يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

خميرة الخميرة نماذج مرض الزهايمر لفحص الجينات والطفرات والمواد الكيميائية التي تؤثر على إنتاج بيتا الأميلويد بواسطة γ-سيكريتاز

983 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67733

⸱

يونيو 24, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف نظام الخميرة الذي يعيد تكوين γ السكريتيز البشري. يسمح هذا النظام بتحديد ودراسة الطفرات التي تؤثر على النشاط وفحص مثبطات γ-secretase (GSIs). باستخدام فقدان الخصائص الوظيفية للطفرات العائلية لمرض الزهايمر ، من الممكن فحص معدلات γ-secretase (GSMs).

الملخص

γ-Secretase هو مركب بروتاز مدمج في غشاء الخلية ، ويتكون من وحدات فرعية للبريسينيلين التحفيزي (PS1 أو PS2) وثلاثة عوامل مساعدة إضافية: nicastrin و Aph-1 و Pen2. يشق مجالات الغشاء لبروتينات الغشاء من النوع الأول ، مثل بروتين سلائف الأميلويد (APP) و Notch. يولد انقسام APP الببتيدات β النشوانية (Aβ) ، والتي تتراكم في مرضى الزهايمر. على الرغم من الأبحاث الكبيرة ، فإن الآلية الدقيقة لهذا التحلل البروتيني الفريد ، الذي يحدث داخل الطبقات الدهنية الثنائية ، لا تزال غير مفهومة تماما. لدراسة الخصائص الأنزيمية ل γ-secretase ، أنشأنا نظام مراسل الخميرة باستخدام ركائز γ-secretase الاصطناعية التي تحتوي على شظايا APP أو Notch مدمجة في منشط النسخ Gal4. تم تقييم نشاط γ-secretase عن طريق التنشيط النسخي لجينات المراسل عند إطلاق Gal4 من الركائز المرتبطة بالغشاء ، كما تم تقييمه من خلال نمو الخميرة أو نشاط β-galactosidase. علاوة على ذلك ، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لتحديد الأشكال المختلفة من Aβ المنتجة من ميكروسومات الخميرة. توفر نماذج الخميرة هذه منصة لفحص الطفرات والجينات والمركبات التي تؤثر على وظيفة γ السيكريتاز. من خلال دراسة فقدان الخصائص الوظيفية للطفرات مرض الزهايمر العائلي PS1 (FAD) ، من الممكن فحص الطفرات المثبطة لمرض الزهايمر العائلي ومعدلات γ-secretase (GSMs) ، بالإضافة إلى مثبطات γ-secretase (GSIs). في هذا التقرير ، نصف الطرق الجينية والكيميائية الحيوية المستخدمة لدراسة نشاط γ السيكريتاز في نظام الخميرة مع الخطوات الأساسية لبروتوكول الفيديو.

المقدمة

γ-Secretase مسؤول عن الانقسام داخل الغشاء لأكثر من 150 بروتينا عبر الغشاء من النوع الأول ، بما في ذلك بروتين سلائف الأميلويد (APP) و Notch1. لا تشمل أهمية الانقسام داخل الغشاء دوران البروتين فحسب ، بل تشمل أيضا نقل الإشارة من خلال الشظايا المتولدة. على سبيل المثال ، تنتج معالجة APP ببتيدات β أميلويد صغيرة (Aβ). على الرغم من أنه يجب إزالة Aβ كمنتج تحلل ، إلا أنه في مرض الزهايمر ، يتراكم في الدماغ لتكوين لويحات الشيخوخة2. من ناحية أخرى ، تعد معالجة Notch ضرورية لإشارات NOTCH3 ، وهو أمر بالغ الأهمية للتنمية. يتكون γ-Secretase من أربعة بروتينات عبر الغشاء: بريسينيلين (PS1 أو PS2) ، نيكاسترين (NCT) ، البلعوم الأمامي -1 (Aph-1a أو 1b) ، ومحسن بريسينيلين 2 (Pen2) 4. تحتوي هذه البروتينات على ما مجموعه 19 مجالا عبر الغشاء: هناك تسعة في PS ، وسبعة في Aph1 ، واثنان في Pen2 ، وواحد في NCT. يعمل PS كوحدة فرعية تحفيزية ويحتوي على بقايا حمض الأسبارتيك الموجودة في مجالات الغشاء TM6 و TM75. أثناء نضوج المركب ، يخضع PS لانقسام محلل للبروتين داخل حلقته المحبة للماء HL6 ، مما يؤدي إلى تكوين شظايا طرفية أمينو ومحطة كربوكسيل4. تم العثور على الطفرات المرتبطة بمرض الزهايمر العائلي (FAD) في كل من جينات APP و PS2. تؤثر طفرات الخاطئة المسببة للأمراض سلبا على نشاط γ السيكريتيز ، مما يقلل من قدرته على معالجة APP بشكل فعال. هذا يؤدي إلى زيادة إنتاج أشكال Aβ42 المعرضة للتجميع بدلا من Aβ406 الشائعة. لا تزال الآليات الدقيقة التي تعطل بها هذه الطفرات الانقسام غير واضحة. تظهر معدلات γ-Secretase (GSMs) ، والتي يمكن أن تغير نسبة Aβ42 إلى أشكال Aβ الأخرى ، واعدة كعوامل علاجية محتملة لعلاج مرض الزهايمر عن طريق خفض مستويات Aβ427.

الخميرة الناشئة خميرة الخميرة لطالما عملت كائن حي نموذجي للتحقيق في الوظائف الرئيسية في الخلايا حقيقية النواة ، مثل انقسام الخلايا ونقل البروتين والالتهام الذاتي. استخدم الباحثون التكامل الوظيفي لدراسة المتماثلات البشرية ، بما في ذلك دورة انقسام الخلية (CDC) ، والإفراز (SEC) ، والجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي (ATG). يسمح تحويل طفرات الخميرة بالجينات البشرية للباحثين بتحليل العمليات الخلوية من منظور وظيفي. من بين العائلات الخمس المعروفة من البروتياز داخل الغشاء ، تمتلك الخميرة ثلاثة فقط: ببتيد الإشارة الببتيداز (Ypf1) ، والمعينات (Pcp1 و Rbd2) ، وإنزيم تحويل Ras (Rce1). ومع ذلك ، لا توجد متماثلات من γ-secretase أو protease site-2 في الخميرة8 ، مما يجعل نهج التكميل غير مناسب. على الرغم من عدم وجود نظيرات خميرة لهذه البروتياز ، إلا أن S. cerevisiae يظل ذا قيمة لاستكشاف البروتينات البشرية. يتم استخدام تقنيات مثل فحوصات الخميرة الهجينة الواحدة والهجينة والثلاثة الهجينة ، والتي تستخدم منشط نسخ الخميرة Gal4 ، للكشف عن التفاعلات بين الحمض النووي أو عوامل النسخ أو البروتينات أو الحمض النوويالريبي 9. لقد قمنا بتعديل نظام Gal4 لمراقبة تحلل البروتين داخل الغشاء بوساطة γ-secretase.

لقد نجحنا في إعادة تشكيل تفاعل انقسام γ سيكريتيز في الخميرة عن طريق إدخال γ السيكريتاز البشري جنبا إلى جنب مع ركائز اصطناعية مدمجة في Gal4 (الشكل 1) 10. تم تتبع تفاعل الانقسام من خلال نظام مراسل Gal ، إما عن طريق مراقبة نمو الخميرة أو قياس نشاط β-galactosidase. بالإضافة إلى ذلك ، حددنا العديد من أشكال Aβ (Aβ38 و Aβ40 و Aβ42 و Aβ43 و Aβ45) التي تم إطلاقها في ميكروسومات الخميرة عن طريق النشاف المناعي (الشكل 1) 11.

عندما تم إدخال طفرات PS1 أو APP المرتبطة ب FAD في هذا النظام ، لوحظت درجات متفاوتة من نشاط فقدانالوظيفة 12. أجرينا شاشة قائمة على النمو لتحديد الطفرات المثبطة التي تعيد الوظيفة الضعيفة للطفرات الفاشية (الشكل 2). لم تنقذ هذه المثبطات العيب فحسب ، بل عززت أيضا بشكل مستقل نشاط التشذيب ل γ-secretase. على وجه التحديد ، قاموا بتقليل مستويات الأشكال الأطول من Aβ ، وخاصة Aβ42 ، بطريقة مشابهة لمعدلات γ السيكريتاز الخافضة Aβ42 (GSMs). يسمح نظام إعادة تكوين الخميرة بفحص الطفرات والجينات والمركبات التي تنظم النشاط ، بما في ذلك مثبط γ سيكريتيز (GSI) والمغير (GSM) 13.

الهدف من هذا البروتوكول هو تحقيق هدفين رئيسيين: أ) إنشاء نظام فحص γ سكريتياز قائم على الخميرة و 2) تقديم مثال على تقنيات إعادة التكوين للتفاعلات الأنزيمية البشرية في الخميرة ، مع التأكيد على جوهر طرق إعادة التكوين. نحدد الخطوط العريضة للطرق في ثلاث إجراءات رئيسية بالخطوات الأساسية التالية: 1) إعادة تكوين γ-سيكريتاز في الخميرة ، 2) إجراء فحص γ سيكريتاز في المختبر باستخدام ميكروسومات الخميرة ، و 3-5) فحص طفرات γ السيكريتاز والمنظمين الكيميائيين في الخميرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. قياس نشاط γ السيكريتاز باستخدام نظام مراسل الخميرة

  1. قم بتحويل البلازميدات (الجدول 1) إلى سلالة الخميرة PJ-69-4A (الجدول 2) باستخدام طريقة أسيتات الليثيوم القياسية للتعبير عن γ-secretase والركيزة14. لإعادة تكوين تفاعل الانقسام ، قم بتحويل ثلاثة بلازميدات: اثنان من أجل γ-secretase وواحد للركيزة. حدد المحولات على وسط SC agar الذي يفتقر إلى Leu و Trp و Ura (SC-LWU).
  2. لتقييم انقسام الركيزة عن طريق النمو ، قم بإزالة سلالات الخميرة على وسط SC-LWU الذي يفتقر أيضا إلى الهيستيدين والأدينين (SC-LWHUAde) وتحتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  3. استخدم حجم المستعمرة لتقييم مستويات التعبير عن HIS3 و ADE2. قم بتقييم حجم المستعمرة على النحو التالي: +++ يمثل نموا من النوع البري مع مستعمرات أكبر من 1 مم ، - لا يمثل أي نمو ، و ++ أو + يمثل نموا جزئيا مع مستعمرات أكبر من 0.5 مم أو أصغر من 0.5 مم ، على التوالي. التعبير عن هذه الجينات هو قياس غير مباشر لنشاط γ-secretase (الشكل 1).
  4. لتقييم انقسام الركيزة عن طريق نشاط β-galactosidase ، أي مستوى التعبير عن lacZ (الشكل 1) ، تنمو السلالات في وسط SC-LWU عند 30 درجة مئوية حتى تصل الثقافة إلى تركيز 1 × 107 خلايا / مل ، المقابلة ل OD600 من 0.8-1.0.
    1. حصاد الخلايا من مزرعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي في أنبوب 1.5 مل عند 21,100 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واغسلها ب 100 ميكرولتر من الماء المثلج وأعد تعليقها في 30 ميكرولتر من D-buffer (20 ملي مولار تريس / كلوريد (درجة الحموضة 8.0) ، 10 ملي ملي كلوريد2 ، 50 ملي كلوريد كولوريد ، 1 ملي EDTA ، 5٪ جلسرين) مع 1 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) وكوكتيلات مثبطات الإنزيم PIs / ماء (محلول 1000x: 1 م p-aminobenzamidine (pABA) ، 1 مجم / مل مضاد للألم ، 1 مجم / مل أبروتينين ، 1 مجم / مل ليوببتين) و PIs / DMSO (محلول 1000x: 1 M فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، 0.1 M N-p-Tosl-L-فينيل ألانين كلورو ميثيل كيتون (TPCK) ، 1 مجم / مل كيموستاتين ، 1 مجم / مل بيبستاتين).
    2. أضف حبة زجاجية مغسولة بالحمض أسفل سطح المحلول مباشرة وقم بتحلل الخلايا عن طريق دوامة الخليط 10x بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة مع وضعها على الجليد بفاصل 1 دقيقة.
    3. تقوم أجهزة الطرد المركزي بتحلل الخلايا عند 21،100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتجمع المادة الطافية كمحاللة خام.
    4. تحضير خليط التفاعل ب 5-10 ميكرولتر من المحللة الخام و 0.4 مل من Z-buffer (40 ملي مولار NaH2PO4 ، 60 ملي مولار Na2HPO4 ، 10 ملي مولار KCl ، 1 ملي مولار MgSO4). ابدأ التفاعل بإضافة 80 ميكرولتر من محلول 0.4٪ o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) ، ثم احتضانه عند 37 درجة مئوية حتى يتحول لون المحلول إلى اللون الأصفر الباهت بسبب تكوين النيتروفينول.
    5. أوقف التفاعل بإضافة 0.2 مل من محلول 1 M Na2CO3 وقياس الامتصاص عند 420 نانومتر لحساب نشاط β-galactosidase.
    6. حدد تركيزات البروتين في المحللات الخام باستخدام مجموعة فحص البروتين ، بناء على طريقة برادفورد باستخدام ألبومين مصل الأبقار (BSA) كمعيار. تحضير كاشف الصبغة عن طريق تخفيف جزء واحد من مخزون الصبغة ب 4 أجزاء من الماء منزوع الأيونات المقطر المزدوج (DDI).
    7. امزج 1-5 ميكرولتر من محلول المحللة أو محلول BSA مع 100 ميكرولتر من الصبغة المخففة في صفيحة ميكروتيتر جيدا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وقم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر. تحديد تركيز البروتين من منحنى BSA القياسي.
      وحدة β-galactosidase = (1,000 × A420) / (t x c x V)
      حيث t = وقت الحضانة ، ج = تركيز البروتين (مجم / مل) ، V = حجم المحللة في الفحص (مل). يتم تعريف وحدة واحدة من β-galactosidase على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لتحلل 1 ميكرولتر من ONPG لإنتاج o-nitrophenol و D-galactose في الدقيقة لكل ملجم من البروتين.
  5. لتأكيد التعبير عن الوحدات الفرعية γ-secretase والركائز ، قم بزراعة السلالات في وسط SC-LWU عند 30 درجة مئوية حتى تصل الثقافة إلىOD 600 0.8-1.0.
    1. حصاد الخلايا من مزرعة 10 مل عن طريق الطرد المركزي في أنبوب سعة 50 مل عند 2,100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وغسل ب 1 مل من الماء المثلج متبوعا بالطرد المركزي في أنبوب 1.5 مل عند 21,100 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإعادة التعليق في 100 ميكرولتر من B88-buffer (20 ملي مولار Hepes / KOH (درجة الحموضة 6.8) ، 250 ملي مولار سوربيتول ، 150 ملي مولار KOAc ، 5 ملي مجم (OAc) 2) مع 1 ملي مولار DTT وكوكتيلات مثبطات الإنزياز البروتيني ، PIs / الماء و PIs / DMSO.
    2. أضف حبات زجاجية أسفل سطح المحلول مباشرة وقم بتحلل الخلية عن طريق دوامة 10x بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة مع الحفاظ على الخليط على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    3. تحلل أجهزة الطرد المركزي عند 845 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وتجمع المادة الطافية كمحللة كلية تحتوي على جزء الغشاء.
    4. امزج 100 ميكرولتر من المحللة الكلية مع 96 مجم من اليوريا و 40 ميكرولتر من 6x عينة SDS (0.4 M Tris / Cl (درجة الحموضة 6.8) ، 12٪ SDS ، 0.6M DTT ، 0.05٪ بروموفينول أزرق ، 50٪ جلسرين) واحتضانها عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إضافة اليوريا ضرورية لمنع تراكم بريسينيلين.
    5. تحليل التعبير عن γ-secretase وركائزه عن طريق تشغيل عينات على 12.5٪ بولي أكريلاميد هلام تريس / جلايسين والنشاف المناعي.
    6. اكتشف γ-secretase وركائزه بواسطة الأجسام المضادة ضد presenilin أو nicastrin أو Aph1 أو Gal4 أو FLAG أو HA أو Pgk1 (التحكم في التحميل) ، والجسم المضاد الثانوي المترافق مع بيروكسيداز الفجل (HRP) ضد الفأر IgG (ل FLAG و HA و Pgk1) ، أو الأرانب IgG (للبريسينيلين ، Aph1 ، و Gal4) ، أو خنزير غينيا IgG (للنيكاسترين).
    7. للكشف عن التلميء الكيميائي ، اخلطي المحلول A (50 ملي مولار Tris / Cl (درجة الحموضة 8.5) ، 1.25 ملي مولار من الألومينول ، 0.02 ملي مولار حمض الكوماريك) مع المحلول B (50 ملي مولار تريس / كلتريد (درجة الحموضة 8.5) ، 0.009٪ H2O2) قبل الاستخدام مباشرة. احتضن اللطخة في حجم كاف من الخليط لمدة 1 دقيقة. الحجم المطلوب يعتمد على حجم اللطخة. للحصول على لطخة 10 سم × 6 سم ، يتم استخدام 4 مل. قم بتطوير اللطخة وتحديد كثافة الإشارة باستخدام محلل الصور المضيئة.

2. قياس إنتاج Aβ عن طريق فحص الميكروسوم في المختبر

  1. قم بتحويل APP C55 أو APP C99 أو بلازميدات γ-secretase (الجدول 1) إلى سلالة الخميرة PJ-69-4A pep4Δ كما هو موضح في الخطوة 1.1. للتعبير عن γ-secretase وركيزته بشكل منفصل (الجدول 2 ؛ سلالات γ311 و γ312 و γ313)14. حدد السلالتين C55 و C99 على وسط أجار SC-U وسلالة γ-secretase على وسط أجار SC-LW.
  2. اعزل الميكروسومات من سلالات الخميرة التي تعبر عن APP C55 أو APP C99 أو γ-secretase وفقا للبروتوكول القياسي11. افصل الميكروسومات عن طريق الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز واستعادته عند واجهة السكروز 1.2 M-1.5 M باستخدام ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها. حدد تركيز البروتين في الميكروسومات عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر بعد إذابتها في 0.2٪ SDS.
  3. تحضير خليط التفاعل باثنين من الميكروسومات ، أي APPC55 أو γ-secretase ، يحتوي على 40 ميكروغرام من البروتين لكل منهما و γ عازلة (50 ملي متر من الأنابيب / KOH (درجة الحموضة 7.0) ، 250 ملي مولار من السكروز ، 1 ملي مولار EGTA) بحجم نهائي قدره 12.5 ميكرولتر γ.
  4. لبدء التفاعل ، قم بتخفيف المخاليط أربعة أضعاف إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر باستخدام γ عازلة تحتوي على 1x مزيج مثبط البروتياز (PI): 50 ميكرومتر ثنائي أيزوبروبيل فلوروفوسفات (DIFP) ، 50 ميكرومتر PMSF ، 0.1 ميكروغرام / مل N α-p-tosyl-L-lysine كلورو ميثيل كيتون (TLCK) ، 0.1 ميكروغرام / مل مضاد للألم ، 0.1 ميكروغرام / مل ليوببتين ، 0.1 ملي مولار EGTA ، 1 ملي ثيولفان ، و 5 ملي مولار فينانثرولين (PNT) إلى 0.25٪ CHAPSO مع 400 ميكروغرام / مل بروتينات. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إذا لزم الأمر ، أضف 0.1٪ فوسفاتيديل كولين (PC) ، أو 10 ميكرومتر L685،458 ، أو DAPT (مثبطات γ-secretase).
  5. أوقف التفاعل بإضافة 500 ميكرولتر من الكلوروفورم / الميثانول (2: 1) واحتضانه لمدة ساعة واحدة مع الدوامة بشكل متقطع. أضف 900 ميكرولتر من الميثانول ، واخلطه ، وجهاز الطرد المركزي عند 21,100 × جم لمدة 15 دقيقة لجمع ببتيدات Aβ في الحبيبات.
  6. اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من الكلوروفورم / الميثانول / الماء (1: 2: 0.8) ، واتركها تجف في الهواء ، وعلقها في 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS ، واغلي الخليط لمدة 10 دقائق. قم بتحليل إنتاج Aβ عن طريق تشغيل العينات على هلام 16.5٪ تريس / تريسين بولي أكريلاميد. لتحديد أشكال Aβ ، استخدم هلام 10٪ تريس / تريسين بولي أكريلاميد مع 8 M يوريا (درجة الحموضة 8.45).
  7. اكتشف Aβ عن طريق النشاف المناعي باستخدام الجسم المضاد 82E1 الخاص بموقع Asp-1 للإنسان Aβ والجسم المضاد الثانوي المترافق HRP ضد IgG للفأر. للكشف عن التلميء الكيميائي ، اخلطي كميات متساوية من المحلول A و B مباشرة قبل الاستخدام كما هو موضح في الخطوة 1.5.7 ، واحتضان اللطخة في حجم كاف من الخليط لمدة دقيقة واحدة. الحجم المطلوب يعتمد على حجم اللطخة. للحصول على لطخة 10 سم × 6 سم ، يتم استخدام 4 مل.
  8. قم بتطوير اللطخة وتحديد كثافة الإشارة باستخدام محلل الصور المضيء.

3. فحص طفرات γ-secretase أو APP ذات التأثير التعديلي

  1. لتوليد طفرات عشوائية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ ، صمم بادئات لدمج مناطق متداخلة 40 نقطة أساس من الجين محل الاهتمام في نهاية 5 من كل برايمر.
  2. قم بإعداد 50 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ في 1x Taq buffer مع 50 نانوغرام من قالب الحمض النووي ، 0.2 ملي مولار dGTP ، 1 ملي مولار dATP / dTTP / dCTP ، 3 ملي مولار MgCl2 ، 0.5 ملي مولار MnCl2 ، 1.25 U Taq polymerase ، و 400 نانومتر بادئات. استخدم بروتوكول PCR التالي: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، متبوعة ب 30 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 120 ثانية ، تنتهي ب 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ينتج عن هذا الإعداد معدل طفرة تقريبي يبلغ 1.9 طفرة لكل كيلو قاعدة10.
  3. قم بتحويل شظايا الحمض النووي المطفرة (4 ميكروجرام) مع الحمض النووي البلازميد الخطي (4 ميكروجرام) إلى سلالة الخميرة PJ69-4A التي تحتوي على طفرات FAD APP أو PS114. يسهل التداخل البالغ 40 نقطة أساس في البادئات إعادة التركيب المتماثل بين الشظايا الموجودة في الخميرة ، مما يؤدي إلى إعادة بناء البلازميد. حدد المحولات على ألواح SC-LWU كما هو موضح في الخطوة 1.1.
  4. عد المحولات على ألواح SC-LWU وقم بتكرارها على ألواح SC-LWHUAde باستخدام المخمل. للتكرار ، اضغط على اللوحة التحويلية على كتلة أسطوانية مغطاة بالمخمل ، ثم اضغط على صفيحة SC-LWHUAde جديدة على المخمل لنقل المستعمرات. تنمو السلالات التي تعبر عن طفرات APP أو PS1 FAD بشكل سيئ على SC-LWHUAde ، بينما تظهر تلك التي لديها طفرات تعديلية نموا قويا وتشكل مستعمرات.
  5. لاستعادة الحمض النووي البلازميد من المستنسخة الإيجابية ، قم بزراعة السلالات في 3 مل من وسط SC-LWU بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية حتى OD600 >1.0. الطرد المركزي الخلايا في أنبوب سعة 15 مل عند 2,100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واغسلها ب 0.8 مل من الماء المثلج متبوعا بالطرد المركزي في أنبوب 1.5 مل عند 21,100 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم أعد تعليقها في 0.3 مل من محلول التحلل (10 ملي مولار تريس / كلوريد (درجة الحموضة 8.0) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي EDTA ، 2٪ تريتون X-100 ، 1٪ SDS).
  6. خلايا الليز بإضافة 0.3 مل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25: 24: 1) و 0.3 جم من الخرز الزجاجي. دوامة بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق ، ثم جهاز طرد مركزي عند 21,100 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. بعد الطرد المركزي ، تنفصل العينة إلى مرحلة مائية علوية ومرحلة فينول سفلى. استرجع المرحلة المائية واخلطها مع 30 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 M و 700 ميكرولتر من الإيثانول 100٪. تجنب أخذ المواد على الطور البيني.
  8. الطرد المركزي المحلول عند 21,100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، اغسل الحبيبات بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وجففها في الهواء ، وأعد تعليقها في 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
  9. نظرا لأن تركيز الحمض النووي البلازميد عادة ما يكون منخفضا جدا لمزيد من التحليل ، فمن الضروري تضخيمه في الإشريكية القولونية. قم بتحويل الحمض النووي البلازميد إلى بكتريا قولونية DH5α بطرق تحويل عاليةالكفاءة 15 وتنقيته لمزيد من التحليل. تحديد الطفرات عن طريق تسلسل الحمض النووي باستخدام طريقة سانجر16.
  10. تنطبق هذه الطريقة على البلازميدات المطفرة المعدة بطرق مختلفة (كما في الخطوتين 3.1 و 3.2). إذا كنت تستهدف مناطق بروتينية معينة ، فقم بتصميم بادئات PCR عكسية باستخدام نيوكليوتيدات عشوائية. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل والربط لتعميم الحمض النووي البلازميد ، يتم الحصول على مكتبة من البلازميدات المطفرة. أدخل طفرات محددة باستخدام مجموعة طفرات خاصة بالموقع.

4. فحص مثبطات γ سيكريتاز (GSI) في الخميرة

  1. استخدم الفحص الكيميائي عالي الإنتاجية ل GSI الذي تم تطويره بناء على نمو الخميرة أو مقايسة β-galactosidase ، كما هو موضح أدناه.
  2. إجراء فحص GSI مع سلالات الخميرة ، γ124 و γ126 و γ190 (الجدول 2). حدد مرشحي GSI كمركبات تقلل من النمو أو نشاط β-galactosidase من النوع البري γ-secretase على APP (γ124) و / أو Notch (γ126) (الجدول 3).
  3. حدد GSI الخاصة بالركيزة التي تحافظ على التطبيق أو مع الحفاظ على الشق استبعاد المركبات السامة عن طريق الفحص المضاد باستخدام تعبير Gal4 القابل للذوبان. يجب ألا يؤثر مرشحو GSI على النمو أو نشاط β-galactosidase لسلالة التحكم Gal4 (γ190) (الجدول 3).
  4. بالنسبة لمقايسة النمو ، تنمو سلالات في وسط SC-LWHUAde الذي يحتوي على GSI محتملة في ألواح 384 بئرا من OD600 من 0.03. احتضن طوال الليل عند 30 درجة مئوية دون رج. مراقبة النمو بعد 24 ساعة بواسطةOD 600.
  5. بالنسبة لمقايسات β-galactosidase بتنسيق 384 بئرا ، تنمو السلالات بتركيز 1 × 107 خلايا / مل في وسط SC-LWU الذي يحتوي على GSIs محتملة. قم بتحليل الخلايا باستخدام نظام فحص Beta-Glo وقياس نشاط β-galactosidase باستخدام 6-o-β-galactopyranosyl-luciferin كركيزة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. بالنسبة لمرشحي GSI ، قم بقياس إنتاج Aβ عن طريق اختبار الجريب في المختبر لتأكيد التأثير المثبط.

5. فحص المغير γ-secretase (GSM) في الخميرة

  1. استخدم الفحص الكيميائي عالي الإنتاجية ل GSM ، والذي تم تطويره بناء على نمو الخميرة أو مقايسة β-galactosidase ، كما هو موضح أدناه.
  2. إجراء فحص GSM مع سلالات الخميرة ، γ106 و γ112 و γ5 (الجدول 2). حدد مرشحي GSM كمركبات تعزز النمو أو نشاط β-galactosidase ل FAD PS1 (γ106 و γ112) أو السلالات الطافرة FAD APP (الجدول 4). استبعاد المواد الكيميائية غير المحددة لمنشط المراسل عن طريق الفحص المضاد بالسلالة بدون γ وحدة فرعية تحفيزية سيكريتاز. يجب ألا يؤثر مرشحو GSM على نمو أو نشاط β-galactosidase لسلالة التحكم بدون PS1 (γ5) (الجدول 4).
  3. بالنسبة لمقايسة النمو ، تنمو سلالات في وسط SC-LWHUAde الذي يحتوي على GSMs محتملة في ألواح 384 بئرا من OD600 من 0.03. احتضن طوال الليل عند 30 درجة مئوية دون رج. مراقبة النمو بعد 48 ساعة بواسطةOD 600.
  4. بالنسبة لمقايسات β-galactosidase بتنسيق 384 بئرا ، قم بزراعة السلالات إلى تركيز 1 × 107 خلايا / مل في وسط SC-LWU الذي يحتوي على GSMs محتملة. قم بتحليل الخلايا باستخدام نظام مقايسة Beta-Glo وقياس نشاط β-galactosidase باستخدام 6-o-β-galactopyranosyl-luciferin كركيزة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. بالنسبة لمرشحي GSM ، قم بقياس إنتاج Aβ عن طريق مقايسة الجريب في المختبر لتأكيد التأثير المعدل ، أي تقليل الأشكال السامة Aβ Aβ42 و Aβ43.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام التقنيات الموصوفة حتى الآن ، قمنا بتحليل الجينات والطفرات والمواد الكيميائية والببتيدات كعوامل تؤثر على نشاط γ-secretase10،11،12،13،17،18،19. يسمح الفحص القائم على النمو للجينات والطفرات باختبار عدد كبير من المستنسخة (100,000-1,000,000). يعد الحجم ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الحاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
تعد إعادة تكوين γ-secretase في الخميرة باستخدام الطرق الجينية والكيميائية الحيوية أمرا بسيطا نسبيا ، ولكن هناك بعض الخطوات الحاسمة لضمان النجاح.

أثناء تحويل الخميرة (الخطوات 1.1 و 2.1 و 3.3) ، يجب إدخال بلازميدات متعددة: اثنان لمكونات γ السيكرتيز وواحد للركائز. يمكن أيضا إجراء التحويل المتسلسل (واحدا تلو الآخر) ، ولكنه يستغرق وقتا طويلا. لاحظ أن إدخال بلازميدات متعددة سيقلل من كفاءة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI Grant رقم 22K06121. يرغب المؤلفون في الإعراب عن تقديرهم للدعم المقدم من أعضاء مختبر علم الإنزيمات في جامعة توهوكو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<الأجسام المضادة القوية> < قوية>
anti Amyloidβ (N) (82E1) أجسام مضادةIBLالقط# 10323
مضاد Aph1a، 245-265 (C) من الطرف المضادبيو ليجندكات# 823101
الأجسام المضادة المضادة لعلم العلم (M2)سيغماCat# F3165
الأجسام المضادة المضادة Gal4سيغماCat# G9293
الجسم المضاد المضاد للحمض الهيدرونيكوري (12CA5)سيغماالفئة # 11 583 816 001
الأجسام المضادة المضادة للنيكاسترينكيميكونCat# AB5890
الأجسام المضادة المضادة PGK1 (22C5D8)أبكامكات# ab197960
الأجسام المضادة المضادة لطرف N لجهاز PS1 (G1Nr) أو الحلقة (GIL)تاكاسوجي et.al، ج. الكيمياء البيولوجية، 277، 50198-50205
ضد الأرنب  IgG، الأجسام المضادة المرتبطة ب HRPالإشارات الخلويةCat# 7074
مضاد خنزير غينيا IgG-HRPسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةكات# sc-2438
IgG مضاد للفئران، وهو جسم مضاد مرتبط ب HRPالإشارات الخلويةCat# 7076
<السلالات القوية>البكتيريا والخميرة
<إيم>إ. كولي DH5αإنفيتروجينكات# 18265017
S. cerevisiae PJ-69-4Aجيمس ب. و. وآخرون، علم الوراثة 144:1425-1436 (1996)
<قوي>المواد الكيميائية، الببتيدات، البروتينات المؤتلفة
(3,5-ديفلوروفينيل لاسيتيل)-Ala-Phg-OBut (DAPT)معهد الببتيداتCat# 3219-v
بروتين الأميلويد وبيتا (الإنسان، 1-38)معهد الببتيداتCat# 4484-v
بروتين الأميلويد وبيتا (الإنسان، 1-40)معهد الببتيداتCat# 4307-v
الأميلويد وبروتين بيتا (الإنسان، 1-42)معهد الببتيداتCat# 4349-v
الأميلويد وبروتين بيتا (الإنسان، 1-43)معهد الببتيداتالتصنيف# 4370-v
مضاد الألم، ثنائي الهيدروكلوريدمعهد الببتيداتCat#4062
الأبروتينينسيغماCat# A1153
تشابسودوجيندوالتصنيف# 343-05163
الكيموستاتينسيغماCat# C7268
ثنائي الأيزوبروبيل فلوروفوسفات (DIFP)واكو للكيميكالCat# 049-18921
685,458 جنيهمعهد الببتيداتCat#4394-v
ليوببتينمعهد الببتيداتCat# 4041
N-p-Tosyl-L-فينيل ألانين كلوروميثيل كيتون (TPCK)سيغماCat# T4376
Nα -p-tosyl-L-lysine كلوروميثيل كيتون (TLCK)سيغماCat# T7254
أو-نيتروفينيل-&بيتا;-دي-جالاكتوبيرانوزيد (ONPG)سيغماCat# N1127
بي-أمينوبنزاميدين (pABA)، ثنائي هيدروكلوريدسيغماكات# 857661
الببستاتين AسيغماCat# P5318
الفينانثرولين (PNT)سيغماCat# P9375
فلوريد الفينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)سيغماCat# P7626
كولين الفوسفاتيديل (PC)، صفار البيض، النوع XVI-EسيغماCat# P3556
بوليميراز DNA Taqتاكاراقط# R001A
ثيولفانسيغماCat# T6031
<قوي>مجموعات الفحص التجارية، مواد أخرى، وأدوات
نظام اختبار بيتا-غلوبروميغاCat# E4720
مجموعة اختبار البروتين Bio-Radبيو-رادكات# 5000001
خرز زجاجي، مغسولة بحمض (425-600 & mu; m)سيغماCat# G8772
LAS4000 إيمج كوانتجنرال إلكتريك للرعاية الصحيةLAS4000 إيمج كوانت
مجموعة الطفرات الموجهة من الموقع من QuikChangeأجيلينتكات# 200518

المراجع

  1. Wolfe, M. S. Unrvaling the complexity of γ-secretase. Semin Cell Dev Biol. 105, 3-11 (2020).
  2. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  3. Zhou, B., et al. Notch Signaling pathway: architecture, disease, and therapeutics. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 95(2022).
  4. Takasugi, N., et al. The role of presenilin cofactors in the gamma-secretase complex. Nature. 422 (6930), 438-441 (2003).
  5. Wolfe, M. S., et al. Two transmembrane aspartates in pre-senilin-1 required for presenilin endoproteolysis and gamma-secretase activity. Nature. 398 (6727), 513-517 (1999).
  6. Valdez-Gaxiola, C. A., Rosales-Leycegui, F. R., Gaxiola-Rubio, A., Moreno-Ortiz, J. M., Figuera, L. E. Early- and late-onset Alzheimer's disease: two sides of the same coin. Diseases. 12 (6), 110(2024).
  7. Nordvall, G., Lundkvist, J., Snadin, J. Gamma-secretase modulators: a promising route for the treatment of Alzheimer's disease. Front Mol Neurosci. 16, 129740(2023).
  8. Sun, L., Li, X., Shi, Y. Structural biology of intramembrane proteases: mechanistic insights from rhomboid and S2P to γ-secretase. Curr Opin Struct Biol. 37, 97-107 (2016).
  9. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int J Mol Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  10. Futai, E., Yagishita, S., Ishiura, S. Nicastrin is dispensable for gamma-secretase protease activity in the presence of specific mutations. J Biol Chem. 284 (19), 13013-13022 (2009).
  11. Yagishita, S., Futai, E., Ishiura, S. In vitro reconstitution of gamma-secretase activity using yeast microsomes. Biochem Biophys Res Commun. 377 (1), 141-145 (2008).
  12. Futai, E., et al. Suppressor mutations for presenilin 1 familial Alzheimer Disease mutants modulate γ-secretase activities. J Biol Chem. 291 (1), 435-446 (2016).
  13. Futai, E. Advanced yeast models of familial Alzheimer disease expressing FAD-linked presenilin to screen mutations and γ-secretase modulators. Methods Mol Biol. 2049, 403-417 (2019).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Transforming yeast with DNA. Methods Mol Cell Biol. 5 (5), 255-269 (1995).
  15. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  16. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  17. Imai, S., Cai, T., Yoshida, C., Tomita, T., Futai, E. Specific mutations in presenilin 1 cause conformational change in γ-secretase to modulate amyloid β trimming. J Biochem. 165 (1), 37-46 (2019).
  18. Watanabe, H., et al. Specific mutations in Aph1 cause γ-secretase activation. Int J Mol Sci. 23 (1), 507(2022).
  19. Suzuki, R., et al. Specific mutations near the amyloid precursor protein cleavage site increase γ-secretase sensitivity and modulate amyloid-β production. Int J Mol Sci. 24 (4), 3970(2023).
  20. Zinser, E., Daum, G. Isolation and biochemical characterization of organelles from the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 11 (6), 493-536 (1995).
  21. Imamura,, et al. Inhibition of gamma-secretase activity by helical beta-peptide foldamers. J Am Chem Soc. 131 (21), 7353-7359 (2009).
  22. Han, J. H., et al. OCIAD2 activates γ-secretase to enhance amyloid β production by interacting with nicastrin. Cell Mol Life Sci. 71 (13), 2561-2576 (2014).
  23. Self, W. K., Holtzman, D. M. Emerging diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease. Nat Med. 29, 2187-2199 (2023).
  24. Solopova, E., et al. Fatal iatrogenic cerebral β-amyloid-related arteritis in a woman treated with lecanemab for Alzheimer's disease. Nat Commun. 14 (1), 8220(2023).
  25. Zhang, Y., Chen, H., Li, R., Sterling, K., Song, W. Amyloid β-based therapy for Alzheimer's disease: challenges, successes and future. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 248(2023).
  26. Xia, W. γ-Secretase and its modulators: twenty years and beyond. Neurosci Lett. 701, 162-169 (2019).
  27. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 20 (4), 309-325 (2021).
  28. Souza, J. M., Goncalves, B. D. C., Gomez, M. V., Vieira, L. B., Ribeiro, F. M. Animal toxins as therapeutic tools to treat neurodegenerative disease. Front Pharmacol. 9, 145(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نشاط غاما-سيكريتيزنموذج الخميرة لمرض ألزهايمرطفرات ألزهايمر العائليةمقايسة بيتا-جالاكتوزيدازتقدير كمية البروتينتفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأتحويل البلازميدالكشف بطريقة اللطخة المناعيةالمعدلات الكيميائية
خميرة الخميرة نماذج مرض الزهايمر لفحص الجينات والطفرات والمواد الكيميائية التي تؤثر على إنتاج بيتا الأميلويد بواسطة γ-سيكريتاز
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.