريد
    1. انقل الأنسجة إلى أنبوب بولي بروبلين سعة 15 مل مملوء بمحلول سكروز 30٪ تم إعداده في الخطوة 7.1.3 للحماية بالتبريد.
    2. يحفظ عند 4 درجات مئوية حتى تغرق الأنسجة تماما في قاع الأنابيب.
    3. انقل الأنسجة إلى برديد بلاستيكي باستخدام ملقط نمط قياسي.
    4. ضع مركب OCT فوق الأنسجة مع التأكد من أن الأنسجة موجهة بشكل صحيح وتتدفق مع الجزء السفلي من القالب بالتبريد.
    5. املأ الجزء العلوي بمركب OCT. قم بإزالة أي فقاعات بطرف ماصة.
    6. ضع المبرد البلاستيكي في حمام مبرد يحتوي على 2-ميثيل بيوتان ، مبرد بالثلج الجاف المسحوق في دلو ثلج ، حتى يتجمد مركب OCT تماما (سيتحول مركب OCT إلى اللون الأبيض).
    7. قم بتخزين كتل المناديل على حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. التقطيع بالتبريد
    1. انقل كتل الأنسجة المجمدة إلى ميكروتوم ناظم البرد عند -20 درجة مئوية قبل التقسيم واترك درجة حرارة كتل الأنسجة المجمدة بالتوازن.
    2. قسم كل كتلة من الأنسجة المجمدة إلى السماكة المرغوبة (عادة 5 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم ناظم البرد. ضع أقسام الأنسجة على شريحة زجاجية مجهرية لتلوين التألق المناعي.
    3. يمكن تخزين الأقسام عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

8. تلطيخ التألق المناعي

  1. تجف الشرائح المجمدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. اعزل القسم بقلم مانع للسائل وجففه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. أعد ترطيب الأقسام ب 150 ميكرولتر من PBS لمدة 10 دقائق.
  4. ضع الشرائح على سطح مستو وأضف 150 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار بنسبة 1٪ (BSA) المخفف ب PBS لكل قسم على الشرائح. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة للحظر.
  5. أضف 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (الجسم المضاد المضاد لورم ويلمز 1 (WT1) ، المخفف إلى 1: 100 مع 1٪ BSA ؛ الجسم المضاد المضاد ل Na-K-2Cl cotransporter 2 (NKCC2) ، مخفف إلى 1: 100 مع 1٪ BSA ؛ أو الجسم المضاد المضاد للأكوابورين 2 (AQP2) ، مخفف إلى 1: 100 مع 1٪ BSA) واحتضانه عند 4 درجات مئوية طوال الليل تحت غرفة رطبة.
  6. اغسل الأقسام باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
  7. أضف 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (الجسم المضاد IgG Alexa Fluor 647 المضاد للأرانب ، المخفف إلى 1: 500 مع 1٪ BSA) و Lotus tetragonolobus lectin (LTL) - فلوريسين (مخفف إلى 1: 200 مع 1٪ BSA) ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
  8. اغسل الأقسام باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  9. ضع الشرائح على سطح مستو وأضف 150 ميكرولتر من Hoechst 33342 (مخفف إلى 1: 10،000 مع PBS) للتلوين النووي. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، محمية من الضوء.
  10. اغسل الأقسام باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  11. قم بتركيب الشرائح ب 20 ميكرولتر من وسط التثبيت وغطاء زجاجي. احتفظ بالشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى يتم إجراء التصوير.

9. استخراج الحمض النووي من الأنسجة

  1. استخراج الحمض النووي من الأنسجة باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد).
    1. انقل الأنسجة إلى أنبوب حبة خزفي وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي (100 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار EDTA ، 1٪ SDS ، و 50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0).
    2. تجانس الأنسجة بسرعة 5 م / ث لمدة 20 ثانية في 3 دورات باستخدام الخالط.
    3. جهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
    4. اجمع 200 ميكرولتر من المادة الطافية باستخدام ماصة P200 وأضف 10 ميكرولتر من محلول البروتيناز K (التركيز النهائي 1 ملغم/مل).
    5. امزج عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل من مجموعة استخراج الحمض النووي.
    7. تخلط عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية وتحتضن عند 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    8. أضف 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
    9. تخلط عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    10. ضع المحللة على عمود دوران استخراج الحمض النووي.
    11. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    12. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل. أضف 500 ميكرولتر من أول مخزن مؤقت للغسيل من مجموعة استخراج الحمض النووي.
    13. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    14. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني من مجموعة استخراج الحمض النووي.
    15. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    16. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
    17. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    18. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل وجهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة التجفيف الكامل لغشاء عمود الدوران ، حيث يمكن أن يتداخل ترحيل الإيثانول إلى المصفاة مع التطبيقات النهائية.
    19. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. أضف 35 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف من مجموعة استخراج الحمض النووي إلى عمود الدوران.
      ملاحظة: عادة ما يكون حجم الشطف المستعاد أقل بحوالي 5 ميكرولتر من حجم المخزن المؤقت للشطف المطبق في البداية على العمود.
    20. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    21. جهاز طرد مركزي عند 20،000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
    22. قياس تركيز الحمض النووي.
  2. القياس الكمي لعدد نسخة الجينوم المتجه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
    1. تمييع الحمض النووي المستخرج المحضر في الخطوة 9.1 بتركيز 25 نانوغرام / ميكرولتر بماء من الدرجة الجزيئية.
    2. صمم زوجا أوليا qPCR للقياس الكمي لجينوم المتجه (تم استخدام tdTomato في هذه الدراسة) وزوج تمهيدي qPCR للجين المرجعي للفأر الذي سيتم استخدامه لتحديد الجينومات ثنائية الصبغيات في عينات الحمض النووي المستخرجة (تم استخدام جين agouti للفأر في هذه الدراسة).
      ملاحظة: التسلسلات التمهيدية المستخدمة في هذه الدراسة هي كما يلي ؛
      tdTomato إلى الأمام: 5 '-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdTomato عكس : 5 '-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3 '
      الماوس إلى الأمام: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      عكس الماوس: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. لتفاعل qPCR سعة 25 ميكرولتر ، امزج 4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المخففة في الخطوة 9.2.1 (ما مجموعه 100 نانوغرام من الحمض النووي في خليط تفاعل 25 ميكرولتر) ، و 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل qPCR 2x ، و 0.5 ميكرولتر من كل من الأعداد الأولية 20 ميكرومتر للأمام والعكسي المحضرة في الخطوة 9.2.2 (التركيز النهائي 400 نانومتر من كل طبقة أولية) ، و 7.5 ميكرولتر من الماء الجزيئي.
    4. قم بقياس تركيز الحمض النووي لمعايير البلازميد ل qPCR أربع مرات وحدد متوسط قيمة تركيز الحمض النووي.
      ملاحظة: تم استخدام بلازميد pAAV-CAG-tdTomato الدائري فائق الالتفاف وبلازميد دائري فائق الالتف يحتوي على تسلسل هدف PCR المشتق من جين agouti الفأر لقياس جينوم المتجهات والتطبيع ، على التوالي ، في هذه الدراسة.
    5. قم بإعداد سلسلة من التخفيفات التسلسلية 1:10 لمعايير الحمض النووي البلازميد التي تغطي نطاقا ديناميكيا من 106.
      ملاحظة: يجب تحليل كل عينة ومعيار على الأقل في نسختين.
    6. قم بإجراء qPCR باستخدام ظروف التدوير الحراري التالية: خطوة تنشيط حرارية أولية عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 35 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتلدين / التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    7. بعد الانتهاء من تفاعل qPCR والحصول على قيم رقم النسخ مزدوجة الشريطة (ds) لجينومات المتجهات والجين المرجعي للفأر في العينات ، حدد أرقام نسخ الجينوم المتجه ds لكل مكافئ جيني ثنائي الصبغيات (ds-vg / dge) عن طريق تطبيع أرقام نسخ الجينوم المتجه ds إلى رقم نسخة الجين المرجعي في كل عينة بناء على المنحنيات القياسية التي تم إنشاؤها من التركيزات المعروفة لكل من الجينوم المتجه والجين المرجعي.
      ملاحظة: يمكن تحديد Ds-vg / dge بناء على التقريب التالي بأن 100 نانوغرام من الحمض النووي الجيني للفأر يمثل 16,900 خلية فأر ثنائية الصبغيات (2N) (أي 5.92 بيكوغرام من الحمض النووي لكل خلية فأر ثنائية الصبغيات).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

حددت دراسة حديثة مجموعة فرعية صغيرة من قفيصة AAV التي تظهر تحسنا ملحوظا في نقل الكلى مقارنة ب AAV9 بعد حقن RP38. تتضمن المجموعة الفرعية المحددة AAV-KP3 ، وهو قفيصة AAV خيمرية ناتجة عن خلط الحمض النووي41. لذلك ، تم اختيار AAV-KP3 لحقن RP في هذه الدراسة ، جنبا إلى جنب مع AAV9 كمعيار قياسي. AAV9-CAG-tdناقلات الطماطم (AAV9) و AAV-KP3-CAG-tdTomato vector (KP3) في خلايا HEK293 بواسطة طريقة تعداء البلازميد الخالية من الفيروسات الغدية وتنقيتها بواس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يحتوي هذا التقرير على حقن RP البطيء إلى الوراء لنواقل AAV كطريقة إدارة محلية لتوصيل الجينات إلى كلية الفأر. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لإجراء حقن RP بأمان في تعديل معدل حقن نواقل AAV لتجنب الضرر المتني للكلى المحقونة. في تقرير سابق عن حقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي ، تم حقن 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي البلازميد في كلية الفأر في غضون 3 ثوانو 24 فقط. هذا الحقن السريع ضروري لزيادة نفاذية غشاء الخلية العابر من أجل تعداء الحمض النووي الفعال ولكن يمكن أن يؤدي إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يتلقى H.N. إتاوة من التقنيات المتعلقة ب AAV المرخصة من قبل Takara Bio Inc. و Capsigen Inc. ، ويعمل كمستشار لشركات التكنولوجيا الحيوية ، وهو مؤسس مشارك لشركة Capsigen Inc. ، ويمتلك أسهما في Capsigen Inc. و Sphere Gene Therapeutics.

شكر وتقدير

نشكر Guangping Gao و James M. Wilson لتزويدنا بالبلازميد المساعد ل AAV9 و Katja Pekrun و Mark A. Kay على البلازميد المساعد ل AAV-KP3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 μm PVDF syringe filterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific05-408-129
15 mL polypropylene tubeCorning352097
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifuge bottleFisher Scientific055641S24
2F Silicone tubingSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G butterfly needleMedex Supply26708
2-methylbutaneMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaction bufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G needleBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropylene tubeCorning430291
5-0 monofilament sutureEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sutureEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tubeMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibodyAbcamab199975A marker for collecting duct cells
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antibody		StressMarq BiosciencesSPC-401A marker for thick ascending limb
cells
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
antibody		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibodyAbcamab89901A marker for podocytes
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylene, 29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugal ultrafiltration tubeMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Ceramic bead tubeFisher Scientific15-340-154
Cesium chlorideSigma-AldrichC3032-1KG
Clamp applying forcepsFine Science Tools00071-14
Closed-loop heat padStryker Medical8002-062-012
Cotton-tipped applicatorPuritan806-WC
Cover glassFisher Scientific12-541B
Cryostat microtomeTanner ScientificTN50
Curved forcepsFine Science Tools11052-10
Curved-type micro vessel clipKleinert-Kutz65145Clamp for the renal artery and renal
vein
Dialysis cassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extraction kitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
high glucose		Corning15-013-CVDMEM-high glucose (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal bovine serum (FBS)VWR89510-186
Gas-tight glass syringeHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
Heat therapy pumpKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenizerFisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
cells		Agilent240073
Ice bucketFisher Scientific07-210-104
Infusion syringe pumpHarvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Liquid blocker penTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2A marker for proximal tubules
Magnesium chloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgesic
Microscope glass slideFisher Scientific12-550-15
Mounting mediumSouthernBiotech0100-01
Needle holderFine Science Tools12501-13
OCT compoundSakura Finetek4583
Ophthalmic ointmentBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethylene tubeBD427401Inner diameter: 0.28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific10010-049
Plastic cryomoldSakura Finetek4566
Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant
(10%)		Fisher Scientific24-040-032
Polyethylene Glycol 800

المراجع

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
  6. Tavakolidakhrabadi, N., Ding, W. Y., Saleem, M. A., Welsh, G. I., May, C. Gene therapy and kidney diseases. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (4), 101333(2024).
  7. Miyazaki, M., Yamashita, T., Miyazaki, T., Taira, H., Suzuki, A. Gene delivery to renal tubular epithelial cells using adeno-associated virus vector in domestic cats. Res Vet Sci. 87 (3), 408-412 (2009).
  8. Qi, Y. F., et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (1), 53-55 (2013).
  9. Takeda, S., et al. Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: Comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol. 96 (4), e119-e126 (2004).
  10. Zhong, F., et al. Protein S Protects against Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 29 (5), 1397-1410 (2018).
  11. Chen, S., et al. Gene delivery in renal tubular epithelial cells using recombinant adeno-associated viral vectors. J Am Soc Nephrol. 14 (4), 947-958 (2003).
  12. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: Conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
  13. Wang, P., et al. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. Sci Transl Med. 10 (462), eaat2039(2018).
  14. Haddad, G., et al. Renal AAV2-mediated overexpression of long non-coding RNA H19 attenuates ischemic acute kidney injury through sponging of microRNA-30a-5p. J Am Soc Nephrol. 32 (2), 323-341 (2021).
  15. Asico, L. D., et al. Nephron segment-specific gene expression using AAV vectors. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 19-24 (2018).
  16. Chung, D. C., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to renal tubule cells via a retrograde ureteral approach. Nephron Extra. 1 (1), 217-223 (2011).
  17. Ito, K., et al. Adeno-associated viral vector transduction of green fluorescent protein in kidney: Effect of unilateral ureteric obstruction. BJU Int. 101 (3), 376-381 (2008).
  18. Konkalmatt, P. R., et al. Renal rescue of dopamine D2 receptor function reverses renal injury and high blood pressure. JCI Insight. 1 (8), e85888(2016).
  19. Rubin, J. D., Nguyen, T. V., Allen, K. L., Ayasoufi, K., Barry, M. A. Comparison of gene delivery to the kidney by adenovirus, adeno-associated virus, and lentiviral vectors after intravenous and direct kidney injections. Hum Gene Ther. 30 (12), 1559-1571 (2019).
  20. Saito, S., et al. rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol. 23 (12), 1345-1356 (2019).
  21. Shen, X., et al. Transparenchymal renal pelvis injection of recombinant adeno-associated virus serotype 9 vectors is a practical approach for gene delivery in the kidney. Hum Gene Ther Methods. 29 (6), 251-258 (2018).
  22. Wang, J. N., et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 14 (640), eabk2709(2022).
  23. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  24. Woodard, L. E., et al. Hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney. J Vis Exp. (131), e56324(2018).
  25. Yadav, M. K., Yoo, K. W., Atala, A., Lu, B. Lentiviral vector mediated gene therapy for type Dent disease ameliorates Dent disease-like phenotypes for three months in CIC-5 null mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 149-166 (2022).
  26. Hillestad, M. L., Guenzel, A. J., Nath, K. A., Barry, M. A. A vector-host system to fingerprint virus tropism. Hum Gene Ther. 23 (10), 1116-1126 (2012).
  27. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  28. Ikeda, Y., Sun, Z., Ru, X., Vandenberghe, L. H., Humphreys, B. D. Efficient gene transfer to kidney mesenchymal cells using a synthetic adeno-associated viral vector. J Am Soc Nephrol. 29 (9), 2287-2297 (2018).
  29. Williams, R. M., et al. Mesoscale nanoparticles selectively target the renal proximal tubule epithelium. Nano Lett. 15 (4), 2358-2364 (2015).
  30. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  31. Koike, H., et al. An efficient gene transfer method mediated by ultrasound and microbubbles into the kidney. J Gene Med. 7 (1), 108-116 (2005).
  32. Ishida, R., et al. Kidney-specific sonoporation-mediated gene transfer. Mol Ther. 24 (1), 125-134 (2016).
  33. Davis, L., Park, F. Gene therapy research for kidney diseases. Physiol Genomics. 51 (9), 449-461 (2019).
  34. Rubin, J. D., Barry, M. A. Improving molecular therapy in the kidney. Mol Diagn Ther. 24 (4), 375-396 (2020).
  35. Huang, S., et al. Application of ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated exogenous gene transfer in treating various renal diseases. Hum Gene Ther. 30 (2), 127-138 (2019).
  36. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  37. Wang, J. H., Gessler, D. J., Zhan, W., Gallagher, T. L., Gao, G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  38. Furusho, T., et al. Enhancing gene transfer to renal tubules and podocytes by context-dependent selection of AAV capsids. Nat Commun. 15 (1), 10728(2024).
  39. Ding, W. Y., et al. Adeno-associated virus gene therapy prevents progression of kidney disease in genetic models of nephrotic syndrome. Sci Transl Med. 15 (708), eabc8226(2023).
  40. Wu, G., et al. Adeno-associated virus-based gene therapy treats inflammatory kidney disease in mice. J Clin Invest. 134 (17), e174722(2024).
  41. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  42. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  43. Shen, S., et al. Engraftment of a galactose receptor footprint onto adeno-associated viral capsids improves transduction efficiency. J Biol Chem. 288 (40), 28814-28823 (2013).
  44. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med. 5 (189), 189ra176(2013).
  45. Gomes, M. M., Wang, L., Jiang, H., Kahl, C. A., Brigande, J. V. A rapid, cost-effective method to prepare recombinant adeno-associated virus for efficient gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol Biol. 1427, 43-57 (2016).
  46. Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative dot blot assay for AAV titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins. J Vis Exp. (136), e56766(2018).
  47. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 5, 3075(2014).
  48. Lu, Z. Y., et al. Constitutive and conditional gene knock-out mice for the study of intervertebral disc degeneration: Current status, decision considerations, and future possibilities. JOR Spine. 6 (1), e1242(2023).
  49. Kaspar, B. K., et al. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  50. Werfel, S., et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knock-out in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 104 (1), 15-23 (2014).
  51. Jinek, M., et al. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  52. Wang, X., Huang, X., Fang, X., Zhang, Y., Wang, W. CRISPR-Cas9 system as a versatile tool for genome engineering in human cells. Mol Ther Nucleic Acids. 5 (11), e388(2016).
  53. Ueki, K., et al. Establishment of pancreatic -cell-specific gene knock-out system based on CRISPR-Cas9 technology with AAV8-mediated gRNA delivery. Diabetes. 72 (11), 1609-1620 (2023).
  54. Marichal-Gallardo, P., et al. Single-use capture purification of adeno-associated viral gene transfer vectors by membrane-based steric exclusion chromatography. Hum Gene Ther. 32 (17-18), 959-974 (2021).
  55. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  56. Chen, S. H., et al. A simple, two-step, small-scale purification of recombinant adeno-associated viruses. J Virol Methods. 281, 113863(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ناقلات AAVالحقن الكلوي الرجوعيالعلاج الجيني للكلىترانسدكشن الأنيبيبات القريبةAAV بـ CsClAAV بـ CUنماذج أمراض الكلىترانسدكشن في الجسم الحي
توصيل الجينات الفعال والآمن إلى كلية الفأر عن طريق الحقن البطيء للحوض الكلوي الرجعي لناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.