يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنشاء وحدة زراعة مشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا الظهارية باستخدام الأغشية الليفية النانوية

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67780

⸱

ديسمبر 27, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نوضح كيف يمكن للخلايا الظهارية المزروعة بالخلايا الليفية في نظام الطبقتين القائم على الغشاء الليفي النانوي أن تلتصق بثبات وتنمو على الغشاء.

الملخص

تشمل العقبات الفنية في ثقافة الخلايا الظهارية عدم التمايز وفقدان الوظيفة. يمكن لطرق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) المحاكاة الحيوية أن تعزز كفاءة زراعة الخلايا. تقدم هذه الدراسة نظاما متقدما للزراعة من طبقتين يهدف إلى زراعة الخلايا الظهارية كطبقات تشبه الأنسجة مع ثقافة الخلايا الليفية في بيئة ثلاثية الأبعاد. تم تصنيع كحول البولي فينيل (PVA) والأغشية الليفية النانوية (NMs) بولي (ε-كابرولاكتون) (PCL) عن طريق الغزل الكهربائي واستخدامها كمصفوفة خارج الخلية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لثقافة الخلايا الظهارية والخلايا الليفية ، على التوالي. في آبار الإدخال العلوية ، تمت زراعة الخلايا الظهارية الرئوية على PVA NM ، وفي الغرف السفلية ، تمت زراعة الخلايا الليفية على PCL NM. يزيل هذا التكوين الاتصال المباشر للخلية ويسهل فحص إشارات الباراكرين بوساطة العوامل القابلة للذوبان. تم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتحليل توزيع البروتينات داخل الخلايا ونمط نموها وتعبيرها ، بما في ذلك المنطقة المغلقة في الخلايا الظهارية. مكنت تقنيات التكديس Z من عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مفصلة ، مما يوفر رؤى دقيقة لسلامة التقاطعات الضيقة والتنظيم المكاني داخل الطبقة الظهارية. قام الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) بتقييم الخصائص المورفولوجية لأنواع الخلايا على الأغشية الليفية النانوية. كشف تصوير SEM عن هياكل سطح الخلية المعقدة والتفاعلات مع الألياف النانوية ، مما يوفر منظورا شاملا للبنية الخلوية وتفاعل الخلية مع البنية الليفية النانوية. يعد اختبار مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) طريقة بسيطة لقياس معدلات نمو الخلايا الظهارية والخلايا الليفية بمرور الوقت. يوفر السلوكيات التكاثرية والتأثيرات التآزرية المحتملة لثقافة هذه الخلايا. تسلط هذه النتائج الضوء على فعالية نظام الزراعة المشتركة البسيط للزراعة المتزامنة للأرومات الليفية والخلايا الظهارية ، وهو أمر بالغ الأهمية في مختلف السياقات الفسيولوجية والدوائية ، بما في ذلك تجديد الأنسجة الظهارية ، والبيئة المكروية للورم مع الخلايا البطانية والمناعية وغيرها من الخلايا السدى ، ومقايسة السمية ، واختبار نشاط الدواء.

المقدمة

على مر العقود ، كانت الثقافة أحادية الطبقة الكلاسيكية ثنائية الأبعاد (2D) ضرورية لفهم العدوى وعلم الأدوية وعلم السموم1،2. ومع ذلك ، من المهم مراعاة التعقيد والتفاعلات الديناميكية بين التراكيب المتعددة والهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد (3D) للبيئة المكروية للأنسجة. وبالتالي ، فإن ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد لها قيود في تقليد الهياكل الشبيهة بالأنسجة3،4. على سبيل المثال ، هناك نقص في إشارات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى أخرى (ECM) ، وهو أمر ضروري في تمايز الخلايا والتكاثر والوظائف الخلوية في البيئة المكروية للجسم الحي. لهذه الأسباب ، تم تطوير أنظمة مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد5. تنمو الخلايا في الثقافة ثلاثية الأبعاد وتتفاعل مع المصفوفة خارج الخلية المحيطة في ثلاثة أبعاد. علاوة على ذلك ، تم تطوير نهج الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد ، المكون من أكثر من نوع واحد من الخلايا ، لسد الفجوة بين نماذج الخلية المفردة المبسطة في المختبر والتفاعلات الخلوية الديناميكية التي تحدث في الجسم الحي6. اكتسبت أنظمة الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد شعبية في دراسة التواصل بين الخلية والخلية وتفاعلات المصفوفة الخلوية خارج الخلية (ECM)7،8،9،10. وتحتوي أنظمة الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد الحالية على عدة أشكال ويمكن فصلها إلى استزراع مشترك مباشر وغير مباشر8،9. في الزراعة المشتركة المباشرة ، يمكن أن تتأثر وظائف الخلايا المختلفة في الخلايا المستزرعة بشكل أساسي بالاتصال المباشر بدلا من تأثيرات الباراكرين. بالمقارنة ، تتمتع الزراعة المشتركة غير المباشرة بميزة أكبر في التحقيق في تفاعل الباراكرين باستخدام حواجز أو طبقات لفصل أنواع الخلايا المختلفة.

يتم استخدام مواد وطرق مختلفة لتصنيع سقالات المحاكاة الحيوية التي تحاكي ECM باستخدام مواد متوافقة حيويا وقابلة للتحللالبيولوجي 10. يحاكي هيكل السقالة النانوية تكوين ECM الأصلي في الأنسجة البيولوجية ، مما يوفر بنية ثلاثية الأبعاد لزراعة الخلايا11،12. تم استخدام الأغشية النانوية الليفية الكهربائية (NMs) في الزراعة المشتركة المباشرة وغير المباشرة لأنواع مختلفة من الخلايا13،14،15.

تشكل الخلايا الظهارية حاجزا ماديا للأعضاء الرئيسية ، في حين أن الخلايا الليفية هي خلايا سدى سائدة تتوسط في إعادة تشكيل ECM وتنظم الظهارة المجاورة6،16،17. تتفاعل الخلايا الظهارية والخلايا الليفية مع اللامينين في الغشاء القاعدي والفيبرونيكتين في المصفوفة الخلالية ، على التوالي ، من خلال مستقبلات الإنتجرين على سطح الخلية18. عندما يتم زراعة الخلايا الظهارية على بولي (كحول الفينيل) (PVA) NMs بأقطار 150-250 نانومتر والمسام الدقيقة ، فإنها تشكل طبقات متعددة بدلا من مجاميع الخلايا والكرويات ، وتتشابه أنماط نموها مع تلك الموجودة في الخلايا في الأنسجةالظهارية 19. وبالمقارنة ، فإن بولي (كابرولاكتون) (PCL) NMs بأقطار 400-1,500 نانومتر ومسام دقيقة 10-50 ميكرومتر توفر بعدا مكانيا مشابها للمصفوفة الخلالية لنمو الخلايا الليفية المستنبتة13،14. نظرا لتوافقها الحيوي ، فإن أغشية PVA و PCL شائعة الاستخدام في هندسة الأنسجة20،21.

تقدم هذه الدراسة نظام استزراع متقدم من طبقتين باستخدام NMs المسامية بالكهرباء المغزولة لزراعة الخلايا الظهارية كطبقات شبيهة بالأنسجة والخلايا الليفية داخل بنية ثلاثية الأبعاد. يمكن تقسيم البروتوكول إلى خمس مراحل رئيسية: تصنيع الألياف النانوية ، والألياف بعد الربط المتشابك وتقييم الجودة ، وإعداد بئر الثقافة المرفقة بالغشاء ، وبذر الخلايا والزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد ، ومقايسات الخلايا المزروعة ثلاثية الأبعاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصنيع ألياف PVA النانوية المستقرة في الماء

  1. تزن 0.02 غرام من بولي (حمض الأكريليك) (PAA) و 1 غرام من PVA ، ثم أضفها إلى زجاجة زجاجية نظيفة تحتوي على شريط مغناطيسي. أضف 7.8 مل من الماء المقطر إلى الزجاجة ، ضع الزجاجة على طبق نمام ، واضبط درجة الحرارة على 84 درجة مئوية ، والسرعة على 500 دورة في الدقيقة ، والوقت على 12 ساعة.
  2. دع الزجاجة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل إضافة 0.2 مل من الجلوتارالديهايد (GA). ضع الزجاجة على أداة تقليب الطبق ، واضبط السرعة على 500 دورة في الدقيقة ، والوقت على 30 دقيقة ، ودرجة الحرارة على درجة حرارة الغرفة.
  3. استخدم حقنة سعة 5 مل للغزل الكهربائي ، وافصل الغطاسات عن البراميل ، ونظف الحطام البلاستيكي الصغير داخل البراميل وطرف الغطاسات.
  4. استخدم الإبر لمنع تدفق السائل ، ثم صب محلول PVA في كل برميل (الحجم: 2.5-3 مل لكل منهما). قم بتجميع الغطاسات ، ثم قم بإزالة الإبر.
    ملاحظة: قد تكون هناك فقاعة في المحلول ، لذا انتظر حتى تختفي الفقاعة. يستغرق هذا من 10 إلى 30 دقيقة.
  5. قم بتجميع إبرة معدنية جديدة 27 جم ، ثم ضعها في آلة الغزل الكهربائي.
  6. لف المجمع جيدا بورق الألمنيوم.
  7. دع لوحة الحاقن تعود إلى موضعها الأصلي. استخدم الإعدادات التالية للماكينة: (كل مضخة) حجم الحقن: 2 مل ، معدل الحقن: 6 ميكرولتر / دقيقة ، سرعة الأسطوانة: 100 دورة في الدقيقة ، مسافة الطرف إلى المجمع: 14 سم. تحقق من تدفق السائل لكل مضخة.
  8. قم بتشغيل الجهاز بإمكانيات كهربائية تبلغ حوالي 12 كيلو فولت.
  9. تأكد من أن الرطوبة 40-50٪ في البداية و 25-30٪ في نهاية العملية. استخدم جهاز ترطيب عندما تنخفض الرطوبة وضع الأطباق التي تحتوي على الماء المقطر داخل الغسالة الكهربائية في اليوم السابق للغزل الكهربائي لزيادة الرطوبة.
    ملاحظة: هذا عامل حاسم في التصنيع الناجح للألياف النانوية PVA.
  10. تحقق من التدفق بانتظام. إذا كانت الإبرة مسدودة ، فقم بإيقاف الجهاز مؤقتا. استخدم مناديل معملية لإزالة القطرة وانتظر حتى تظهر القطرة الجديدة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتغيير الإبرة ، ثم استمر في تشغيل الجهاز.
  11. تستغرق عملية تصنيع الألياف النانوية PVA ~ 6 ساعات حتى تكتمل. بعد انتهاء عملية الغزل الكهربائي ، افصل الرقاقة التي تحتوي على حصيرة الألياف عن المجمع وقم بتخزين حصيرة الألياف النانوية في مادة مجففة تحت الفراغ.

2. معالجة الغشاء النانوي الليفي PVA ببخار حمض الهيدروكلوريك (HCl) وتقييم جودة الألياف

ملاحظة: يتم الحفاظ على استقرار الماء ل PVA NMs جيدا بعد تفاعل ما بعد التشابك بواسطة بخار حمض الهيدروكلوريك. تم تحسين هذه العملية من أجل السماكة المناسبة وحجم المسام وخشونة NMs. PVA عبارة عن بوليمر محب للماء للغاية ، والألياف النانوية PVA المغزولة كهربائيا غير مستقرة في ملامسة الماء والظروف الرطبة. يجب معالجة PVA NMs ببخار حمض الهيدروكلوريك بعد تصنيع بوليمر PVA مباشرة.

  1. قطع حصيرة من الألياف النانوية إلى قطع بالحجم المطلوب لإدراج البئر العابر.
  2. قم بإعداد طبق صغير يحتوي على 1.5 مل من حمض الهيدروكلوريك النقي. ضع الطبق المحتوي على حمض الهيدروكلوريك وقطع الألياف النانوية داخل حجرة مفرغة وأغلق الغطاء.
    ملاحظة: يستخدم بخار حمض الهيدروكلوريك كعامل ما بعد الارتباط المتقاطع لجعل الألياف النانوية مستقرة في الماء.
  3. افتح الصمام المتصل بمضخة التفريغ ، وانتظر 10 ثوان حتى يرتفع دخان حمض الهيدروكلوريك ، ثم أغلق الصمام. عالج الأغشية بأبخرة حمض الهيدروكلوريك لمدة 2 دقيقة.
  4. بعد المعالجة ببخار حمض الهيدروكلوريك ، أضف بعض قطرات الماء المقطر (DW) إلى الأغشية ، وضعها على شريحة زجاجية ، وقم بإزالة الغشاء من الرقاقة. بعد تجفيف الهواء لمدة 20 دقيقة ، تلتصق الأغشية بشكل طبيعي بالشريحة.
  5. قم بتغطية الأغشية على شريط كربوني بطبقة رقيقة من الذهب باستخدام آلة طلاء تلقائية. الحصول على صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
  6. بعد تشابك PVA NMs مع حمض الهيدروكلوريك ، اغسلها 3x باستخدام 1x PBS ، وتحقق من الرقم الهيدروجيني بعد نقعها في وسط الاستزراع لتأكيد عدم وجود حمض الهيدروكلوريك المتبقي.

3. تصنيع الألياف النانوية PCL وتقييم جودة الألياف النانوية

  1. تزن 1.5 غرام من PCL وأضفها إلى زجاجة زجاجية نظيفة. أضف 8.5 مل من الكلوروفورم إلى الزجاجة ، ضع الزجاجة على طبق ، وقم بإذابة PCL في الكلوروفورم لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.9 ، باستثناء الخطوتين 1.7 و 1.8 ، اضبط معدل الحقن على 8 ميكرولتر / دقيقة والجهد عند 17.5 كيلو فولت.
    ملاحظة: يستغرق تصنيع PCL ~ 3.5 ساعة حتى ينتهي.
  3. قم بقص قطعة صغيرة من الغشاء وقم بتغطية القطع عن طريق عملية الرش التلقائي لمدة 5 دقائق. الحصول على صور التسويق عبر محرك البحث.

4. تجميع طبقتين من الأغشية في بئر عابر

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، نستخدم صفيحة ذات 24 بئرا وإدخالها جيدا. يتم توصيل PVA NM ببئر الإدخال ، بينما يتم توصيل PCL NM ببئر الأسفل.

  1. قطع حصيرة من الألياف النانوية إلى قطع مستديرة ، بقطر 10 مم و 13 مم ل PVA و PCL NMs ، على التوالي.
  2. استخدم polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 كعامل لاصق لربط الأغشية بالملحق والغرفة جيدا. قبل الاستخدام ، اخلطي قاعدة Sylgard 184 (الجزء أ) وعامل المعالجة (الجزء ب) في كوب بلاستيكي بنسبة كتلة 10: 1. استخدم شريحة زجاجية نظيفة لخلط محلول PDMS بقوة لمدة 2-3 دقائق حتى يمتلئ الخليط بالكامل بالفقاعات. دع الفقاعة تتشكل وتختفي لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام ؛ في هذه الأثناء ، اترك الشريحة دافئة إلى 100 درجة مئوية.
  3. انشر PDMS على شريحة زجاجية ، واغمس الحافة السفلية للإدراج جيدا قليلا في PDMS. احتفظ بالملحق رأسا على عقب على جهاز تسخين الشريحة حتى يتصلب PDMS (~ 10-15 دقيقة). تحقق بعناية باستخدام طرف 200 ميكرولتر للتأكد من أن PDMS ليس لزجا.
  4. عالج قطع PVA NM كما هو موضح في الخطوات من 2.2 إلى 2.4.
  5. اضغط برفق على الملحق جيدا على قطعة PVA NM بحيث يواجه الجزء السفلي من الملحق جانب الألياف النانوية لقطعة الغشاء. أضف قطرة من الماء المقطر إلى وسط البئر واستخدم الملقط لإزالة ورق القصدير. ضع الملحق جيدا في طبق جديد مكون من 24 بئرا ، واترك الغشاء يجف.
  6. عند ربط قطعة PCL NM بالجزء السفلي جيدا ، تأكد من غمس طرف 200 ميكرولتر في خليط PDMS ونقيطه بدقة في الزوايا الأربع وفي المنتصف.
  7. ضع اللوحة على جهاز تسخين الشرائح واترك PDMS يتماسك لمدة 5-7 دقائق لضمان جودة التجميع.
  8. ضع قطعة PCL NM في البئر المحتوي على PDMS ، مع توصيل جانب الألياف النانوية من الغشاء ب PDMS. استخدم فرشاة صغيرة نظيفة للضغط على جانب رقائق الألومنيوم من قطعة الغشاء قليلا للتثبيت الكامل. أضف 0.2 مل من 70٪ من الإيثانول إلى البئر لإزالة الرقاقة بسهولة.
  9. قم بتعقيم الملحق والجزء السفلي جيدا في إعداد البئر العابر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن تخزين نظام PDMS المختلط عند -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. تنبيه: يمكن تخزين اللوحة المتصلة بالغشاء الليفي النانوي PCL جافة ولكن يجب أن تكون مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام.
  10. في اليوم التالي ، اغسل الملحق والقاع جيدا بإضافة 200 ميكرولتر و 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) ، على التوالي ، لمدة 3 × 10 دقائق. الملحق والسفلي جاهزان للاستخدام.

5. بذر الخلايا وتجميع طبقتين لنموذج الزراعة المشتركة

ملاحظة: تم زراعة خلايا MLE-12 في 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) و 1٪ مضاد حيوي للبنسلين / الستربتومايسين. تم زراعة خلايا NIH3T3 في 1x DMEM عالية الجلوكوز مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / الستربتومايسين مضاد حيوي.

  1. حافظ على الخلايا في طبق استزراع 150 مم. عندما تكون متقاربة بنسبة 70-80٪ ، اغسل الخلايا ب 10 مل من 1x PBS وقم بتربسينها ب 2 مل من محلول التربسين / EDTA الدافئ مسبقا بنسبة 0.05٪ لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  2. اضغط برفق على الطبق لإخراج الخلايا من الأسفل ، ثم أضف 8 مل من وسائط الثقافة الكاملة لكل نوع من الخلايا لتحييد إنزيم التربسين. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وجهاز طرد مركزي بسعة 400 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. قم بتلطيخ الخلايا باستخدام Cell-Tracker لمراقبة توزيع الخلايا المصنفة على NM (انظر القسم 6 لمزيد من التفاصيل).
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسائط DMEM / F12 الكاملة. حدد رقم الخلية واضبطه على 6 × 106 خلايا MLE-12 / مل و 8 × 105 خلايا NIH3T3 / مل.
    ملاحظة: يتم استخدام وسائط DMEM / F12 الكاملة للزراعة المشتركة مع خلايا MLE-12 و NIH3T3.
  4. املأ الجزء السفلي جيدا ب 500 ميكرولتر من وسائط DMEM / F12 الكاملة (البئر بدون PCL). انقل الملحق المتصل بالغشاء الليفي النانوي PVA إلى البئر العابر ، وأضف 50 ميكرولتر من تعليق خلية MLE-12. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  5. في الوقت نفسه ، املأ الجزء السفلي المتصل بالغشاء الليفي النانوي PCL جيدا ب 500 ميكرولتر من معلق خلية NIH3T3 واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  6. بعد ساعتين ، قم بتجميع الملحق المحتوي على خلية MLE-12 والبئر السفلي المحتوي على خلية NIH3T3 في إعداد البئر العابر. هذا هو نموذج الزراعة المشتركة مع خلايا MLE-12 كطبقة عليا وخلايا NIH3T3 كطبقة سفلى. الزراعة المشتركة للخلايا في الأغشية ذات الطبقتين للوقت المطلوب.

6. فحص توزيع الخلايا

  1. قم بإعداد 5 ميكرومتر من محلول Cell-Tracker الأحمر والأخضر بحجم إجمالي قدره 2 مل من وسط DMEM / F12 الكامل.
  2. بعد التربسين ، امزج خلايا MLE-12 مع محلول Cell-Tracker الأحمر المعد مسبقا و NIH3T3 مع محلول Cell-Tracker الأخضر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة لضمان وضع العلامات المثلى على الخلايا. أضف 8 مل من وسط DMEM / F12 الكامل إلى العينات وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: لا يمكن أن يؤثر Cell Tracker على قابلية الخلية للبقاء والتكاثر. ومن ثم يمكن زراعة الخلايا الملطخة بجهاز تعقب الخلايا حتى التقاء. قد تقل شدة التألق في الخلايا الملطخة بعد 4-5 أيام من الزراعة.
  3. كرر الخطوات من 5.3 إلى 5.6.
  4. أثناء المراقبة تحت المجهر متحد البؤر ، انقل الملحق جيدا من اللوحة المكونة من 24 بئرا إلى صفيحة مكونة من 12 بئرا.
    ملاحظة: هذا يقلل من المسافة بين العدسة الموضوعية والخلايا ، مما يسمح بمراقبة مورفولوجيا الخلية.

7. الملاحظات متحدة البؤر للخلايا المزروعة ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: ارتباط الخلية الظهارية ب PVA NM ضعيف مقارنة بالخلايا الليفية ب PCL NM. تخلص من الوسائط القديمة يدويا عن طريق شفط الماصة وأضف وسائط أو محلول جديد برفق إلى جدار الآبار. أثناء عملية التلوين ، حاول ألا تدع الأغشية تجف.

ملاحظة: يمكن تحسين ربط الخلية عن طريق طلاء اللامينين أو دمج الببتيدات من أشكال ربط الإنتجرين في ألياف PVA النانوية19.

  1. انقل الملحق إلى طبق جديد مكون من 24 بئرا. تخلص من الوسائط القديمة وأضف 150 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4٪. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإزالة محلول PFA بنسبة 4٪ واغسل الخلايا الملتصقة ب 150 ميكرولتر من 1x PBS.
  3. للحجب والنفاذية ، أضف 150 ميكرولتر من مصل الماعز العادي بنسبة 5٪ و 0.2٪ Triton X-100 المخفف في 1x PBS واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بإعداد Alexa Fluor 594-congulgated anti-zona occludens Ab (1:400) و Phalloidin-iFlour 488 (1: 1,000) عن طريق تخفيفهما في كاشف مخفف للأجسام المضادة. قم بإزالة محلول الحجب ، وأضف 150 ميكرولتر من محلول الفلوروفور لكل بئر ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة بأقصى قدر من الدقة ، لأنها ستؤثر بشكل مباشر على جودة النتائج. تجنب التعرض للضوء.
  5. تخلص من محلول الجسم المضاد واغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من 1x PBS لمدة 10 دقائق.
  6. أضف 150 ميكرولتر من Hoechst 33342 المخفف في 1x PBS (1: 1,000) واحتضانه لمدة 10 دقائق ؛ تجنب التعرض للضوء.
  7. قم بإزالة محلول Hoechst 33342 واغسل الخلايا الملتصقة ب 150 ميكرولتر من 1x PBS لمدة 10 دقائق.
  8. قم بإعداد شريحة زجاجية نظيفة وأضف كمية دقيقة من جل التثبيت المائي. استخدم ملقطا بأطراف مدببة لفصل الأغشية بدقة عن الحافة المحيطة. ضع الأغشية على جل التثبيت ، مع التأكد من أن الجانب الذي يحتوي على الخلايا متجها لأعلى. أضف كمية دقيقة من جل التثبيت وقم بتغطيتها بشريحة غطاء. أغلق الشرائح بطلاء الأظافر ، مما يضمن إحكاما دقيقا وكاملا.
  9. مراقبة الخلايا تحت مجهر متحد البؤر باستخدام إعدادات التصوير التالية: التحكم في طاقة الليزر: 405 شدة 10 ؛ التحكم في طاقة الليزر: 488 شدة 10 ؛ التحكم في طاقة الليزر: 561 شدة 10 ؛ حساسية الكاشف: 420LP (قيمة 600) ؛ حساسية الكاشف: 525/50 (قيمة 700) ؛ حساسية الكاشف: 561LP (قيمة 750).

8. فحص ارتباط الخلية بالألياف النانوية

  1. تخلص من الوسائط القديمة واغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من 1x PBS.
  2. قم بإصلاح الخلايا ب 150 ميكرولتر من 3٪ GA مخفف في 1x PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من 1x PBS في 10 دقائق.
  4. قم بإصلاح الخلايا بشكل ثانوي عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ (OsO4) المخفف في 1x PBS لمدة 1 ساعة.
    تنبيه: OsO4 وبخاره ضاران. يجب استخدامه في غطاء الدخان.
  5. تخلص من المحلول واغسل الخلايا ب 300 ميكرولتر من 1x PBS لمدة 2 × 10 دقائق.
  6. قم بتجفيف الخلايا بالإيثانول المتدرج من 50٪ و 70٪ و 90٪ و 95٪ إلى 100٪ لمدة 10 دقائق في كل خطوة. قم بتنفيذ خطوة التجفيف الأخيرة عن طريق إضافة الإيثانول الطازج بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق.
  7. جفف الخلايا والأغشية في الهواء تماما. استخدم ملقطا بأطراف مدببة لفصل الأغشية ، وضع الأغشية على حامل العينة باستخدام صنبور من الجانبين. قم بإجراء الاخرق الأيوني لمدة 5 دقائق قبل مراقبة الخلايا تحت SEM بتكبير 2,000 مرة.

9. فحص نمو الخلية

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام اختبار CCK-8 لتحديد معدل نمو الخلية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

  1. تحضير خليط CCK-8 عن طريق خلط 9 أجزاء من DMEM / F12 الدافئ مسبقا (من حيث الحجم) مع جزء واحد من كاشف CCK-8. بعد إزالة وسائط الثقافة القديمة ، أضف 150 ميكرولتر من خليط CCK-8 إلى البئر المحتوي على الخلية.
  2. انقل الملحق إلى اللوحة الجديدة المكونة من 24 بئرا لفصلها عن الخلايا السفلية التي تحتوي على البئر. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  3. اجمع المادة الطافية وانقله إلى أنبوب سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 1,800 × جم لمدة 3 دقائق.
  4. أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا. قراءة الكثافة الضوئية (OD) عند 450 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يحدد هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة لتكوين الخلايا الظهارية الرئوية MLE-12 والخلايا الليفية NIH3T3 من خلال بناء نموذج من طبقتين قائم على الغشاء الليفي النانوي (الشكل 1). يناسب هذا النموذج تصوير الخلايا الحية والكيمياء المناعية والتحليل الكمي لنقطة النهاية للخلايا المزروعة المشتركة. يمكن أيضا استخدام أنواع الخلايا الأخرى عن طريق تحسين كثافة الخلايا وظروف النمو.

يظهر SEM التوزيع المنتظم للألياف النانوية PVA المصنعة دون أي تكوين حبة (الشكل 2 أ).<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمثل الانتقال من الثقافة ثنائية الأبعاد إلى نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد تقدما كبيرا في تطوير نماذج الزراعة المشتركة في المختبر . يجب أن يحاكي نموذج الثقافة ثلاثية الأبعاد البيئة المكروية للأنسجة التي يمكن للخلايا أن تتكاثر وتتجمع وتميز22. يعزز استخدام نماذج الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد القائمة على السقالات تكرار بنية الأنسجة. في هذه الدراسة ، يوفر نظام الآبار العابر القائم على NM زراعة مشتركة ثلاثية الأبعاد غير مباشرة لنوعين من الخلايا. يسمح PCL NM مع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكوري من خلال المعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI) ، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (HR16C0001). مشروع تعزيز القدرات البحثية في العلوم الأساسية من خلال منحة المعهد الكوري للعلوم الأساسية (المركز الوطني للمرافق والمعدات البحثية) الممولة من وزارة التعليم (2019R1A6C1010003)؛ ومنح المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (2022R1A4A5032702).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ Trypsin / EDTAWelgeneLS015-01
100x Penicilin / StreptomycinGibco10378016
20xPBS LPSحل CBP007A
4٪ ParaformaldehydeBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 مترافق ZO-1 الأجسامInvitrogen339194
مخفف الأجسام المضادة طقم فحص OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8الخلايا DonginbioCCK-3000
(150x20) SPL20151
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker أحمر CMTPXInvitrogenC34552
كلوروفورمSamchunC0584
أنبوب مخروطي SPL50050
غطاء زجاجيCorningCLS2980245
DMEM نسبة عالية من الجلوكوزWelgeneLM001-05
DMEM / F12WelgeneLM 002-05
قواعد DURAN Desiccator مع شفة طائرة ، خيط لولبيDWK Life Sciences   ؛7.022 260
مجفف زجاج DURAN StopcockDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Stopcock ، مع PTFE SpindleDWK Life Sciences   ؛10322671
آلة الغزل الكهربائيNanoNCESR200RD
الكحول الإيثيلي ، نقيسيجما ألدريتش459844
FBSسيجما ألدريتشTMS-013-BKR   ؛
وحدة الماسح الضوئي بالليزر الفلوري K1-fluoأنظمة
جل / جبلBiomeda Corp.محلول الجلوتارالديهايد M01
سيجما ألدريتش340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
فوهة معدنية 27GNanoNC
طلاء الأظافرطبيعة جمهورية
الطبيعة مصل الماعز العاديمختبرات ناقلاتS-1000
رابع أكسيد الأوزميومسيجما ألدريتش201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
قفل Syringe_Lure بلاستيكي (10 مل)HENKE SASS WOLFAL10
بولي (حمض أكريليك)سيجما ألدريتش323667
بولي (كحول فينيل)سيجما ألدريتش341584
بولي كابرولاكتونسيجما ألدريتش440744
نقي HCLDuksan1129
المسح المجهري الإلكترونيSECSNE-4500M
زجاج منزلقMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
قارئ Synergy H1 متعدد الأوضاعBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
المضادة طبق ثقافة غطاء النانو

المراجع

  1. Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
  2. Barrila, J., et al. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  4. Krause, S., et al. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).
  5. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  6. Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).
  7. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  8. Liu, R., et al. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).
  9. Vis, M. A. M., Ito, K., Hofmann, S. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).
  10. Kook, Y. M., Jeong, Y., Lee, K., Koh, W. G. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).
  11. Stocco, T. D., et al. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).
  12. Gao, X., Han, S., Zhang, R., Liu, G., Wu, J. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).
  13. Kim, T. E., et al. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).
  14. Oh, Y. S., Choi, M. H., Shin, J. I., Maza, P. A. M. A., Kwak, J. Y. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).
  15. Lee, S. J., et al. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).
  16. DeLeon-Pennell, K. Y., Barker, T. H., Lindsey, M. L. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).
  17. Lühr, I., et al. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).
  18. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).
  19. Tran, T. X. T., et al. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).
  20. Oun, A. A., Shin, G. H., Rhim, J. -W., Kim, J. T. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).
  21. Zhang, W., et al. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).
  22. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  23. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).
  24. Malakpour-Permlid, A., et al. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).
  25. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  26. Torras, N., García-Díaz, M., Fernández-Majada, V., Martínez, E. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).
  27. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  28. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  29. Luo, L., Liu, L., Ding, Y., Dong, Y., Ma, M. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تقنية الغزل الكهربائيغشاء كحول البولي فينيلغشاء بولي كابرولاكتونالزراعة المشتركة للخلايا الليفيةالإشارات الجواريةالمجهر البؤريالمجهر الإلكتروني الماسح
إنشاء وحدة زراعة مشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا الظهارية باستخدام الأغشية الليفية النانوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.