قمنا بتطوير مكون إضافي مفتوح المصدر Micro-Manager ، والذي يتيح المراقبة الحية لثنائيات الأقطاب الفلورية على مجهر إضاءة منظم. يدعم المكون الإضافي مراقبة كل من الاتجاه ثنائي القطب ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مكون إضافي مفتوح المصدر Micro-Manager للتصوير المباشر لثنائيات الأقطاب الفلورية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن للفحص المجهري للاستقطاب الفلوري (FPM) تصوير موضع الفلوروفورات واتجاهها ثنائي القطب. على الرغم من إنجازات الفحص المجهري للاستقطاب الفلوري فائق الدقة ، إلا أن اعتمادها على ما بعد الاستحواذ يعيق المراقبة في الوقت الفعلي. يوفر الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية المستقطبة (pSIM) تصويرا فائق الدقة لثنائيات الأقطاب الفلورية بسرعة تصوير عالية وهو مناسب تماما لتطبيقات الخلايا الحية. قمنا بتطوير تطبيق مفتوح المصدر لإعادة بناء صور الاستقطاب في الوقت الفعلي وعرض ثنائيات الأقطاب الفلورية. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتوسيع الطريقة لتحقيق رسم خرائط الاتجاه ثلاثي الأبعاد (3DOM) ، مما أدى إلى توسيع فائدته للدراسات البيولوجية المعقدة. علاوة على ذلك ، قدمنا مقدمة شاملة لتوسيع مجهر SIM الحالي على التصوير الاستقطاب وقدمنا دليل تكوين مفصل ل Micro-Manager 2.0 للتحكم في المجهر ، مما يتيح معاينة التصوير المستقطب في الوقت الفعلي. بالإضافة إلى ذلك ، قدمنا رمز MATLAB لإعادة البناء الكامل بما في ذلك كل من pSIM و 3DOM. يهدف هذا الدليل الشامل إلى مساعدة المبتدئين في إتقان العمليات بسرعة والبدء فيها بسهولة.
المقدمة
ظهر الفحص المجهري للاستقطاب الفلوري (FPM) كتقنية قوية للتصوير في وقت واحد لكل من موضع الفلوروفورات واتجاهها ثنائي القطب ، مما يوفر رؤى عميقة في التصوير البيولوجي1،2. من خلال تسهيل مراقبة اتجاه اتجاهات الجزيئات الحيوية ، يكشف FPM النقاب عن الترتيب المعقد للجزيئات الكبيرة مثل الأكتين3،4،5 ، والأنابيب الدقيقة5 ، والسبتين6 ، وخيوط الحمض النووي 7-9 ، ومركب المسام النووية10
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توسيع مجهر الإضاءة الهيكلي الحالي لتصوير الاستقطاب
- قم بإعداد مجهر SIM.
ملاحظة: نفترض أن القراء لديهم أساس معين في إعداد المجهر ويمتلكون بالفعل مجهر ضوئي منظم. إذا كنت تفتقر إلى الخبرة ذات الصلة ، فراجع هذه الورقة ، التي توفر وصفا تفصيليا لكيفية بناء مجهر SIM16. يمكن استبدال وحدة التحكم في الاستقطاب ل "HWP + WQP + LCVR" بلوحة موجة دوامة بيتزافي pSIM 5 أو لوحة نصف موجة بيتزا17. - قم بقياس نسب انقراض الاستقطاب لثلاثة اتجاهات شريطية عن طريق تحميل أنماط مختلفة على معدل الضوء المكاني (SLM). ضع المستقطب وقم بتدويره مباشرة بعد ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن تنفيذ طريقة pSIM على مجاهر SIM بناء على التداخل باستخدام أشعة الليزر المستقطبة s. تداخل الاستقطاب s هو النوع الأكثر استخداما من بطاقة SIM ويولد خطوط إضاءة عالية التباين. يتم تضمين النموذج الأولي الأكاديمي لإعداد المجهر في العمل الأصلي ل pSIM5. تم تقديمه بإيجاز في الشكل 1 ، وهو معدل الضوء المكاني (SLM) يولد الترتيب ±1 من الحزم الحيورية وتحافظ لوحة نصف موجة البيتزا على الاستقطاب s لثلاثة اتجاهات. في حين أن بدائل SIM الأخرى قد تستخدم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في دراستنا ، قمنا بتطوير مكون إضافي يسمح بالمعاينة في الوقت الفعلي لتقنيتين لتصوير الاستقطاب ، pSIM و 3DOM. يمكن تنفيذ كلتا التقنيتين في نظام SIM موجود مع تعديل طفيف. لقد قدمنا الخطوات التفصيلية لتثبيت مجهر pSIM و 3DOM وإعداد Micro-Manager للتحكم في المجهر وتوضيح كيفية الحصول على نتائج الاستقطاب في العرض المباشر. تشمل النتائج التجريبية خيوط الأكتين التي تم تصويرها بواسطة pSIM و λ-DNA المصورة بواسطة 3DOM. يكون اتجاه ثنائيات أقطاب الفالودين موازيا تقريبا لاتجاه خيوط الأكتين ، في حين أن اتج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFC3401100).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 100 نانومتر حبات الفلورسنت | Invitrogen | F8801 | |
| 4٪ محلول الفورمالديهايد | Invitrogen | R37814 | |
| الكاميرا | Tucsen | Dhyana 400BSI V3 | https://www.tucsen.com/download-software/ |
| المواد الأساسية لأطقم الأسنان (النوع الأول نوع الإعداد الحراري ، سائل) | سنشري للأسنان | N / A | |
| Dulbecco s النسر المعدل s متوسط | Gibco | C11995500BT | |
| Eclipse TE2000 مجهر مقلوب | نيكون | TE2000 E | |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | 10099141C | |
| MATLAB R2019b | MathWorks | الإصدار R2019b | https://ww2.mathworks.cn/downloads/ |
| MetroCon V4.0 | Kopin | الإصدار 4.0 | برنامج معدل الضوء |
| المكانيمايكرو مدير 2.0 | & و مو anager | الإصدار 2.0 | تحميل Micro-Manager أحدث إصدار |
| MS-2000 XYZ المرحلة الآلية | العلمية التطبيقية | MIM3 | https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/ |
| myDAQ | National Instruments | 781325-01 | تنزيلات البرامج وبرامج التشغيل - NI |
| OBIS 561 نانومتر LS 20 ميجاوات ليزر | متماسك | 1325777 | |
| Phalloidin-AF568 | Invitrogen | A12380 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Corning | 21-040-CV | |
| بولي ميثيل ميثاكريليت | Solarbio | M9810 | |
| ProLong Diamond | Invitrogen | P36980 | |
| معدل الضوء المكاني | Kopin | SXGA-12 | |
| SYTOX صبغة الحمض | النووي البرتقاليInvitrogen | S11368 | |
| Triton X-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | |
| &lambda ؛ -DNA | Invitrogen | S11368 |
المراجع
- Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
- Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
