مقالة منهجية

استخراج معامل الشباب للأغشية القاعدية الرئوية الأصلية للفئران من خرائط القوة المشتقة من الفحص المجهري للقوة الذرية

DOI:

10.3791/67784

⸱

يناير 31, 2025

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصور هذا البروتوكول كيفية تحضير عمليات الاستئصال بالتبريد لأنسجة رئة الفئران ، وإجراء تجارب خريطة قوة الفحص المجهري للقوة الذرية ، وتحليل البيانات لتحديد معامل يونغ للغشاء القاعدي الرئوي الأصلي للفئران.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) بتوصيف الخواص الميكانيكية للعينة بدقة مكانية تبلغ عدة عشرات من النانومتر. نظرا لأن خلايا الثدييات تستشعر وتفاعل مع ميكانيكا بيئتها الدقيقة المباشرة ، فإن توصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية للأنسجة ذات الدقة المكانية العالية أمر بالغ الأهمية لفهم مختلف العمليات التنموية والاستتبابية والمرضية. يلعب الغشاء القاعدي (BM) ، وهو بنية تحتية رقيقة من 100 إلى 400 نانومتر تقريبا من المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، دورا مهما في تطور الورم وتكوين ورم خبيث. على الرغم من أن تحديد معامل يونغ لمثل هذه البنية التحتية الرقيقة ل ECM يمثل تحديا ، إلا أن البيانات الميكانيكية الحيوية ل BM توفر رؤى جديدة أساسية حول كيفية تأثير BM على سلوك الخلية ، بالإضافة إلى أنها توفر إمكانات تشخيصية قيمة. هنا ، نقدم بروتوكولا مرئيا لتقييم ميكانيكا BM في أنسجة رئة الفئران ، والتي تعد واحدة من الأعضاء الرئيسية المعرضة للورم الخبيث. نصف سير عمل فعال لتحديد معامل يونغ ل BM ، والذي يقع بين طبقات الخلايا البطانية والظهارية في أنسجة الرئة. تشتمل التعليمات خطوة بخطوة على تجميد أنسجة رئة الفئران ، والتقطيع بالتبريد ، وتسجيل خريطة قوة AFM على أقسام الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم إجراء تحليل بيانات شبه تلقائي باستخدام CANTER Processing Toolbox ، وهو برنامج تحليل بيانات AFM سهل الاستخدام تم تطويره داخليا. تتيح هذه الأداة التحميل التلقائي لخرائط القوة المسجلة ، وتحويل القوة مقابل منحنيات الامتداد البيزو إلى منحنيات القوة مقابل المسافة البادئة ، وحساب وحدات يونغ ، وتوليد خرائط معامل يونغ. أخيرا ، يوضح كيفية تحديد وعزل قيم معامل يونغ المشتقة من BM الرئوي من خلال استخدام أداة الترشيح المكاني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت خرائط قوة AFM كتقنية مستخدمة على نطاق واسع لتحديد الخصائص الميكانيكية النانوية لمجموعة متنوعة من العينات البيولوجية ذات الدقة المكانية النانومترية وحساسية قوة البيكونوتون1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12. تم إجراء بحث رائد حول تطبيق قياسات AFM على العينات البيولوجية في ظل الظروف الفسيولوجية من قبل P. Hansma وزملاؤه13،14،15،16،17،18،19،20. بعد ذلك ، تم استخدام قياسات قوة AFM لتقييم الخصائص الميكانيكية للجزيئات الفردية21 ، والخلايا الحية وهيكلها الخلوي9،10،22،23،24،25،26 ، والأنسجة وأقسامالأنسجة 6،8،11،27،28 ، 29،30،31 ، وكذلك الهلاميات المائيةالبيولوجية 3،4،32. في بحثنا ، استخدمنا AFM لفحص الخواص الميكانيكية للروابط البيولوجية والكيميائية18،33،34،35،36،37 ولقياس الخصائص الميكانيكية النانوية للخلاياالفردية 38،39،40. علاوة على ذلك ، أظهرت قياسات غضروف صفيحة النمو8 أن بنية الكولاجين ومعامل يونغ للمصفوفة خارج الخلية (ECM) يوجه انقسام الخلايا الغضروفية ، وبالتالي اتجاه نمو صفيحة نمو الفئران أثناء التطور الجنيني. علاوة على ذلك ، قمنا بالتحقيق في التغييرات المرتبطة بتنكس الغضروف وهشاشة العظام في الغضروف المفصلي2،41،42،43،44،45،46،47.

في السنوات الأخيرة ، فحصت العديد من تحقيقات AFM الخصائص الميكانيكية لكل من الأنسجة الرئوية السليمة والمرضية48،49،50،51،52. ومع ذلك ، فحصت هذه التحقيقات في المقام الأول ميكانيكا الأنسجة العامة ، دون التركيز على مكونات أنسجة معينة مثل BM. يشكل BM طبقة رقيقة (100 نانومتر - 400 نانومتر في البشر) من بنية ECM متخصصة تبطن غالبية أعضاء الثدييات وهياكل الأنسجة مثل الخلايا العصبية والعضلات وأنسجة الخلايا الشحمية والأوعية الدموية. اكتشفنا أن الخصائص الميكانيكية لمؤشر كتلة الدم الرئوي للفئران تلعب دورا محوريا أثناء تكوين ورم خبيث بطريقة ترتبط بها BM الأكثر ليونة مع احتمالية بقاء أعلى في مرضى سرطان الثديوالكلى 53. علاوة على ذلك ، كشف هذا التحقيق أن بروتين المصفوفة خارج الخلية المفرز نيترين -4 يقلل من معامل يونغ ل BM من خلال تفاعل متكافئ 1: 1 مع laminin γ1 ، وهو مكون رئيسي موجود في جميع شبكات اللامينين تقريبا داخل BMs40.

هنا ، نقدم تصور البروتوكول المطور الخاص بنا لتحديد معامل يونغ (EBM) لكتلة الجسم الرئوية الرقيقة للفئران 100-200 نانومتر. معامل يونغ ل BM هو مقياس لصلابتها ويتم تعريفه على أنه نسبة الإجهاد (القوة لكل وحدة مساحة) مقابل الإجهاد المحوري الناتج (الإزاحة) أثناء تشوه مرن خطي54 ، في هذه الحالة ، ضغط صغير ل BM بواسطة طرف AFM البادئة. في تجربة AFM ، يمكن الحصول على القوة والإزاحة (عمق المسافة البادئة) من انحراف ناتئ AFM وموضع الكابولي ، ويمكن استخراج معامل يونغ (علاقة الإجهاد والإجهاد) من القوة الناتجة مقابل منحنى المسافة البادئة باستخدام نموذج مرن مناسب ، والذي يفسر هندسة طرف المسافة البادئة (في هذه الحالة نموذج هيرتز المعدل55). الخطوات الرئيسية موضحة في الشكل 1. في البداية ، يحدد هذا البروتوكول منهجية إعداد وتضمين عينات أنسجة رئة الفئران في مركب OCT (انظر الخطوة 1) ، وبالتالي تسهيل إجراء القطع بالتبريد اللاحق (الخطوة 2) الذي يتيح تحديد صلابة BM باستخدام خرائط قوة AFM. تتيح تقنية القطع بالتبريد المعروضة هنا ، والتي تستخدم شريطا أحادي الجانب ومزدوج الجوانب ، تقطيع أنسجة الرئة دون الحاجة إلى التثبيت ودون إذابة القسم. تم توضيح إجراء AFM التفصيلي لجمع البيانات المناسبة لتقييم صلابة BM في القسم الثالث من البروتوكول. في القسم التالي من البروتوكول ، نوضح كيف يمكن تحليل أحجام القوة المتولدة تلقائيا (الخطوة 4.1) باستخدام برنامج قائم على MATLAB تم تطويره داخليا ، وهو CANTER Processing Toolbox56. في هذه الخطوة ، يتم استخراج معامل يونغ من كل منحنى مسافة بادئة مسجل عن طريق تركيب نموذج هرتز معدل ، والذي يتم تصحيحه لهندسة المسافة البادئة ، في هذه الحالة ، هرم رباعي الجوانب55. أخيرا ، نصف في الخطوتين 4.2 و 4.3 كيفية تطبيق أداة الترشيح المكاني وأداة الترشيح R2 لصندوق الأدوات المطور لاستخراج قيم معامل يونغ الخاصة بالغشاء القاعدي (BM) من المجموعة الشاملة لقيم معامل يونغ التي تم الحصول عليها في خريطة القوة التي تحتوي على جميع مقصورات الأنسجة للجدار السنخي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات التعامل مع عينات من قبل مجلس التجارب على التابع لوزارة البيئة والأغذية الدنماركية (الإذن رقم 2017-15-0201-01265) وفقا للقانون الدنماركي لرعاية. لإثبات هذا البروتوكول ، استخدمنا فأر ذكر C57BL / 6 في عمر 13 أسبوعا.

تنبيه: في البروتوكول التالي ، تتطلب عدة خطوات التعامل مع عينات الأنسجة. ارتد دائما قفازات مناسبة ومعطف مختبر أثناء التعامل مع العينات البيولوجية.

1. تحضير العينة

  1. ضع رئة الفأر التي تم حصادها حديثا في قالب قاعدة 15 × 15 × 5 مم يمكن التخلص منه. باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة 0.9 مم ، قم بحقن نسبة 1: 1 (الحجم إلى الحجم) بعناية من درجة حرارة القطع المثلى (OCT) إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في العينة مع سحب الإبرة في نفس الوقت. قم بإجراء الحقن في درجة حرارة الغرفة مع إمساك العينة بإحكام باستخدام ملقط جراحي صغير. يعتبر الحقن مكتملا عندما تصبح العينة منتفخة ، ويلاحظ قدر ملحوظ من النزيف.
  2. املأ OCT النقي في القالب حتى تغمر العينة بالكامل. لضمان التجميد الكامل للرئة بأكملها ، قم بتخزين العينة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين العينة لمدة عامين على الأقل عند -80 درجة مئوية. بناء على مواصفات الشركة المصنعة ل OCT ، فإن وقت تخزين الأنسجة المضمنة يزيد عن 10 سنوات. يوصى عموما بلف العينات التي تحتاج إلى تخزينها لفترات تتجاوز 4 أشهر في فيلم شفاف لمنع امتصاص الرطوبة في العينة.

2. التقطيع بالتبريد لعينة الرئة المدمجة

  1. قم بتنظيم درجة حرارة حجرة التبريد إلى -17 درجة مئوية ، حيث أن هذه هي درجة حرارة القطع المثلى لعينات أنسجة الرئة. اضبط درجة حرارة وحدة مرحلة القطع على -22 درجة مئوية ، إذا كانت هذه الميزة متوفرة. يعمل هذا على ضمان الحفاظ على درجة حرارة القطع المثلى على سطح العينة طوال عملية التقسيم بأكملها.
  2. قم بإعداد 40 شريحة مجهرية باستخدام شريط لاصق على الوجهين يتم وضعه بعناية في منتصف الشريحة الزجاجية قبل دحرجة أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل فوق الشريط لضمان التصاق قوي وخالي من الفقاعات. تأكد من أن طول الشريط اللاصق على الوجهين يعادل تقريبا عرض كتلة OCT التي تحتوي على العينة. تسمح الشرائح المجهرية ذات الحافة المصقولة بوضع العلامات بقلم رصاص يحتوي على عينة من المعلومات ورقم القسم.
  3. أدخل شرائح المجهر المعدة في صندوق شرائح. بعد ذلك ، ضع الصندوق الذي يحمل الشرائح داخل غرفة التبريد لتبريدها.
    ملاحظة: يمنع تبريد الشرائح حدوث دورة تجميد وذوبان عند التقاط الأقسام ، مما قد يضر بالخصائص الميكانيكية للعينة.
  4. قم بإعداد العديد من الأشرطة اللاصقة أحادية الجانب ، كل منها بقياس نفس حجم كتلة العينة المجمدة تقريبا.
  5. املأ الحلقتين الداخليتين لحامل العينة بوسط OCT. ضع العينة داخل وسيط OCT على حامل العينة ، مع التأكد من أنها مستوية قدر الإمكان. بعد ذلك ، ضع حامل العينة لمدة 10 دقائق تقريبا داخل غرفة التبريد حتى يتجمد وسط OCT تماما ويتم تثبيت العينة بإحكام على الحامل.
  6. قم بتثبيت الحامل الذي يحمل العينة على وحدة مرحلة القطع في cryotome. اضبط جميع المكونات الأساسية للتبريد ، مثل ميل مرحلة القطع وموضع الشفرة ، وفقا لدليل المستخدم الخاص بالجهاز لإنشاء مستوى قطع محاذاة بالتوازي مع سطح كتلة OCT.
  7. قم بإجراء التشذيب الأولي للعينة عن طريق ضبط سمك المقطع إلى 50 ميكرومتر وابدأ في القطع حتى الوصول إلى الموقع المطلوب داخل العينة (عادة حوالي 500 ميكرومتر داخل عينة الرئة من سطحها) لجمع شرائح الأنسجة. اضبط سمك التقسيم للبرد إلى 15 ميكرومتر ، وهو ما يتوافق مع السماكة المطلوبة لأقسام الأنسجة.
    تنبيه: من الضروري توخي الحذر أثناء استخدام أداة القطع ، مثل التبريد. لضمان السلامة الشخصية ، التزم بإرشادات السلامة الخاصة بالشركة المصنعة وأبتعد أصابعك عن الشفرة.
  8. قم بتوصيل قطعة من الشريط اللاصق أحادي الجانب بالعينة عن طريق الضغط بقوة بالإبهام. مسبقا ، تأكد من تبريد الإبهام عن طريق تثبيته على جدار الغرفة في التبريد لبضع ثوان.
    ملاحظة: يجب وضع الشريط بإحكام على العينة ، لأن أي نقص في الالتصاق قد يؤدي إلى انفصال الشريط عن الأنسجة أثناء التقسيم.
  9. أنتج قسم مناديل 15 ميكرومتر باستخدام التبريد. استخدم فرشاة لتوجيه القسم ولمنع الشريط اللاصق من الانفصال عن العينة أثناء إجراء القطع. من الضروري للحصول على سطح أملس لقسم الأنسجة أن تظل وتيرة القطع بطيئة ومتسقة.
  10. يقع القسم الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة الآن بشكل مسطح على كتلة الشفرة مع توجيه الشريط لأعلى. استخدم إحدى شرائح المجهر المبرد مع الشريط على الوجهين من صندوق الشرائح ، واضغط عليه بقوة على القسم لالتقاطه. بعد ذلك ، ضع شريحة المجهر ، التي تحمل القسم الآن ، مرة أخرى في صندوق الشريحة.
    ملاحظة: عند التعامل مع شريحة المجهر والقسم ، تأكد من الاحتفاظ بها داخل غرفة التبريد في جميع الأوقات لمنع القسم من الذوبان أثناء إجراء القطع.
  11. كرر الخطوات الثلاث السابقة حتى يتم جمع العدد المطلوب من الأقسام، أي 40.
  12. عند الانتهاء ، ضع الغطاء على صندوق الانزلاق وانقله على الثلج الجاف إلى فريزر -20 درجة مئوية. أخيرا ، قم بتنظيف التبريد عن طريق تطهير جميع العناصر المستخدمة وتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غرفة التبريد.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة. قم بتخزين العينات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى يتم إجراء قياسات AFM. يجب ألا يتجاوز وقت التخزين الموصى به للأقسام ووسيط OCT 6 أسابيع. بعد هذا الإطار الزمني ، قد تظهر الأقسام ووسيط OCT تغييرات تشبه حرق المجمد نتيجة لمساحة سطحها الكبيرة وميلها لامتصاص الرطوبة.

3. خرائط قوة AFM لقسم الرئة

ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام JPK NanoWizard 4XP (AFM) والمرحلة الآلية من Bruker جنبا إلى جنب مع DMi8 (المجهر البصري المقلوب) من Leica لتسجيل منحنيات إزاحة القوة لأقسام الرئة.

  1. إعداد AFM
    1. قم بتشغيل جميع الأجهزة المطلوبة لإعداد AFM (على سبيل المثال ، الكمبيوتر ، وحدة التحكم في AFM ، طاولة عزل الاهتزاز ، المجهر البصري ، إلخ).
    2. قم بتشغيل برنامج التحكم AFM. في نظرة عامة على اختيار التجربة ، حدد وضع التصوير المتقدم QI . بالإضافة إلى ذلك، حدد الموقع الذي يجب تخزين بيانات التجربة وملفات المعايرة فيه.
      ملاحظة: إذا لم يكن لديك ملحق التصوير المتقدم QI ، فاستخدم وضع تعيين قوة وضع التلامس كخيار بديل.
    3. حدد ناتئا بثابت زنبركي مناسب لنوع العينة المحدد الذي يتم ملاحظته. بالنسبة لعينات أنسجة الرئة الرخوة ، يوصى باستخدام MLCT Cantilever F من Bruker بطرف هرمي وثابت زنبركي اسمي يبلغ 0.6 نيوتن / م. إذا كانت الشريحة تحتوي على ناتئ متعدد (مثل MLCT) ، فقم بإزالة أي ناتئ أطول من الرقاقة باستخدام زوج من الملقط تحت مجهر استريو للتأكد من أن الكابول المستخدم للقياس فقط هو الذي يتلامس مع العينة.
      ملاحظة: يمكن أن تؤدي الكابولات الأخرى الملامسة للعينة غير تلك المستخدمة في القياس إلى حركة غير مرغوب فيها للعينة أثناء التجربة أو حتى إلى انفصال العينة عن الشريط الأساسي.
      تنبيه: تجنب ملامسة الكابول المستخدم للقياس بالملاقط في الخطوة الحالية أو اللاحقة.
    4. قم بتركيب الشريحة على حامل الكابول. أدخل الحامل في رأس AFM. ضع رأس AFM على مرحلة العينة ، والتي تقع على المجهر البصري المقلوب. قم بمحاذاة مسار الرافعة الضوئية كما هو موضح في دليل المستخدم. يتم تحقيق المحاذاة الصحيحة لمسار الرافعة الضوئية عندما يتم وضع شعاع الليزر في البداية في الطرف الأمامي من ناتئ القياس ، وبعد ذلك ، يصطدم شعاع الليزر المنعكس بمركز الصمام الثنائي الضوئي المجزأ.
  2. معايرة الكابولي باستخدام طريقة الضوضاء الحرارية57
    ملاحظة: تتضمن معايرة الكابولي تحديد حساسية الرافعة البصرية المقلوبة (InvOLS) وثابت الزنبرك. تعد المعايرة الفردية لكل ناتئ مستخدم ضرورية لأن ثابت الزنبرك الاسمي الذي يتم توفيره عادة للناتئ عادة ما يكون مجرد تقريب تقريبي. في التجارب التي يتم فيها تحديد الخصائص الميكانيكية للعينة من منحنيات القوة المسجلة ، مثل تلك الموضحة في هذا البروتوكول ، من الضروري تحديد InvOLS مباشرة من خلال طريقة قائمة على التلامس على ركيزة صلبة. يمكن أن توفر الطرق البديلة التي تحدد InvOLS ، مثل اشتقاقها من هندسة الكابولي ، تقريبا تقريبيا فقط وليست مناسبة لنوع التطبيق الموضح هنا. بدلا من ذلك ، إذا تم استخدام الكابولي حيث يوفر المورد ثابت الزنبرك الدقيق ، فيمكن تحديد InvOLS من خلال إجراء وصفه Schiller et al.58.
    1. ضع شريحة مجهرية على مرحلة العينة من AFM. تعمل شريحة المجهر كركيزة صلبة للتحديد القائم على التلامس ل InvOLS.
    2. بعد وضع رأس AFM على مرحلة العينة ، اخفض الرأس باستخدام محركات السائر حتى تكون الفجوة المتبقية بين حامل الكابولي وشريحة المجهر حوالي 1-2 مم فقط. ضع PBS على جانب حامل الكابول ، مما يسمح له بالتدفق لأسفل وتشكيل الغضروف المفصلي السائل في الفجوة بين الحامل وشريحة المجهر باستخدام حقنة 1 مل بإبرة طويلة (0.9 مم × 70 مم).
      ملاحظة: تأكد من استخدام نفس السائل ، مثل المخزن المؤقت أو الوسائط ، الذي يتم استخدامه لقياسات حجم القوة للعينة أيضا لعملية المعايرة.
    3. لإجراء معايرة قائمة على جهات الاتصال في البرنامج، انتقل إلى صفحة الحصول على البيانات وحدد خيار العرض المتقدم . قم بالوصول إلى مدير المعايرة باستخدام زر قائمة البرجر الموجود في الزاوية اليمنى العليا. ضمن هذه الواجهة، حدد المستند إلى جهة الاتصال كطريقة واختر ناتئ MLCT F من القائمة المنسدلة كاسم الكابول. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتعيين Setpoint على 1 V وعدد عمليات الفحص إلى 10 في حقول الإدخال المقابلة.
    4. في صفحة الحصول على البيانات ، في لوحة التحكم اليسرى، أدخل نقطة ضبط بقيمة 1 فولت لإجراء الاقتراب التلقائي. انقر فوق الزر Blue Downwards Pointing Arrow الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة المستخدم لبدء النهج التلقائي. عند انتهاء النهج ويكون الكابول على اتصال بشريحة المجهر ، انقر فوق الزر "معايرة" في نافذة مدير المعايرة ..
      ملاحظة: يتم بعد ذلك تحديد كل من InvOLS وثابت الزنبرك الكابولي تلقائيا عن طريق تسجيل 10 منحنيات قوة بالإضافة إلى الكثافة الطيفية للطاقة الحرارية (PSD) ، والتي تستخدم لتحديد ثابت الزنبرك بطريقة الضوضاء الحرارية57. بعد الانتهاء من إجراء المعايرة التلقائية ، تحقق بصريا من أن المنحنى الملائم يصف بشكل صحيح الوضع العادي (الذروة الأولى) ل PSD المسجل للناتئ وأن ثابت الزنبرك المحدد له نفس ترتيب الحجم مثل ثابت الزنبرك الاسمي الذي قدمته الشركة المصنعة للناتئ. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب ضبط نطاق التركيب يدويا للتأكد من أن الملاءمة تتقارب مع وتمثل الذروة الأولى في طيف الطاقة الحرارية.
    5. بعد انتهاء المعايرة، أغلق نافذة إدارة المعايرة . بعد إغلاق مدير المعايرة، يتم إنشاء ملف معايرة (*.tnd ملف ascii) في الدليل المحدد مسبقا (انظر الخطوة 3.1.2) يحتوي على نتائج المعايرة المحددة، والتي تكون مطلوبة لاحقا لتحليل البيانات. توثيق قيم المعايرة للرجوع إليها في المستقبل أثناء عملية تحليل البيانات، على سبيل المثال، في دفتر المختبر.
      تنبيه: من هذه الخطوة فصاعدا، امتنع عن تغيير موضع الليزر على الكابولي، أو ضبط المرآة في رأس AFM، أو نقل حامل الكابول. سيؤثر تعديل هذه العناصر على InvOLS ويجعل قيم المعايرة غير صالحة. للتعويض عن الانجراف الحراري ، اضبط موضع الصمام الثنائي الضوئي المجزأ لرأس AFM.
  3. تحليل الجدار السنخي في قسم الرئة
    1. استرجع شريحة العينة لتقييمها من الفريزر. اترك العينة تذوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة تقريبا حتى يصبح وسط OCT بالكامل صافيا. بعد ذلك ، أضف بعض قطرات PBS إلى قسم أنسجة الرئة لإعادة ترطيبها.
    2. ضع شريحة المجهر التي تحمل قسم أنسجة الرئة على مرحلة العينة. قم بتثبيت رأس AFM مرة أخرى على مرحلة العينة وقم بخفض الرأس حتى يتم وضع الكابول على ارتفاع 1 مم تقريبا فوق العينة. أضف بعض PBS الإضافي إلى جانب حامل الكابولي باستخدام حقنة سعة 1 مل مع إبرة 0.9 مم × 70 مم حتى يتم تشكيل الغضروف المفصلي السائل بين قسم الأنسجة وحامل الكابول.
    3. انتقل إلى مدير الإعدادات بالنقر فوق الزر مع أيقونة مفتاح الربط في الزاوية اليمنى العليا من واجهة المستخدم. في "إدارة الإعدادات"، اضبط الإعدادات العامة التالية. ضمن قسم إعدادات النهج ، اضبط الارتفاع المستهدف على 4 ميكرومتر. ثم ، ضمن قسم إعدادات الوضع الحالي ، انتقل إلى إعدادات الملاحظات المتقدمة واضبط المضاعف على 1. أخيرا ، ضمن القسم الفرعي إعدادات القوة ، الموجود أيضا داخل قسم إعدادات الوضع الحالي ، حدد الخيار تراجع بيزو من الوضع في القائمة المنسدلة في النهاية .
    4. استخدم المجهر البصري المقلوب لتحديد الجدار السنخي السليم والانتقال إليه. يتميز الجدار السليم في صورة المجال الساطع بحواف داكنة وناعمة. (انظر الشكل 2 أ - ب).
      ملاحظة: يمكن أن يساعد استيراد صورة المجال الساطع في برنامج التحكم AFM ، عند توفره ، في التنقل في الكابول إلى جدار سنخي معين والتقاط خريطة القوة أو QI فوقه بدقة. في برنامج JPK SPM ، يشار إلى هذه الوظيفة باسم التراكب المباشر.
    5. قم بتعيين معلمات منحنيات المسافة البادئة للقوة في لوحة التحكم اليسرى بناء على AFM المستخدم ، والناتئ المستخدم ، والعينة المرصودة. بالنسبة إلى NanoWizard 4XP و MLCT Cantilever F من Bruker ، نوصي بالمعلمات التالية: Setpoint = 5 nN. طول z = 8 ميكرومتر ؛ z السرعة = 300 ميكرومتر / ثانية.
      ملاحظة: طول z الموصى به البالغ 8 ميكرومتر كبير نوعا ما. ويعزى ذلك إلى خصائص أنسجة الرئة. بالنظر إلى أن أنسجة الرئة عادة ما تكون ناعمة جدا ، يمكن أن يصل عمق المسافة البادئة إلى 4 ميكرومتر في نقاط معينة ، حتى مع وجود نقطة ضبط متواضعة نسبيا تبلغ 5 نانو نيوتن. من أجل ضمان أن خط الأساس ، حيث لا يكون الطرف ملامسا للعينة ، يمثل حوالي نصف منحنى القوة البادئة على الأقل ، يوصى بضبط الطول الكلي للمنحنى على 8 ميكرومتر. سيؤدي ذلك إلى تبسيط تحليل المنحنى بشكل كبير لاحقا. بالنسبة لأجهزة AFMs الحيوية الأخرى ، يجب أن تكون هذه المعلمات قابلة للتطبيق أيضا ، على الرغم من أن تسمية بعض المعلمات ، مثل نقطة الضبط ، التي تحدد قوة المسافة البادئة القصوى ، قد تختلف بين الشركات المصنعة المختلفة. إذا كان نظام AFM غير قادر على تحقيق السرعة الرأسية العالية الواردة هنا ، فمن الضروري تقليل سرعة z وفقا لتوصية الشركة المصنعة ل AFM.
      تنبيه: من أجل ضمان قابلية مقارنة النتائج ، من الضروري استخدام سرعات متطابقة لنهج z في جميع التجارب.
    6. قم بتعيين موقع وحجم خريطة قوة النظرة العامة الأولية ، مع التأكد من أنها تشمل الجدار السنخي بأكمله ، ويمتد من جانب هوائي إلى آخر. بالنسبة لعينات أنسجة رئة الفئران ، عادة ما يكون الحجم بين 20 ميكرومتر × 20 ميكرومتر و 30 ميكرومتر × 30 ميكرومتر كافيا. بغض النظر عن الحجم المحدد للخريطة ، قم بتعيين عدد وحدات البكسل (التي تتوافق مع عدد منحنيات القوة المسجلة) على 50 × 50. يؤدي هذا إلى توليد 2,500 منحنى مسافة بادئة للقوة لكل خريطة ، مما يوفر الدقة اللازمة لتحديد BM في قناة المنحدر لخريطة القوة. (انظر الشكل 2C-D).
    7. بعد تسجيل خريطة النظرة العامة ، افحص قناة الارتفاع والمنحدر لخريطة القوة. إذا كانت قناة الارتفاع تشير إلى أن الجدار السنخي سليم (انظر الشكل 2 د) وإذا كان من الممكن تمييز BM في قناة المنحدر كخط ساطع محدد بوضوح (انظر الشكل 2C ، E) يقع بين طبقتين من الظهارة والبطانة ، التقط خريطة قوة أكثر تركيزا بحجم 3 ميكرومتر × 3 ميكرومتر أو 4 ميكرومتر × 4 ميكرومتر على BM. حافظ على وحدات البكسل عند 50 × 50 منحنى.
      ملاحظة: يؤدي هذا الإجراء إلى دقة خريطة أعلى ويسمح بتسجيل عدد أكبر من قيم معامل يونغ ، خاصة بالنسبة لمقياس BM (انظر الشكل 2E-F). علاوة على ذلك ، يتيح ذلك تمايزا أكثر دقة بين BM والأنسجة المحيطة ، مما يعزز دقة عملية الترشيح المكاني اللاحقة. إذا أظهرت قنوات خريطة النظرة العامة جدارا منعطرا أو ممزقا ، أو القطع الأثرية الناتجة عن لمس الكابولي للعينة ليس فقط بالطرف ، أو عدم وجود BM يمكن التعرف عليه في قناة المنحدر ، فانتقل إلى جدار آخر في قسم الأنسجة حتى يمكن تحديد جدار به تقييم خال من القطع الأثرية ل BM.
      كرر الخطوات السابقة (3.3.6 و 3.3.7) على أقسام أخرى من نفس عينة الرئة حتى يتم تقييم العدد المطلوب من الجدران السنخية. يوصى بأربعة جدران على الأقل لكل عينة رئة لتحقيق نتائج قوية59.
    8. بمجرد اكتمال القياس ، قم بتنظيف جميع المعدات والمواد التي لامست العينة و PBS. إذا لم تعد هناك حاجة إلى العينة ، فتخلص منها في حاوية نفايات زجاجية قابلة للتعقيم. احفظ جميع البيانات المسجلة ، وقم بإيقاف تشغيل برنامج التحكم في AFM والكمبيوتر. أخيرا ، أغلق أي أجهزة كهربائية تم استخدامها.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا. يتم حفظ البيانات التجريبية ويمكن تحليلها في وقت لاحق.

4. تحليل البيانات

  1. تحليل منحنيات القوة البادئة
    ملاحظة: يمكن العثور على دليل مفصل لتطبيق تحليل منحنى القوة هنا: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis.
    1. قم بتشغيل CANTER Processing Toolbox56 في MATLAB وافتح تطبيق تحليل منحنى القوة .
      ملاحظة: يمكن تنزيل Toolbox من مستودع GitHub باتباع هذا الرابط: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. يتوفر ملف README.md ، الذي يتألف من دليل شامل حول كيفية تثبيت البرنامج وبدء تشغيله باستخدام MATLAB ، في مستودع GitHub. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول كل تطبيق مدرج في صندوق الأدوات في موقع الويكي المقابل على https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki.
    2. قم بتحميل خريطة القوة عالية الدقة (3 ميكرومتر × 3 ميكرومتر أو 4 ميكرومتر × 4 ميكرومتر) بالنقر فوق الزر "تحديد ملف " ، والانتقال إلى الموقع حيث يتم حفظ خريطة القوة ، والنقر المزدوج عليها ، ثم النقر فوق تحميل البيانات زر على واجهة المستخدم الخاصة بالتطبيق.
    3. تظهر نافذة منبثقة تطلب قيم المعايرة (InvOLS وثابت الربيع) التي تم تحديدها (انظر الخطوة 3.2) للناتئ المستخدم لتسجيل خريطة القوة المحددة في خطوة البروتوكول السابقة. أدخل قيم المعايرة في حقول التحرير المعنية. إذا لم يتم توثيقها أثناء الخطوة 3.2.4، فراجع ملف المعايرة الذي تم إنشاؤه تلقائيا، والذي يحتوي أيضا على قيم المعايرة. احتفظ بالخيار الافتراضي نعم لسؤال ما إذا كان يجب حساب الفصل بين عينة الإلماح. بعد ذلك ، انقر فوق إرسال زر للمتابعة.
    4. تظهر نافذة منبثقة ثانية ، مما يسمح بتحديد هندسة المسافة البادئة ونسبة بواسون للعينة ذات المسافة البادئة. بالنسبة لناتئ MLCT المستخدمة، حدد الهرم رباعي الجوانب كهندسة طرف وأدخل 17.5 درجة لنصف الزاوية إلى الحافة (كلاهما القيم الافتراضية). استخدم نسبة بواسون الافتراضية البالغة 0.5 ، والتي تمثل مادة غير قابلة للضغط. لمتابعة إجراء تحميل خريطة QI ، انقر فوق الزر إرسال .
      ملاحظة: أثناء إجراء التحميل ، يتم تحويل منحنيات الانحراف والإزاحة المسجلة (البيانات الأولية ل AFM) إلى منحنيات مسافة بادئة للقوة بناء على قيم المعايرة المقدمة. للحصول على فهم شامل لخطوات التحويل الفردية والمعادلات المرتبطة بها ، راجع المعلومات التكميلية ل Hartmann et al.59.
    5. عند الانتهاء من عملية التحميل ، سيتم عرض منحنى القوة الأولي لخريطة القوة على الشاشة. تأكد من تحديد وضع تصحيح الخط الأساسي Offset + Tilt . يكتشف هذا الوضع تلقائيا خط الأساس لمنحنى تحريض القوة ويصحح الإمالة والإزاحة الرأسية لتكون صفرا. بالإضافة إلى ذلك، حدد عبر نموذج Hertz كخوارزمية لمكتشف نقطة الاتصال واستخدم قيمة 20٪ في حقل التحرير المعين لهذا الخيار. هذه الخوارزمية مناسبة بشكل خاص للكشف عن نقطة التلامس في منحنيات المسافة البادئة للقوة التي تم تسجيلها على عينات الأنسجة الرخوة. أخيرا ، اضبط عمق الملاءمة في حقل التحرير المقابل على 1.5 ميكرومتر.
      ملاحظة: للتأكد من أن صلابة شريحة المجهر لا تؤثر على معامل يونغ الناتج ، يوصى بضبط الحد الأقصى لعمق الملاءمة على قيمة لا تزيد عن 10٪ من سمك قسم الأنسجة60. لمزيد من التفاصيل حول خوارزميات التصحيح ، راجع المعلومات التكميلية ل Hartmann et al.59.
      تنبيه: استخدم نفس عمق الملاءمة طوال التجارب لضمان مقارنة النتائج.
    6. لتطبيق ملاءمة نموذج Hertz المعدل على جميع منحنيات القوة البادئة لخريطة QI ، انقر فوق الزر Keep & Apply to all . تفتح نافذة حوار تسأل عما إذا كان يجب عرض كل منحنى قوة أثناء التحليل أم لا. من خلال عدم عرض المنحنيات ، يتم تسريع سرعة المعالجة قليلا.
    7. بعد الانتهاء من تحليل منحنى القوة الأخير ، تظهر نافذة تسأل عما إذا كان يجب حفظ نتائج الملاءمة. لحفظ النتائج في كليهما. تنسيقات ملفات tsv (قيم مفصولة بعلامات جدولة) و .xlsx (Excel) ، انقر فوق نعم وأدخل اسما لملفات النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يتم حفظ ملف نصي بامتداد الملف * .meta_data ، والذي يحتوي على جميع التفاصيل المتعلقة بتحليل المنحنيات ، مثل قيم المعايرة المستخدمة ، ونموذج الملاءمة المختار ، وخوارزمية الكشف عن نقطة الاتصال المحددة ، ونطاق الملاءمة ، والمعلومات الأخرى ذات الصلة.
    8. أغلق تطبيق تحليل منحنى القوة بالنقر فوق أيقونة الصليب في الزاوية اليمنى العليا من النافذة الرئيسية.
  2. التصفية المكانية لنتائج خريطة QI
    ملاحظة: تضمن خطوة التصفية المكانية أن قيم معامل يونغ فقط لخرائط QI الناشئة من BM تؤخذ في الاعتبار لأي تحليل إضافي. يمكن العثور على دليل مفصل لأداة تصفية النتائج هنا: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool.
    1. حدد أداة تصفية النتائج من قائمة التطبيقات في نافذة تحديد التطبيق في CANTER Processing Toolbox وابدأ التطبيق بالنقر فوق الزر "بدء التطبيق ".
    2. لتحميل نتائج الملاءمة ، انقر فوق فتح في شريط القائمة العلوي لواجهة مستخدم أداة تصفية النتائج . في النافذة المنبثقة اللاحقة، حدد موقع الزر تعيين الأول الموجود داخل علامة التبويب خرائط JPK واختر ملف .tsv الذي يحتوي على نتائج تحليل منحنى القوة (راجع الخطوة 4.1.6). انقر فوق الزر " تعيين " الثاني وحدد موقع ملف خريطة QI الذي يتوافق مع ملف .tsv المحدد بالفعل. بعد ذلك، انقر فوق إرسال لتحميل بيانات الخريطة وفرض نتائج تحليل المنحنى.
    3. حدد خيار Emodul من القائمة المنسدلة أعلى القناة المعروضة لعرض نتائج معامل Young التي تم الحصول عليها كصورة خريطة. علاوة على ذلك ، اختر خيار Emodul (إذا لم يكن محددا بالفعل) من القائمة المنسدلة لقناة البيانات الموجودة أسفل مخطط الرسم البياني لتصور توزيع قيم معامل Young المحملة لخريطة QI.
    4. انقر فوق زر سهم تدفق التلاعب ، الموجود في وسط واجهة المستخدم ، وتأكد من أنه يشير إلى الجانب الأيمن. اضبط زر تبديل مرشح الصورة على موضع التشغيل في لوحة التصفية الموجودة أعلى محاور الرسم البياني. حدد خيار Freehand من القائمة المنسدلة تصفية الهندسية ثم انقر فوق الزر "إضافة ".
    5. في صورة القناة العلوية، ارسم قناع المرشح عن طريق تدوير BM أثناء الضغط على مفتاح الماوس الأيسر. يمكن التعرف على BM في خريطة معامل Young كهيكل مشرق (قيم معامل يونغ العالية) مقارنة بالأنسجة الرخوة المجاورة (انظر الشكل 3 أ). عند الانتهاء من رسم القناع ، حرر مفتاح الماوس الأيسر وانقر نقرا مزدوجا على القناع ليتم تطبيقه على الخريطة. يظهر الرسم البياني للرسم البياني الموجود على اليمين الآن فقط قيم معامل يونغ لمناطق الخريطة المميزة باللون الأخضر (اللون الافتراضي ؛ انظر الشكل 3C-D).
    6. لإنشاء ملف نتيجة .tsv جديد يحتوي فقط على قيم معامل Young المقنعة ، انقر في شريط القائمة العلوي لواجهة المستخدم على حفظ > حفظ الرسم البياني > حفظ البيانات. بدلا من ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق منطقة فارغة من محاور رسم الرسم البياني وحدد حفظ البيانات من قائمة السياق.
    7. انقر فوق تحديد الكل في النافذة المنبثقة لتسأل عن النتائج التي يجب كتابتها في ملف .tsv. ثم قم بتأكيد التحديد بالنقر فوق OK زر. بعد ذلك ، أدخل اسما لملف .tsv في مربع حوار الحفظ ، واختر موقع الحفظ المطلوب ، وأخيرا انقر فوق "موافق " لحفظ النتائج التي تمت تصفيتها
    8. أغلق أداة تصفية النتائج بالنقر فوق أيقونة الصليب في الزاوية اليمنى العليا من التطبيق.
  3. R2 تصفية النتائج
    ملاحظة: تضمن خطوة البروتوكول هذه أن نتائج معامل يونغ فقط هي التي تم أخذها في الاعتبار حيث أظهر نموذج هيرتز المعدل اتفاقا جيدا مع منحنى القوة البادئة الذي تم تركيبه عليه. يمكن العثور على دليل مفصل لأداة تصفية R² هنا: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool.
    1. ابدأ تشغيل أداة تصفية R² عن طريق تحديدها في قائمة تطبيقات نافذة اختيار التطبيق في CANTER Processing Toolbox والنقر فوق بدء التطبيق.
    2. انتقل إلى شريط القائمة العلوي لواجهة المستخدم وانقر فوق فتح ملف .tsv. في مربع حوار ملف التحميل اللاحق ، حدد موقع ملف .tsv الذي يحتوي على نتائج معامل Young ل BM المحفوظة خلال الخطوة السابقة 4.2.5 ، وحدده بالنقر المزدوج.
    3. يظهر مربع حوار يعرض قائمة بأعمدة البيانات المضمنة في ملف .tsv. حدد Emodul كعمود يحتوي على بيانات معامل يونغ. بعد ذلك، في مربع حوار مربع قائمة منفصل يطلب بيانات R²، اختر rsquare_fit. بمجرد اكتمال إجراء التحميل ، يتم عرض بيانات معامل Young المحملة في شكل رسم بياني على الجانب الأيسر العلوي من الشاشة ، بينما يتم تصوير توزيع بيانات R² في الرسم البياني على الجانب الأيمن العلوي.
    4. أدخل 0.96 في حقل التحرير الموجود في وسط واجهة المستخدم الرسومية. انقر فوق الزر "تصفية البيانات " لتطبيق عامل تصفية R² باستخدام القيمة التي تم إدخالها. سيحتفظ هذا الإجراء فقط بالنتائج التي لها قيمة R² 0.96 أو أعلى. يتم عرض التوزيعات التي تمت تصفيتها لنتائج معامل Young وقيم R² المقابلة في النصف السفلي من واجهة المستخدم.
    5. حدد حفظ البيانات التي تمت تصفيتها من شريط القائمة العلوي لإنشاء ملف .tsv جديد يتضمن فقط النتائج التي تفي بمعيار عامل تصفية R² المحدد > 0.96. يمكن الآن عرض البيانات المحفوظة كرسم بياني ، على سبيل المثال ، باستخدام أداة رسم الرسم البياني ، والتي تصور توزيع معامل يونغ لمؤشر كتلة الدم الرئوي الذي تم فحصه (انظر الشكل 4 أ).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تحديد وقياس الجدار السنخي السليم ، فإن النتيجة الأولية لهذا البروتوكول هي قيم معامل يونغ المصفاة ل BM. من المهم ملاحظة أنه لا يمكن العثور على جدار سنخي مناسب لقياس AFM في كل قسم من أقسام الأنسجة. في ملاحظاتنا التجريبية ، أظهرت ما يقرب من 75٪ من عمليات القطع بالتبريد المشتقة من عينات رئة الفئران جدارا سنخيا قابلا للقياس الكمي. لتحديد التوزيع المكاني لمعامل يونغ بدقة في BM الرئوي ، ننصح باستخدام خرائط القوة التي تمتد إما 3 ميكرومتر × 3 ميكرومتر أو 4 ميكرومتر × 4 ميكرومتر. يضمن هذا النهج دقة كافية لفحص BMs الرئوية للفأر ، والتي يبلغ سمكها عادة 100 نانومتر - 200 نانومتر. لذلك ، يتضمن النهج التجريبي التقاط منحنيات قوة 50 × 50 لكل خريطة قوة ، مما ينتج عنه ما مجموعه 2,500 منحنى قوة. داخل خريطة القوة ، تكون منحنيات القوة متباعدة بشكل متساو. هذا يعني أنه بالإضافة إلى معامل يونغ ل BM ، يتم فحص هياكل الأنسجة المحيطة ب BM حتى في خرائط القوة الصغيرة. لذلك ، لتحديد معامل يونغ بدقة وانتقائية حصريا لمؤشر كتلة الدم الرئوي ، قمنا بتنفيذ عملية تصفية من خطوتين في هذا البروتوكول.

تحدد خطوة التصفية الأولية للتصفية المكانية المعتمدة على المشغل نتائج ملاءمة منحنى القوة التي تنشأ من BM الرئوي للفئران ، والتي تضم ما يقرب من 10٪ إلى 25٪ من إجمالي قيم النتائج الواردة في خريطة القوة التي تم تحليلها. بعد هذا التصفية المكانية الأولية ، يتم الاحتفاظ بحوالي 250 - 625 نتيجة ملاءمة لمزيد من التحليل. تضمن خطوة التصفية التالية تضمين النتائج المتعلقة ب BM التي تنشأ من منحنيات القوة الموصوفة بشكل كاف بواسطة نموذج Hertz المعدل. لذلك ، يتم استخدام معامل التحديد (R2) لملاءمة نموذج هيرتز المعدل كمعيار مرشح. تشير تجربتنا التجريبية إلى أن الحفاظ على النتائج ذات قيم R2 أعلى من 0.96 مناسب للنتائج الملائمة التي تم الحصول عليها من خلال الالتزام بهذا البروتوكول. من المهم ملاحظة أن قيمة R2 تتأثر بشكل كبير بجودة (نعومة) وطول خط الأساس لمنحنى القوة ، وتحديد نقطة الاتصال ، وتقارب النموذج المجهز. بعد تطبيق كلا إجراءي الترشيح ، تبقى ما يقرب من 100 إلى 500 قيم معامل يونغ عادة لدرجة BM لجدار سنخي واحد.

يمكن تصور توزيع قيم معامل يونغ المتبقية من BM باستخدام الرسم البياني (الشكل 4 أ). من المهم ملاحظة أن قيم معامل يونغ الناتجة لمؤشر كتلة الدم الرئوي تتبع توزيعا لوغاريتميا طبيعيا ، والذي يتم ملاحظته بشكل شائع للمتغيرات العشوائية التي يمكنها فقط الوصول إلى القيم الموجبة61. يتم تصور ذلك من خلال مخطط QQ في الشكل 4 ب. وبالتالي ، يمكن تركيب توزيع طبيعي (غاوسي) لتوزيع قيم معامل يونغ (E) المحولة بالمسجل اللوغاريتمي. هنا ، تم استخدام اللوغاريتم الطبيعي (ln) لتحويل قيم E . تم استخراج موضع الذروة للتوزيع (μ) والانحراف المعياري (σ) من هذا الملاءمة ثم أعيد تحويلها لاحقا للحصول على معامل يونغ التمثيلي ، المشار إليه باسم EBM ، باستخدام المعادلة التالية:

figure-results-1

لاحظ أنه بعد إعادة التحويل ، لم يعد الفاصل الزمني للانحراف المعياري متماثلا حول قيمة الذروة. يمكن حساب الحواف السالبة (σ-) والموجبة (σ+) لفاصل الانحراف المعياري باستخدام التعبيرات التالية:

figure-results-2

figure-results-3

هذه المعادلات هي نتيجة لحقيقة أن الدالة الأسية هي الدالة العكسية للوغاريتم الطبيعي62.

بعد إعادة تحويل قيمة الذروة μ = 9.31 والانحراف المعياري σ = 0.18 المحدد من الرسم البياني في الشكل 4 أ ، فإن قيمة معامل يونغ التمثيلية هي EBM = 11.05 كيلو باسكال مع فاصل انحراف معياري يبلغ [-1.82 كيلو باسكال ، +2.18 كيلو باسكال]. بدلا من ذلك ، يمكن تركيب توزيع لوغاريتمي طبيعي على الرسم البياني لقيم معامل يونغ (E) غير المحولة لتحديد المعلمات المميزة للتوزيع.

يوصى بتحليل ما لا يقل عن أربعة جدران لكل فأر للحصول على نتيجة تمثيلية قوية كما أوضحنا بالتفصيل في Hartmann et al.59. لتحديد معامل يونغ التمثيلي EBM للماوس ، تم رسم القيم المحولة لوغاريتمية لجميع الجدران الأربعة في رسم بياني واحد مشترك وتم تحديد μ و σ عن طريق تركيب توزيع طبيعي. بعد ذلك ، يتم إعادة تحويل μ و σ كما هو موضح سابقا لاسترداد EBM والفاصل الزمني للانحراف المعياري لماوس الموضوع.

figure-results-4
الشكل 1: نظرة عامة على خطوات البروتوكول الرئيسية لتحديد معامل يونغ للغشاء القاعدي الرئوي الفئراني. تتضمن الخطوة الأولى الحصول على رئتي الفئران وإعدادهما ، متبوعا بتضمينهما. ومن ثم ، يتم حقن الرئة بمزيج من وسيط OCT و PBS ، ثم يتم غمرها بالكامل في مركب OCT. بعد ذلك ، يتم الحصول على أقسام أنسجة الرئة بسمك 15 ميكرومتر من خلال التشريح بالتبريد باستخدام التبريد. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل عملية استخدام أشرطة لاصقة أحادية الجانب ومزدوجة الجوانب لتأمين العينات في مكانها أثناء عملية القطع. بعد ذلك ، يتم تحديد قيم معامل يونغ ل BM من خلال قياسات خريطة قوة AFM على أقسام الأنسجة. بعد الانتهاء من عملية تحليل منحنى القوة ، يتم تطبيق الترشيح المكاني و R² لعزل نتائج معامل يونغ للهيكل محل الاهتمام ، وتحديدا BM (كما هو موضح باللون الأخضر في خريطة القوة ومقاس كميا في توزيع معامل يونغ المحول باللوغاريتم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 2: تجربة AFM لخريطة القوة النموذجية التي أجريت على قسم أنسجة رئة الفئران. (أ) صورة نظرة عامة على الفحص المجهري للحقل الساطع لقسم أنسجة رئة الفئران ، مما يتيح تحديد الجدران السنخية السليمة المناسبة الواقعة بين الحويصلات الهوائية. على الجانب الأيمن من الصورة ، يظهر ناتئ MLCT المثلث الشكل F ل AFM. (ب) عرض مكبر لجدار محدد داخل قسم الأنسجة. (ج) قناة المنحدر و (د) الارتفاع لخريطة نظرة عامة 15 × 15 ميكرومتر تحتوي على منحنيات قوة 50 × 50 للجدار السنخي. في قناة المنحدر ، يمكن تحديد BM على أنه خط ساطع (سهم أبيض) ، مما يشير إلى هيكل من الصلابة المتزايدة داخل الجدار. تؤكد قناة الارتفاع سلامة الجدار ، ولا تظهر أي دليل على التمزق. بعد تحديد BM في خريطة النظرة العامة 15 × 15 ميكرومتر، تسجل خريطة أصغر حجما مقاس 4 × 4 ميكرومتر (E: قناة منحدرة، F: قناة ارتفاع) مع منحنيات قوة 50 × 50. قضبان المقياس: (A) 200 ميكرومتر و (BD) 25 ميكرومتر. نطاقات مقاييس الألوان لصور AFM المعروضة هي (C) 2.36 - 9.29 nN / μm ، (D) 0 - 3.38 ميكرومتر ، (E) 2.36 - 9.29 nN / μm (صورة عامة) و 2.42 - 8.37 نانوتن / ميكرومتر (صورة أصغر) ، (F) 0 - 3.38 ميكرومتر (صورة عامة) و 0 - 1.99 ميكرومتر (صورة أصغر) ، من الظلام إلى الساطع. تم استخدام مقاييس الألوان الخطية لجميع صور AFM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 3: تصور إجراء التصفية المكانية. (أ) خريطة معامل يونغ الناتجة عن تحليل منحنى القوة ، كما هو موضح في أداة تصفية النتائج لتمكين التصفية المكانية للنتائج. يمكن التعرف على BM على أنه شريط ساطع (قيم معامل يونغ عالية) محاط بمقصورات أنسجة أكثر ليونة. (ب) الرسم البياني لقيم معامل يونغ المقابلة للخريطة غير المفلترة (A). بعد تطبيق (C) لقناع المرشاح المكاني (المنطقة الخضراء) ، (D) يشتمل الرسم البياني حصريا على قيم معامل Young من المنطقة المميزة الخضراء ، والتي تم تحديدها على أنها BM. لاحظ أن القيم الناعمة المتبقية التي يمكن ملاحظتها على الجانب الأيسر من الرسم البياني يمكن أن تعزى إلى نوبات متقاربة ضعيفة ، والتي سيتم التخلص منها في خطوة الترشيح R² اللاحقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 4: توزيع معامل يونغ لمؤشر كتلة الدم الرئوي الفئراني الذي تم تلقيه باتباع هذا البروتوكول. (أ) الرسم البياني الطبيعي لوغاريتمي لقيم معامل BM Young الناتجة (N = 325). من خلال تركيب توزيع طبيعي (خط صلب أسود) ، يتم تحديد القيمة المتوسطة μ = 9.31 مع انحراف معياري σ = 0.18. بعد إعادة التحويل ، يتوافق هذا مع معامل يونغ لنسبة BM ل EBM = 11.05 كيلو باسكال مع فاصل انحراف معياري غير متماثل يبلغ [-1.82 كيلو باسكال ، +2.18 كيلو باسكال]. (ب) مخطط QQ لكميات قيم معامل BM Young اللوغاريتمية مقابل كميات التوزيع الطبيعي القياسي. يوضح هذا المخطط أنه باستثناء بعض القيم في ذيول اليسرى واليمنى للتوزيع ، فإن قيم معامل يونغ الناتجة موزعة بشكل أساسي لوغاريتميا عادية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حظيت الخصائص الميكانيكية ل BMs باهتمام كبير نظرا لتأثيرها على الوظائف الخلوية المختلفة ، مثل تبرعم الورم ، والتمايز الخلوي ، وحركة الخلايا ، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين53،63،64،65،66،67،68. وبالتالي ، توجد فجوة لم تتم ملوتها في القدرة على تقييم ميكانيكا BM بطريقة متسقة وقابلة للقياس. يهدف هذا البروتوكول إلى تمكين مستخدمي AFM من تحديد معامل يونغ لعضلات الدم الرئوية من عينات رئة الفئران السليمة أو المرضية التي تم الحصول عليها من الفئران البرية أو المعدلة وراثيا. يسهل تطبيق MATLAB الرسومي سهل الاستخدام المستند إلى واجهة المستخدم CANTER Processing Toolbox56 التحليل النهائي لبيانات AFM. من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين الآخرين الذين يجرون دراسات يمكن أن تؤدي إلى تقدم في التشخيص السريري أو الإدارة أو استراتيجيات العلاج الجديدة لاضطرابات الرئة.

تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول التأكد من أنه أثناء القطع بالتبريد لعينة الرئة ، لا تذوب أقسام الأنسجة في أي وقت لمنع التغيرات في الخصائص الميكانيكية بسبب دورات التجميد والذوبان. لذلك ، من الضروري استخدام شرائح المجهر المبردة مسبقا فقط لجمع الأقسام والتعامل معها فقط داخل غرفة التبريد. تتمثل الخطوة الأكثر أهمية أثناء تسجيل خرائط القوة على الجدار السنخي في استخدام صورة المنحدر التي تم إنشاؤها ، والتي توفر نظرة عامة نوعية على توزيع الصلابة للمنطقة التي تم فحصها ، لتحديد موقع القياس المناسب ل BM. تشكل التصفية المكانية لقيم معامل يونغ التي تم الحصول عليها خطوة حاسمة في البروتوكول وهي سمة رئيسية لمجموعة أدوات معالجة CANTER. تمكن خطوة التصفية هذه الباحث من تحديد BM ، الذي يقع بين طبقتين أكثر نعومة من الخلايا ، من خلال بصمته المميزة الأكثر صلابة واستخراج قيم معامل يونغ المقابلة ل BM لمزيد من التحليل.

كشف سير عمل التحليل المتقدم هذا أن الفئران بالضربة القاضية netrin-4 أظهرت معامل يونغ أعلى بكثير (حوالي ضعفين) في غشاء القاعده الرئوي مقارنة بفئران القمامة البرية53. وبالتالي، فإن هذا البروتوكول ييسر التحليل المقارن لمختلف الظروف أو المجموعات.

بالإضافة إلى AFM ، توجد العديد من المنهجيات لفحص الخواص الميكانيكية للمواد الحيوية ، بما في ذلك الملقط البصري أو المغناطيسي69،70،71 على المستوى الجزيئي ، وتقنيات المسافة البادئة الدقيقة72،73 على نطاق متوسط واختبار الضغط المحصور أو غير المحصور74،75 على المستوى العياني على وجه التحديد ، تم استخدام تصوير عضل الضغط واختبار الشد76،77 والريولوجيا78 لتقييم صلابة BM لعينات الأوعية الدموية ومصفوفات BM المعاد تشكيلها. ومع ذلك ، فإن تقنيات مثل تصوير عضل الضغط واختبار الشد يمكنها فقط تقييم الخصائص الميكانيكية للأنسجة الكاملة أو هياكل الأنسجة الكاملة ، مثل الأوعية الدموية بأكملها ، والتي تشمل طبقات الخلايا المختلفة والعناصر الهيكلية. نتيجة لذلك ، عند استخدام هذه الطرق لتقييم الميكانيكا الحيوية ل BM ، يتم دائما تثبيت الخصائص الميكانيكية لغير BM ، مثل المكونات الخلوية ، على نتائج BM ، مما يجعل من الصعب عزل الخصائص المحددة ل BM نفسها.

في هذا البروتوكول ، يتم استخراج ميزة الاهتمام (BM) من خلال التصفية المكانية لنتائج خريطة القوة. ويتمثل أحد قيود هذا النهج في اشتراط أن تكون خاصية الاهتمام قابلة للتمييز والتعرف عليها كنمط مميز في خرائط معامل يونغ التي تم الحصول عليها أو أي قناة خريطة أخرى متاحة. على سبيل المثال ، يمكن التعرف على BM في الأنسجة السنخية فقط بسبب هيكله المترابط ، والذي يظهر معامل يونغ أعلى بكثير مقارنة بالخلايا المحيطة. وبالتالي ، يتجلى BM كشريط ساطع مستمر في خرائط معامل يونغ التي تم الحصول عليها. ومع ذلك ، تظهر الهياكل البيولوجية الأخرى خصائص ميكانيكية لا تختلف بما فيه الكفاية عن تلك الموجودة في الأنسجة المحيطة لتمكين التصفية المكانية في نتائج الخريطة. على الرغم من أنه يمكن دمج البروتوكول مع طرق أخرى لتحديد الهياكل في خرائط القوة المسجلة ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، إلا أن هذا النهج قد يؤدي إلى نتائج يصعب تفسيرها. قد تحدث هذه المضاعفات لأن إجراءات التلوين يمكن أن تغير الخواص الميكانيكية للأنسجة. وبالتالي ، يجب إجراء أي معالجة أو تلطيخ للأنسجة قبل قياسات AFM فقط في حالة عدم توفر طريقة بديلة لتحديد الميزة ذات الأهمية. علاوة على ذلك ، من المهم إجراء تجارب التحكم المناسبة لمقارنة الخصائص الميكانيكية الحيوية للعينات الملطخة وغير الملطخة.

يقدم البروتوكول طريقة لتحديد الهياكل المستهدفة بناء على تباين معامل يونغ. وبالتالي ، يمكن تطبيقه على الأنسجة ذات BM تشريحي مشابه لتلك الموجودة في الرئة ، بما في ذلك الغدة الدرقية والقولون والبروستاتا. (انظر رقم البيانات الموسعة في Hartmann et al.59). على الرغم من أنه تم تطويره في البداية لتحليل ميكانيكا BM ، إلا أن هذا البروتوكول وصندوق أدوات معالجة CANTER56 متعدد الاستخدامات بما يكفي لفحص أي منطقة متميزة ومتصلة ميكانيكيا داخل خرائط قوة AFM (راجع التعليمات الموجودة في www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki). هذا التطبيق الواسع يجعل هذه الأداة ذات قيمة عبر مجال AFM ويدعم التركيز المتزايد على علم الأحياء الميكانيكي في المجتمع العلمي الأوسع.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H. و H.C.-S. الاعتراف بالتمويل المقدم من وزارة العلوم والفنون في ولاية بافاريا من خلال التركيز البافاري على البحوث Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben (CANTER) والمنتدى الأكاديمي البافاري (BayWISS) - اتحاد الدكتوراه للبحوث الصحية. تم تمويل تطوير برنامج تحليل البيانات CANTER Processing Toolbox من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية كجزء من المشروع الفرعي 1 (CL 409 / 4-1 / 2) لاتحاد الأبحاث استكشاف تنكس الغضروف المفصلي والعظام تحت الغضروفي وتجديده في هشاشة العظام - ExCarBon (FOR2407-1 / 2). B.H. و H.C.-S. الاعتراف بالتمويل المقدم من مؤسسة الأبحاث الألمانية من خلال حملة الأجهزة الرئيسية GGA-HAW (INST 99 / 38-1). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل جمعية السرطان الدنماركية (R204-A12454 (R.R.)) ومؤسسة الأبحاث الألمانية (539446614 إلى R.R.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل حقنةB براون9166017VInjekt-F
10 مل حقنةB براون4606108VInjekt Luer Solo
15 مل أنبوب فالكونSarstedt62.554.002أنبوب غطاء لولبي
ناتئ - MLCTBruker AFM Probes3444AFM ناتئ مع شكل طرف
هرمي شفرات CryotomeLeica Biosystems14035843496شفرات منخفضة الارتفاع DB80LX
حامل عينة CryotomeLeica Biosystems14047740044قرص عينة 30
CyotomeLeica BiosystemsCM1950Leica Cryostat
Direct Overlay Extensionامتداد برنامج Brukerلبرنامج JPK SPM الذي يتيح استيراد الصورة البصرية للمجهر المقلوب إلى عارض البيانات لبرنامج SPM.
قاعدة يمكن التخلص منهخدماتالعلوم SA62534-15Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 مم
شريط على الوجهينtesa Film56661-00002شريط فيلم صور
حامل ناتئ زنبركيBruker
مجهر مقلوب - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK المرحلة الآليةBruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM SoftwareBruker
K5 CMOS Microscope KameraLeica Microsystems
MATLABMathworksالإصدار R2024a أو أعلى
MATLAB - Curve Fitting Toolbox Mathworks
MATLAB - صندوق أدوات معالجةالصور Mathworks
MATLAB - Signal Processing Toolbox Mathworks
MATLAB - صندوق أدوات الإحصاء والتعلم الآليMathworks
CarlRothH869.1شرائح مجهر عادي لشرائح المجهر معايرة الكابولية
بلوريCarl RothH870.1مع حافة بلورية للتقطيع بالتبريد
إبرة & oslash ؛ 0.9 مم & مرات ؛ 25 ممB براون4657500OCT حقن   في عينة الرئة
إبرة & أوسلاش ؛ 0.9 مم & مرات ؛ 70 ممBBraun 4665791إبرة طويلة لتطبيق PBS تحت
مركبOCT Sakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. مركب
الفوسفات المخزن الملحيBio& بيعBS.L1825PBS بدون Ca2 + ، Mg2 + ، 500 مل
QI امتداد التصوير المتقدمBrukerملحق برنامج Bruker لبرنامج JPK SPM الذي يوفر لكل بكسل صورة مسجلة منحنى القوة الأساسي بالكامل.
مشرطبي براون5518083مشرط جراحي يمكن التخلص منه
Kaut-BullingerM681700مقص دقيق 13 سم  
شريط من جانبtesa Film57330-00000شريط شفاف كريستالي ، 33 م × 19 مم
صندوق منزلقGWL أنظمة تخزينK50WSlidebox ل 50 شريحة
مجهر ستيريو - Stemi DR1663ملاقط Zeiss
- Vomm SS-SA-ESDEleshopELE002121
قالب ثابت شرائح مجهر - شرائح مجهر AFM حل مقص واحد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsteens, D., et al. Atomic force microscopy-based characterization and design of biointerfaces. Nat Rev Mater. 2 (5), 17008(2017).
  2. Aro, E., et al. Severe extracellular matrix abnormalities and chondrodysplasia in mice lacking collagen prolyl 4-hydroxylase isoenzyme II in combination with a reduced amount of isoenzyme I. J Biol Chem. 290 (27), 16964-16978 (2015).
  3. Domke, J., Radmacher, M. Measuring the elastic properties of thin polymer films with the atomic force microscope. Langmuir. 14 (12), 3320-3325 (1998).
  4. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), e0220281(2019).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: validation with a gel-microfiber composite. Biophys J. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  7. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nanotechnol. 7 (11), 757-765 (2012).
  8. Prein, C., et al. Structural and mechanical properties of the proliferative zone of the developing murine growth plate cartilage assessed by atomic force microscopy. Matrix Biol. 50, 1-15 (2016).
  9. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophys J. 70 (1), 556-567 (1996).
  10. Radmacher, M., Tillamnn, R. W., Fritz, M., Gaub, H. E. From molecules to cells: imaging soft samples with the atomic force microscope. Science. 257 (5078), 1900-1905 (1992).
  11. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nat Nanotechnol. 4, 186-192 (2009).
  12. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophys J. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  13. Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  14. Hansma, P. K., et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquids. Appl Phys Lett. 64 (13), 1738-1740 (1994).
  15. Moy, V. T., Florin, E. L., Gaub, H. E. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors. Science. 266 (5183), 257-259 (1994).
  16. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, H. G., Hansma, P. K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. Science. 265 (5178), 1577-1579 (1994).
  17. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, P. K. Imaging soft samples with the atomic force microscope: gelatin in water and propanol. Biophys J. 69 (1), 264-270 (1995).
  18. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat Struct Biol. 6 (4), 346-349 (1999).
  19. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  20. Drake, B., et al. Imaging crystals, polymers, and processes in water with the atomic force microscope. Science. 243 (4898), 1586-1589 (1989).
  21. Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. Mechanical stability of single DNA molecules. Biophys J. 78 (4), 1997-2007 (2000).
  22. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophys J. 78 (1), 520-535 (2000).
  23. Lekka, M., et al. Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy. Eur Biophys J. 28 (4), 312-316 (1999).
  24. Weisenhorn, A. L., Khorsandi, M., Kasas, S., Gotzos, V., Butt, H. J. Deformation and height anomaly of soft surfaces studied with an AFM. Nanotechnology. 4 (2), 106(1993).
  25. Rotsch, C., Jacobson, K., Radmacher, M. Dimensional and mechanical dynamics of active and stable edges in motile fibroblasts investigated by using atomic force microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (3), 921-926 (1999).
  26. Goldmann, W. H., Ezzell, R. M. Viscoelasticity in wild-type and vinculin-deficient (5.51) mouse F9 embryonic carcinoma cells examined by atomic force microscopy and rheology. Exp Cell Res. 226 (1), 234-237 (1996).
  27. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomater. 126, 315-325 (2021).
  28. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthr Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  29. Kinney, J. H., Balooch, M., Marshall, S. J., Marshall, G. W. Jr, Weihs, T. P. Atomic force microscope measurements of the hardness and elasticity of peritubular and intertubular human dentin. J Biomech Eng. 118 (1), 133-135 (1996).
  30. Symposium on Thin Films - Stresses and Mechanical Properties VI,. 1996 MRS Spring Meeting. Lundkvist, A., et al. , 353-358 (1997).
  31. Tao, N. J., Lindsay, S. M., Lees, S. Measuring the microelastic properties of biological material. Biophys J. 63 (4), 1165-1169 (1992).
  32. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Eng Med Biol Mag. 16 (2), 47-57 (1997).
  33. Becke, T. D., et al. Pilus-1 backbone protein RrgB of Streptococcus pneumoniae binds collagen I in a force-dependent way. ACS Nano. 13 (6), 7155-7165 (2019).
  34. Becke, T. D., et al. Single molecule force spectroscopy reveals two-domain binding mode of Pilus-1 tip protein RrgA of Streptococcus pneumoniae to fibronectin. ACS Nano. 12 (1), 549-558 (2018).
  35. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical activation drastically accelerates amide bond hydrolysis, matching enzyme activity. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  36. Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Single-molecule force-clamp experiments reveal kinetics of mechanically activated silyl ester hydrolysis. ACS Nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).
  37. Docheva, D., et al. Researching into the cellular shape, volume and elasticity of mesenchymal stem cells, osteoblasts and osteosarcoma cells by atomic force microscopy. J Cell Mol Med. 12 (2), 537-552 (2008).
  38. Docheva, D., Padula, D., Schieker, M., Clausen-Schaumann, H. Effect of collagen I and fibronectin on the adhesion, elasticity and cytoskeletal organization of prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 361-366 (2010).
  39. Kiderlen, S., et al. Age related changes in cell stiffness of tendon stem/progenitor cells and a rejuvenating effect of ROCK-inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 509 (3), 839-844 (2019).
  40. Reuten, R., et al. Structural decoding of netrin-4 reveals a regulatory function towards mature basement membranes. Nat Commun. 7, 13515(2016).
  41. Fleischhauer, L., et al. Nano-scale mechanical properties of the articular cartilage zones in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Appl Sci. 12 (5), 2596(2022).
  42. Alberton, P., et al. Aggrecan hypomorphism compromises articular cartilage biomechanical properties and is associated with increased incidence of spontaneous osteoarthritis. Int J Mol Sci. 20 (5), 1-16 (2019).
  43. Alberton, P., et al. Aggrecan is critical in maintaining the cartilage matrix biomechanics which in turn influences the correct development of the growth plate. Osteoarthr Cartilage. 27, S178-S178 (2019).
  44. Gronau, T., et al. Forced exercise-induced osteoarthritis is attenuated in mice lacking the small leucine-rich proteoglycan decorin. Ann Rheum Dis. 76 (2), 442-449 (2017).
  45. Hartmann, B., et al. Early detection of cartilage degeneration: A comparison of histology, fiber Bragg grating-based micro-indentation, and atomic force microscopy-based nano-indentation. Int J Mol Sci. 21 (19), 7384-7398 (2020).
  46. Rellmann, Y., et al. ER stress in ERp57 knockout knee joint chondrocytes induces osteoarthritic cartilage degradation and osteophyte formation. Int J Mol Sci. 23 (1), 182(2021).
  47. Kamper, M., et al. Early changes in morphology, bone mineral density and matrix composition of vertebrae lead to disc degeneration in aged collagen IX -/- mice. Matrix Biol. 49, 132-143 (2016).
  48. Akhtar, R., Sherratt, M. J., Cruickshank, J. K., Derby, B. Characterizing the elastic properties of tissues. Mater Today. 14 (3), 96-105 (2011).
  49. Junior, C., et al. Baseline stiffness modulates the non-linear response to stretch of the extracellular matrix in pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12928(2021).
  50. Junior, C., et al. Multi-step extracellular matrix remodelling and stiffening in the development of idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 24 (2), 1708(2023).
  51. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. J Mech Behav Biomed Mater. 74, 118-127 (2017).
  52. Zemla, J., et al. AFM-based nanomechanical characterization of bronchoscopic samples in asthma patients. J Mol Recognit. 31 (12), e2752(2018).
  53. Reuten, R., et al. Basement membrane stiffness determines metastases formation. Nat Mater. 20 (6), 892-903 (2021).
  54. Johnstone, A. H. CRC Handbook of Chemistry and Physics. J Chem Technol Biotechnol. 50 (2), 294-295 (1991).
  55. Rico, F., et al. Probing mechanical properties of living cells by atomic force microscopy with blunted pyramidal cantilever tips. Phys Rev E. 72 (2), 1-10 (2005).
  56. CANTER Processing Toolbox v.5.7.0. , GitHub. (2022).
  57. Hutter, J. L. J. B. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64 (7), 1868-1873 (1993).
  58. Schillers, H., et al. Standardized nanomechanical atomic force microscopy procedure (SNAP) for measuring soft and biological samples. Sci Rep. 7 (1), 5117(2017).
  59. Hartmann, B., et al. Profiling native pulmonary basement membrane stiffness using atomic force microscopy. Nat Protoc. 19 (5), 1498-1528 (2024).
  60. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys J. 82 (5), 2798-2810 (2002).
  61. Jolicoeur, P. Introduction to Biometry. , Springer US. Boston, MA. (1999).
  62. Bronshtein, I. N., Semendyayev, K. A., Musiol, G., Mühlig, H. Handbook of Mathematics. , 6th Edition, Springer. Berlin. (2015).
  63. Fiore, V. F., et al. Mechanics of a multilayer epithelium instruct tumour architecture and function. Nature. 585 (7825), 433-439 (2020).
  64. Koester, J., et al. Niche stiffening compromises hair follicle stem cell potential during ageing by reducing bivalent promoter accessibility. Nat Cell Biol. 23 (7), 771-781 (2021).
  65. Bedzhov, I., Zernicka-Goetz, M. Self-organizing properties of mouse pluripotent cells initiate morphogenesis upon implantation. Cell. 156 (5), 1032-1044 (2014).
  66. Kyprianou, C., et al. Basement membrane remodelling regulates mouse embryogenesis. Nature. 582 (7811), 253-258 (2020).
  67. Saraswathibhatla, A., Indana, D., Chaudhuri, O. Cell-extracellular matrix mechanotransduction in 3D. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 495-516 (2023).
  68. Sherwood, D. R. Basement membrane remodeling guides cell migration and cell morphogenesis during development. Curr Opin Cell Biol. 72, 19-27 (2021).
  69. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11 (5), 288(1986).
  70. Marago, O. M., Jones, P. H., Gucciardi, P. G., Volpe, G., Ferrari, A. C. Optical trapping and manipulation of nanostructures. Nat Nanotechnol. 8 (11), 807-819 (2013).
  71. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  72. Marchi, G., et al. Microindentation sensor system based on an optical fiber Bragg grating for the mechanical characterization of articular cartilage by stress-relaxation. Sens Actuators B. 252, 440-449 (2017).
  73. Wakitani, S., et al. Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collagen gel. Tissue Eng. 4 (4), 429-444 (1998).
  74. Moutos, F. T., Freed, L. E., Guilak, F. A biomimetic three-dimensional woven composite scaffold for functional tissue engineering of cartilage. Nat Mater. 6 (2), 162-167 (2007).
  75. Schwarz, S., et al. Contactless vibrational analysis of transparent hydrogel structures using laser-Doppler vibrometry. Exp Mech. 60 (8), 1067-1078 (2020).
  76. Bhave, G., Colon, S., Ferrell, N. The sulfilimine cross-link of collagen IV contributes to kidney tubular basement membrane stiffness. Am J Physiol Renal Physiol. 313 (3), F596-F602 (2017).
  77. Fisher, R. F., Wakely, J. The elastic constants and ultrastructural organization of a basement membrane (lens capsule). Proc R Soc Lond B Biol Sci. 193 (1113), 335-358 (1976).
  78. Wisdom, K. M., et al. Covalent cross-linking of basement membrane-like matrices physically restricts invasive protrusions in breast cancer cells. Matrix Biol. 85-86, 94-111 (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CANTER

مقالات ذات صلة