مقالة منهجية

منهجية محسنة لدراسة تكوين العظم بعد الولادة عن طريق التعظم الغشائي في نموذج إصابة نخاع عظم الفئران

DOI:

10.3791/67727

⸱

فبراير 7, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نموذج إصابة نخاع عظم الفئران أداة مفيدة لدراسة تكوين العظم بعد الولادة من خلال التعظم داخل الغشاء. يصف هذا البروتوكول الجراحي المبسط إجراء استئصال نخاع العظم لتقييم المصب لتكوين العظام الجديدة والاستجابات الخلوية بعد الإصابة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلتئم إصابات العظام الطويلة من خلال مسارات تكوين العظام الغضروفي أو داخل الغشاء. على عكس المسار الغضروفي الذي يتطلب قالب غضروف ، فإن عملية التعظم داخل الغشاء تتضمن التحويل المباشر للخلايا الجذعية والسلفية للهيكل العظمي (SSPCs) إلى بانيات عظمية مكونة للعظام. هناك طرق جراحية محدودة لنمذجة هذه العملية في فئران التجارب. هنا ، قمنا بتحسين نموذج إصابة نخاع العظم في الفئران لتسهيل دراسة إصلاح العظام عن طريق التعظم داخل الغشائي وتقييم منظمات تكوين العظم بعد الولادة. هذه الطريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وسهلة الاستخدام ، وتسمح بالتقييم الزمني لتكوين العظام الجديدة في فترة قصيرة (3-7 أيام بعد الإصابة) باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) وأنسجة القسم المجمد. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم مساهمات SSPCs وبانيات العظم الناضجة بسهولة باستخدام مزيج من الفئران المراسلة الفلورية ونموذج إصابة نخاع العظم الغشائي هذا. في السياقات السريرية ، يكون تكوين العظام داخل الغشاء مناسبا لشفاء عيوب الحجم الحرجة ، والكسور المستقرة ، والعيوب القشرية ، والصدمات الناتجة عن استئصال الورم ، واستبدال المفاصل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلتئم إصابات العظام الطويلة من خلال مسار تكوين العظام الغضروفي أو داخل الغشاء. على عكس المسار الغضروفي ، الذي يتطلب خطوة سلائف الغضروف ، فإن إصلاح العظام عن طريق التعظم داخل الغشائي ينطوي على التحويل المباشر للخلايا الجذعية والسلفية للهيكل العظمي (SSPCS) إلى بانيات عظم مكونةللعظام 1. سريريا ، هذه العملية ذات صلة بالتئام العظام في مجموعة متنوعة من السياقات ، بما في ذلك عيوب الحجم الحرجة ، والكسور المستقرة ، والعيوب القشرية ، وتكوين العظم الناتج عن الإلهاء ، والصدمات الناتجة عن استئصال الورم ، والاندماج العظمي لغرسات استبدال المفاصل2،3. ومن المثير للاهتمام ، في الدراسات التي أجريت على المرضى الذين يعانون من كسور العظام الطويلة ، كان لدى 66٪ -82٪ كسور نازحة ، مما يتطلب أجهزة تثبيت لتثبيت العظام4،5. تلتئم هذه العظام المستقرة بشكل صارم بشكل أساسي من خلال التعظم داخل الغشائي حيث تتلامس نهايات العظام المكسورة بشكل مباشر مع بعضها البعض6،7. ومع ذلك ، فإن التنظيم الميكانيكي لتجديد العظام داخل الغشاء لا يزال غير مدروس نسبيا مقارنة بتكوين العظام عبر المسارات الغضروفي يتم إعاقة العلاجات المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) لزيادة التئام العظام بسبب الفعالية السريرية المحدودة والتكاليف المرتفعة وترتبط بآثار ضارةكبيرة 8.

يوفر استئصال نخاع العظم الميكانيكي نموذجا قيما لدراسة تكوين العظام داخل الغشاء. يسمح نموذج الإصابة البسيط هذا بدراسة تجديد العظام في نخاع العظام دون تعطيل العظم القشري. بعد استئصال BM ، تتضمن عملية الشفاء مراحل متميزة ولكنها متداخلة. تحدث المرحلة الأولية في أول 1 إلى 5 أيام وتتضمن تكوين جلطة والتهابات ، حيث تبدأ الخلايا الالتهابية والسيتوكينات في الشفاء. من الأيام 3 إلى 14 ، تتميز المرحلة الثانية بالتجديد ، بما في ذلك الأوعية الدموية الجديدة ، وهجرة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) وانتشارها ، وتمايز الخلايا العظمية ، وتكوين العظام المنسوجة. تبدأ مرحلة إعادة التشكيل النهائية بعد حوالي 10 أيام من الجراحة ، حيث تخضع أنسجة العظام للنضوج وإعادة الهيكلة حتى يتم استعادة النخاع بالكامل بحلول اليوم 569. هذا الجدول الزمني للشفاء السريع يجعل نموذج استئصال BM مثاليا لدراسة استجابات إصلاح العظام المبكرة ، خاصة خلال الفترات الحرجة للالتهاب ، وتجنيد الخلايا السلفية ، وتمايز بانيات العظم. باستخدام تقنيات مثل علم الأنسجة وقياس التدفق الخلوي والتحليل الكمي للأشعة المقطعية ، يمكن تقييم الاستجابات الخلوية وتكوين العظام في مراحل الإصلاح المبكرة. باستخدام التقنيات المذكورة أعلاه ، يمكن أن يوفر نموذج استئصال BM نظرة ثاقبة لآليات تجديد العظام داخل الغشائية ويساعد في تحديد الأهداف العلاجية الرئيسية لتعزيز التئام العظام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ الإجراءات التالية بموافقة لجنة رعاية واستخدام المؤسسي بالمركز الصحي بجامعة كونيتيكت (IACUC). تم إجراء جميع العمليات الجراحية في ظل ظروف معقمة كما هو موضح في إرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH). تمت إدارة الألم وخطر الإصابة بالعدوى باستخدام المسكنات والمطهرات المناسبة لضمان نتيجة ناجحة.

1. تحضير المنطقة الجراحية والأدوات

  1. جهز غرفة العمليات الجراحية عن طريق تطهير أسطح العمل بمنظف مطهر سريري.
    ملاحظة: يجب على الجراح ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، بما في ذلك القفازات المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة ، وغطاء الشعر ، والعباءة ، والقناع.
  2. قم بإعداد وسادة تدفئة مغطاة بوسادة جراحية معقمة. اجمع ورتب جميع الأدوات والكواشف المعقمة (جدول المواد) مع سهولة الوصول إليها.

2. التخدير قبل الجراحة

  1. قم بوزن جميع الفئران قبل الجراحة. احسب كميات المسكن المراد استخدامه بناء على التركيبة المتاحة للبوبرينورفين.
  2. قم بتجميع وحدة تخدير داخل مساحة العمل المعقمة ، والتي تتضمن غرفة تحريض ومجموعة مخروط أنف. اضبط إخراج الأكسجين على 2 لتر دقيقة -1 والأيزوفلوران على 1.5-3٪ (حجم / حجم) حسب عمر الفأر ووزنه.
  3. بمجرد تخدير الفأر ، أخرج من غرفة الحث وضعه على وسادة جراحية معقمة في وضع الاستلقاء. ضع مزلق العين على كلتا العينين. ضع مخروط الأنف فوق الرأس. تأكد من تخدير الماوس بشكل كاف عن طريق الضغط برفق على إصبع القدم. تأكد من عدم وجود استجابة انعكاسية للأطراف الخلفية قبل المتابعة.
  4. قبل الجراحة ، قم بإزالة الفأر لفترة وجيزة من مخروط الأنف لحقن الجرعة الإجمالية من البوبرينورفين الممتد عبر الطريق تحت الجلد ؛ الجرعة الإجمالية 3.25 مجم / كجم.

3. وصف الإجراء الجراحي

ملاحظة: يستخدم هذا الإجراء الجراحي C57BL / 6 من الذكور والإناث من الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 10 أسابيع و 24 أسبوعا. يمكن إجراء الإجراء على الفئران التي لا يقل عمرها عن 6 أسابيع حتى 33 أسبوعا وعلى سلالات فطرية مختلفة ، كما هو موضح من قبل الآخرين10،11. قد تتطلب الفئران الأصغر سنا أطوال إبرة أقصر ، بينما قد تتطلب الفئران الأكبر سنا أو الأكبر إبرة أطول.

  1. املأ حقنة سعة 3 مل مزودة بإبرة 26 جم بمحلول ملحي معقم. ضع هذا على الجانب.
  2. قم بإزالة الفراء من الطرف الخلفي الذي سيتم إجراء العملية عليه باستخدام مقص كهربائي أو يعمل بالبطارية (شفرة # 40) وإزالة أي فرو فضفاض من المجال الجراحي. باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية ، عالج موقع الجراحة بمقشر يحتوي على اليود (10٪ بوفيدون - يود) ، متبوعا بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪. افرك موقع الجراحة بدءا من منتصف الركبة وقم بإجراء مسح دائري للخارج. دع الموقع يجف. كرر خطوات التنظيف 3 مرات.
  3. ضع الماوس على ظهره وثني ركبة الساق المنطوقة. أمسك ساق الفأر في اليد غير المهيمنة بحيث تنحني الركبة فوق الإصبع الأوسط ، ويستقر الإصبع الثاني على عظم الفخذ ، ويستقر الإبهام على الظنبوب.
  4. قم بعمل شق أفقي صغير ضحل أسفل الرضفة مباشرة باستخدام مشرط.
    ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على تحسين تصور موقع الإدراج. مع الخبرة ، يمكن تخطي هذه الخطوة.
  5. حدد مساحة المفصل عن طريق وضع الإبرة أفقيا عبر الركبة المثنية والشعور بالمسافة بين عظم الفخذ والساق. باستخدام هذا الموقع التشريحي للتوجيه ، خذ إبرة 25 جم وقم بالحفر يدويا (عن طريق لف الإبرة والضغط المعتدل في نفس الوقت على الإبرة) في عظم الفخذ البعيد من الركبة باتجاه الجانب القريب. أدخل الإبرة من خلال الرضفة أو حولها.
  6. قم بتصوير الفأر بالأشعة السينية للتأكد من وضع الإبرة بشكل مناسب في التجويف النخاعي ، بالقرب من المركز قدر الإمكان (الشكل 1).
  7. قم بإزالة الإبرة 25 جم وأدخل إبرة 26 جم على الفور في نفس الفتحة داخل تجويف النخاع. قم بربط جوانب التجويف النخاعي بحركة دائرية 5 مرات على الأقل حتى تشعر بالنعومة. حافظ على اتساق عدد حركات التوسيع بين كل ماوس.
    ملاحظة: قد تتسبب الخطوتان 3.5 و 3.7 في إصابة الجراح بالإبر إذا لم يتم التعامل معها بعناية.
  8. قم بإزالة الإبرة 26 جم واستبدل الإبرة 26 جم المتصلة بالمحقنة المالحة. اغسل التجويف حتى يصبح التدفق العكسي واضحا. يتطلب هذا عادة 1.5-2 مل من المحلول الملحي. قم بإزالة المحقنة والإبرة وتخلص منها بأمان في وعاء حاد.
    ملاحظة: لا ينبغي أن تكون هناك مقاومة عند دفع السائل. إذا كان الأمر كذلك ، فأعد إدخال الإبرة للتأكد من أنها داخل التجويف. قد يكون من الضروري سحب الإبرة في منتصف الطريق.
  9. أغلق الجرح الجلدي باستخدام خياطة لاصقة موضعية.

4. رعاية ما بعد الجراحة

  1. بعد الجراحة مباشرة، يتم تطبيق نصف الجرعة المتبقية من البوبرينورفين طويل المفعول باستخدام الجرعات من الخطوة 2.4.
    ملاحظة: يوفر بوبرينورفين ممتد المفعول تخفيف الآلام لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  2. راقب الموجودة على وسادة التدفئة بحثا عن علامات التنفس الطبيعي دون عائق حتى تستيقظ من الجراحة. بمجرد أن تكون متنقلة ، أعد الفئران إلى قفصها.
  3. استمر في مراقبة الفئران مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة للتأكد من أنها تلتئم بشكل صحيح ولديها حركة كاملة ، ومراقبة علامات الألم.

5. معالجة العظام لمسح وتحليل μCT

  1. القتل الرحيم للفئران وفقا لطريقة القتل الرحيم الإنسانية التي تنظمها ووافقت عليها IACUC أو غيرها من السياسات المؤسسية المعمول بها. هنا ، تم استخدام طريقة القتل الرحيم الأولية لاستنشاق ثاني أكسيد الكربون2 ، تليها طريقة ثانوية لخلع عنق الرحم.
  2. احصد عظم الفخذ عن طريق تقشير الجلد حول الأطراف الخلفية وإزالة الطرف بالكامل في مفصل الورك.
  3. ضع كل طرف بين إسفنجتين في شريط مدمج. انقل العظام الموجودة في الكاسيتات إلى محلول فورمالين بنسبة 10٪ وثبتها عند 4 درجات مئوية لمدة 5-7 أيام ، مع مراعاة عمر وحجم الماوس.
    ملاحظة: يؤدي كل من التثبيت المفرط ونقص التثبيت إلى ضعف دقة النخاع.
  4. بعد التثبيت ، اغسل الكاسيت في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق 3 مرات.
  5. قم بإزالة الأطراف من الكاسيت وقص العضلات باستخدام مشرط حسب الحاجة.
    ملاحظة: اعتمادا على التطبيقات النهائية ، يمكن أن تؤدي المناولة الخشنة إلى تعطيل الطبقة السمحاقية للعظام.
  6. افصل عظم الفخذ في الركبة عن طريق قطع الأربطة بعناية باستخدام مقص جراحي صغير أو مشرط.
    ملاحظة: يمكن استخدام الظنبوب لتطبيقات أخرى أو التخلص منه.
  7. انقل عظم الفخذ إلى أنابيب مخروطية 1.7 مل أو 15 مل إلى محلول إيثانول بنسبة 70٪. يمكن أن تبقى العظام في 70٪ من الإيثانول عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للفحص بالأشعة المقطعية.
  8. مسح وتقييم عظم الفخذ بحثا عن المعلمات التربيقية ، وإنتاج بيانات نوعية وكمية.

6. معالجة العظام للتقطيع المجمد والأنسجة

ملاحظة: يمكن معالجة العظام للتجميد والأنسجة بعد الخضوع لفحص μCT. لا يؤثر المسح على وضع العلامات الفلورية أو تلطيخ الأجسام المضادة اللاحقة.

  1. انقل العظام من 70٪ إيثانول إلى PBS واغسلها 3 مرات ، 5 دقائق لكل غسلة.
  2. احتضان في سلسلة من محاليل السكروز من 10٪ ، 20٪ ، إلى 30٪ في PBS عند 4 درجات مئوية طوال الليل عند كل تركيز. قم بتخزين العظام في 30٪ سكروز لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية أو في هذا المحلول عند -20 درجة مئوية لمدة 6-12 شهرا حتى تصبح جاهزة للتضمين.
    ملاحظة: يؤدي استخدام تدرج السكروز إلى اختراق أفضل للأنسجة. بعد الخطوة 6.1 ، يمكن وضع العظام مباشرة في محلول سكروز بنسبة 30٪ طوال الليل.
  3. قم بتضمين العظام في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) باستخدام قوالب التثبيت بالتبريد. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للقسم.
  4. قسم العظام المدمجة باستخدام طريقة شريط الأغشية المبردة مع ضبط درجة حرارة ناظم البرد بين -24 درجة مئوية و -26 درجة مئوية.
  5. قم بلصق الأقسام الموجودة على الأغشية المبردة بشريحة لاصقة باستخدام مادة لاصقة بصرية وقم بمعالجتها حتى تصلب باستخدام الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية (UV).

7. معالجة قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: هذا البروتوكول متوافق مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة. لتوصيف الخلايا الجذعية والهيكلية السلفية ، يوصى بتجميع 3-4 عظام معا لأن هذه مجموعات خلايا نادرة في نخاع العظام.

  1. تحضير وسائط تلطيخ فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) (FSM). لعمل محلول 1000 مل من FSM ، امزج: 100 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ، 10 مل من 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك (HEPES) ، 20 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، 870 مل من DD H2O. مرر محلول FSM عبر مرشح 0.2 ميكرومتر.
  2. قبل حصاد الأنسجة ، املأ أطباق بتري ب 4-5 مل من PBS المعقم بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
  3. تحضير وسائط الهضم
    1. لكل 4-6 عظم الفخذ ، قم بإعداد خليط هضم في 10 مل من PBS يحتوي على 0.005 جم من الكولاجيناز P و 0.02 غرام من الهيالورونيداز. امزج عن طريق دوامة لطيفة ومرر الخليط عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.
  4. حصاد العظام في اليوم 3 بعد الجراحة كما هو موضح في الخطوة 5.2. قم بإزالة جميع العضلات والأنسجة الضامة بشفرة مشرط.
  5. املأ طبق بتري ب 5 مل من وسائط الهضم. ضع 4-6 عظام في وسط الهضم. اقطع كل عظم جيدا ، مع عمل القطع الأول طوليا وجانبيا.
  6. انقل الأنسجة إلى أنبوب دائري القاع سعة 14 مل وأغلقه بالبارافيلم قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم.
  7. رج العبوة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة عن طريق إبقاء الأنبوب أفقيا على شاكر.
  8. قم بإزالة الأنبوب من شاكر. سيتم تكتل الخلايا في الأسفل. اجمع المادة المهضومة برفق دون إزعاج الخلايا الموجودة في القاع ، وقم بتمرير الهضم عبر مرشح 70 ميكرومتر. اجمع المرشح في أنبوب جديد سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من FSM البارد واحتفظ به على الجليد.
  9. أضف إلى الخلايا 5 مل المتبقية من مزيج الهضم. ختم مرة أخرى بالبارافيلم وقم بتغطيته بورق الألمنيوم. هز الأنبوب كما هو موضح أعلاه. كرر الخطوات 7.7-7.8.
  10. بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، انقل الملخص إلى نفس الأنبوب الذي يحتوي على الملخص من الخطوة 7.8 ، مرورا بمرشح 70 ميكرومتر مع 10 مل أخرى من FSM.
  11. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 274 × جم عند 4 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية وجمع حبيبات الخلية. قم بإزاحة الحبيبات عن طريق النقر برفق على الأنبوب.
    ملاحظة: تعتمد قوة الطرد المركزي (g) على نصف قطر دوار يبلغ 170 مم. يرجى التحقق من نصف قطر الدوار وضبط السرعة وفقا لذلك.
  12. لإجراء تحلل خلايا الدم الحمراء ، أضف 1 مل من محلول التحلل من كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK). احتفظ بجميع الكواشف والخلايا على الجليد.
  13. احتضان الخلايا في ACK لمدة 5 دقائق تقريبا في RT. لا تتجاوز 5 دقائق لتجنب الإفراط في تحلل الخلايا.
  14. أضف 9 مل من FSM. جهاز طرد مركزي عند 274 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  15. شفط المادة الطافية. قم بتفكيك بيليه الخلية عن طريق جرف الأنبوب برفق على رف أنبوبي.
  16. أضف 10 مل من FSM (حجم 4 عظام ، يمكن تعديله بناء على عدد العظام التي تم دمجها) وإعادة تعليقه.
  17. خذ حصة من كل عينة وأضف يوديد البروبيديوم (PI) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عد الخلايا الحية والإجمالية باستخدام عداد خلوية.
  18. تابع تلطيخ الأجسام المضادة للعينات باستخدام العلامات المرغوبة لتحليل قياس التدفقالخلوي 12،13،14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التحقق من نجاح إجراء الاستئصال الميكانيكي لنخاع العظم (BM) عن طريق التصوير بالأشعة السينية ، بينما تم إدخال إبرة 26G في التجويف النخاعي (الشكل 2 أ). عندما أشار التصوير بالأشعة السينية إلى أن الإبرة قد تم إدخالها بزاوية غير مناسبة أو اخترقت العظم ، تمت إعادة إدخال الإبرة بالزاوية المناسبة وإعادة تصويرها لتأكيد الوضع الدقيق. عندما يتعذر تحقيق موقف ناجح ، تم استبعاد من التحليل. في حين أن التصوير الشعاعي ثنائي الأبعاد (2D) يمكن أن يؤكد أن الإبرة قد تم إدخالها داخل تجويف BM ، فإن التصوير ثلاثي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان الهدف هو إنشاء طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لدراسة العمليات الجزيئية والخلوية التي تحكم إصلاح العظام ، مع التركيز على التحويل المباشر للهيكل العظمي والخلايا السلفية (SSPCs) إلى بانيات عظمية ترسيب للعظام في مساحة / تجويف نخاع العظام. طريقة استئصال نخاع العظم الميكانيكية الموضحة هنا هي بروتوكول محسن ومعتمد لاستئصال نخاع العظم عن طريق الإصابة الميكانيكية ، مما يسمح بالتحقيق في تكوين العظام داخل الغشاء. تعد العديد من الخطوات في هذا البروتوكول حاسمة لضمان تكوين قوي للعظام بعد الإصابة وقابل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات للإبلاغ عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من قبل NIH / NIDCR R01-DE030716-01 و NIH / NIAMS R01-DE030716-01S1 إلى AS و NIH / NIAMS R01AR080131 إلى RG و UConn REP Convergence Grant إلى RG و AS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ محلول الفورمالين Sigma-AldrichHT501128
25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Hypodermic NeedleAit Tite / Fisher Scientific14-817-239 ؛ المرجع #NEZ25058
26 G 1/2 "إبر تحت الجلد يمكن التخلصExel International / Fisher Scientific14-840-83 ؛ المرجع # 26402يمكن استبدال أي إبر 26 G ، يجب أن تكون قابلة للفصل من المحقنة   ؛
3 مل حقنة معقمةفيشربراند / فيشر العلمية   ؛14-955-457
AB وسادة معقمةMcKesson / فيشر ScientificNC0593755بدلا من ذلك يمكن استخدام منصات ماصة قابلة للتعقيم   ؛
حمض الخليك ، الجليديMillipore SigmaAX0073يحتاج إلى تخفيفه إلى 1٪
من محلول الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) محلول عازلةGibco / Thermo Fisher Scientific   ؛A1049201يستخدم لتحلل خلايا الدم الحمراء استعدادا لقياس التدفق الخلوي 
غرفة تحريض التخدير 2 لترVetEquip941444
البيتادين (بروفيدون اليود) محلول  Penn Veterinary Supply Inc / Fisher ScientificNC0158124
Buprenorphine HCL Injection 0.3 mg / mL   ؛عام / Covetrus59122يجب الحصول على ترخيص إدارة مكافحة المخدرات الحكومية والفيدرالية لشراء مادة خاضعة للرقابة
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
Collagenase P & nbsp ؛روش11249002001تستخدم لهضم
مسحات القطن وأدوات التطبيقFisherbrand / Fisher Scientific   ؛22-363-172
Cryofilm Type II C (10) ، مختبر قسم 3.5 سم، محلولCFS 105
DAPI ؛Abcamab228549
مقياس الجرام الرقميToprime / AmazonB06X6LW4V9يمكن استخدام أي مقياس علامة تجارية لوزن الفئران
تشريح الملقط   ؛فيشربراند / فيشر العلمي  08-953E; 08-953F
مقص تشريح فيشربراند / فيشر العلمي  08-940
تحمل شفرات التبريد / الميكروتوم منخفضةدباغة علميةTNR315LP
Ethiqa XR بوبرينورفين ممتد الإصدار 1.3 مجم / ملEthiqa XR / Cevetrus72117يجب الحصول على ترخيص إدارة مكافحة المخدرات الحكومية والفيدرالية لشراء مادة خاضعة للرقابة
Fast Green ، 0.2٪علوم التنظير الإلكتروني EMS50-319-57
حرارة مصل الأبقار الجنينية تعطيلGibco / ثيرمو فيشر العلمي  A5256801تستخدم لصنع FACS Staining Media (FSM)
Fluoromount-G Mounting Solution   ؛SouthernBiotech 0100-01
GLUSEAL لاصق موضعي للبشرة AD الجراحي GLU-550
الماعز المضاد للأرانب Alexa 647Thermo FisherA212441:300 تخفيف
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)Gibco / Thermo Fisher Scientific14065056يستخدم لصنع وسائط تلطيخ FACS (FSM)
وسادة تسخين (كبيرة)Boncare / AmazonB0CLHSWXSXيمكن استخدام أي وسادة تسخين ذات علامة تجارية ، وإزالة غطاء القماش   ؛
هيماتوكسيلينميليبورسيجما / فيشر M1051740500
ميليبورسيجماHX0514تستخدم لهضم العظام
نظام التخدير الحيواني الأيزوفلورانVetEquip901810
KUBTEC المعلمة 2D خزانة نظام الأشعة السينيةOncoMed SolutionsN / Aاستخدام أي نظام تصوير لخزانة الأشعة السينية يمكن استخدام
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة أنابيبكورنينج / توماس العلمي   ؛8600A52
زجاج غطاء مجهر ، 18 مم × 18 مم ، # 1 سمكGlobe Scientific1414-10
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid HEPES (1M) Gibco / Thermo Fisher Scientific156300-80تستخدم لصنع وسائط تلطيخ FACS (FSM) لاصق
بصري نورلاند NO61Edmund Optical37-322يستخدم للصق أقسام cryofilm على شريحة   ؛
Osterix Rabbit الأجسام المضادة أحادية النسيلة  Abcamab2094841: 500 تخفيف
بيروكسيجارد جاهز للاستخدام مطهر بخطوةواحدة Virox Technologies29101يمكن استبداله بأي مطهر سريري / مختبري
آخر Propidium Iodide (PI)   ؛Invitrogen / Thermo Fisher Scientific P1304MPصبغة الفلورسنت النووية المستخدمة للكشف عن الخلايا الميتة لعدد قابلية الحياة ماكينة
تشذيب كهربائية قابلة لإعادة الشحنWahl / AmazonB001FWXKUEيمكن استخدام أي مقص ، أداة تشذيب أصغر حجما ستجعل من السهل حلق الصغيرة
قوارض الأنف المخروطVetEquip921609
Safranin O ، 85٪ نقي ومعتمدمن فيشر AC419211000 العلمي
Seal'N Freeze Cryotray قوالب مربعة علومالتنظير الإلكتروني EMS62642-01تستخدم للتضمين ، ويمكن استخدام قوالب التضمين الأخرى. يحتوي هذا النموذج المحدد على قالب أعمق ، بالإضافة إلى غطاء لإغلاق الكتلة  .
نترات الفضةSigma AldrichS6506نترات الفضة لصبغة von Kossa
محلول ملحي معقم من الفوسفات المعقم (PBS)Gibco / Thermo FisherScientific 10010023بدلا من ذلك ، يمكن استخدام PBS المحضر حديثا والذي تم تصفيته وتعقيمه
مشارط قياسية معقمةIntegra Miltex / Fisher Scientific12-460-455
مشارطقياسية معقمةIntegra Miltex / Fisher Scientific12-460-455
مسحوق السكروز 1 كجمثيرمو فيشر Scientific036508-A1
Superfrost Plus Miscroscope SlidesFisherbrand / Fisher Scientific   ؛1255015شرائح لاصقة
Sure-Tek معالجة الأنسجة / تضمين الكاسيتفيشربراند هيستوسيت / فيشر ساینتفيك22-048-141
الأنسجة بالإضافة إلى درجة حرارة القطع المثلى O.C.T مركبفيشر سالانتوكي23-730-571
إسفنج الأنسجةEpredia / Fisher Scientific84-53إسفنج الأنسجة يحمي الأنسجة من الإفراط في تناول الطعام  
تولويدين بلوفيشر AC348600050
منها تلطيخ اليابان المستوى الهيالورونيداز يمكن العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Intramembranous OssificationBone Marrow InjuryPostnatal OsteogenesisSkeletal Stem CellsBone RegenerationMurine Bone ModelOsteoblast DifferentiationMicro Computed TomographyFrozen Section HistologyBone Repair Mechanisms

مقالات ذات صلة