Method Article

توليد الفيريات / العضيات ثلاثية الأبعاد من مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد باستخدام جهاز ختم جديد

DOI:

10.3791/67787

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Cell and Molecular Therapy NUCEL Group, School of Medicine, University of São Paulo, 2Biochemistry Department, Chemistry Institute, University of São Paulo, 3Department of Polymers, Faculty of Technology of the State of São Paulo – Zona Leste (FATEC ZL), 4Technical Division for Teaching, Research and Innovation Support - DTAPEPI Biotechnology and Innovation Facility, School of Medicine, University of São Paulo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة منهجية فعالة من حيث التكلفة وفعالة لتوليد هياكل الخلايا ثلاثية الأبعاد باستخدام نظام قائم على الطوابع لإنشاء الآبار الصغيرة في قوالب الاغاروز. يعزز النظام تكوين الكرات / العضيات الموحدة ، وبالتالي تحسين تفاعلات الخلية. يقلل هذا النهج من التباين التجريبي ويدعم التطبيقات في اختبار الأدوية وهندسة الأنسجة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) تمثيلا أكثر دقة للبيئة المكروية في الجسم الحي من الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) ، لأنها تعزز التفاعلات المحسنة بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية. هدفت هذه الدراسة إلى تطوير منهجية فعالة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار لتوليد هياكل خلوية ثلاثية الأبعاد (كرويات / عضيات) باستخدام نظام مبتكر قائم على الطوابع لإنشاء آبار صغيرة في قوالب الاغاروز. تم استخدام طابع جديد لإنتاج 663 بئر صغير لكل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار ، مما يوفر بيئة مثالية لتجميع الخلايا. تم زرع خلايا جزر البنكرياس الخنازير الأولية في هذه الآبار الصغيرة ، حيث تجمعت لتشكيل كرويات / عضويات. تم تحضين المزارع عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، وتم استبدال الوسط كل 3 أيام. تمت مراقبة التكوين الكروي بشكل دوري ، وتم جمع العينات للتوصيف. نجحت الطريقة في إنشاء كفيريات موحدة وعالية الجودة ، مما يقلل من التباين التجريبي ، ويقلل من التلاعب ، ويعزز تفاعلات الخلايا. يوفر استخدام قوالب الأنماط الدقيقة القائمة على الاغاروز بيئة مبسطة وخاضعة للرقابة للثقافات ثلاثية الأبعاد ، مما يوفر حلا موحدا وفعالا من حيث التكلفة. تدعم هذه المنهجية تطبيقات اختبار الأدوية وهندسة الأنسجة ، وتوفر منصة عملية وقابلة للتطوير لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد التي يمكن تنفيذها بسهولة في إعدادات المختبرات المختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدار الخمسين عاما الماضية ، أظهرت العديد من تحقيقات بيولوجيا الخلية أن الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) تفشل في تكرار الظروف في الجسم الحي التي لوحظت بدقة في النماذجالحيوانية 1. من الناحية الهيكلية ، لا تسمح مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد للخلايا بالتنظيم ثلاثي الأبعاد وتكرار الوضع الذي لوحظ في أنظمة in vivo . علاوة على ذلك ، يتم تغيير مسارات الإشارات الخلوية في الثقافات ثنائية الأبعاد مقارنة بالثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) ، والتي يمكن أن تفسر على الأرجح سبب تباين أنواع معينة من فحص الأدوية باستخدام الثقافات ثنائية الأبعاد2. ظهر تقدم كبير في تقنيات زراعة الخلايا مع إدخال أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد. تختلف أنظمة 3D اختلافا كبيرا في التعقيد اعتمادا على التركيب الخلوي والهندسة الخلوية. بشكل عام ، يتم إنشاء نوعين من الهياكل ، وهما: الكرويات والعضيات. توصف الكرات الكروية بأنها مجموعات بسيطة من الخلايا التي يتم الحصول عليها من الأنسجة الطبيعية أو السرطانية والأجسام الجنينية وخطوط الخلايا. يتأثر تكوين الهياكل ثلاثية الأبعاد بعوامل مختلفة ، بما في ذلك تفاعلات الخلية والخلية ومسارات الإشارات بوساطة مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتي توفر الدعم الهيكلي والإشارات الكيميائية الحيوية. تنظم هذه العناصر التفاعلات التي تساهم في تنظيم الأنسجة ووظيفتها3. تم وصف نظام الثقافة الكروية لأول مرة في أوائل السبعينيات ، باستخدام خطوط خلايا رئة الهامستر الصينية V79 كنموذج للسرطان العقدي ، الذي ينمو في ظل ظروف غير ملتصقة ويشكل مجالات مثالية4. توصف العضيات بأنها مجموعات من أنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء المشتقة من الخلايا الجذعية أو السلفية ، والتي تنظم ذاتيا من خلال العمليات ، مثل فرز الخلايا ومواصفات النسب ، بطريقة محدودة مكانيا ، مما يعكس التطور في الجسم الحي 5.

تتوفر العديد من الطرق والمواد المتاحة لخلايا الزراعة في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد. الطرق الرئيسية المستخدمة حاليا لتوليد ثقافات ثلاثية الأبعاد هي: 1) قطرات معلقة. 2) ثقافة الخلايا الدوارة والبلاستيك منخفض التعلق ؛ 3) صفائح هرمية تحتوي على آبار مخروطية ؛ 4) السقالات الكبيرة التي يسهل اختراقها. 5) الخرز المغناطيسي. و 6) الهلاميات المائية الخالية من السقالات.

القطرات المعلقة هي الطريقة المستخدمة للحصول على ثقافات ثلاثية الأبعاد خالية من السقالات. تقدم هذه الطريقة قيودا معينة ، بما في ذلك الحاجة إلى معالجة واسعة النطاق ، وكفاءة إنتاج منخفضة ، وهندسة كروية ، والتعرض لقوى قص عالية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون الإجراءات المحددة ، مثل الاستبدال المتوسط أو الإضافة المركبة ، صعبة وقد تؤدي إلى فقدان المواد. علاوة على ذلك ، تشير تقارير الأدبيات إلى أن بعض خطوط الخلايا تفشل في إنتاج كرويات معبأة بإحكام عند استخدام هذا النهج6.

تستخدم زراعة الخلايا الدوارة والبلاستيك منخفض الارتباط لمنع الخلايا من الالتصاق بالركيزة ، مما يؤدي إلى تجمعها وتشكيل كرويات. تتطلب هذه العملية قوارير محددة و / أو تحريض / دوران. على الرغم من أن هذا هو أحد أكثر الأساليب مباشرة لإنتاج الكرويات أو العضيات على نطاق واسع ، إلا أنه لا يخلو من عيوب ، مثل الحاجة إلى معدات معينة ، وطول عمر الثقافة المنخفض ، واختلاف الحجم في الكرويات ، والأضرار الميكانيكية للخلايا ، والكفاءة المنخفضة6.

الصفائح الهرمية التي تحتوي على آبار مخروطية هي صفائح متوفرة تجاريا تؤثر على التكاليف ، بالإضافة إلى حقيقة أن بعض التلاعبات قد تعيق تكوين الكرويات / العضيات7.

تستخدم السقالات الكبيرة التي يسهل اختراقها أيضا للثقافة ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك ، تكمن العقبة الرئيسية في تحقيق تلقيح الخلايا الفعال والتوزيع المنتظم. تنشأ هذه المشكلة لأن أحجام المسام قد تكون إما صغيرة جدا لاختراق الخلايا أو كبيرة جدا للاحتفاظ بالخلايا بشكل آمن. لمعالجة هذه المشكلة ، تم استكشاف العديد من الاستراتيجيات8 ، والتي تؤثر بشكل مباشر على تعقيد هذه التقنية وتكلفتها.

تولد منهجية الخرز المغناطيسي عددا صغيرا من الكرويات / العضيات ، ولها تكلفة عالية ، وقد تترك بقايا الجسيمات النانوية داخل الخلايا9.

من بين أنظمة زراعة الأجسام الكروية ، تتوفر هيدروجيل الاغاروز غير اللاصق ، والذي يمثل هيدروجيل خال من السقالات. يوفر هذا النهج فوائد ملحوظة ، مثل التحكم الدقيق في حجم الهياكل ثلاثية الأبعاد والقدرة على توليد عدد كبير من هذه الهياكل لكل لوحة. في هذه الطريقة ، يتم إدخال الخلايا في هيدروجيل مع آبار مسبقة التشكيل ، حيث تغرق وتتجمع ذاتيا في كرويات ثلاثية الأبعاد10.

في هذه الدراسة ، نقدم جهازا ومنهجية لتوليد آبار الاغاروز الصغيرة باستخدام قالب micropattern بطريقة بسيطة وفعالة وقابلة للتكرار ومنخفضة التكلفة.

يهدف استخدام هذا الطابع كقالب لتوليد الآبار الصغيرة في agarose ، بمساعدة الجاذبية ، إلى تعزيز تفاعل الخلايا داخل الميكروWell والتنظيم الخلوي ، وتوليد هياكل ثلاثية الأبعاد (كرويات / عضويات) في المختبر بطريقة بسيطة وفعالة وقابلة للتكرار ومنخفضة التكلفة ، وبالتالي توفير وقت البحث والموارد المختبرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري التابعة لمؤسستنا CEUA-FMUSP: 1699/2021 ، المعتمدة في 8 سبتمبر 2021 - "عزل وتغليف جزر البنكرياس الخنازيرية" وهو جزء من المشروع المواضيعي لمجموعة العلاج الخلوي والجزيئي NUCEL (www.usp.br/nucel) ، منحة FAPESP رقم 2016 / 05311-2 ، بعنوان: "الطب التجديدي الذي يهدف إلى علاج الأمراض التنكسية المزمنة (السرطان والسكري)".

1. تصنيع جهاز الطوابع

ملاحظة: هذا الطابع مصنوع خصيصا من قبل مجموعة NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). تم تطوير جهاز الطوابع باستخدام البرنامج المشار إليه ، المعترف به على نطاق واسع بدقته وقدرات النمذجة ثلاثية الأبعاد المتقدمة.

  1. تأكد من أن النماذج الأولية المصممة تحتوي على 663 ميكرو دبوس مرتبة لتمكين توليد عدد مكافئ من الثقافات ثلاثية الأبعاد ، مثل الكرويات أو العضيات. لضمان ثبات الختم على أسطح درج T6 ، ضع خمس نقاط دعم بشكل استراتيجي على طول محيط الجهاز.
  2. تأكد من أن الميكروبينات ذات تصميم مخروطي بأبعاد قابلة للتعديل ، يتراوح طولها من 1 إلى 3 مم. يتراوح قطر قاعدة المخروط بين 0.7 و 1.5 مم ، بينما تتراوح زاوية الاستدقاق من 5 درجات إلى 10 درجات.
  3. تأكد من أن هيكل "التوقف" للجهاز ، الذي يحدد عمق الميكروبينات ، له طول قابل للتعديل من 10 إلى 19 مم وقطره من 20 إلى 40 مم ، مع توزيع الميكروبوسات بشكل موحد عبر سطحه.
  4. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتصميم الجهاز بحيث يكون له مقبض مريح ، مناسب للتشغيل بيد واحدة ، لتعزيز التطبيق العملي والدقة أثناء الاستخدام.
    ملاحظة: لتسهيل إنتاج الجهاز على نطاق واسع ، يتم توفير الملف الرقمي بتنسيق .stl ، وهو ضروري لعملية الطباعة ثلاثية الأبعاد.
  5. ما عليك سوى تقطيعه باستخدام البرنامج المناسب وطباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد متوافقة. استخدم أبعاد الطباعة التالية: X - 68 مم ؛ Y - 120 مم ؛ Z - 150 مم ، مما يضمن توازنا مثاليا بين الوظائف والجودة الهيكلية.
  6. لتصنيع الجهاز ، استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد قابلة للمعالجة الضوئية ، وهي متوافقة مع راتنج البوليمر القابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية والذي يجب أن يكون له دقة عالية وتشطيب سطح موحد ، وهي خصائص أساسية لأداء الجهاز الأمثل.
  7. قم بتقطيع النموذج الرقمي للطباعة باستخدام برنامج متوافق مع الطابعة ثلاثية الأبعاد المحددة.

2. تحضير آبار الاغاروز الصغيرة

  1. تحضير محلول الاغاروز.
    1. قم بوزن مسحوق الاغاروز النقي وقم بإذابه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1-2٪ (وزن / حجم).
    2. سخني المحلول في الميكروويف أو الحمام المائي حتى يذوب تماما ، مع التأكد من أنه متجانس وشفاف.
      ملاحظة: تجنب ارتفاع درجة الحرارة أو إعادة التسخين المفرط ، لأن ذلك قد يؤدي إلى تدهور الاغاروز. لا تقم بإعداد كميات كبيرة من محلول المخزون.
    3. اترك المحلول يبرد إلى ~ 40 درجة مئوية ، وهي درجة الحرارة المثالية لسحب العينات.
  2. تحضير الختم المخصص.
    1. اغسل الختم بإسفنجة ذات شعيرات ناعمة وماء مقطر لإزالة البقايا.
    2. قم بتعريض الختم الذي تم تنظيفه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5-10 دقائق لضمان العقم.
  3. تشكيل الآبار الصغيرة.
    1. صب / ماصة ~ 3 مل من محلول الاغاروز 40 درجة مئوية في كل بئر من صفيحة 6 آبار ، مما يضمن عمقا موحدا يبلغ 2-3 مم.
    2. ضع الختم المصنوع خصيصا في وسط البئر بينما لا يزال الاغاروز دافئا.
      ملاحظة: يحتوي الطابع على دعامات جانبية تضمن المحاذاة والثبات ، مما يلغي الحاجة إلى الدعم اليدوي. يخلق كل طابع ~ 663 بئر صغير (~ 2 مم في الارتفاع) لكل بئر. تأكد من عدم وجود فقاعات على الميكروبينات ؛ إذا تشكلت الفقاعات ، حرك الختم برفق للقضاء عليها.
    3. اترك الاغاروز يتجمد لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريك اللوحة.
      ملاحظة: لا تزعج الاغاروز أثناء التصلب لتجنب الاختلافات في هيكل الميكروويل.
    4. قم بإزالة الختم بحركات لطيفة ذهابا وإيابا لتحرير المكنسة الكهربائية دون إتلاف الآبار الصغيرة.
      ملاحظة: تسهل هذه الحركة دخول الهواء ، مما يسمح بإزالة الختم بسلاسة دون تشويه الجل. يجب أن تظل الآبار الصغيرة سليمة.
    5. اغسل الآبار الصغيرة 3x بمحلول PBS لإزالة البقايا.
    6. قم بتعريض اللوحة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق للقضاء على التلوث الميكروبي.
    7. أضف 3 مل من وسط الاستزراع واحتضان اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: تتحقق هذه الحضانة من عدم وجود تلوث قبل تلقيح الخلايا.

3. بذر الخلايا في الآبار الصغيرة

  1. تحضير تعليق الخلية.
    1. اجمع الخلايا عن طريق التربسين أو طريقة تفكك أخرى للحصول على تعليق متجانس.
    2. عد الخلايا واضبط التركيز وفقا للرقم المطلوب لكل ميكروبئر.
      ملاحظة: لزرع 5,000 خلية لكل بئر صغير في 663 بئر صغير ، قم بإعداد معلق يحتوي على ما لا يقل عن 3.315 × 106 خلايا إجمالية. تحسين تركيز الخلية لمنع النخر المركزي ولضمان انتشار المغذيات والأكسجين الكافي.
  2. بذر الخلايا.
    1. الماصة ~ 3 مل من تعليق الخلية المحضرة فوق الآبار الصغيرة ، مما يضمن التوزيع المتساوي عن طريق تدوير اللوحة برفق.
    2. اسمح للخلايا بالاستقرار بالجاذبية (~ 10-15 دقيقة) أو إجراء طرد مركزي لطيف عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن استخدام الطرد المركزي لضمان تركيز الخلايا في الآبار الصغيرة.
    3. انقل اللوحة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية مع جو رطب.

4. صيانة مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد

  1. استبدل وسط الاستزراع.
    1. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام ، وإزالة 50٪ من الوسط القديم وإضافة وسط جديد.
      ملاحظة: تأكد من بقاء الآبار الصغيرة مغمورة طوال فترة الاستزراع لمنع الجفاف.
  2. مراقبة تشكيل الثقافات ثلاثية الأبعاد.
    1. استمر في الاستزراع حتى يتم تشكيل الهياكل ثلاثية الأبعاد بالكامل وضغطها (على سبيل المثال ، 2-3 أيام لثقافات جزر البنكرياس الأولية).
      ملاحظة: بالنسبة للثقافات التي تتطلب وقتا أطول للتكوين ، قم بإجراء تغييرات جزئية في الوسط كل 2-3 أيام.

5. جمع وتوصيف الهياكل ثلاثية الأبعاد

  1. اجمع الكرويات / العضيات.
    1. قم بإزالة الوسيط القديم وجمع الهياكل ثلاثية الأبعاد عبر سحب العينات القوية باستخدام طرف ماصة عريض القطر أو مقطوع لمنع الضغط أو التفكيك.
      ملاحظة: يجب التحكم في سحب العينات القوي لإخراج الركام دون تشويهها.
  2. استعد للتحليل.
    1. استخدم الكرويات / العضيات التي تم جمعها على الفور أو قم بإصلاحها لتحليلها في المستقبل.
      ملاحظة: يعتمد ارتباط الكرويات واستقرارها على نوع الخلية ووقت التكوين وظروف الزراعة. توخي الحذر ضروري لتجنب الانفصال.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اشتقت زراعة الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة من جزر البنكرياس الخنازيرية. كان مستحضر الجزيرة المستخدم في هذه الدراسة يحتوي على نقاء 80 ± 5٪ بناء على تلطيخ ديثيزون ، و >80٪ من صلاحية خلايا الجزيرة بناء على الكشف عن ثنائي أسيتات الفلوريسين في الخلايا الحية أو يوديد البروبيديوم في الخلايا الميتة (طريقة الفلورسنت الحية / الميتة). تأكد من أن مستحضر جزيرة البنكرياس الخنازير نقي بنسبة 80٪ على الأقل (على سبيل المثال ، عن طريق تلطيخ الديثيزون) و >80٪ قابل للتطبيق. عند العزل ، حافظ على الثقافات الملتصقة في وسط CMRL 1066 ، مع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من وجود العديد من بروتوكولات الثقافة ثلاثية الأبعاد في الأدبيات ، إلا أن دراسة أجراها Wassmer et al.13 اختبرت العديد من المنهجيات لتوليد هياكل ثلاثية الأبعاد باستخدام جزر البنكرياس. لاحظ المؤلفون أن الجزر الكروية الأصلية والكرويات المجمعة ذاتيا أظهرت تباينا كبيرا فيما يتعلق بالحجم والشكل وكانت أكبر من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام طرق أخرى. بناء على النتائج التي توصلوا إليها ، خلصوا إلى أنه يمكن إنشاء الكرات باستخدام تقنيات مختلفة ، لكل منها مزاياها ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون بشكل خاص للمساعدة الفنية الممتازة التي قدمتها Zizi de Mendonça (كلية الطب، جامعة ساو باولو، البرازيل). تم دعم هذا العمل من خلال منح من وكالات البحث البرازيلية التالية: BNDES 09.2.1066.1 ، CAPES (رقم عملية PVE 88881.068070 / 2014-01) ، CNPq (أرقام المنح 457601/2013-2 ، 401430/2013-8 ، ورقم INCT-Regenera 465656/2014-5) ، FAPESP (رقم المشروع المواضيعي 2016/05311-2) ، FINEP 01.08.06.05 ووزارتي العلوم والتكنولوجيا (MCTI) والصحة (MS-DECIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
31L ميكروويفالكترولوكس78965840 6699 9المعدات المستخدمة لتسخين محلول الاغاروز ، مما يسهل ذوبانه وضمان مزيد من التجانس. يسمح للمحلول بالوصول إلى الحالة السائلة المثالية لتكوين الآبار.
طابعة ثلاثيةالقابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية
- طابعة ثلاثية الأبعاد Creality Halot OneCrealityN / Aتستخدم لطباعة جهاز الطوابع
AgaroseUNISCIENCEUNI-R10111لتشكيل الجل ، قم بإذابة 1 إلى 2٪ في محلول الفوسفات الملحي (PBS) أو الوسط المناسب.
Autodesk Fusion 3603D Modeling
BB15 CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher51023121المعدات المستخدمة لاحتضان الخلايا المستزرعة في بيئة مناسبة وخاضعة للرقابة.
ChituboxChituboxN / Aبرنامج يستخدم لتقطيع الجزء لطباعة
خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانيةGrupo VECON / Aيضمن بيئة معقمة لأداء زراعة الخلايا ضمن المعلمات والبروتوكولات المحددة.
وسط الاستزراعUSBiological/Life SciencesC5900-03Aيحتوي على إضافات لزراعة الخلايا بشكل صحيح.
لوحات الاستزراع (P6)SARSTEDT1023221تستخدم لتشكيل الاغاروز وزراعة الخلايا.
قارورة إرلينماير (25 مل)Laborglas91 216 14حاوية تستخدم لإذابة 1 &ndash ؛ 2٪ agarose في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو أي وسيط مناسب آخر ، يتم تسخينه عادة في الميكروويف.
فالكون 15 مل البوليسترين أنبوب الطرد المركزيCorning352099يستخدم لإبقاء الخلايا في حالة تعليق وإجراء التخفيفات المحتملة.
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Vitrocell Embriolife005/19مادة مضافة لوسط الاستزراع.
محلول PBS (محلول ملحي للفوسفات)مختبر غيرمخفف 1x بماء MiliQ فائق النقاء. تستخدم لإذابة الاغاروز من 1 إلى 2٪ ولغسل الآبار المنتجة بالفعل.
زجاجة كاشف بغطاء أزرق - SchottLaborglas21801545تستخدم لإعداد وتخزين وسط الثقافة.
جهاز الطوابعNUCEL GroupN / ALink- يوفر هذا الرابط الوصول إلى ملف .stl الخاص بجهاز الطوابع. ما عليك سوى تقطيعه باستخدام البرنامج المناسب وطباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد متوافقة. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK
EChKS3Qns0rOA?usp=مشاركة
قارورة الثقافة المعالجة مع مرشح 25 سم & sup2;يستخدم 430639الكورنينجلزراعة الخلايا الملتصقة وصيانتها.
التربسينميرك07-07-9002لتفكك الخلايا قبل البذر.
ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV)N / AN / Aيستخدم لتعقيم الختم والألواح.
الأبعاد من راتنج البوليمر - طابعة ثلاثية الأبعاد من راتنج البوليمر القابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lian, J., Yue, Y., Yu, W., Zhang, Y. Immunosenescence: a key player in cancer development. J Hematol Oncol. 13 (1), 151(2020).
  2. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  3. Dzobo, K., Dandara, C. The extracellular matrix: its composition, function, remodeling, and role in tumorigenesis. Biomimetics. 8 (2), 146(2023).
  4. Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. J Natl Cancer Inst. 46 (1), 113-120 (1971).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  6. Bialkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Milowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  7. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. J Vis Exp. (81), e50665(2013).
  8. Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3D Cell culture in alginate hydrogels. Microarrays (Basel). 4 (2), 133-161 (2015).
  9. Hou, S., et al. Advanced development of primary pancreatic organoid tumor models for high-throughput phenotypic drug screening. SLAS Discov. 23 (6), 574-584 (2018).
  10. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  11. Maria-Engler, S. S., et al. Co-localization of nestin and insulin and expression of islet cell markers in long-term human pancreatic nestin-positive cell cultures. J Endocrinol. 183 (3), 455-467 (2004).
  12. Mantovani, M. C., et al. Immobilization of primary cultures of insulin-releasing human pancreatic cells. Islets. 1 (3), 224-231 (2009).
  13. Wassmer, C. H., et al. Engineering of primary pancreatic islet cell spheroids for three-dimensional culture or transplantation: a methodological comparative study. Cell Transplant. 29, 963689720937292(2020).
  14. Stuart, M. P., et al. Successful low-cost scaffold-free cartilage tissue engineering using human cartilage progenitor cell spheroids formed by micromolded nonadhesive hydrogel. Stem Cells Int. 2017, 7053465(2017).
  15. Charelli, L. E., Dernowsek, J. A., Balbino, T. A. Generation of tissue spheroids via a 3D printed stamp-like device. J Vis Exp. (188), e63814(2022).
  16. Micromold for the production of cellular spheroids and use. , Patent BR 10 2019 027360 7 A2 (2019).
  17. Riffle, S., Pandey, R. N., Albert, M., Hegde, R. S. Linking hypoxia, DNA damage and proliferation in multicellular tumor spheroids. BMC Cancer. 17, 338(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Cell CultureSpheroid FormationOrganoid GenerationAgarose MicrowellsStamp DevicePorcine Pancreatic IsletsCell AggregationDrug Testing PlatformTissue EngineeringCell Viability

Related Articles