يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة QuEChERS-HPLC المعدلة للكشف عن الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في أجنة أسماك الزرد المعرضة للجسيمات الدقيقة

1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67757

⸱

يونيو 13, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

قمنا بتطوير طريقة QuEChERS-HPLC المعدلة لتقييم المستويات الداخلية ل 16 هيدروكربوكرية في أجنة أسماك الزرد.

الملخص

تم ربط تعرض الأمهات للجسيمات الدقيقة (PM2.5) ، التي يبلغ قطرها الديناميكي الهوائي 2.5 ميكرومتر أو أقل ، بالإجهاض التلقائي والأمراض الخلقية المختلفة لدى البشر. ومع ذلك، لا تزال الآليات الأساسية غير واضحة. تستخدم أجنة أسماك الزرد على نطاق واسع لدراسة السمية التنموية ل PM2.5 ، لكن قياس المستويات الداخلية للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) ، وهي المكونات السامة الأساسية ل PM2.5 ، يشكل تحديا. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء سريعة وسهلة ورخيصة وفعالة ومتينة وآمنة (QuEChERS-HPLC) لتقييم المستويات الداخلية ل 16 هيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المدرجة في قائمة الملوثات ذات الأولوية لوكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA). تمت معالجة أجنة أسماك الزرد بمواد عضوية قابلة للاستخراج (EOM) من PM2.5 لمدة 2-72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). تم استخدام طريقة QuEChERS لإعداد العينة ، وتم استخدام HPLC-FLD / DAD (HPLC مع كاشف التألق وكاشف مصفوفة الصمام الثنائي) للتحليلات النوعية والكمية ل PAHs. لقد نجحنا في اكتشاف ستة هيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (الفينانثرين والأنثراسين والفلورين والأسينافثين والفلورانثين والبيرين) في أجنة أسماك الزرد المعرضة ل PM2.5. هذه الطريقة ضرورية للتحقيق في آليات السمية التنموية الناجمة عن PM2.5.

المقدمة

الجسيمات الدقيقة (PM2.5) ، بقطر ديناميكي هوائي يبلغ 2.5 ميكرومتر أو أقل. هو عامل خطر بيئي رئيسي. نظرا لصغر حجمه ، فإن PM2.5 قادر على دخول نظام الدورة الدموية واختراق حاجز الأم والجنين. ربطت الدراسات الوبائية بين تعرض الأمهات ل PM2.5 والإجهاض التلقائي والأمراض الخلقيةالمختلفة 1،2،3،4. ومع ذلك ، فإن الآليات الأساسية للسمية الجنينية ل PM2.5 ليست مفهومة جيدا. الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ، المكون السام الأساسي ل PM2.5 ، شديدة السمية للإنسان بسبب خصائصها المسببة للطفرات والمسرطنة5،6. من بين مئات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ، تم تعيين 16 ملوثا عالي الأولوية من قبل وكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA).

أسماك الزرد ، Danio rerio ، هي كائن حي نموذجي قوي للفقاريات نظرا لتشابهه الجيني مع البشر ، وتطوره السريع ، ومعدل التكاثر المرتفع ، وسهولة الصيانة. تسمح شفافية أجنة الزرد بالمراقبة المباشرة للجسم بالكامل تحت المجهر ، مما يتيح إجراء دراسات مفصلة. يمكن أن تدخل الهيدروكربكرات العطرية متعددة الحلقات الذائبة إلى أجنة أسماك الزرد عن طريق الانتشار7. استخدمت العديد من الدراسات أجنة الزرد لاستكشاف التأثيرات والآليات السامة للمواد العضوية القابلة للاستخراج (EOM) من PM2.58،9،10،11. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات قد ميزت فقط الهيدروكربروسيك العطري العطري المتعدد الحلقات البالغ 16 أولوية في EOM ، دون الكشف عن المستويات الداخلية للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في أجنة أسماك الزرد12. قد يكون هذا التحدي بسبب صغر حجم أجنة الزرد وتعقيد المصفوفة الجنينية.

طريقة سريعة وسهلة ورخيصة وفعالة ومتينة وآمنة (QuEChERS) هي تقنية مبتكرة لتحضير العينات تستخدم لتحليل بقايا المبيدات الحشرية والأدوية البيطرية والملوثات الأخرى في عينات الطعام والبيئة13،14. عندما تقترن بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، فقد تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن المبيدات الحشرية في أسماك الزرد15. تتميز الهيدروكربونات متعددة الحلقات ، التي تحتوي على حلقتين أو أكثر من حلقات البنزين ، بخصائص مضان قوية ، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص للكشف باستخدام كاشفات التألق. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة QuEChERS-HPLC المعدلة لتقييم مستويات 16 هيدروكربوكرية في أجنة أسماك الزرد المعرضة ل EOM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. معالجة العينة

  1. مجموعة PM2.5
    1. اجمع PM2.5 على مرشحات غشاء الكوارتز مقاس 47 مم.
      ملاحظة: تم جمع PM2.5 في المناطق الحضرية في سوتشو ، الصين.
  2. استخراج EOM
    1. نقطع الفلتر إلى قطع ونضعه في قارورة زجاجية مخروطية الشكل مع 150 مل من الأسيتونيتريل.
    2. الموجات فوق الصوتية قارورة عند 35 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ونقل المستخلص إلى أربعة أنابيب 50 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 7,000 × جم لمدة 20 دقيقة ، ثم انقل المادة الطافية إلى مبخر دوار ومركزها إلى حوالي 5 مل.
    4. يتبخر حتى يجف تحت تدفق النيتروجين في حمام مائي 35 درجة مئوية ويذوب البقايا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  3. معالجة أجنة الزرد
    1. الحفاظ على سمك الزرد في نظام مياه معاد تدويرها في دورة ضوء 14 ساعة و 10 ساعات في دورة مظلمة عند 28 درجة مئوية16.
    2. اجمع البويضات المخصبة (200 جنين لكل مجموعة) وانقلها إلى أطباق بتري زجاجية (زجاج الصودا والجير ، 80 × 15 مم) مع 30 مل من الماء من نظام المياه المعاد تدويرها.
    3. أضف 30 ميكرولتر من EOM (10 مجم / مل) إلى طبق بتري زجاجي يحتوي على 200 جنين بعد ساعتين من الإخصاب (HPF). تعمل المجموعات غير المعالجة كعناصر تحكم فارغة.
      ملاحظة: التركيز النهائي ل EOM هو 10 مجم / لتر ، بناء على معدل تشوه القلب (الشكل التكميلي S1).
    4. ضع الأطباق في حاضنة 28 درجة مئوية.

2. تحضير عينة QuEChERS

  1. قم بإزالة الأطباق مع الأجنة بقوة 72 حصان من الحاضنة. اغسل الأجنة 3 مرات بالماء النقي.
  2. نقل الأجنة إلى أنابيب 1.5 مل (وفقا لمجموعات مختلفة) وإزالة الماء الزائد.
  3. ضع الأنابيب في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتجميد embyros17 وتجميدها. ثم قم بطحن الأجنة باستخدام قضيب زجاجي.
  4. أضف 25 ميكرولتر من محلول قياسي مختلط 16 PAH (2.0 ميكروغرام / مل) إلى مجموعة التحكم DMSO لاختبار استرداد السنبل.
  5. أضف 1 مل من n-hexane والدوامة لمدة 30 ثانية ، ثم الموجات فوق الصوتية عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. جهاز طرد مركزي عند 7,000 × جم لمدة 5 دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
  7. كرر الخطوتين 2.5 و 2.6.
  8. تبخر المواد الطافية المجمعة حتى تجف تحت تدفق النيتروجين في حمام مائي 35 درجة مئوية.
  9. أضف 1 مل من الأسيتونيتريل والدوامة لمدة 30 ثانية.
  10. أضف 10 مجم من الأمين الثانوي الأولي (PSA) ، و 45 مجم من كبريتات المغنيسيوم ، و 15 مجم من عبوة C18 ، ثم دوامة لمدة 30 ثانية.
  11. جهاز طرد مركزي عند 7,000 × جم لمدة 5 دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
  12. كرر الخطوة 2.9 وجهاز الطرد المركزي عند 7,000 × جم لمدة 5 دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
  13. تبخر المادة الطافية إلى 0.5 مل تحت النيتروجين.
  14. قم بالتصفية من خلال غشاء صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر.

3. تحديد الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات باستخدام HPLC

  1. قم بإعداد سلسلة من حلول العمل (تتراوح من 1 إلى 500 نانوغرام / مل) لمعيار 16 PAH المختلط مع الأسيتونيتريل وحقنها في كروماتوجراف سائل باستخدام الأسيتونيتريل / الماء كمرحلة متحركة.
    1. حقن 20 ميكرولتر واستخدام إجراء الشطف التالي: 0-18.5 دقيقة ، 40٪ أسيتونيتريل إلى 100٪ أسيتونيتريل ؛ 18.5-28 دقيقة ، 100٪ أسيتونيتريل ؛ 28-29.5 دقيقة ، 100٪ إلى 40٪ أسيتونيتريل ؛ وقت التوقف: 32 دقيقة ؛ درجة حرارة العمود: 25 درجة مئوية ؛ معدل التدفق: 1.8 مل / دقيقة. ارسم منحنى قياسي بتركيزات كتلية لمحاليل العمل القياسية على المحور x ومناطق الذروة المقابلة على المحور y ، تغطي نطاقا من 5 نانوغرام / مل إلى 500 نانوغرام / مل.
      ملاحظة: يمكن العثور على الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث من الهيدروكربونات متعددة الحلقات في الجدول التكميلي S1.
  2. حقن العينة المنقاة (من الخطوة 2.14.) في الكروماتوجراف السائل باستخدام كاشف التألق (FLD) وكاشف مصفوفة الصمام الثنائي (DAD).
  3. تحديد وجود الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات من خلال مقارنة أوقات الاستبقاء وقياس مناطق الذروة المرتبطة بها.
    ملاحظة: تم تحديد تركيزات كتلة الهيدروكربونات متعددة الحلقات باستخدام المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه مسبقا من الخطوة 3.1.1.
  4. احسب التركيزات الداخلية ل 16 هيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات بناء على تركيزات الكتلة المقاسة للعينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم توضيح الإجراء الكامل للتعرض ل EOM وإعداد العينة واكتشاف الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في الشكل 1. وبالنسبة ل HPLC-FLU/DAD، اعتبرت نسبة الإشارة إلى الضوضاء البالغة 3:1، مع نطاق الكشف من 0.3 إلى 5.0 نانوغرام/مل، مقبولة. وتراوحت حدود طريقة الكشف من 3.0 × 10-4 إلى 5.0 × 10-3 نانوغرام/كائن حي. أظهرت جميع منحنيات المعايرة خطية عالية (ص2 > 0.999). كانت قيم الدقة المحددة باستخدام المستخلصات التي تم الحصول عليها من عينات المصفوفة أقل من 5٪. تراوحت معدلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتبر أجنة أسماك الزرد نموذجا قويا للفقاريات لدراسات السمية التنموية ، لكن صغر حجمها يعقد اكتشاف المركبات العضوية شبه المتطايرة (SVOCs) مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات أثناء تحضير العينة ، يعد منع تلوث أجنة الزرد أمرا بالغ الأهمية. يعد التنظيف السليم للعينات خطوة أساسية لتجنب ترحيل المركبات من وسط التعرض إلى مستخلص العينة. يمكن أن يؤدي الغسيل غير المكتمل إلى المبالغة في التقدير ، في حين أن الغسيل المفرط يمكن أن يتسبب في فقدان المواد من داخل الأجنة ، مما يؤدي إلى التقليل من التق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة: 81972999) وخطة تطوير العلوم والتكنولوجيا في سوتشو (البحوث الأساسية في التطبيقات الطبية ، SKY2023036 و SKY2023115).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
16 الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات الحلول القياسية المختلطة o2si الحلول الذكية (ساوث كارولينا ، الولايات المتحدة الأمريكية)110124-0616 محلولا قياسية مختلطة من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات تشمل النفثالين (Nap) ، الأسينافثيلين (Acy) ، الآس النفثين (Ace) ، الفلورين (Flo) ، الفينانثرين (Phe) ، الأنثراسين (النمل) ، الفلورانثين (الأنفلونزا) ، البيرين (Pyr) ، بنزو [أ] أنثراسين (BaA) ، الكريسين (Chr) ، بنزو [ب] الفلورانثين (BbF) ، بنزو [ك] الفلورانثين (BkF) ، بنزو [أ] بيرين (BaP) ، إندينو [1،2،3-cd] بيرين (IcdP) ، ديبنز [أ ، ح] أنثراسين (DahA) ، بنزو [ز ، ح ، أنا] بيريلين (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (سانتا كلارا، الولايات المتحدة الأمريكية)FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
AcetonitrileScharlab (برشلونة ، إسبانيا)AC03661000المذيب
CNWBOND HC-C18 SPE & nbsp ؛ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (شنغهاي ، الصين)SBEQ-CA0801C18 عبارة عن تعبئة ذات مرحلة عكسية مع توازن جيد بين الماء والكارهة للماء ، والتي يمكنها امتصاص وفصل المركبات العضوية القطبية وغير القطبية جيدا.
Agilent Technologies، Inc (سانتا كلارا ، الولايات المتحدة الأمريكية)12214013لفصل وتنقية وإزالة الشوائب العضوية ؛
Dispersive SPE 15 مل ، ENAgilent Technologies، Inc (سانتا كلارا ، الولايات المتحدة الأمريكية)5982-5056تنقية العينة
ANPEL Laboratory Technologies (شنغهاي) Inc. (شنغهاي ، الصين)SCAA-104مرشح إبرة الطور العضوي (نايلون) ، 0.22 وميكرو ؛ م
هكسانشارلاب (برشلونة ، إسبانيا)HE02481000مذيب
ميليبورميرك (نيو جيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)تحضير تنظيم المياه فائقة النقاء
- N-EVAP تنظيم مبخرات النيتروجين(ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)تبخير المذيبات
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية)الطرد
المركزي  Vortex- Genie 2 (G560E)الصناعات العلمية (نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies، Inc (سانتا كلارا ، الولايات المتحدة الأمريكية)959990-918هذا العمود بشكل شائع في أنظمة HPLC لتحقيق تحليل دقيق وموثوق به للهيدروكربونات العطرية المتعددة الحلقات
التعبئة شركة مرشح يستخدم

المراجع

  1. Wang, H., et al. Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss. Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).
  2. Grippo, A., et al. Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth. Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).
  3. Tanner, J. P., et al. Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring. Environ Res. 142, 345-353 (2015).
  4. Feng, Y., et al. Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).
  5. Lin, Y., et al. Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing. J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).
  6. Chen, Y., et al. Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years. Atmos Environ. 248, 118202(2021).
  7. Carls, M. G., et al. Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles. Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).
  8. He, Y., et al. Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio). Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).
  9. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Sci Total Environ. 719, 135097(2020).
  10. Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model. Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).
  11. Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage. Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).
  12. Zhang, H., et al. Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355, 31-38 (2016).
  13. González-Curbelo, M., et al. Evolution and applications of the QuECHERS method. TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).
  14. Wilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology. Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).
  15. Zhao, C., et al. Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio. Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).
  16. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  17. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  18. Ji, C., et al. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 457, 131749(2023).
  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الكشف عن الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقاتتحضير العيناتكاشف الفلوريةكاشف مصفوفة الصمامات الثنائيةالمواد العضوية القابلة للاستخلاصالسمية التطورية
طريقة QuEChERS-HPLC المعدلة للكشف عن الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في أجنة أسماك الزرد المعرضة للجسيمات الدقيقة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.