Method Article

طريقة عالية الإنتاجية لمراقبة الأنماط الظاهرية الحركية في Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لتحديد العوامل الوراثية المشاركة في أنواع مختلفة من الحركيات في الزائفة الزنجارية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تلعب سلوكيات الحركة دورا مهما في قدرة البكتيريا على استغلال الموارد المتاحة في بيئتها. هذا ينطبق بشكل خاص على العامل الممرض متعدد الاستخدامات Pseudomonas aeruginosa ، والذي يمكن أن يظهر أنواعا متنوعة من الحركة ، بما في ذلك الاحتشاد والوخز ، وهي سمات مسببة للأمراض مهمة تساهم في الاستعمار السطحي ، وتكوين الأغشية الحيوية ، والتهرب من دفاعات المضيف. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول حركة عالي الإنتاجية لدراسة سلوكيات الحركة ل P. aeruginosa. يسمح البروتوكول بالاختبار المتزامن لسلالات متعددة من المتصورة الزنجارية من مكتبة متحولة على مستوى الجينوم ، على سبيل المثال ، لتحديد وتحليل العوامل الوراثية المشاركة في حركتها. يوفر هذا النهج إمكانية دراسة الحركة بطريقة شاملة ورؤى حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء المتصورة الزائجارية . يمكن أيضا تعديل البروتوكول الموصوف هنا لاستيعاب أنواع مختلفة من فحوصات الحركة بالإضافة إلى الأنواع البكتيرية الأخرى ، وبالتالي توفير منصة قوية لتعزيز فهم السلوك البكتيري في سياقات مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa هو عامل ممرض انتهازي يمكنه استعمار بيئات متنوعة بسبب تعدد استخداماته الأيضيةالملحوظ 1،2. هذا التنوع أمر بالغ الأهمية للانتقال من نمط نمو العوالق إلى الأغشية الحيوية مما يساهم في قدرتها على الازدهار في مجموعة واسعة من المنافذ التي تتراوح من الماء إلى جسم الإنسان3،4،5. يتم دعم الانتقال بين أنماط النمو هذه من خلال القدرة الواسعة على التحرك عبر هذه البيئات باستخدام أنواع مختلفة من الحركة ، بما في ذلك السباحة والاحتشاد والوخز1،6. يتم التوسط في كل نوع من أنواع الحركة بآليات وهياكل خلوية متميزة ويسمح ل P. aeruginosa بالاستجابة للإشارات البيئية7،8. يتم تشغيل حركة السباحة بواسطة سوط قطبي واحد ويستخدم للتحرك عبر الوسائط السائلة نحو العناصر الغذائية ، على سبيل المثال9. حركة الاحتشاد هي حركة منسقة يسهلها إنتاج السوط والسطحي الحيوي وتسمح للمستعمرات بالانتشار عبر الأسطح شبه الصلبة10،11. أخيرا ، حركة الوخز مستقلة عن السوط. بدلا من ذلك ، يتم التوسط في الوخز بواسطة النوع الرابع بيلي (T4P) ويستخدم للتحرك فوق الأسطح12،13. تساهم حركة الوخز أيضا في الخطوات المبكرة لتكوين الأغشية الحيوية ل P. aeruginosa من خلال توفير الارتباط الأولي بالسطح. بعد التعلق الأولي ، يسمح الوخز للبكتيريا بالتحرك عبر الأسطح وإنشاء مستعمرات دقيقة ، والتي يمكن أن تتطور بعد ذلك إلى أغشية حيوية ناضجة1،4،13.

تقليديا ، يتم إجراء فحوصات الحركة البكتيرية بشكل فردي ، سلالة واحدة في كل مرة ، على لوحة أجار ناعمة أو باستخدام طرق الفحص المجهري6،14،15. تم استخدام الوسائط شبه الصلبة لسنوات عديدة في دراسة الحركة البكتيرية. في الوقت الحاضر ، لا تزال هذه التقنيات تستخدم لتحديد الأنماط الظاهرية للحركة في البكتيريا. على سبيل المثال ، تقليديا ، لوحظت حركة الاحتشاد عن طريق تلقيح 2.5 ميكرولتر من P. aeruginosa ثقافة في وسط طبق بتري يحتوي على وسائط M9 بتركيز أجار 0.5٪ -0.8٪16. عادة ما يتم قياس حركة الوخز من خلال النظر إلى انتشار البكتيريا على سطح الواجهة بين أجار (عند 1٪) وقاعدة طبق بتري بعد طعنة تلقيح المتصورة الزنجارية من خلال وسط الاستزراع. يتم الحصول على هالة كبيرة من توسع المستعمرة الخلالية بعد 48 ساعة من الحضانة ، في حين أن السلالات غير الوخز لا تنتج مثل هذه المنطقة من توسع المستعمرة1،17،18.

في الآونة الأخيرة ، اكتشفت مناهج الطفرات التي تشكلها جينات جديدة تشارك في الحركة أو تكوين الأغشية الحيوية في P. aeruginosa19،20،21. على سبيل المثال ، تم العثور على جينات جديدة تشارك في حركة الوخز باستخدام مكتبة متحولة عالية الكثافة في P. aeruginosa19. أداة أخرى مفيدة في علم الجينوم الوظيفي هي استخدام مجموعات الطافرة المرتبة22،23. من المحتمل أن تكون مجموعة Keio24 ، التي تحتوي على عمليات حذف أحادية الجين لجميع الجينات غير الأساسية في الإشريكية القولونية ، هي أشهر مجموعة من الطفرات وقد تم استخدامها لتحديد الجينات التي تؤثر على الأنماط الظاهرية المختلفة من النمو في الوسائط المختلفة25 إلى مورفولوجيا الخلية26 وأكثر. هذه المجموعات متاحة أيضا ل Salmonella enterica serovar Typhimurium27 و Bacillus subtilis28 و P. aeruginosa29 بالإضافة إلى العديد من الأنواع الأخرى. هذه المجموعات مناسبة أيضا لدراسة الحركة بطريقة على مستوى الجينوم ، مما يؤدي إلى تطوير طريقة عالية الإنتاجية لدراسة حركة P. aeruginosa. هنا ، تم اختبار الطريقة من خلال تقييم مساهمة طفرات P. aeruginosa في كل من حركة الوخز والاحتشاد على الألواح عالية الكثافة. يمكن استخدام هذه الطريقة عالية الإنتاجية لمختلف الأنماط الظاهرية للحركة وهي مناسبة لدراسة حركة البكتيريا الأخرى أيضا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم توضيح سير العمل العام لهذا الإجراء في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1: سير العمل التجريبي. (1) قم بإعداد الكمية اللازمة من وسائط الحركة بناء على نوع الحركة ذات الأهمية في التجارب. (2) باستخدام نظام النسخ المتماثل اليدوي أو الآلي ، قم بإعداد لوحات المخزون المصدر ل P. aeruginosa المكتبة المتحولة لإدخال الينقولات للمجموعة الطافرة بالكثافة المناسبة ، مع التركيز على الدقة والتلقيح المنتظم عبر جميع آبار الألواح. (3) نقل العينات من لوحات المصدر لمجموعة الطافرة إلى لوحات الحركة. (4) بعد الحضانة ، راقب وتحليل الأنماط الظاهرية للحركة وحدد الجينات المشاركة في الحركة ذات الأهمية باستخدام صور عالية الجودة. (5) إجراء فحوصات الحركة التقليدية للتحقق من صحة الضربات التي تم تحديدها من خلال تجارب الحركة عالية الإنتاجية. تم إنشاؤه باستخدام BioRender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لوحات الاحتشاد - وسائط M9لوحات الوخز - LB mediaلوحات المصدر - وسائط LB
200 مل من محلول أملاح 5x M910 غ كلوريد الصوديوم10 غ كلوريد الصوديوم
10 مل من الجلوكوز 20٪10 جم تربتون10 جم تربتون
25 مل من أحماض الكازامينو5 جم مستخلص الخميرة5 جم مستخلص الخميرة
1 مل من 1M MgSO410 جرام أجار15 جرام أجار
500 مل من أجار 1٪أضف dH2O إلى 1 لترأضف dH2O إلى 1 لتر
أضف dH2O إلى 1 لترجنتاميسين (التركيز النهائي 15 ميكروغرام / مل)

الجدول 1: تكوين الوسائط لمختلف اللوحات المستخدمة في الفحص.

1. تحضير لوحات متوسطة الثقافة

ملاحظة: انظر جدول المواد لإعداد حلول المخزون وظروف التخزين. يجب ملء اللوحات على سطح مستو. عند التجفيف ، يجب أن تكون الألواح مسطحة على السطح (أي غير مكدسة). هذا يضمن أن وسط الثقافة في اللوحة يجف بالتساوي. يمكن أن تعمل أي ألواح أحادية الأبعاد ذات بصمة نموذجية ، لكن الألواح ذات الأبعاد الداخلية الأكبر (بدون جدران داخلية) ، مثل لوحات Singer Instruments Plus أو ألواح زراعة الأنسجة المفردة غير المعالجة بئر VWR ، تسهل العمل بكثافة أعلى من المستعمرات لكل لوحة.

  1. قم بإعداد كمية مناسبة من الوسائط للتجارب حسب الوصفة الواردة في الجدول 1. احتفظ بالوسائط عند ~ 45 درجة مئوية - 50 درجة مئوية لمنع الأجار من التصلب.
    1. بالنسبة للوحات المصدر ، قم بإعداد 59 لوحا (مرق ليسوجيني) تحتوي على 1.5٪ أجار و 15 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ، وهو أمر ضروري لتكرار مكتبة PA14 الكاملة - 59 × 25 مل = ~ 1500 مل. قم بإعداد 15 لوحا آخر من LB 1.5٪ أجار و 15 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين لترقية المكتبة بتنسيق 384 كثافة - 15 × 25 مل = ~ 400 مل.
    2. ألواح الوخز: إذا كنت تعمل بتنسيق 96 كثافة ، فقم بإعداد 59 لوحا من الوخز (رطل 1٪ أجار). قم بإعداد 15 لوحة وخز إذا كنت تعمل بتنسيق 384 كثافة.
    3. لوحات الاحتشاد: قم بإعداد 15 (تنسيق 384 كثافة) أو 59 (تنسيق 96 كثافة) (M9-glucose 0.5٪ أجار)
  2. ارفع الغطاء عن الطبق واسكب 25 مل من الوسائط لكل طبق. وزعي الوسائط بالتساوي عبر الطبق عن طريق رفع كل ركن من أركان اللوحة برفق واحدا تلو الآخر. كرر حركة التذبذب هذه 2x-3x. ضع الغطاء مرة أخرى على اللوحة.
  3. دع الألواح تتصلب وتجف في درجة حرارة الغرفة (RT) طوال الليل. إذا لم يتم استخدام الألواح على الفور ، ضعها في أكياس محكمة الغلق واحفظها في مكان جاف. يمكن تخزينها لمدة 3 أسابيع.

2. إعداد لوحات المصدر ل P. aeruginosa مكتبة الينقولات المتحولة

ملاحظة: تشير لوحات المصدر إلى لوحات LBA-gentamycin التي تحتوي على نسخة من مكتبة PA14 والتي تستخدم لاحقا لتلقيح ألواح الحركة. ال P. aeruginosa مكتبة الينقولات المتحولة (مكتبة PA14) عبارة عن مجموعة من 59 لوحة مجمدة مكونة من 96 بئرا29. يتم وصف خطوات إعداد لوحات المصدر لكل تنسيق فيما يلي. هذا البروتوكول قابل للتكيف مع المختبرات التي لا يمكنها الوصول إلى النسخ المتماثل Rotor +. يمكن للباحثين تنفيذ نفس الإجراءات التجريبية بنجاح باستخدام النسخ المتماثلة اليدوية ، مثل النسخ المتماثلة ذات 96 سنا المحملة بنابض والمستخدمة هنا لتكرار الألواح المجمدة لمكتبة PA14 خلال اليوم الأول (راجع جدول المواد) أو أي مكررات أخرى ذات 96 سنا. يجب تعقيم أجهزة النسخ المتماثلة اليدوية والسماح لها بالتبريد بين كل استخدام.

  1. اليوم 1: تكرار مكتبة PA14 من 59 لوحة مجمدة مكونة من 96 بئرا على لوحات المصدر
    1. قم بتعقيم جهاز نسخ مكرر مكون من 96 سنا محمل بنابض عن طريق وضعه على لوح ساخن عند درجة حرارة قصوى لمدة 8 دقائق. بعد التعقيم ، اترك النسخ المتماثل يبرد بدرجة كافية (~ 10 دقائق) لتجنب قتل البكتيريا.
    2. احصل على لوحة مصدر واحدة. باستخدام النسخ المتماثل المعقم المكون من 96 سنا ، قم بغمس دبابيس النسخ المتماثل بعناية في لوحة واحدة مكونة من 96 بئرا ، ثم انقل الخلايا مباشرة على سطح لوحة المصدر. كرر حتى يتم نسخ جميع الألواح المجمدة البالغ عددها 59 بئرا في مكتبة PA14 على لوحات المصدر.
    3. احتضان ألواح المصدر ذات الكثافة 96 عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم الطريقة بتنسيق 96 كثافة ، فيمكن بعد ذلك استخدام لوحات المصدر هذه لتلقيح لوحات الحركة.
  2. اليوم 2: الترقية من تنسيق 96 كثافة إلى تنسيق 384 كثافة
    ملاحظة: يمكن تخطي اليوم 2 إذا كان يعمل بكثافة 96.
    1. بعد الحضانة ، اترك الألواح (مسطحة على سطح ، غير مكدسة) في درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة) لتبرد. إذا كان هناك تكاثف على الأغطية ، فقم بإزالة التكثيف باستخدام مناديل مهمة دقيقة لمنع قطرات الماء من السقوط على الألواح ، مما قد يتسبب في تلوث متبادل بين المستعمرات.
    2. قم بتكوين النسخ المتماثل باستخدام المعلمات التالية لضمان نقل المستعمرة بدقة. قم بتشغيل النسخ المتماثل. في القسم تحديد وضع تشغيل، حدد تحديد البرامج المخزنة وتشغيلها.
    3. في القسم تحديد لوحات المصدر، حدد PlusPlate 96 Agar. في القسم تحديد اللوحات المستهدفة، حدد PlusPlate 384 Agar. في القسم تحديد الوسادات، حدد دبوس قصير 96.
    4. في قسم نسخ خيارات البرنامج ، حدد عام وانقر فوق إعادة التدوير > لا شيء.
    5. في قسم المصدر ، حدد إزاحة وانقر فوق عشوائي > نصف قطر افتراضي. في القسم الهدف ، حدد التثبيت واضبط الضغط على 20٪. اترك جميع الإعدادات الأخرى كإعداد افتراضي.
    6. أدخل Short Pin RePads 96 في المقصورة المناسبة.
    7. ضع اللوحات المصدر والهدف على المنصة المخصصة للنسخ المتماثل. ضع لوحات المصدر ذات الكثافة 96 (اللوحات 1 و 2 و 3 و 4) ولوحة المصدر الفارغة الجديدة (لوحات LBA) على المنصة. باستخدام المعلمات المحددة ، سيقوم روبوت تثبيت المصفوفة الميكروبية بنقل المستعمرات من الألواح ذات الكثافة 96 إلى اللوحة الجديدة ذات الكثافة 384. اضغط على تشغيل.
    8. قم بتغيير جميع اللوحات الموجودة على المنصة (لوحات المصدر الأربع التالية بكثافة 96 ولوحة مصدر فارغة جديدة) وكرر العملية حتى تتم ترقية جميع الألواح. بالنسبة للمجموعة الأخيرة من اللوحات ، استخدم اللوحة 57 و 58 و 59 و 1. ستتألف كل لوحة بكثافة 384 من مستعمرات متناوبة من أربع ألواح بكثافة 96 (انظر الشكل 2). احتضان ألواح LBA بكثافة 384 عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
      ملاحظة: يمكن بعد ذلك استخدام لوحات المصدر هذه بكثافة 384 لتلقيح لوحة الحركة لتنفيذ البروتوكول بكثافة 384. في أي خطوة بعد الحضانة ، يمكن تخزين الأطباق عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.

figure-protocol-2
الشكل 2: الترقية من لوحة 96 كثافة إلى 384 لوحا بكثافة. يتم نقل المستعمرات من أربع ألواح مصدر بكثافة 96 ودمجها في صفيحة واحدة بكثافة 384. يتوافق كل ربع من اللوحة ذات الكثافة 384 مع واحدة من الألواح الأصلية المكونة من 96 بئرا (الأحمر والأزرق والأصفر والأخضر) ، مع الحفاظ على موضع كل طفرة. تم إنشاؤه باستخدام BioRender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تجربة الحركة عالية الإنتاجية

ملاحظة: تم تنفيذ البروتوكول هنا بتنسيق 384 كثافة ، ولكن يمكن تكييف نفس البروتوكول إلى تنسيق 96 كثافة عن طريق تعديل المعلمات الموجودة على النسخ المتماثل للنقل من لوحات المصدر إلى لوحات الحركة باستخدام التحديد 96 بدلا من 384.

  1. بعد الحضانة ، اترك الألواح (مسطحة على سطح ، غير مكدسة) في درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة) لتبرد. في حالة حدوث تكاثف على الأغطية ، قم بإزالته باستخدام مسح دقيق لمنع قطرات الماء من السقوط على الألواح ، مما قد يتسبب في تلوث متبادل بين المستعمرات.
  2. احصل على العدد المناسب من اللوحات (59 لتنسيق 96 كثافة أو 15 لتنسيق 384 كثافة) للفحص المطلوب: لوحات أجار M9-glucose 0.5٪ للاحتشاد ، LB ، و 1٪ لوحات أجار للوخز.
  3. قم بتكوين النسخ المتماثل باستخدام المعلمات التالية لضمان نقل المستعمرة بدقة.
    1. قم بتشغيل النسخ المتماثل. في القسم تحديد وضع تشغيل، حدد تحديد البرامج المخزنة وتشغيلها. في القسم تحديد لوحات المصدر، حدد PlusPlate 384 Agar.
    2. في القسم تحديد اللوحات المستهدفة، حدد PlusPlate 384 Agar. في القسم تحديد الوسادات، حدد Short Pin 384. في القسم نسخ خيارات البرنامج نسخ متماثل، حدد عام > إعادة التدوير > لا شيء.
    3. في برامج المغناء، حدد نسخ متماثل للعدل.
    4. في القسم المصدر، حدد الإزاحة > عشوائي > نصف قطر افتراضي. في القسم الهدف، حدد التثبيت واضبط الضغط على 2٪. اترك جميع الإعدادات الأخرى كإعداد افتراضي.
  4. أدخل Short Pin RePads 384 في المقصورة المناسبة.
  5. ضع اللوحات المصدر والهدف على المنصة المخصصة للنسخ المتماثل. ضع لوحات المصدر بكثافة 384 وألواح الحركة الفارغة على المنصة. اضغط على تشغيل باستخدام المعلمات المحددة ، سيقوم روبوت تثبيت المصفوفة الميكروبية بنقل المستعمرات من لوحات المصدر ذات الكثافة 384 إلى لوحات الحركة. ستتألف كل لوحة بكثافة 384 من نسخة من لوحة مصدر واحدة بكثافة 384.
  6. تأكد من أن النقل متساو وأن جميع المستعمرات مثبتة بشكل مناسب على سطح أجار لألواح الحركة. ضع ألواح الحركة الملقحة في أكياس بلاستيكية. ضع الأكياس التي تحتوي على الألواح بحذر في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    ملاحظة: توضع الألواح في أكياس للحفاظ على الرطوبة ومنع الجفاف غير المتساوي. ضع الأطباق في الحاضنة بحيث تكون الأغطية متجهة لأعلى.
  7. بعد الحضانة ، تحقق من لوحات الحركة بحثا عن نمو المستعمرة وعدم وجود تلوث.
  8. اليوم 3: تصوير لوحات الحركة
    ملاحظة: يتم استخدام Singer Instruments PhenoBooth لالتقاط صور عالية الدقة لألواح الحركة. يستخدم كاميرا علمية وينتج صورا بدقة 23 ميجابكسل. يتضمن خمس قنوات إضاءة لالتقاط صور عالية الدقة للمستعمرات من أطباق بتري وألواح مستطيلة. تعمل أجهزة التصوير الأخرى عالية الجودة أيضا.
    1. بعد فترة الحضانة ، تكون لوحات الحركة جاهزة لعملية التصوير. قم بتشغيل Phenobooth وانقر على الرمز المقابل لبرنامج Phenobooth.
    2. يتم فتح صفحة تحديد المشروع. انقر فوق مشروع جديد > Colony Counting. اختر مسار الملف المطلوب لتخزين الصور في حقل الموقع. في الحقل الدقة، اختر 5626 × 4220. انقر فوق موافق ، الجهاز جاهز الآن لالتقاط الصور.
    3. أدخل اللوحة في القارئ بحيث يكون الجانب المتوسط لأعلى بعد إزالة الغطاء. تأكد من وضع اللوحة بشكل صحيح قبل إغلاق القارئ لتجنب تشويش اللوحة.
    4. اضبط المعلمة على الضوء الأبيض في علامة التبويب إضاءة. انقر فوق معاينة. اضبط إعدادات التعريض الضوئي في علامة التبويب إعدادات PhenoBooth للحصول على المعلمات المثلى لمراقبة الأنماط الظاهرية للحركة.
    5. انقر فوق اكتساب ؛ ستظهر الصور الملتقطة على الجانب الأيسر من الشاشة. بمجرد الانتهاء ، أغلق البرنامج (سيتم حفظ جميع الصور الملتقطة في الملف الذي تم اختياره مسبقا في علامة التبويب الموقع).
      ملاحظة: يحفظ Phenobooth الصور بتنسيق JPEG ، ولكن بالنسبة لخطوات التحليل النهائية ، يمكن أن تكون الصور بتنسيق TIFF أو JPEG أو PNG.

4. تحليل الأنماط الظاهرية للحركة

ملاحظة: يتم إجراء تحليل الصور كما هو موضح بالتفصيل بواسطة French et al.30،31. يتوفر برنامج نصي لإجراء تحليل البيانات من31 (ImageJ Macro).

  1. باختصار ، تتم معالجة الصور في ImageJ32 ، والتي تولد قيمة لكل مستعمرة على لوحة الحركة. أولا ، قم بتحويل الصور إلى تنسيق 8 بت ، وقم بتقسيم المستعمرات ومناطق الحركة المرتبطة بها من الخلفية باستخدام الأمر Threshold. ارسم منطقة الاهتمام (ROI) حول كل مستعمرة وقم بقياس منطقة الحركة. يؤدي ذلك إلى إنشاء جدول يحتوي على قيمة كثافة متكاملة لكل بئر ، مرتبة حسب الصفوف. يمكن حفظ هذا الجدول كملف CSV لمزيد من التحليل.
    1. قم بتشغيل الماكرو في ImageJ وافتح المجلد الذي يحتوي على الصور.
    2. عند المطالبة، اضبط دوران اللوحة عن طريق تعديل زاوية اللوحة باستخدام خيار المعاينة بحيث تكون اللوحة مستقيمة. عندما تكون راضيا ، انقر فوق الزر "موافق ".
    3. بعد ذلك ، حرك المستطيل حول المستعمرات واستخدمه لاقتصاص جزء اللوحة الذي يحتوي على المستعمرات. عندما تكون جاهزا ، انقر فوق الزر "موافق ".
    4. ستحدد المطالبة التالية الشبكة المستخدمة لرسم عائد الاستثمار حول كل مستعمرة وقياس منطقة الحركة. حدد كثافة المستعمرة المناسبة. اضبط المعلمات المختلفة إذا لزم الأمر ، بحيث تكون كل دائرة حول مستعمرة. عندما تكون جاهزا ، قم بتنشيط حسنا؟ وانقر فوق الزر "موافق ". سيؤدي هذا إلى قياس منطقة الحركة لكل مستعمرة وحفظ ملف CSV في المجلد الذي يحتوي على البيانات.
  2. اجمع ملف CSV هذا مع وسيلة إيضاح اللوحة ، مرتبة أيضا حسب الصفوف ، لتحديد كل منطقة حركة مع المتحولة المقابلة. تتوافق قيم الكثافة المتكاملة المنخفضة مع الطفرات التي كانت غير متحركة أو أظهرت انخفاضا في الحركة.

5. فحوصات الحركة التقليدية للتحقق من صحة الزيارات

ملاحظة: بعد مراقبة الطفرات ذات الحركة المتأثرة في بروتوكول الحركة عالي الإنتاجية ، من المهم التحقق من صحة الزيارات التي تم الحصول عليها بشكل فردي. يختلف بروتوكول الحركة الفردية عن البروتوكول المستخدم لاختبار الإنتاجية العالية ، لكن الوسائط المستخدمة هي نفسها.

  1. فحص حركة الاحتشاد
    ملاحظة: يتم تنفيذ حركة الاحتشاد كما هو موضح بالتفصيل بواسطة Ha et al.16.
    1. باختصار ، قم بالأوتوكلاف بمحلول أجار مع M9 (0.5٪ أجار) والجلوكوز وأحماض الكازامينو و MgSO4. صب الأجار المبرد والمختلط في ألواح بتري (25 مل لكل طبق).
    2. تلقيح ب 2.5 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية بين عشية وضحاها. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع توجيه الأغطية لأعلى لمراقبة الأنماط الظاهرية للحركة.
  2. اختبار الحركة الوخز
    ملاحظة: يتم تنفيذ حركة الوخز كما هو موضح بالتفصيل بواسطة Haley et al.33،34.
    1. باختصار ، الأوتوكلاف أ رطل 1٪ أجار (انظر الجدول 1). صب أجار LB 1٪ المبرد والمختلط في ألواح بتري (25 مل لكل طبق).
    2. طعنة البكتيريا في قاع ألواح الوخز (1٪ أجار). احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ثم عند RT لمدة 48 ساعة إضافية. قم بإزالة الأجار من اللوحة وتصور منطقة الوخز عن طريق تلطيخ طبق بتري ب 1٪ بنفسجي كريستالي.
    3. قم بتصوير أطباق Petri باستخدام PhenoBooth بنفس المعلمات الموضحة في الخطوة 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمنا هذا البروتوكول لتوصيف تأثير تعطيل الجينات على حركة المتصورة الزنجارية في الإنتاجية العالية. هنا ، قمنا بتفصيل استخدامه لدراسة حركة الاحتشاد والوخز في مجموعة حذف على مستوى الجينوم من P. سلالة الزنجار PA14 (مكتبة PA14). يوفر البروتوكول تنوعا كبيرا وسهولة في الاستخدام ، مما يسمح بإجراء تعديلات على خطوات مختلفة من البروتوكول ، مثل استخدام وسائط ثقافية مختلفة أو مجموعات متحولة.

تم تسجيل المسوخ بناء على منطقة حركتها. لن تؤثر معظم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح لنا بروتوكول الحركة عالي الإنتاجية الموصوف هنا بمعالجة وتحليل النمط الظاهري للحركة للعديد من المستعمرات بدقة وقابلية للتكاثر. بالمقارنة مع الطرق اليدوية التقليدية ، يزيد هذا النهج شبه الآلي من قابلية التوسع وإنتاجية فحوصات الحركة للسماح بالتقييم على مستوى الجينوم لحركة البكتيريا. تم تحسين البروتوكول للاستخدام مع مكتبة PA14 ، ولكن يمكن استخدام هذا الاختبار مع أي مكتبة مرتبة من المسوخ ، مثل مجموعة Keio للإشريكية القولونية24 أو مجموعة SGD ل Salmonel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن أصحاب البلاغ أي إفصاح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مختبر Surette في جامعة McMaster على تقديم نسخة من مكتبة PA14. نشكر الدكتور فابريس جان بيير على تعليقاته المفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2019-06044) ومنحة أولية للمحققين الجدد من Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS ؛ # 295613). يحمل J.-P.C. زمالة Chercheur boursier Junior 2 من Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 لوحة بئر    كورنينغ   3701 
آغار فيشر ساينتفيك   BP1423-2 التركيز النهائي 0.5٪ لحركة السرب أو 1٪ للحركة المتحركة على التوالي.
Casamino Acids    فيشر ساينتفيك   223050 حضر مخزون 20٪ من الماء. الفلتر يعقم ب 0.22 & mu؛ m مرشح وتخزين عند 4 درجات مئوية. التركيز النهائي 0.5٪ في M9 وسط أدنى.
كريستال فيوليت بيولوجيا بيسك    CB0331حضر محلول بنسبة 1٪ في الماء.
دي-جلوكوز    بيولوجيا بيسك    GB0219 جهز كمية 20٪ من الماء (1.1 متر) وقم بتعقيمه عن طريق التعقيم (autoclaving). التركيز النهائي 0.2٪ في الحد الأدنى من الوسط M9.
فيلتروبور S 0.2 سارستيد 83.1826.001
جنتامايسين سلفات   بيولوجيا بيسك    GB0217 حضر مرق بوزن 30 ملغ/مل في الماء. الفلتر يعقم ب 0.22 & mu؛ M تصفية وتخزينها عند 4 & درجة؛ C – التركيز النهائي في الألواح 15 وميكرو؛ ز/مل..    
حلقة اللقاح والإبرة فيشر ساينتفيك 22363597
M9 أملاح مينيمل، 5X فيشر ساينتفيك 248510جهز مخزونا من 1 متر في الماء وقم بتعقيمه بواسطة المعقم المعقم (autoclave). التركيز النهائي 1 ملليمولار في M9 وسط أدنى.   
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)   فيشر ساينتفيك M63-500  جهز مخزون 1 متر من MgSO4 في الماء. الفلتر يعقم ب 0.22 & mu؛ M فلتر وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. التركيز النهائي 
مكتبة طفرات إدخال الترانسبوزون PA14   ليبراتي وآخرون، 2006 (انظر المرجع 29)59 لوحة بسعة 96 بئر للمجموعة بأكملها. كل بئر يحتوي على طفرة واحدة في LB تحتوي على 25٪ جلسر.
طبق بترى 92x16 مم;سارستيد 82.1473.001
PhenoBooth+ سينجر إنسترومنتس https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ ؛قم بإذابة 11.3 جرام من المسحوق في 200 مل من الماء المنقي. جهاز تعقيم عند 121 & درجة؛ C لمدة 15 دقيقة  
حقنة بلاستيكية 10 ملم فيشر ساينتفيك 14955459
روتور+     سينجر إنسترومنتس https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ ؛
Short pin Repads 384 كثافة  سينجر إنسترومنتس   REP-004 
RePads ذات الدبوس القصير 96 كثافة    سينجر إنسترومنتس   REP-002 
كلوريد الصوديوم (NaCl)   فيشر ساينتفيك BP358-212 
مكرر 96 دبوس محمل بنابضEnzyScreen   CR1000 
شفرة جراحية ستانلس ستانلس رقم 25 فيشر ساينتفيك 08-918-5F
التربتون Oxoid   LP0042B 
لوحات يونيويلسينجر إنسترومنتس   لوحات البلس: PLU-003   أبعاد اللوحة: 54 &00; 34 &00; 38 سم - بدون جدران داخلية، توفر أبعادا داخلية أكبر.
لوحات يونيويلVWRألواح زراعة الأنسجة بئر واحد: 75780-348نفس أبعاد PlusPlates.
مستخلص الخميرة  فيشر ساينتفيك 248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
  4. Ribbe, J., Baker, A. E., Euler, S., O'Toole, G. A., Maier, B. Role of cyclic Di-GMP and exopolysaccharide in type IV pilus dynamics. J Bacteriol. 199, e00859-e00916 (2017).
  5. Arora, S. K., Neely, A. N., Blair, B., Lory, S., Ramphal, R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections. Infect Immun. 73 (7), 4395-4398 (2005).
  6. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  7. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, e47365(2019).
  8. Breidenstein, E. B. M., Fuente-Núñez, C., de la Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  9. Toutain, C. M., Zegans, M. E., O'Toole, G. A. Evidence for two flagellar stators and their role in the motility of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (2), 771-777 (2005).
  10. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and requires flagella and pili. J Bacteriol. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  11. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environ Microbiol. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  12. Kühn, M. J., et al. Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (30), e2101759118(2021).
  13. Talà, L., Fineberg, A., Kukura, P., Persat, A. Pseudomonas aeruginosa orchestrates twitching motility by sequential control of type IV pili movements. Nat Microbiol. 4 (5), 774-780 (2019).
  14. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. J Bacteriol. 31 (6), 575-580 (1936).
  15. Turnbull, L., Whitchurch, C. B. Motility assay: Twitching motility. Methods Mol Biol. 1149, 73-86 (2014).
  16. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods Mol Biol. 1149, 67-72 (2014).
  17. Semmler, A. B. T., Whitchurch, C. B., Mattick, J. S. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 145 (Pt 10), 2863-2873 (1999).
  18. Henrichsen, J. Twitching Motility. Annu Rev Microbiol. 37, 81-93 (1983).
  19. Nolan, L. M., et al. A global genomic approach uncovers novel components for twitching motility-mediated biofilm expansion in Pseudomonas aeruginosa. Microb Genom. 4 (11), e000229(2018).
  20. Overhage, J., Lewenza, S., Marr, A. K., Hancock, R. E. W. Identification of genes involved in swarming motility using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant library. J Bacteriol. 189 (5), 2164-2169 (2007).
  21. De Bleeckere, A., et al. High throughput determination of the biofilm prevention concentration for Pseudomonas aeruginosa biofilms using a synthetic cystic fibrosis sputum medium. Biofilm. 5, 100106(2023).
  22. Brochado, A. R., Typas, A. High-throughput approaches to understanding gene function and mapping network architecture in bacteria. Curr Opin Microbiol. 16 (2), 199-206 (2013).
  23. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  24. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 2006.0008(2006).
  25. Tong, M., et al. Gene dispensability in Escherichia coli grown in thirty different carbon environments. mBio. 11 (6), e02259-e02320 (2020).
  26. French, S., Côté, J. P., Stokes, J. M., Truant, R., Brown, E. D. Bacteria getting into shape: genetic determinants of E. coli morphology. mBio. 8, e01977-e02016 (2017).
  27. Porwollik, S., et al. Defined single-gene and multi-gene deletion mutant collections in Salmonella enterica sv Typhimurium. PLoS One. 9 (7), e99820(2014).
  28. Koo, B. M., et al. Construction and analysis of two genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst. 4 (3), 291-305.e7 (2017).
  29. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  30. French, S., et al. A robust platform for chemical genomics in bacterial systems. Mol Biol Cell. 27 (6), 1015-1025 (2016).
  31. French, S., Guo, A. B. Y., Brown, E. D. A comprehensive guide to dynamic analysis of microbial gene expression using the 3D-printed PFIbox and a fluorescent reporter library. Nat Protoc. 15 (2), 575-603 (2020).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Haley, C. L., Kruczek, C., Qaisar, U., Colmer-Hamood, J. A., Hamood, A. N. Mucin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by significantly enhancing twitching motility. Can J Microbiol. 60 (3), 155-166 (2014).
  34. Déziel, E., Comeau, Y., Villemur, R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities. J Bacteriol. 183 (4), 1195-1204 (2001).
  35. Gao, P., et al. oprC impairs host defense by increasing the quorum-sensing-mediated virulence of Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol. 11, 1696(2020).
  36. Rosenau, F., et al. Lipase LipC affects motility, biofilm formation and rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 309 (1), 25-34 (2010).
  37. Anyan, M. E., et al. Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 18013-18018 (2014).
  38. Burdman, S., Bahar, O., Parker, J. K., De La Fuente, L. Involvement of type IV pili in pathogenicity of plant pathogenic bacteria. Genes. 2 (4), 706-735 (2011).
  39. Lewis, K. A., et al. Nonmotile subpopulations of Pseudomonas aeruginosa repress flagellar motility in motile cells through a type IV pilus- and pel-dependent mechanism. J Bacteriol. 204 (5), e00528-e00621 (2022).
  40. Chang, C. Y. Surface sensing for biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 8, 2671(2018).
  41. Zegadło, K., et al. Bacterial motility and its role in skin and wound infections. Int J Mol Sci. 24 (2), 1707(2023).
  42. Jurado-Martín, I., Sainz-Mejías, M., McClean, S. Pseudomonas aeruginosa: An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors. Int J Mol Sci. 22 (6), 3128(2021).
  43. Qin, S., et al. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Sig Transduct Target Ther. 7 (1), 199(2022).
  44. Piskovsky, V., Oliveira, N. M. Bacterial motility can govern the dynamics of antibiotic resistance evolution. Nat Commun. 14 (1), 5584(2023).
  45. Xu, J., Koizumi, N., Nakamura, S. Crawling motility on the host tissue surfaces is associated with the pathogenicity of the zoonotic spirochete Leptospira. Front Microbiol. 11, 1886(2020).
  46. Rasmussen, L., et al. A high-throughput screening assay for inhibitors of bacterial motility identifies a novel inhibitor of the Na+-driven flagellar motor and virulence gene expression in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 55 (9), 4134-4143 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudomonas AeruginosaBacterial MotilitySwarming MotilityTwitching MotilityHigh Throughput ProtocolMotility AssayGenome Wide MutantBiofilm FormationColony Pinning RobotImageJ Analysis

Related Articles