هنا ، نوضح كيف يمكن للخلايا الظهارية المزروعة بالخلايا الليفية في نظام الطبقتين القائم على الغشاء الليفي النانوي أن تلتصق بثبات وتنمو على الغشاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء وحدة زراعة مشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا الظهارية باستخدام الأغشية الليفية النانوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تشمل العقبات الفنية في ثقافة الخلايا الظهارية عدم التمايز وفقدان الوظيفة. يمكن لطرق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) المحاكاة الحيوية أن تعزز كفاءة زراعة الخلايا. تقدم هذه الدراسة نظاما متقدما للزراعة من طبقتين يهدف إلى زراعة الخلايا الظهارية كطبقات تشبه الأنسجة مع ثقافة الخلايا الليفية في بيئة ثلاثية الأبعاد. تم تصنيع كحول البولي فينيل (PVA) والأغشية الليفية النانوية (NMs) بولي (ε-كابرولاكتون) (PCL) عن طريق الغزل الكهربائي واستخدامها كمصفوفة خارج الخلية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لثقافة الخلايا الظهارية والخلايا الليفية ، على التوالي. في آبار الإدخال العلوية ، تمت زراعة الخلايا الظهارية الرئوية على PVA NM ، وفي الغرف السفلية ، تمت زراعة الخلايا الليفية على PCL NM. يزيل هذا التكوين الاتصال المباشر للخلية ويسهل فحص إشارات الباراكرين بوساطة العوامل القابلة للذوبان. تم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتحليل توزيع البروتينات داخل الخلايا ونمط نموها وتعبيرها ، بما في ذلك المنطقة المغلقة في الخلايا الظهارية. مكنت تقنيات التكديس Z من عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مفصلة ، مما يوفر رؤى دقيقة لسلامة التقاطعات الضيقة والتنظيم المكاني داخل الطبقة الظهارية. قام الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) بتقييم الخصائص المورفولوجية لأنواع الخلايا على الأغشية الليفية النانوية. كشف تصوير SEM عن هياكل سطح الخلية المعقدة والتفاعلات مع الألياف النانوية ، مما يوفر منظورا شاملا للبنية الخلوية وتفاعل الخلية مع البنية الليفية النانوية. يعد اختبار مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) طريقة بسيطة لقياس معدلات نمو الخلايا الظهارية والخلايا الليفية بمرور الوقت. يوفر السلوكيات التكاثرية والتأثيرات التآزرية المحتملة لثقافة هذه الخلايا. تسلط هذه النتائج الضوء على فعالية نظام الزراعة المشتركة البسيط للزراعة المتزامنة للأرومات الليفية والخلايا الظهارية ، وهو أمر بالغ الأهمية في مختلف السياقات الفسيولوجية والدوائية ، بما في ذلك تجديد الأنسجة الظهارية ، والبيئة المكروية للورم مع الخلايا البطانية والمناعية وغيرها من الخلايا السدى ، ومقايسة السمية ، واختبار نشاط الدواء.
المقدمة
على مر العقود ، كانت الثقافة أحادية الطبقة الكلاسيكية ثنائية الأبعاد (2D) ضرورية لفهم العدوى وعلم الأدوية وعلم السموم1،2. ومع ذلك ، من المهم مراعاة التعقيد والتفاعلات الديناميكية بين التراكيب المتعددة والهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد (3D) للبيئة المكروية للأنسجة. وبالتالي ، فإن ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد لها قيود في تقليد الهياكل الشبيهة بالأنسجة3،4. على سبيل المثال ، هناك نقص في إشارات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى أخرى (ECM) ، وهو أمر ضروري في تمايز الخلايا والتكاثر والوظائف الخلوية في البيئة المكروية للج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصنيع ألياف PVA النانوية المستقرة في الماء
- تزن 0.02 غرام من بولي (حمض الأكريليك) (PAA) و 1 غرام من PVA ، ثم أضفها إلى زجاجة زجاجية نظيفة تحتوي على شريط مغناطيسي. أضف 7.8 مل من الماء المقطر إلى الزجاجة ، ضع الزجاجة على طبق نمام ، واضبط درجة الحرارة على 84 درجة مئوية ، والسرعة على 500 دورة في الدقيقة ، والوقت على 12 ساعة.
- دع الزجاجة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل إضافة 0.2 مل من الجلوتارالديهايد (GA). ضع الزجاجة على أداة تقليب الطبق ، واضبط السرعة على 500 دورة في الدقيقة ، والوقت على 30 دقيقة ، ودرجة الحرارة على درجة حرارة الغرفة.
- استخدم حقنة سعة 5 مل للغزل الكهربائي ، وافصل الغطاسات ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يحدد هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة لتكوين الخلايا الظهارية الرئوية MLE-12 والخلايا الليفية NIH3T3 من خلال بناء نموذج من طبقتين قائم على الغشاء الليفي النانوي (الشكل 1). يناسب هذا النموذج تصوير الخلايا الحية والكيمياء المناعية والتحليل الكمي لنقطة النهاية للخلايا المزروعة المشتركة. يمكن أيضا استخدام أنواع الخلايا الأخرى عن طريق تحسين كثافة الخلايا وظروف النمو.
يظهر SEM التوزيع المنتظم للألياف النانوية PVA المصنعة دون أي تكوين حبة (الشكل 2 أ).<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمثل الانتقال من الثقافة ثنائية الأبعاد إلى نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد تقدما كبيرا في تطوير نماذج الزراعة المشتركة في المختبر . يجب أن يحاكي نموذج الثقافة ثلاثية الأبعاد البيئة المكروية للأنسجة التي يمكن للخلايا أن تتكاثر وتتجمع وتميز22. يعزز استخدام نماذج الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد القائمة على السقالات تكرار بنية الأنسجة. في هذه الدراسة ، يوفر نظام الآبار العابر القائم على NM زراعة مشتركة ثلاثية الأبعاد غير مباشرة لنوعين من الخلايا. يسمح PCL NM مع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكوري من خلال المعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI) ، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (HR16C0001). مشروع تعزيز القدرات البحثية في العلوم الأساسية من خلال منحة المعهد الكوري للعلوم الأساسية (المركز الوطني للمرافق والمعدات البحثية) الممولة من وزارة التعليم (2019R1A6C1010003)؛ ومنح المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (2022R1A4A5032702).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.05٪ Trypsin / EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| 100x Penicilin / Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| 20x | PBS LPS | حل CBP007A | |
| 4٪ Paraformaldehyde | Biosesang | PC2031-050-00 | |
| Alexa Fluor-594 مترافق ZO-1 الأجسام | Invitrogen | 339194 | |
| مخفف الأجسام المضادة طقم فحص OP Quanto | Epredia | 10129-576 | |
| CCK-8 | الخلايا Donginbio | CCK-3000 | |
| (150x20) SPL | 20151 | ||
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker أحمر CMTPX | Invitrogen | C34552 | |
| كلوروفورم | Samchun | C0584 | |
| أنبوب مخروطي SPL | 50050 | ||
| غطاء زجاجي | Corning | CLS2980245 | |
| DMEM نسبة عالية من الجلوكوز | Welgene | LM001-05 | |
| DMEM / F12 | Welgene | LM 002-05 | |
| قواعد DURAN Desiccator مع شفة طائرة ، خيط لولبي | DWK Life Sciences ؛ | 7.022 260 | |
| مجفف زجاج DURAN Stopcock | Daihan Science | SM.2444061 | |
| DURAN Stopcock ، مع PTFE Spindle | DWK Life Sciences ؛ | 10322671 | |
| آلة الغزل الكهربائي | NanoNC | ESR200RD | |
| الكحول الإيثيلي ، نقي | سيجما ألدريتش | 459844 | |
| FBS | سيجما ألدريتش | TMS-013-BKR ؛ | |
| وحدة الماسح الضوئي بالليزر الفلوري K1-fluo | أنظمة | ||
| جل / جبل | Biomeda Corp. | محلول الجلوتارالديهايد M01 | |
| سيجما ألدريتش | 340855 | ||
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| فوهة معدنية 27G | NanoNC | ||
| طلاء الأظافر | طبيعة جمهورية | ||
| الطبيعة مصل الماعز العادي | مختبرات ناقلات | S-1000 | |
| رابع أكسيد الأوزميوم | سيجما ألدريتش | 201030 | |
| Phalloidin-iFlour 488 | abcam | ab176753 | |
| قفل Syringe_Lure بلاستيكي (10 مل) | HENKE SASS WOLF | AL10 | |
| بولي (حمض أكريليك) | سيجما ألدريتش | 323667 | |
| بولي (كحول فينيل) | سيجما ألدريتش | 341584 | |
| بولي كابرولاكتون | سيجما ألدريتش | 440744 | |
| نقي HCL | Duksan | 1129 | |
| المسح المجهري الإلكتروني | SEC | SNE-4500M | |
| زجاج منزلق | Marienfeld Superior | K15663717 | |
| Sylgard 184 set | omniscience | OMNI.05255 | |
| قارئ Synergy H1 متعدد الأوضاع | Biotek | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
المراجع
- Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
- Barrila, J., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
