Method Article

تحسين توصيل الحويصلة خارج الخلية باستخدام سقالة مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد بغمد أساسي لإدارة الجروح المزمنة

DOI:

10.3791/67764

⸱

February 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتصنيع سقالات مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد ذات غمد أساسي لالتئام الجروح المزمنة. يتم عزل الحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة ، ويتم تحميلها في القلب (الجينات) مع الغمد المصنوع من كربوكسي ميثيل السليلوز والألجينات لياز. يسمح هذا التصميم بتدهور السقالة المتحكم فيه وإطلاق المركبات الكهربائية بكفاءة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدد هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتصنيع السقالات المطبوعة حيويا ثلاثية الأبعاد ذات الغمد الأساسي والمصممة لتعزيز التئام الجروح المزمنة. يتضمن البروتوكول عزل الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، والمعروفة بخصائصها التجديدية والمناعية. ثم يتم دمج هذه المركبات الكهربائية في هيكل سقالة فريد. تتميز السقالة بنواة مكونة من الجينات المحملة بالمركبات الكهربائية ، وتحيط بها غمد مصنوع من كربوكسي ميثيل السليلوز والألجينات ليز. يضمن هذا التصميم المبتكر تدهورا خاضعا للسقالة مع تعزيز الإطلاق الفعال والخاضع للرقابة للمركبات الكهربائية في موقع الجرح. يغطي البروتوكول الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك إعداد وتوصيف المركبات الكهربائية ، وصياغة الأحبار الحيوية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، وتحسين معلمات الطباعة لتحقيق بنية الغلاف الأساسية المطلوبة. من خلال الجمع بين السلامة الهيكلية والنشاط الحيوي ، تهدف السقالة إلى معالجة قيود ضمادات الجروح التقليدية ، وتقديم نهج مستهدف لتسريع تجديد الأنسجة وتقليل الالتهاب في الجروح المزمنة. توفر هذه الطريقة استراتيجية قابلة للتكرار وقابلة للتطوير لتطوير مواد حيوية متقدمة مع تطبيقات سريرية محتملة في إدارة الجروح المزمنة. يسلط البروتوكول الضوء أيضا على الاعتبارات الحاسمة لتحقيق نتائج متسقة ، مما يضمن القدرة على التكيف مع التطبيقات العلاجية المستقبلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب الجروح المزمنة ، التي غالبا ما ترتبط بالالتهاب المفرط ، إدارة في الوقت المناسب لمنع المضاعفات الخطيرة مثل الالتهابات ونخر الأنسجة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى بتر الأطراف. على الرغم من التقدم ، لا تزال العلاجات الحالية مكلفة وغير مريحة ولها آثار جانبية ولها فعالية محدودة ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى ضمادات أكثر علاجا1،2،3. يعد تطوير جيل جديد من ضمادات الجروح المصممة خصيصا للجروح المزمنة أمرا ضروريا لمواجهة هذه التحديات. علاوة على ذلك ، تتطلب الطبيعة المعقدة لالتئام الجروح مواد تضميد مع مجموعة من الخصائص ، بما في ذلك الترطيب والمرونة والالتصاق والنشاط الحيوي والتحللالبيولوجي 4. تهدف هذه الدراسة إلى تطوير ضمادة جروح معدلة بيولوجيا تدمج الحويصلات خارج الخلية (EVs) مع سقالة مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد ذات غمد أساسي لتوفير بيئة علاجية خاضعة للرقابة وتسريع التئام الجروح المزمنة.

تساعد المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا الجذعية في التئام الجروح المزمنة من خلال تعزيز الاستجابات المضادة للالتهابات ونمو الخلايا والهجرة وتكوين الأوعيةالدموية 5. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمركبات الكهربائية توفير جزيئات نشطة بيولوجيا ، بما في ذلك أدوية الجزيئات الصغيرة ، وتركيبات الجينات والبروتينات لإدارة الجروح المزمنة6. علاوة على ذلك ، فإن قدرتها على حماية البضائع من التدهور الأنزيمي تحسن الاستقرار والتوافر البيولوجي للعوامل العلاجية ، مما يوفر مزايا مميزة على عوامل النمو التقليدية والأدوية الجزيئية الصغيرة ، والتي غالبا ما تتحلل بسرعة في الجسم الحي7. على الرغم من هذه المزايا ، لا يزال التسليم الفعال والمستدام للمركبات الكهربائية للأنسجة المستهدفة يمثل تحديا كبيرا.

يمكن أن تكون سقالات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد بمثابة منصة توصيل للمركبات الكهربائية لتعزيز آثارها العلاجية8. تحاكي هذه السقالات البيئات الخلوية الطبيعية وتسمح بالتحكم في إطلاق المركبات الكهربائية 9,10. كما أنها تحمي المركبات الكهربائية من التدهور ، مما يعزز استقرار الحمض النووي الريبي الصغيروالبروتينات 11. أظهر Han et al. أنه يمكن إطلاق المركبات الكهربائية بشكل فعال من سقالات GelMA المطبوعة حيويا ثلاثية الأبعاد. أدى هذا الإصدار إلى تحسين ارتباط الخلايا وتعزيز التعبير الجيني المتعلق بمسارات النقل الميكانيكي في الخلايا الجذعية الوسيطة للوسادة الشدقية البشرية (hBFP-MSCs) المزروعة على السقالات12. Born et al. ، من خلال تحسين تركيز الرابط المتقاطع ، حقق إطلاقا محكما للمركبات الكهربائية. أظهر هذا النهج فعاليته في تعزيز تكوين الأوعية ويقدم طريقة واعدة للتسليم المنظم للمركباتالكهربائية 13.

تتيح الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ذات الغمد الأساسي إنشاء هياكل معقدة ومتعددة المواد عن طريق طباعة مادة أساسية مغلفة بغمد. يمكن أن يشمل اللب الخلايا أو عوامل النمو أو الأدوية ، بينما يوفر الغمد الدعم الميكانيكي والحماية أو يعمل كحاجز. هذه الطريقة لها تطبيقات في هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، مثل تطوير شبكات الأوعية الدموية ، ومحاكاة هياكل الأنسجة الطبيعية ، وإنشاء أنظمة توصيل الأدوية. يسمح بالتحكم الدقيق في توزيع المواد وتكوينها ، مما يعزز الوظائف والأهمية البيولوجية للتركيبات. بالمقارنة مع التقنيات البديلة ، توفر الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ذات الغلاف الأساسي تحكما دقيقا في توزيع المواد وتكوينها ، مما يحسن الوظائف والأهمية البيولوجية للتركيبات14،15.

يوفر التدهور المصمم هندسيا في ضمادات الجروح فوائد مثل تقليل الانزعاج أثناء التغييرات ، وبيئة رطبة للشفاء والسيطرة على العدوى ، والتسليم العلاجي في الوقت المناسب ، والتجديد الأمثل للأنسجة16،17،18. الهلاميات المائية Alginate (Alg) وكربوكسي ميثيل السليلوز (CMCh) متوافقة حيويا وفعالة لتوصيل الحويصلات خارج الخلية (EVs) إلى الجروح ، وتعزيز الشفاء من خلال الاتصال الخلوي وتقليل الالتهاب18. في هذه الدراسة ، تم دمج المركبات الكهربائية في قلب Alg ، بينما تم استخدام غمد CMCh و AlgLyase (AlgLyase) لتمكين تدهور الضمادات السريع وتسليم المركبات الكهربائية. يسهل تصميم الغلاف الأساسي هذا الإطلاق السريع للمركبات الكهربائية استجابة لتدهور السقالات ، مما يعزز فعاليتها العلاجية ويعالج قيود علاجات الجروح المزمنة الحالية. الهدف الأساسي من هذه الدراسة هو تطوير ضمادة معدلة بيولوجيا تعزز التئام الجروح من خلال دمج إطلاق المركبات الكهربائية الخاضعة للرقابة مع سقالة قابلة للتحلل بشكل سريع الاستجابة ، مما يؤدي في النهاية إلى تحسين نتائج علاج الجروح المزمنة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت الأبحاث على بما يتفق تماما مع المعايير الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الوطنية لأخلاقيات علم الأحياء ولجنة أخلاقيات بجامعة نزوى. تم منح الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة بموجب معرف التخليص: VCGSR ، AREC / 01/2023. تم إيواء جميع في ظروف معملية قياسية ، مما يضمن الضوابط البيئية المثلى والتغذية السليمة والرعاية الشاملة لحماية رفاهيتها طوال فترة الدراسة. تلتزم جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات بشكل صارم بالسياسات المؤسسية والمعايير الدولية لرعاية وإرشادات ARRIVE.

1. زراعة الخلايا

  1. استرجع قارورة من الخلايا الجذعية الجذعية (الممر # 2) من تخزين النيتروجين السائل وتعامل معها بتقنيات معقمة لمنع التلوث. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، مع التأكد من إزالتها بمجرد بقاء جزء جليدي صغير.
  2. قم بإعداد وسيط كامل بما في ذلك MSC SFM Basal Medium ، مكملا ب 1٪ (حجم / حجم) MSC SFM XenoFree ، و 1٪ (حجم / حجم) GlutaMAX ، و 0.01٪ (حجم / حجم) جنتاميسين. أضف 1 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بمعدل 3 إلى 5 قطرات كل 5 ثوان إلى القارورة ثم اخلطها برفق. انقل محتويات قارورة الخلايا الجذعية الجذعية بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 4 مل وسط كامل مسخن مسبقا ، في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
  3. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من توازن جهاز الطرد المركزي بشكل صحيح.
  4. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسائط الكاملة الدافئة مسبقا. ثم انقل الخلايا إلى قارورة T25 تحتوي على 4 مل من الوسط الكامل.
  5. قم بإمالة القارورة برفق لضمان توزيع الخلايا بالتساوي. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  6. قم بتغيير الوسط كل يومين ، واستبدله بوسط طازج ، دافئ مسبقا ، كامل. استخدم ماصة لطيفة لتجنب اضطراب الخلايا. عند الوصول إلى التقاء 70٪ -80٪ ، قم بسحب الوسط المستهلك من قارورة T25.
  7. اغسل الخلايا ب 3 مل من PBS الطازج لإزالة البقايا. تأكد من التغطية الكاملة للقارورة أثناء الغسيل.
  8. أضف 1 مل من محلول التربسين 0.25٪ إلى قارورة T25 ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-7 دقائق ، وراقب بعناية الانفصال تحت المجهر بتكبير 4x.
  9. اضغط على القارورة برفق إذا لزم الأمر لضمان انفصال الخلية بالكامل. أضف وسطا كاملا مدفأة مسبقا إلى القارورة والماصة لأعلى ولأسفل فوق السطح للمساعدة في فصل الخلايا. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
  10. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتعليق حبيبات الخلية في وسط جديد كامل وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم Neubauer. انقل الخلايا إلى قارورة T75. تأكد من كثافة بذر تبلغ 5,000 خلية / سم2 لتحقيق النمو الأمثل.
  11. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. بعد 72 ساعة من حضانة الخلية ، اجمع الوسائط المكيفة من الخلايا لعزل المركبات الكهربائية. استخدميه مباشرة بعد الاستلام.

2. عزل المركبات الكهربائية

  1. جهاز الطرد المركزي 13 مل من الوسائط المكيفة المجمعة عند 800 × جم لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الخلوي. قم بتصفية المادة الطافية برفق باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات الكبيرة.
  2. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لهطول الأمطار إلى الوسائط المكيفة المفلترة والدوامة جيدا للخلط. تأكد من أن المحلول متجانس.
  3. احتضن الخليط طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح للمركبات الكهربائية بالترسيب. الطرد المركزي الخليط عند 3,220 × جم لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية. تحقق من توازن الأنابيب.
  4. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. الطرد المركزي الحبيبات مرة أخرى عند 3,220 × جم لمدة 5 ثوان لإزالة السائل المتبقي.
  5. قم بسحب حبيبات EV برفق في 200 ميكرولتر من PBS لتجنب تلف المركبات الكهربائية. قم بقياس تركيز بروتين EVs باتباع تعليمات الشركة المصنعة (مجموعة فحص البروتين BCA).
  6. قم بإجراء النشاف الغربي للكشف عن العلامات الخاصة بالمركبات الكهربائية (CD63 و CD81 و CD9) ، للتحقق من النمط الظاهريEV 18. أكد التحليل وجود هذه العلامات ، مما يتحقق من صحة هوية المركباتالكهربائية 19.
  7. لتقليل مخاطر تلوث RNase ، يوصى باستخدامه مباشرة دون تخزين إضافي. في حالة الحاجة ، قم بتخزين المركبات الكهربائية عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. قم بتقسيم تعليق المركبات الكهربائية إلى أحجام 40 ميكرولتر لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.

3. وضع العلامات على المركبات الكهربائية مع PKH-26

  1. تحضير العازلة
    1. قم بإذابة 0.238 جم من HEPES في حوالي 90 مل من الماء المعقم فائق النقاء في وعاء معقم. استخدم محلول HEPES المحضر حديثا. أضف 0.85 جم من كلوريد الصوديوم إلى محلول HEPES.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك ، كما هو مطلوب ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني المعاير. أضف الماء منزوع الأيونات ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 مل. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لتعقيمه.
  2. تمييع 4 ميكرولتر من صبغة PKH-26 في 1 مل من المخزن المؤقت المحضر. تخلط جيدا بواسطة الماصة لضمان التجانس.
  3. أعد تعليق المركبات الكهربائية المنقاة في 1 مل من PBS بتركيز 700 ميكروغرام / مل. أضف 1 مل من تعليق المركبات الكهربائية إلى 1 مل من محلول PKH-26 المحضر. بالنسبة لمجموعة التحكم في الصبغة فقط ، أضف 1 مل من الوسط الكامل بدون EVs إلى 1 مل من محلول PKH-26. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة للمجموعة الضابطة أيضا لحساب التراكم غير المحدد المحتمل أو تكوين المذيلة.
  4. امزج المركبات الكهربائية جيدا عن طريق قلب الأنبوب برفق 10x-15x. احتضن الخليط لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مما يضمن التعرض المتساوي للمركبات الكهربائية للصبغة.
  5. قم بإعداد محلول BSA طازج بنسبة 2 مل بنسبة 1٪ باستخدام ماء معقم فائق النقاء وأضفه إلى 2 مل من الخليط الناتج لإخماد تفاعل وضع العلامات. تخلط بلطف لمنع التجميع.
  6. قم بتركيز المركبات الكهربائية المسماة PKH-26 وفقا للبروتوكول المذكور أعلاه (الخطوات 2.2-2.7). أعد تعليق المركبات الكهربائية المصنفة في 300 ميكرولتر من PBS. ماصة عينة المركبات الكهربائية المسمى PKH-26 في أنبوب مرشح 30 كيلو دالتون.
  7. جهاز الطرد المركزي العينة عند 3,220 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. خلال هذه الخطوة ، ستمر صبغة PKH-26 الحرة والجزيئات الصغيرة عبر الغشاء إلى المرشح ، بينما سيتم الاحتفاظ بالمركبات الكهربائية المسماة PKH-26 في المحتجز.
  8. بعد الطرد المركزي الأولي ، تخلص من المرشح وأضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الاحتفاظ. أعد تعليق المركبات الكهربائية برفق في PBS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
  9. قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 3,220 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لغسل أي صبغة حرة متبقية أو جزيئات صغيرة.
  10. تأكد من عدم وجود PKH-26 في محلول الترشيح بواسطة المجهر الفلوري. إذا تم الكشف عن أي صبغة ، كرر خطوات الغسيل.
  11. اجمع المحلول العلوي بواسطة ماصة دقيقة وقم بإزالة الفلتر من أنبوب التجميع. اقلب الفلتر بعناية (اقلبه رأسا على عقب).
  12. جهاز الطرد المركزي للمرشح المقلوب عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. سيساعد ذلك في جمع PKH-26-EVs المحتجزة من غشاء المرشح إلى أنبوب التجميع الجديد. استخدم PKH-26-EVs مباشرة للخطوة التالية.

4. 3D الطباعة الحيوية

  1. تحضير Bioinks
    1. قم بإعداد محلول ألجي الصوديوم الطازج بنسبة 4.5٪ (وزن / حجم) باستخدام ماء معقم فائق النقاء. يقلب طوال الليل عند 60 درجة مئوية للسماح للمحلول بالذوبان تماما.
    2. قم بإذابة CMCh في ماء معقم فائق النقاء لتحقيق محلول 3.8٪ (وزن / حجم). تحضير طازجة. يقلب طوال الليل عند 60 درجة مئوية حتى يذوب تماما.
    3. قم بالطرد المركزي للأحبار الحيوية المحضرة عند 3,220 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة أي فقاعات قد تتداخل مع عملية الطباعة.
    4. امزج 3 مل من محلول Alg المحضر مع المركبات الكهربائية المصنفة أو التحكم في الصبغة فقط باستخدام خلاط الحقنة لتحقيق تركيز 0.01٪ (وزن / حجم) من المركبات الكهربائية. تأكد من التوزيع المتساوي عن طريق الخلط اللطيف.
    5. باستخدام خلاط الحقنة ، امزج 1 مل من CMCh مع محلول AlgLyase المحضر حديثا في ماء معقم فائق النقاء لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.5 mU / mL.
  2. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، قم بتحميل الحبر الحيوي Alg / Exo في نفس الوقت في الجزء الأساسي والحبر الحيوي CMCh / AlgLyase في الجزء الغمد من إعداد الحقنة الأساسية / الغمد.
  3. اترك الأحبار الحيوية ترتاح لمدة 15 دقيقة قبل الطباعة.
  4. إعداد طابعة ثلاثية الأبعاد حيوية
    1. باستخدام برنامج 3D-bioprinter ، قم بإنشاء هيكل السقالة عن طريق تحديد شكل أسطواني بنمط حشو قطري. لهذا الغرض ، اضبط قطر الأسطوانة وارتفاعها على 20 مم و 1.1 مم على التوالي. قم بتكوين حجم المسام إلى 1 مم.
    2. اضبط سرعات ضخ فوهة اللب والغمد على 1 مم / ثانية بسمك 0.25 مم لكل طبقة واضبط سرعة الحركة على 6 مم / ثانية. اطبع أربع طبقات بسمك 0.25 مم لكل طبقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. ابدأ في الطباعة على فيلم البوليستر.
  6. استخدم المرطب مع كلوريد الكالسيوم الهباء الجوي (2.2٪) لربط السقالة أثناء عملية البثق. ضع فوهة جهاز الترطيب على بعد 20 سم تقريبا من رأس البثق لضمان الربط المتقاطع الفعال دون المساس بهيكل السقالة. لمزيد من التشابك ، اغمر السقالة في محلول كلوريد الكالسيوم (2.2٪) لمدة 10 دقائق.
  7. اشطف السقالة 3x بماء معقم فائق النقاء لإزالة أي كلوريد كالسيوم زائد وحبر حيوي غير مرتبط.
  8. تأكد من تخزين السقالة في بيئة معقمة عند 4 درجات مئوية للحفاظ على سلامة السقالة ووظائفها لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.

5. تتبع إطلاق المركبات الكهربائية

  1. إنشاء نموذج الجرح الجلدي الدائري
    1. تخدير ذكور أكيتا المصابة بالسكري متغاير الزيجوت (8 أسابيع) عن طريق إعطاء حقن داخل الصفاق من الكيتامين (70 ملغ/كغ) والزيلازين (10 ملغ/كغ). تأكد من التخدير المناسب من خلال تقييم عدم وجود استجابات انعكاسية (على سبيل المثال ، قرصة إصبع القدم) ومراقبة معدل التنفس. لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير ، ضع مرهم عيون بيطري معقم على العينين.
    2. جهز منطقة الجلد الظهرية عن طريق حلقها أولا باستخدام مقص كهربائي. تجنب تهيج الجلد أو إصابته. تعقيم المنطقة المحلوقة باستخدام محلول بوفيدون اليود.
    3. باستخدام جهاز معقم ، قم بإنشاء جرح جلدي دائري كامل السماكة مقاس 6 مم على السطح الظهري لكل فأر.
    4. ضع السقالة المطبوعة حيويا ثلاثية الأبعاد برفق والتي تحتوي على مركبات كهربائية تحمل علامة PKH مباشرة على فراش الجرح. تأكد من أن السقالة تغطي سطح الجرح بالكامل بأقل قدر من الجيوب الهوائية عن طريق الضغط برفق باستخدام ملقط معقم. تأكد من مراقبة عن كثب بعد العملية والبقاء تحت المراقبة حتى يستعيد وعيه تماما ويمكنه الحفاظ على الاستلقاء القصي.
  2. التصوير الفلوري
    1. في 2 ساعة ، 4 ساعات ، 8 ساعات ، 24 ساعة بعد الزرع ، قم بتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران. لتحريض التخدير ، ضع الفئران في حجرة نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) وعرضها ل 2٪ -3٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين. ضع مرهم العين على عيون الفئران لمنع الجفاف. بمجرد التخدير ، انقل الفئران إلى نظام IVIS وحافظ عليها بنسبة 1٪ -2٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين الذي يتم توصيله عبر قنوات الأنف. تحقق من أن مخدرة تماما ومستقرة قبل الشروع في التصوير.
    2. استخدم نظام IVIS لالتقاط إشارات الفلورسنت من المركبات الكهربائية التي تحمل علامة PKH والتي تم إطلاقها من السقالة. في معالج التصوير، حدد خيار التصوير الفلوري وقم بتنشيط مرشحات الإثارة والانبعاث لصبغة PKH. اضبط إعدادات الكاميرا، بما في ذلك مجال الرؤية وارتفاع الهدف، لتحسين اكتشاف الإشارة. تأكد من تحديد المواقع المتسقة عبر جميع النقاط الزمنية للتصوير لتمكين المقارنات الدقيقة. ابدأ في الحصول على الصور وحفظ البيانات الناتجة.
    3. حدد كثافة إشارة الفلورسنت باستخدام برنامج IVIS. سيسمح ذلك بتتبع إطلاق المركبات الكهربائية بمرور الوقت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصوير الإصدار في الجسم الحي للمركبات الكهربائية من كل من سقالات Alg-EVs / CMCh و Alg-EVs / CMCh-AlgLyase في الشكل 1 ب ، ج. كما هو متوقع ، أظهرت سقالة Alg-EVs / CMCh-AlgLyase ملف تعريف إطلاق أسرع مقارنة ب Alg-EVs / CMCh ، لا سيما في النقاط الزمنية 2 ساعة و 4 ساعات. يخضع إطلاق المركبات الكهربائية من الهلاميات المائية لمجموعة من الآليات الفيزيائية والكيميائية ، بما في ذلك الانتشار والتورم والتآكل والتدهور20. من خلال الاستفادة من Alglyase ، تس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتمثل أحد الجوانب المحورية للبروتوكول في تصميم السقالة ذات الغلاف الأساسي ، وهو أمر ضروري لتحقيق تسليم المركبات الكهربائية بكفاءة. يشتمل التصميم على Alg كمادة أساسية ومزيج من CMCh مع Alglyase كغمد. يسهل هذا الإعداد الإطلاق الخاضع للرقابة والسرعة للمركبات الكهربائية. المادة الأساسية ، Alg ، تغلف المركبات الكهربائية ، مما يضمن حمايتها وتسليمها محليا. يتيح الغمد ، المكون من CMCh و Alglyase ، التدهور المتسارع لنواة Alg ، وهو أمر بالغ الأهمية لإطلاق المركبات الكهربائية في الوقت المناسب. في من...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شكر خاص لسعيد الهاشمي وعبد الرحمن المحاربي من شركة هابي للإنتاج على عملهما المتميز في التصوير. كما نعرب عن امتناننا لوزارة التعليم العالي والبحث والابتكار وجامعة نزوى على دعمهما المالي وتوفير الموارد المطلوبة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
23 G أرجواني الدقة مخروطيةفوهة CellinkKT0000002000لتوفير بثق دقيق للأحبار الحيوية مع الحد الأدنى من انسداد
الجينات لياز (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGAlgyase هو إنزيم يحلل الألجينات.
مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra ، 30 كيلو دالتون MWCOMerckUFC9030يستخدم لغسل PKH-26 المسمى EVs
BCA AssayKit Thermo Scientific10678484لتحديد تركيز البروتين / المركبات الكهربائية
نظام الطباعة الحيويةRegematV1لتصنيع سقالة
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتش05470-5Gلإيقاف تفاعل PKH 26   ؛
كلوريد الكالسيومSigma AldrichC3306-100Gللربط المتشابك وتثبيت الأحبار الحيوية في هندسة الأنسجة
جهاز طرد مركزيSigma2-16Pيستخدم لعزل المركبات
طرد مركزي 5810 REppendorf22625101يستخدم لزراعة الخلايا
خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانيةTelstarBio IIAdvance Cell
Culture CryoCube   ؛ سلسلة F570 - فريزر ULTEppendorfF571240035لتخزين مجهر
الفلورسنتالكهربائية OLYMPUS   ؛IX73P1F تستخدم للتحقق من PKH-26 المتبقي في المرشح
جنتاميسين (50 مجم / مل)ثيرموفيشر15750مضاد حيوي لوسائط زراعة الخلايا
GlutaMAX-I CTS ، (100X) ، سائلThermofisherA12860مكمل وسائط زراعة
الخلايا HClSigma Aldrich7647-01-0تحضير العازلة 
هيبسكارل روثآرت. No.  6763.3إعداد العازلة 
كربوكسي ميثيل السليلوز عالي اللزوجة (CMCh) BDH27929 4TCMCh هو مشتق من السليلوز القابل للذوبان في الماء.
حاضنةنيو برونزويك  NB-170Rثقافة الخلايا
Invivo التصويرPerkinElmerIVIS Lumina XRMS Series III   ؛لتتبع إصدار المركبات الكهربائية ، في الجسم الحي
جهاز تحريك المغناطيسSalvisLABMC35لتحضير الأحبار الحيوية
miRCURY أطقم Exosome لعزل ExosomeQiagen76743Evs عزل
NaOhDaejung1310-73-2إعداد العازلة  
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Thermo ScientificJ61196. APCell Culture
PKH 26MCE154214-55-8صبغة فلورية حمراء لوضع العلامات على المركبات الكهربائية
ألجينات الصوديوم (Alg)Sigma AldrichA0682-100Gعديد السكاريد الطبيعي المشتق من الأعشاب البحرية البنية.
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)Carl RothArt-Nr-P029.1تحضير العازلة 
StemPro BM الخلايا الجذعية الوسيطةThermofisherA1382901الخلايا الجذعية الوسيطة
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501وسائط زراعة الخلايا
التربسين 0.25٪Thermofisher25050014تفكك الخلايا
دوامةDaihan ScientificVM-10يستخدم لخلط المخزن المؤقت لهطول الأمطار مع الوسائط المكيفة
الشكل الغمد الأساسي الكهربائية جهاز للمركبات محلول خلاط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nat Rev Disease Primers. 8 (1), 50(2022).
  2. Tran, H. Q., Shahriar, S. S., Yan, Z., Xie, J. Recent advances in functional wound dressings. Adv Wound Care. 12 (7), 399-427 (2023).
  3. Shao, M., et al. Emerging trends in therapeutic algorithm of chronic wound healers: Recent advances in drug delivery systems, concepts-to-clinical application and future prospects. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 34 (5), 385-452 (2017).
  4. Rezvani Ghomi, E., Khalili, S., Nouri Khorasani, S., Esmaeely Neisiany, R., Ramakrishna, S. Wound dressings: Current advances and future directions. J Appl Poly Sci. 136 (27), 47738(2019).
  5. Ding, J. Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in skin wound healing: Roles, opportunities and challenges. Military Med Res. 10 (1), 36(2023).
  6. Sharma, D., Kumar, A., Mostafavi, E. Extracellular vesicle-based biovectors in chronic wound healing: Biogenesis and delivery approaches. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 822-840 (2023).
  7. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Adv Drug Delivery Rev. 106, 148-156 (2016).
  8. Han, P., Ivanovski, S. 3d bioprinted extracellular vesicles for tissue engineering-a perspective. Biofabrication. 15 (1), 013001(2022).
  9. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  10. Zheng, Y., Pan, C., Xu, P., Liu, K. Hydrogel-mediated extracellular vesicles for enhanced wound healing: The latest progress, and their prospects for 3d bioprinting. J Nanobiotechnol. 22 (1), 57(2024).
  11. Keener, A. B. How extracellular vesicles can enhance drug delivery. Nature. 582 (7812), S14-S14 (2020).
  12. Han, P., et al. 3d bioprinted small extracellular vesicles from periodontal cells enhance mesenchymal stromal cell function. Biomater Adv. 158, 213770(2024).
  13. Born, L. J., et al. Sustained released of bioactive mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles from 3d-printed gelatin methacrylate hydrogels. J Biomed Mater Res A. 110 (6), 1190-1198 (2022).
  14. Kjar, A., Mcfarland, B., Mecham, K., Harward, N., Huang, Y. Engineering of tissue constructs using coaxial bioprinting. Bioact Mater. 6 (2), 460-471 (2021).
  15. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3d bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  16. Deshayes, S., Kasko, A. M. Polymeric biomaterials with engineered degradation. J Poly Sci A Poly Chem. 51 (17), 3531-3566 (2013).
  17. Xu, Q., et al. Injectable hyperbranched poly (β-amino ester) hydrogels with on-demand degradation profiles to match wound healing processes. Chem Sci. 9 (8), 2179-2187 (2018).
  18. Vakilian, S., et al. Engineered local delivery of extracellular vesicles loaded with si-tnf-α, via a core-sheath 3d-bio-printed scaffold as an effective wound dressing. J Drug Delivery Sci Technol. 101, 106189(2024).
  19. Mirsanei, Z., et al. Synergistic effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles and dexamethasone on macrophage polarization under inflammatory conditions. Inflammopharmacology. 32 (2), 1317-1332 (2024).
  20. Ma, Y., Brocchini, S., Williams, G. R. Extracellular vesicle-embedded materials. J Controlled Release. 361, 280-296 (2023).
  21. Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell-extracellular vesicles in the inflammation of wound healing. Front Immunol. 14, 1214757(2023).
  22. Lou, P., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics for the regeneration of chronic wounds: Current knowledge and future perspectives. Acta Biomater. 119, 42-56 (2021).
  23. Cai, Y., Chen, K., Liu, C., Qu, X. Harnessing strategies for enhancing diabetic wound healing from the perspective of spatial inflammation patterns. Bioactive Mater. 28, 243-254 (2023).
  24. Li, Z., et al. Multifunctional hydrogel-based engineered extracellular vesicles delivery for complicated wound healing. Theranostics. 14 (11), 4198(2024).
  25. Cabral, J., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Extracellular vesicles as modulators of wound healing. Adv Drug Delivery Rev. 129, 394-406 (2018).
  26. Moghadasi Boroujeni, S., Mashayekhan, S., Vakilian, S., Ardeshirylajimi, A., Soleimani, M. The synergistic effect of surface topography and sustained release of tgf-β1 on myogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 104 (7), 1610-1621 (2016).
  27. Jayaraman, P., et al. Controlled release of drugs in electrosprayed nanoparticles for bone tissue engineering. Adv Drug Delivery Rev. 94, 77-95 (2015).
  28. Huang, X., Brazel, C. S. On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems. J Controlled Release. 73 (2-3), 121-136 (2001).
  29. Smith, A. M., Senior, J. J. Alginate hydrogels with tuneable properties. Adv Biochem Eng Biotechnol. 178, 37-61 (2021).
  30. Yan, X., Sha, X. Nanoparticle-mediated strategies for enhanced drug penetration and retention in the airway mucosa. Pharmaceutics. 15 (10), 2457(2023).
  31. Pant, B., Park, M., Park, S. -J. Drug delivery applications of core-sheath nanofibers prepared by coaxial electrospinning: A review. Pharmaceutics. 11 (7), 305(2019).
  32. Pinheiro, A., et al. Extracellular vesicles: Intelligent delivery strategies for therapeutic applications. J Controlled Release. 289, 56-69 (2018).
  33. Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T., Koizuni, A. A novel locus, mody4, distal to d7mit189 on chromosome 7 determines early-onset niddm in nonobese c57bl/6 (akita) mutant mice. Diabetes. 46 (5), 887-894 (1997).
  34. Fang, R. C., et al. Limitations of the db/db mouse in translational wound healing research: Is the noncnzo10 polygenic mouse model superior. Wound Repair Regen. 18 (6), 605-613 (2010).
  35. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  36. Sellers, R. S. Translating mouse models: Immune variation and efficacy testing. Toxicol Pathol. 45 (1), 134-145 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Vesicle Delivery3D Bioprinted ScaffoldChronic Wound ManagementMesenchymal Stem CellsCore Sheath ScaffoldExtracellular Vesicle IsolationBioink FormulationScaffold Cross LinkingWestern BlottingDiabetic Wound Healing

Related Articles