مقالة منهجية

طريقة فعالة لاستخراج ظهارة قناة فالوب البشرية لتحليلات الخلية المفردة

DOI:

10.3791/67753

⸱

مارس 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة ليوم واحد لعزل الخلايا الظهارية لقناة فالوب البشرية. يمكن طلاء الخلايا الظهارية المعزولة في ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) أو تفكيكها إلى معلقات أحادية الخلية واستخدامها في التجارب النهائية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قناتي فالوب البشرية متأصلة في التكاثر. الغرض من قناتي فالوب هو السماح بعبور المنوية والبويضة ، وإذا نجح الإخصاب ، فإن الجنين. تعد الخلايا الظهارية التي تبطن السطح الداخلي لقناتي فالوب جزءا لا يتجزأ من عمليات قناة فالوب الطبيعية وغير الطبيعية ، بما في ذلك بدء المرض. بعد انقطاع الطمث ، تتوقف قناتي فالوب عن لعب دور مهم في الجسم ويتغير تكوين الخلايا داخل الظهارة. نصف طريقة يمكن من خلالها عزل هذه الخلايا الظهارية من قناتي فالوب الطازجة مع الحد الأدنى من تلوث الخلايا اللحمية في معلق أحادي الخلية. يمكن زراعة هذه الخلايا في الثقافة أو استخدامها لمزيد من التحليل مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. يمكن تحقيق بروتوكول العزل هذا في 4-6 ساعات وينتج خلايا قابلة للحياة يمكن استخدامها للتحليل الفوري للمصب يسهل هذا البروتوكول الفعال عزل الخلايا الظهارية لقناة فالوب مع مجموعة ظهارية مخصبة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون قناتي فالوب من أجزاء متعددة. من المبيض إلى الرحم ، تتكون قناة فالوب من الفيمبري ، والأمبولة ، والبرزخ ، والجزء الداخلي من الجدارة. يمتد الفيمبريا من نهاية قناة فالوب حيث يمسك البويضة التي يطلقها المبيض. ثم تنتقل البويضة عبر الأمبولا ، حيث من المرجح أن يتم تخصيبها ، إلى البرزخ وأخيرا يتم نقلها إلى الرحم من خلال الجزء الداخلي1. يتكون الغشاء المخاطي الأعمق لقناة فالوب التي تسهل نقل البويضة من طبقة من الظهارة اللمعية ، بما في ذلك الخلايا المهدبة والإفرازية. تميل الخلايا الهدبية إلى أن تكون أكثر تركيزا في fimbriae2. يلعبون دورا أساسيا في تحريك البويضة جسديا عبر قناة فالوب من المبيض إلى الرحم. تسمح زوائدها للخلايا المهدبة ليس فقط بتحريك البويضة على طول ولكن أيضا لإزالة الإجهاد السام الجيني بعد الإباضة3.

تفرز الخلايا الظهارية لقناة فالوب الإفرازية سائلا يساعد في التغذية وتجميع الأمشاج4. تختلف نسبة الخلايا المهدبة والإفرازية على طول ظهارة قناة فالوب في حالة ما بعد انقطاع الطمث مع انخفاض في الخلايا المهدبة حيث لم تعد قناة فالوب تؤدي وظيفة حاسمة في النقل5. علاوة على ذلك ، في حالة عدم وجود هرمون الاستروجين ، يعتقد أن قناتي فالوب تصبح أثرية1،6. يفترض أن هذا الفقدان للخلايا المهدبة في قناة فالوب يزيد من خطر الإصابة بالسرطان المصلي7. بالإضافة إلى ذلك ، يعتقد أن الخلايا الظهارية الإفرازية لقناة فالوب تؤدي إلى آفات سرطان البوق المصلي داخل الظهارة (STIC) ، وهي مقدمة معروفة للنوع الفرعي الأكثر عدوانية من سرطانات المبيض الأنبوبية ، والسرطان المصلي عالي الدرجة7،8.

الغرض من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا الظهارية عن قناتي فالوب البشرية وفصلها إلى معلقات أحادية الخلية. ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة ظهارية أحادية الخلية غنية يمكن استخدامها في العديد من التحليلات. كما هو موضح في هذه المخطوطة ، قمنا بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي والخلايا المطلية في 2D بعد العزلة. يوضح تحليل قياس التدفق الخلوي وجود خلايا مفردة ، والتي تكون في الغالب قابلة للحياة وظهارية بطبيعتها. في هذه التحليلات ، قمنا بتضمين أربع علامات ، e506 للبقاء ، و EpCAM للخلايا الظهارية ، و CD45 للخلايا المناعية ، و CD10 للخلايا اللحمة. تم استبعاد الخلايا الميتة باستخدام علامة الجدوى e506 ، وتم إخراج الخلايا المناعية باستخدام CD45. من الممكن أن يحتوي المعلق على مجموعة خلايا مناعية. ومع ذلك ، لتحقيق مجموعة نقية نسبيا من الخلايا الظهارية ، يمكن استنفاد الخلايا الإيجابية CD45 باستخدام مجموعة استنفاد CD45. علاوة على ذلك ، عند طلاءها في الثقافة ، غالبا لا تتكاثر الخلايا الإيجابية CD45. تظهر الخلايا المعزولة عبر هذه الطريقة ونمت في 2D مجموعات ظهارية شبيهة بالحصى ملتصقة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد مستحضرات خلوية ، والتي يمكن تطويرها إلى مكتبات RNA أحادية الخلية.

أصبحت الأبحاث لتحديد النسب الخلوي لظهارة قناة فالوب ، والتغيرات في هذه السلالات خلال مراحل مختلفة من الحياة الإنجابية ، والتحريض على الأحداث التي تؤدي إلى التحول الخبيث والتكوين أكثر بروزا خلال السنوات الأربع الماضية6،9،10،11،12. سيفيد هذا البروتوكول بشكل كبير البحث في هذا المجال من خلال توفير طريقة فعالة لعزل ظهارة قناة فالوب ومعالجتها في خلايا مفردة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اقتباس هذا البروتوكول من طريقة عزل الخلايا الظهارية الرحمية الموصوفة سابقا13،14. تم جمع عينات جديدة من قناتي فالوب مجهولة الهوية من خلال بروتوكول IRB المعتمد من جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA) # 10-0727 وهضمها في معلق أحادي الخلية في غضون 4-6 ساعات تقريبا.

1. جمع قناة فالوب وتحضيرها

  1. اجمع قناتي فالوب البشرية الطازجة (الشكل 1 أ) في وسط التفكك (DMEM [4.5 جم / لتر D-glucose] تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 5 مل من L-glutamine ، و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين) في أنابيب 15 مل أو 50 مل ونقلها على الجليد إلى المختبر.
  2. انقل قناتي فالوب إلى طبق بتري معقم يحتوي على وسائط تفكك طازجة.
  3. تحت مجهر تشريح ، قم بتشريح الدهون والأنسجة الضامة وأي أوعية تحيط بالأنابيب باستخدام ملقط دقيق ومقص Vannas Tubingen (الشكل 1 ب).
  4. تحت المجهر التشريح ، قم بقطع المستوى الإكليلي لقناتي فالوب بالمقص لتشكيل أسطوانات صغيرة ، ~ 3-5 مم في قطر كل منها (الشكل 1 ج) ، باستخدام ملقط النقطة الدقيقة لتثبيت الأنسجة.

2. عزل الخلايا الظهارية وتفككها

  1. استنشق بعناية وسائط التفكك من الطبق.
  2. اغسل قطع المناديل 2x بمحلول ملحي بارد 1x مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق سحب العينات برفق ~ 2 مل لتغطية القطع وتدوير اللوحة برفق.
  3. قم بشفط الغسيل النهائي 1x PBS ، واحتضن قطع المناديل لمدة 5 دقائق في حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) البارد 5 ملي مولار في درجة حرارة الغرفة ، وكرر ذلك لما مجموعه حضانتين. استنشق 5 ملي مولار EDTA بعد كل حضانة.
  4. شظايا الأنسجة في محلول ملح متوازن بارد بنسبة 1٪ من التربسين / هانكس (HBSS) واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 40 دقيقة (الشكل 1 د).
  5. قم بشفط 1٪ من التربسين / HBSS واغسل قطع المناديل 2x في وسط تفكك بارد لتعطيل التربسين.
  6. احتضان شظايا الأنسجة في 2 مل من وسائط التفكك مع 0.4 مجم من DNase لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد تكون فترة حضانة أطول ضرورية، ولكن لا تتجاوز 45 دقيقة قبل بدء الخطوة 2.7.
  7. تحت مجهر تشريح ، بينما لا تزال في الوسائط باستخدام DNase ، أمسك جزءا من قناة فالوب ، التجويف الموازي لقاع الطبق ، في مكانه باستخدام ملقط. من ناحية أخرى ، اضغط بشكل متكرر على قطعة قناة فالوب بالملقط لطرد الخلايا الظهارية من تجويف الأنبوب. تأكد من رؤية هالة من الخلايا حول الأنسجة حيث يتم إطلاق الخلايا من تجويف الأنبوب. كرر لكل جزء من قناة فالوب في الطبق (الشكل 1 ه).
  8. انقل الوسائط المحتوية على الخلايا إلى أنبوب معقم سعة 15 مل ، واغسل طبق بتري بوسط تفكك 2x على الأقل ، واجمع الغسالات في أنبوب 15 مل. تخلص من شظايا الأنبوب اللحمي.
  9. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من وسائط التفكك.
  10. عد الخلايا عن طريق اقتباس 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وخلط 1: 1 مع تريبان بلو. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط في شريحة عد الغرفة وإدخالها في عداد الخلايا (الشكل 1F).

3. الهضم إلى تعليق خلية واحدة

  1. أعد تعليق الخلايا في 9 مل من وسائط التفكك ، و 1 مل من 8 مجم / مل من الكولاجيناز (النوع 1) ، و 0.4 مجم من DNase. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة في شاكر مداري عند 200 دورة في الدقيقة (الشكل 1G).
  2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 5 مل من وسائط التفكك لغسل الكولاجيناز.
  3. مرر معلق الخلية عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مل (الشكل 1H).
  4. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. إذا ظهرت حبيبات الخلية باللون الأحمر ، فقم بإجراء تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) كما هو موضح في الخطوات 3.6-3.8. إذا لم تكن حبيبات الخلية حمراء ، فانتقل إلى الخطوة 3.9.
  6. قم بتخفيف 500 ميكرولتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء في 4.5 مل من الماء فائق النقاء.
  7. استنشق الوسائط ، وأضف 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء المخفف ، واحتضنه على الثلج لمدة 3 دقائق.
  8. لإيقاف تحلل كرات الدم الحمراء ، أضف 45 مل من 1x PBS إلى أنبوب 50 مل.
  9. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
  10. عد الخلايا عن طريق اقتباس 10 ميكرولتر من معلق الخلية وخلطه 1: 1 مع التريبان الأزرق. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط في شريحة عد الغرفة وإدخالها في عداد الخلية (الشكل 1I).

4. تلطيخ قياس التدفق الخلوي

  1. Aliquot 250,000 خلية في أنبوبين منفصلين من البوليسترين مستدير سعة 5 مل للجسم المضاد المترافق الأولي والتحكم في النمط المتماثل لاستخدامه في قياس التدفق الخلوي لعلامة السطح.
    ملاحظة: يمكن استخدام عدد أقل من الخلايا لاستيعاب عدد الخلايا وعدد الخلايا اللازمة لتحليل المصب. لتحقيق نتائج التدفق المثلى ، يجب تضمين ما لا يقل عن 50,000 خلية في التحليل.
  2. قم بتخفيف الجسم المضاد (على سبيل المثال ، EpCAM و CD10 المضاد للإنسان) والنمط المتماثل وفقا للتخفيف الموصى به من قبل الشركة المصنعة في 1x PBS. قم بتضمين صبغة قابلة للإصلاح (e506) وجسم مضاد CD45 مترافق مضاد للإنسان لإخراج الخلايا المناعية البشرية الحية. اصنع خليطا كافيا للأجسام المضادة لمدة 50 ميكرولتر على الأقل لكل أنبوب. اتركيه في الظلام على الجليد حتى الخطوة 4.4.
  3. اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. استنشق 1x PBS. أعد تعليق الحبيبات في لوحة الجسم المضاد أو النمط المتماثل واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
  5. بعد الحضانة ، قم بتخفيفه في 1 مل من 1x PBS وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. استنشق 1x PBS وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من 1x PBS.

5. جمع بيانات قياس التدفق الخلوي

  1. قم بتسجيل الدخول إلى جهاز FACS.
    ملاحظة: نقدم البروتوكول باستخدام مقياس التدفق الخلوي المشار إليه (انظر جدول المواد). بالنسبة لمقاييس التدفق الخلوية الأخرى ، التزم بتعليمات الشركة المصنعة. تم تكوين إعداد الجهد لمقياس التدفق الخلوي مسبقا للحصول على الأداء الأمثل مع PBMCs البشرية ، مما يلغي الحاجة إلى تعديلات الجهد قبل كل تشغيل FACS.
  2. إذا كان الجهاز في وضع الاستحواذ ، فانتقل إلى الخطوة 5.3. إذا كان الجهاز في وضع تحليل البيانات ، فقم بالتغيير إلى وضع الاستحواذ بالضغط على زر الطاقة في أعلى اليمين. عند عرض نافذة منبثقة، اضغط على الزر الذي يقرأ وضع الاكتساب.
  3. في أسفل اليسار، إذا كان الجهاز يقرأ المعايرة المطلوبة، فانتقل إلى الخطوة 5.3.1. إذا كان الجهاز يقرأ المعايرة موافق، فانتقل إلى الخطوة 5.4.
    1. لمعايرة الماكينة ، أخرج حبات المعايرة من الثلاجة والدوامة 4 درجات مئوية.
    2. ضع قطرة واحدة من حبات المعايرة في أنبوب دائري من البوليسترين سعة 5 مل وضع الأنبوب في حامل الأنبوب الفردي.
    3. اضغط على زر الباركود في أعلى اليمين وامسح زجاجة حبة المعايرة. ستظهر نافذة منبثقة. إذا تم إعداد كل شيء، فانقر فوق نعم | حسنا ودع المعايرة تعمل.
    4. إذا نجحت المعايرة، فقم بتسجيل الخروج وتسجيل الدخول مرة أخرى إلى وضع الاكتساب . انتقل إلى الخطوة 5.4.
  4. انقر فوق فتح | مساحة عمل جديدة في أعلى اليمين.
  5. حدد البرد 5 رف ؛ حدد ثلاثة من الآبار. حدد البئر الأول وأعطه وصفا (على سبيل المثال ، FTX Ab). حدد البئر التالي وأعطه وصفا فريدا (على سبيل المثال ، FTX Iso). حدد البئر الأخير واعطه وصف التبييض.
    ملاحظة: قم دائما بتضمين عينة مبيض بعد كل 4-5 عينات تجريبية لضمان تنظيف عينات الخلية في الوقت المناسب.
  6. حدد جميع الآبار وقم بإعداد الظروف التجريبية على النحو التالي: إعدادات الأداة: PBMCs البشرية ؛ معدل التدفق: مرتفع. مزيج العينة: خلط لطيف. الوضع: قياسي. الحجم الإجمالي للعينة 200 ميكرولتر ؛ امتصاص العينة 150 ميكرولتر ؛ التعليق التوضيحي: الأجسام المضادة المدخلة ووضع العلامات على الفلوروفور الخاص بها.
  7. حدد تحرير | خيارات وقم بتسمية الملف ضمن الوصف | تطبيق | موافق.
  8. أخرج الرف من الثلاجة وضعه على الدرج بحيث يكون الباركود مواجها للماكينة. ضع أنابيب العينة في الحامل لتعكس ترتيب العينات على الشاشة واضغط على زر التشغيل لبدء التجربة.
  9. بمجرد انتهاء التجربة ، قم بتوصيل USB ، وحدد ملف | نسخ ، وقم بتوسيع المجلد الخاص ، وحدد التجربة ، وانقر فوق نسخ وإخراج.
  10. بعد جمع البيانات ، استخدم البرنامج لتحليل ورقة البيانات.
  11. ابدأ بالتحكم في النمط المتماثل. استخدم أداة المضلع لتحديد الخلايا على مخطط التشتت الأمامي (FSC) مقابل المبعثر الجانبي (SSC).
  12. قم بإخراج الخلايا الميتة عن طريق تغيير المحور Y إلى e506 والمحور X إلى FSC. استخدم أداة المضلع لتحديد مجموعة الخلايا الحية السالبة e506.
  13. انقر نقرا مزدوجا على السكان المحددين. قم بتغيير المحور Y إلى CD45 البشري. استخدم أداة المضلع لتحديد مجموعة الخلايا. هذه هي مجموعة الخلايا البشرية السالبة CD45.
  14. انقر نقرا مزدوجا فوق مجموعة الخلايا السالبة CD45. قم بتغيير المحور Y إلى الرسم البياني والمحور X إلى EpCAM البشري. استخدم أداة تحديد النطاق للنقر على نهاية الرسم البياني وحدد المساحة الفارغة حتى نهاية الرسم البياني. يمثل هذا السكان الإيجابيين ل EpCAM. كرر مع صبغة CD10 البشرية.
  15. اسحب بوابات النمط المتماثل أسفل مساحة عمل الجسم المضاد. سيتم إخراج الخلايا الإيجابية CD45 وسيتم اختيار مجموعات إيجابية ل EpCAM و CD10 لها.
  16. لإنشاء مخططات بيانية تمثيلية، حدد محرر التخطيط. اسحب الرسوم البيانية المطلوبة إلى صفحة التخطيط. لمقارنة النمط المتماثل وتلوين الأجسام المضادة ، قم بتراكب الرسم البياني للنمط الإسواني مع الرسم البياني للجسم المضاد. قم ببوابة الخلايا الموجبة بناء على التحكم في النمط المتماثل.

6. الكيمياء المناعية

  1. خلايا الثقافة بعد خطوة العزل النهائية في زجاج الغرفة المطلوبة تنزلق حتى تلتق.
  2. لإصلاح الخلايا ، أضف 500 ميكرولتر من الحضانة الباردة 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  3. استنشق 4٪ PFA واغسله 3x باستخدام 1x PBS.
  4. لاختراق الخلايا ، أضف ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من 0.25٪ Triton-X في PBS واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. أثناء النفاذية ، قم بإعداد المخزن المؤقت المانع (4٪ مصل الماعز العادي [NGS] للأجسام المضادة التي لا تنتج في الماعز).
  6. استنشق 0.25٪ Triton-X واغسله 3x مع 1x PBS.
  7. أضف ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب (4٪ NGS في PBS). كتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بإعداد تخفيفات الأجسام المضادة الأولية في 1٪ NGS في 1x PBS وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  9. بعد الحظر ، أضف ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: قد تفضل بعض الأجسام المضادة الأولية حضانة بين عشية وضحاها 4 درجات مئوية. تحقق من ورقة بيانات الأجسام المضادة.
  10. تحضير محاليل الأجسام المضادة الثانوية في 1٪ NGS في 1x PBS. لف الأنابيب بورق قصدير وقم بإعداد المحاليل في الظلام لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء. تخزينها في الظلام حتى تصبح جاهزة.
  11. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، اغسل 3x باستخدام 1x PBS.
  12. أضف ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: خلال الخطوات التالية ، حاول إبقاء الشريحة في الظلام قدر الإمكان.
  13. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل 3x باستخدام 1x PBS.
  14. قم بإزالة الغرف ، إما ببساطة عن طريق إزالتها يدويا أو باستخدام الأداة المرفقة مع الشرائح. اتبع الإرشادات المطبوعة على عبوة شريحة الغرفة للإزالة.
  15. أضف قطرة من مصل التثبيت 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وضع غطاء في الأعلى. قلل من عدد الفقاعات وتأكد من تغطية جميع الخلايا. الخطوة الاختيارية: استخدم طلاء الأظافر حول الحواف لإغلاق الغطاء.
  16. ضع الشريحة بشكل مسطح في صندوق منزلق حتى تجف وضعها على حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  17. صورة على مجهر مجهز بمضان صحيح يعتمد على اقتران الأجسام المضادة الثانوية لضمان صورة نظيفة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتضمين سبع مجموعات من قناة فالوب حيث قمنا بعزل مجموعة من الخلايا الظهارية المخصبة (الشكل 2 أ والشكل التكميلي S1A). لتقييم الجدوى وإثراء الخلايا الظهارية لطريقة التعليق أحادية الخلية هذه ، تم إجراء قياس التدفق الخلوي. لقياس صلاحية الخلية ، تم تلطيخ الخلايا بعلامة الجدوى ، e506. سمح هذا أيضا بإخراج جميع الحطام والخلايا الميتة عند تحليلها.

لتحديد تكوين الخلايا المعزولة بهذه الطريقة ، تم تلطيخ العينات بعلامة الخلية الظهارية (EpCAM) ، وعلامة الخلايا اللحمية (CD10) ، وعلامة الخلية المناعية (CD45). كما هو موضح في الشكل 2 ب ، قمنا بعزل مجموعة من الخلايا الظهارية القابلة للحياة والمخصبة من أنسجة قناة فالوب. كانت صلاحية العينة في المتوسط 82٪. بالنسبة لجميع العينات ، بعد إخراج الخلايا الإيجابية ل CD45 ، لاحظنا وجود مجموعة من الخلايا الظهارية المخصبة بخلايا إيجابية EpCAM يبلغ متوسطها 80٪ من العينة. كان هناك بعض تلوث الخلايا اللحمية ولكن 7.8٪ فقط في المتوسط. يوضح الشكل 2C الخلايا المعزولة في 2D بعد 4-6 أيام من الطلاء. من الواضح أن الخلايا الظهارية كانت معزولة لأنها شكلت مجموعات متسقة متسقة ذات مظهر مرصوف بالحصى. في الشكل التكميلي S1B ، تم طلاء الخلايا بعد العزل وزراعتها لمدة 2-6 أيام. تم استخدام الكيمياء المناعية لتوصيف الخلايا التي تنمو في الثقافة. كانت معظم الخلايا في المزرعة ملطخة إيجابية ل EpCAM وعلامة الخلية الإفرازية ، PAX8. تم تحديد عدد قليل فقط من الخلايا على أنها إيجابية للفيمنتين. شوهدت الخلايا الهدبية في الثقافة كما تم التقاطها بواسطة الفيديو ، كما هو موضح في الفيديو التكميلي S1.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط تجريبي. (أ) يتم الحصول على قناتي فالوب. (ب) تتم إزالة الدهون الزائدة والأنسجة الضامة. (ج) يتم تقطيع الأنابيب إلى قطع ~ 3-5 مم. (د) تغسل القطع في PBS ، ثم تحتضن في EDTA 2x لمدة 5 دقائق ، وتحتضن في 1٪ تريبسين لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. (ه) باستخدام زوجين من الملقط ، أحدهما للإمساك والآخر للدفع ، يطرد الخلايا الظهارية من قطع قناة فالوب. (و) انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل ، وتدور ، وعدت. (ز) إعادة التعليق في DMEM والكولاجيناز و DNase. ملخص لمدة 30-45 دقيقة. (ح) يصفى بمصفاة 100 ميكرومتر. (ط) الحصاد عن طريق الطرد المركزي والعد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: توصيف الخلايا الظهارية المعزولة. (أ) جدول المعلومات السريرية للمريض ونتائج قياس التدفق الخلوي. (ب) تم إجراء قياس التدفق الخلوي بعد العزل لإظهار أنه تم عزل مجموعة مخصبة من الخلايا الظهارية (إيجابية EpCAM). يشار إلى التحكم السلبي في النمط المتماثل باللون الأسود ، ويشار إلى النتيجة التجريبية باللون الوردي. (ج) تم طلاء الخلايا بعد العزل. تم التقاط الصور بعد 4-6 أيام من الطلاء. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: AUB = نزيف الرحم غير الطبيعي. EIN = أورام داخل ظهارة بطانة الرحم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: توصيف إضافي للخلايا الظهارية المعزولة في الثقافة. (أ) جدول المعلومات السريرية للمريض. (ب) تم زراعة الخلايا المعزولة وتلطيخها من أجل EpCAM ، وهي علامة خلية إفرازية (PAX8) ، وعلامة خلية لحمية (Vimentin) بعد 2-6 أيام من الطلاء لتوصيف نوع الخلية في الثقافة. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: EIN: الأورام داخل ظهارة بطانة الرحم. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الفيديو التكميلي S1: تم التقاط مقطع فيديو لضرب الخلايا المهدبة بتكبير 30 ضعفا لإثبات الخلايا المهدبة في المزرعة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك قدر كبير من الاهتمام بدراسة ظهارة قناة فالوب حيث تلعب قناتي فالوب دورا مهما في التكاثر وهي موقع المنشأ لمعظم HGSOC. تحقيقا لهذه الغاية ، وصف العديد من الباحثين بروتوكولات لعزل خلايا قناة فالوب في كل من النماذج البشرية والفئران10،11،12،15،16،17،18،19،20،21. تضيف الطريقة التي نصفها لاستخراج وإثراء الخلايا الظهارية لقناة فالوب إلى بروتوكولات عزل خلايا قناة فالوب الحالية. على الرغم من وجود تداخلات داخل هذه البروتوكولات ، إلا أن هناك نوعين عامين من الطرق التي تم الإبلاغ عنها في الفئران والبشر. الأول ينطوي على فرم قناة فالوب بأكملها وهضمها إنزيميا مما يعطي تعليقا كليا للخلية10،12،15،16،17. والثاني ينطوي على القذف بالتحريض أو الكشط ، مما ينتج عنه صفائح من الأنسجة11،18،19،20،21. تسمح كلتا الطريقتين بتحليل الخلايا الظهارية من خلال التجارب النهائية مثل قياس التدفق الخلوي والتسلسل والثقافة في المختبر . تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لطريقتنا في أن البروتوكول ينتج مجموعة من خلايا قناة فالوب المخصبة بالفعل للخلايا الظهارية من خلال الهضم الأنزيمي وخطوات الدفع الميكانيكية. يمكن هضم هذه المجموعة المخصبة للظهارة بشكل أكبر مما يؤدي إلى تعليق أحادي الخلية يمكن استخدامه في العديد من التطبيقات مثل قياس التدفق الخلوي ، والثقافة ثنائية الأبعاد ، والكيمياء الخلوية المناعية ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

تشمل الخطوات الرئيسية التي وجدناها للتأثير على إنتاجية الخلية المدة التي تحتضن فيها شظايا قناة فالوب في 1٪ من التربسين / HBSS و DMEM / DNase. سيؤدي الإفراط في الحضانة في أي من المحاللين إلى تدهور الخلايا وتقليل قابلية الخلايا للحياة بشكل كبير. ومع ذلك ، فإن وقت الحضانة غير الكافي سيمنع قدرة الباحث على دفع العديد من الخلايا الظهارية أثناء خطوة البروتوكول 2.6 لأنها ستستمر في الالتصاق ببعضها البعض. من المهم أيضا استخدام محلول التربسين بنسبة 1٪ ، حيث أن التركيزات المنخفضة والعليا من محاليل التربسين قللت من إنتاجية الخلايا الظهارية لقناة فالوب القابلة للحياة. من خلال الجمع بين العزل الكيميائي والميكانيكي وخطوة الهضم (خطوة البروتوكول 3.1) ، يمكننا تقصير الفترة التي تستغرقها الانتقال من الأنسجة إلى تعليق الخلية الواحدة بشكل كبير. هذا يضمن جدوى جيدة ووقتا لإجراء تحليل المصب في نفس اليوم.

في خطوة البروتوكول 1.4 ، من الأهمية بمكان التأكد من أن قطع قناة فالوب المقطوعة بسمك 3-5 مم. إذا كانت القطع كبيرة جدا ، فسيكون من الصعب تنفيذ خطوة البروتوكول 2.7 وتقليل إنتاجية الخلية في النهاية حيث سيكون من الضروري وقت حضانة أطول في DMEM / DNase.

على الرغم من أن معلق الخلية غني بالخلايا الظهارية ، إلا أن تلوث الخلايا اللحمية أمر لا مفر منه. إذا كان المستحضر بحاجة إلى أن يكون خلايا ظهارية بحتة ، فيمكن إجراء الفرز باستخدام قياس التدفق الخلوي والعلامات التي وصفناها لعزل الخلايا الظهارية واستنفاد الخلايا اللحمة.

تم استخدام قناتي فالوب بعد انقطاع الطمث في هذه الدراسة. ومع ذلك ، فقد تم استخدام هذه الطريقة بنجاح في مختبرنا على قناتي فالوب قبل انقطاع الطمث. يتمثل الاختلاف الرئيسي بين قناتي فالوب قبل وبعد انقطاع الطمث في تكوين الخلايا الظهارية المهدبةوالإفرازية 1. يعمل هذا البروتوكول في جميع مراحل الإنجاب.

سيسهل هذا البروتوكول الفعال التحقيق في أنواع خلايا ظهارة قناة فالوب ، بما في ذلك تحديد السلالات الخلوية ، وتغيراتها الديناميكية أثناء الدورات الإنجابية وكذلك بعد انقطاع الطمث ، ودورها في بدء سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم المؤلفين Ruegg L و James Allan LB و DiBernardo G جزئيا من قبل مشاريع جمعية المحاربين القدامى في لوس أنجلوس الكبرى 1I01BX006019-01A2 و I01BX006411-01 إلى Memarzadeh S. المؤلف Ochoa C مدعوم من قبل جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس إيلي ومركز إديث برود للطب التجديدي وأبحاث الخلايا الجذعية برنامج تدريب المنح الدراسية للخريجين في مؤسسة روز هيلز. نود أن نشكر المختبر الأساسي لعلم الأمراض الانتقالي في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس وعلى وجه التحديد كو كيهلي وكلوي يين للمساعدة في شراء الأنسجة. نود أيضا أن نشكر كين ياماوتشي وجوهر الفحص المجهري BSCRC على مساعدتهم في التصوير. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com (رقم الاتفاقية JL27QWDYNT). أخيرا ، نود أن نشكر فيليسيا كورديا وقلب قياس التدفق الخلوي BSCRC للمساعدة في قياس التدفق الخلوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ تربسين ثرمو علمية J63993.09
100 & micro; م مصفاة الخليةCorning431752
المجهر الإلكترونيParaformaldehyde15710-S
5 مل أنابيب القاع المستديرةCorning352008
60 مم لوحة ثقافةالخلية Corning & nbsp ؛CLS430589-500EA
6-well Cell Culture PlateCorning353046
Anti-CD10BioLegend312212
Anti-CD326 (Ep-CAM)BioLegend324218
Anti-CD45   ؛BioLegend304026
Anti-EpCAMAbcamab223582
Anti-IgG2a PerCP BioLegend400250
Anti-PAX8Sigma-Aldrich363M-15
Anti-VimentinAgilent TechnologiesM072501-2
نظام شرائح الغرفةThermo Scientific  154917PK
كولاجيناز ثرمو علمية 17100017
DMEMThermo Scientific 10569-010
DNase ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
ملقط نقطة دقيقة VWR102091-526أي ملقط دقيق من اختيارك سيعمل
صبغ قابلية للإصلاح eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FlowJo إصدار برنامج 9   ؛BD Biosciencesبرنامج تحليل البيانات
GlutaMAXGibco35050-061
HBSSThermo Scientific  14175-095
MACuant Analyzer 10 مقياس التدفق الخلوي Miltenyi Biotec
MACuant معايرة الخرزMiltenyi Biotec130-093-607
Mammocult تقنيات الخلايا الجذعية5620
مصل الماعز العاديفيشر PI31873
علمي PBS & nbsp ؛ثرمو علمية 14190-144
البنسلين الستربتوميوسين Gibco15140-122
PerCP مترافق CD45BioLegend304026
المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء   ؛تونبو للعلوم البيولوجيةTNB-4300-L100 
تريتون X-100ثيرمو علمي BP151-100
مقص زنبركي Vannas-Tubingen  أدوات العلومالدقيقة 15003-08
VECTASHIELD مع DAPIFisher ScientificNC9524612
4٪ علوم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crow, J., Amso, N. N., Lewin, J., Shaw, R. W. Morphology and ultrastructure of fallopian tube epithelium at different stages of the menstrual cycle and menopause. Hum Reprod. 9 (12), 2224-2233 (1994).
  2. Patek, E., Nilsson, L., Johannisson, E. Scanning electron microscopic study of the human fallopian tube. Report II. Fetal life, reproductive life, and postmenopause. Fert Steril. 23 (10), 719-733 (1972).
  3. Coan, M., et al. Exploring the role of fallopian ciliated cells in the pathogenesis of high-grade serous ovarian cancer. Int J Mol Sci. 19 (9), 2512(2018).
  4. Leese, H., Tay, J., Reischl, J., Downing, S. Formation of fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction. 121 (3), 339-346 (2001).
  5. Donnez, J., Casanas-Roux, F., Ferin, J., Thomas, K. Changes in ciliation and cell height in human tubal epithelium in the fertile and post-fertile years. Maturitas. 5 (1), 39-45 (1983).
  6. Lengyel, E., et al. A molecular atlas of the human postmenopausal fallopian tube and ovary from single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Rep. 41 (12), 111838-111838 (2022).
  7. Tao, T., et al. Loss of tubal ciliated cells as a risk for "ovarian" or pelvic serous carcinoma. Am J Cancer Res. 10 (11), 3815(2020).
  8. Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. J Hematol Oncol. 5 (1), 8(2012).
  9. Hu, Z., et al. The repertoire of serous ovarian cancer non-genetic heterogeneity revealed by single-cell sequencing of normal fallopian tube epithelial cells. Cancer Cell. 37 (2), 226-242.e7 (2020).
  10. Dinh, H. Q., et al. Single-cell transcriptomics identifies gene expression networks driving differentiation and tumorigenesis in the human fallopian tube. Cell Rep. 35 (2), 108978(2021).
  11. Ulrich, N., et al. Cellular heterogeneity of human fallopian tubes in normal and hydrosalpinx disease states identified using scRNA-seq. Dev Cell. 57 (7), 914-929.e7 (2022).
  12. Brand, J., et al. Fallopian tube single cell analysis reveals myeloid cell alterations in high-grade serous ovarian cancer. iScience. 27 (3), 108990-108990 (2024).
  13. Memarzadeh, S., et al. Cell-autonomous activation of the PI3-kinase pathway initiates endometrial cancer from adult uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (40), 17298-17303 (2010).
  14. Cunha, G. R. Stromal induction and specification of morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelia of the mullerian ducts and urogenital sinus during development of the uterus and vagina in mice. J Exp Zool. 196 (3), 361-369 (1976).
  15. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32 (1873-5061), 51-60 (2018).
  16. Karst, A. M., Drapkin, R. Primary culture and immortalization of human fallopian tube secretory epithelial cells. Nat Protoc. 7 (9), 1755-1764 (2012).
  17. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protocols. 3 (1), 101164(2022).
  18. Radecki, K. C., Lorenson, M. Y., Carter, D. G., Walker, A. M. Microdissection and dissociation of the murine oviduct: Individual segment identification and single cell isolation. J Vis Exp. (177), e63168(2021).
  19. Feng, L., et al. Protocol for the detection of organoid-initiating cell activity in patient-derived single fallopian tube epithelial cells. Methods Mol Bio. 2429, 445-454 (2022).
  20. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6 (1), 8989(2015).
  21. Fotheringham, S., Levanon, K., Drapkin, R. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. (51), e2728(2011).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EpCAM

مقالات ذات صلة