تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مبسطا لمعالجة الأنسجة يتضمن قطع الرأس ، والتثبيت ، والقطع بالتبريد ، وتلوين التألق ، والتلوين المناعي ، والتصوير ، والذي يمكن تمديده إلى التصوير متحد البؤر والتصوير متعدد الفوتونات. تحافظ الطريقة على فعالية مماثلة للتشريح المعقد ، متجاوزة الحاجة إلى المهارات الحركية المتقدمة. يوفر التحليل الكمي للصور إمكانات استقصائية واسعة النطاق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التقطيع بالتبريد المباشر لرؤوس ذبابة الفاكهة لتعزيز تلطيخ مضان الدماغ والتلوين المناعي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد التلوين المناعي ذبابة الفاكهة السوداء أدمغة ضرورية لاستكشاف الآليات الكامنة وراء السلوكيات المعقدة والدوائر العصبية وأنماط التعبير عن البروتين. غالبا ما تنطوي الطرق التقليدية على تحديات مثل إجراء تشريح معقد ، والحفاظ على سلامة الأنسجة ، وتصور أنماط تعبير محددة أثناء التصوير عالي الدقة. نقدم بروتوكولا محسنا يجمع بين التقطيع بالتبريد والتلوين الفلوري والتلوين المناعي. تعمل هذه الطريقة على تحسين الحفاظ على الأنسجة ووضوح الإشارة وتقلل من الحاجة إلى تشريح شاق لتصوير ذبابة الفاكهة الدماغ. تستلزم الطريقة التشريح السريع ، والتثبيت الأمثل ، والحماية بالتبريد ، والاستئصال بالتبريد ، يليه تلطيخ الفلورسنت والتلوين المناعي. يقلل البروتوكول بشكل كبير من تلف الأنسجة ، ويعزز اختراق الأجسام المضادة ، وينتج صورا حادة ومحددة جيدا. نظهر فعالية هذا النهج من خلال تصور مجموعات عصبية محددة وبروتينات متشابكة بدقة عالية. تسمح هذه الطريقة متعددة الاستخدامات بتحليل علامات البروتين المختلفة في الدماغ البالغ عبر طائرات z متعددة ويمكن تكييفها مع الأنسجة والكائنات الحية النموذجية الأخرى. يوفر البروتوكول أداة موثوقة وفعالة للباحثين الذين يجرون الكيمياء المناعية عالية الجودة في دراسات ذبابة الفاكهة العصبية. يسهل التصور التفصيلي لهذه الطريقة التحليل الشامل للتشريح العصبي وعلم الأمراض وتوطين البروتين ، مما يجعلها ذات قيمة خاصة لأبحاث علم الأعصاب.
المقدمة
السلوكيات المعقدة التي تتراوح من التفاعلات الاجتماعية1 ، والإدراك الحسي والمعالجة2 ، والتعلم3 ، إلى الحركة4 مدفوعة بالدماغ. الاضطرابات العصبية شائعة بشكل متزايد ومن المتوقع أن تزداد بمرور الوقت5،6. من الأهمية بمكان دراسة كيفية عمل الدماغ في كل من الصحة والمرض. تشير العقيدة المركزية للبيولوجيا الجزيئية إلى أن واحدة من أهم وظائف الوحدات البيولوجية هي البروتينات7 ، ومقدار ومكان التعبير عنها أمران حاسمان لفهم كيفية عمل الدماغ.
ذبابة الفاكهة السوداء ، المعروفة باسم ذبابة الفاكهة ، هي نموذج ذو قيمة عالية لدراسة وظائف المخ في ظل الشيخوخة والظروف الفيزيولوجيةالمرضية 8. يتيح توفر الأدوات الجينية المتقدمة في ذبابة الفاكهة للباحثين استكشاف وظيفة أي بروتين9 تقريبا ، مع مكتبات وراثية شاملة لكل جين تقريبا يمكن الوصول إليه بسهولة10. إلى جانب عمرها القصير ومعدل التكاثر المرتفع ، فإن هذه الميزات تجعل ذبابة الفاكهة نموذجا استثنائيا لأبحاث الدماغ11. وقد أدى ذلك إلى إنجازات كبيرة ، بما في ذلك تطوير خريطة دماغية كاملة للذبابة12 ، بل وساهم في جائزة نوبل لتوضيح الآليات العصبية لإيقاعات الساعة البيولوجية والساعات الجزيئية13،14،15. نتيجة لذلك ، تظل ذبابة الفاكهة نظاما قويا ومتعدد الاستخدامات ، مما يدفع فهمنا لوظائف المخ إلى الأمام ويوفر رؤى غير مسبوقة في العمليات العصبية.
تعتبر الكيمياء المناعية والتألق المناعي من الأدوات الأساسية لدراسة تعبير البروتين في الموقع. على عكس تقنيات مثل Western Blot ، التي تسمح فقط بالتحليل شبه الكمي ويتم إجراؤها عادة في الأنسجةالسائبة 16 ، أو التقنيات المعقدة والمكلفة مثل قياس الطيف الكتلي لقياس مستوى البروتين17 ، فإن الكيمياء المناعية واضحة نسبيا وتسمح بالقياس الكمي للتعبير عن البروتين وقياس توطين البروتين داخل الأنسجة أو الخلية. الأهم من ذلك ، يمكن أيضا تعدد الكيمياء المناعية الفلورية لقياس بروتينات متعددة لتحديد أنواع وأنسجة معينة من الخلايا أو الإجابة على أسئلة متعددة في نفس الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسمح تثبيت الأنسجة بإجراء مقارنات عبر الظروف التجريبية المختلفة والأنماط الجينية والأعمار والنقاط الزمنية اليومية. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية صعبة ، ويمكن أن تؤثر العديد من العوامل على جودة الصورة. يهدف بروتوكول التقطيع بالتبريد والتلوين المناعي المحسن لأدمغة ذبابة الفاكهة إلى تعزيز التصوير عالي الدقة من خلال تحسين الحفاظ على الأنسجة واختراق الأجسام المضادة وتصور التجمعات العصبية وعلامات البروتين. تم تطويره لمواجهة التحديات في الطرق التقليدية ، مثل التشريح المعقد ، وتلف الأنسجة ، ودقة التصوير المحدودة المرتبطة بحوامل الدماغبالكامل 18. يجمع هذا البروتوكول بين التقطيع بالتبريد والتلوين الفلوري لضمان السلامة الهيكلية والتصوير الحاد عبر مستويات Z متعددة. بالمقارنة مع المستحضرات الكاملة ، تقلل هذه الطريقة من التشويه ، وتسهل انتشار الأجسام المضادة بشكل أعمق ، وتوفر تحليلات توضيحية للتوطين العصبي والبروتين18. يسمح تعدد استخداماته بالتكيف مع الأنسجة والكائنات الحية النموذجية الأخرى ، مما يوفر أداة موثوقة وفعالة لأبحاث علم الأعصاب19،20. يمكن تكييفه للنظر في أي بروتين تقريبا وتطبيقه لدراسة أي حالة أو مرض أو نموذج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد المعدات
- تأكد من تشغيل ناظم التبريد وضبطه على -20 درجة مئوية. قم بتشغيل جهاز تسخين الشرائح أو الحاضنة الصغيرة ، مما يضمن ضبطه على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن وضع الشرائح المصنفة على المدفأة أو الحاضنة وتركها إلى أجل غير مسمى حتى التقسيم.
2. إعداد الحلول
- تحضير 50 مل من محلول ملحي مخزن 1x فوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، من مخزون 10x PBS. تحضير محلول 4٪ بارافورمالدهيد في PBS بحجم نهائي 10 مل.
- تحضير محلول تنظيف 70٪ من الإيثانول في الماء في زجاجة رذاذ. تحضير محلول مانع (3٪ ألبومين مصل بقري (BSA) في محلول ملحي مخزن في تريس من مخزون 20 ضعفا). تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية (التخفيف يعتمد على التجربة). هنا ، يتم استخدام تخفيف 1: 250 من الجسم المضاد للفأر ApoE في 3٪ BSA في TBS.
- تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية (التخفيف يعتمد على التجربة). هنا ، يتم استخدام تخفيف 1: 500 من Alexa Flour 750 A21037 Goat Anti-Mouse Secondary في 3٪ BSA في TBS.
- تحضير محلول صبغة الفلورسنت (التخفيف يعتمد على التجربة). هنا ، يتم تحضير محلول 5 ميكروغرام / مل من النيل الأحمر في PBS.
ملاحظة: يجب تبريد جميع المحاليل ، وخاصة الفلورسنت ، وتخزينها في حاوية مبردة مظلمة. يجب أيضا إحضارها إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مباشرة.
3. جمع الأنسجة
- بعد الحصول على الذباب في قوارير الشيخوخة ، افتح الصمام الموجود على حصيرة ثاني أكسيد الكربون2 وقم بتفريغ الذباب على السجادة بسرعة لتجنب الهروب. انتظر حتى يصبح الذباب فاقدا للوعي في الغالب ، مما يتوقف عن معظم الحركة. يطير الموضع تحت مجهر SZ61 عن طريق تحريك السجادة أسفل العدسة الشيئية. اضبط التكبير والتركيز بحيث يكون الذباب مرئيا بوضوح ومريحا لقطع الرأس.
ملاحظة: الذباب المستخدم في هذا المثال هو ELAV/+ وELAV>ApoE4 - أدخل مقصا زنبركيا بين الصدر والرأس ، واضغط بقوة ، واقطع رأس 5 إلى 10 رؤوس ذبابة لكل مجموعة تجريبية. أعد الذباب غير المستخدم إلى قارورة الشيخوخة.
ملاحظة: في حالة وجود قلق بشأن اختراق المثبت ، يمكن إجراء شق صغير على الجزء الخلفي من الرأس للسماح بزيادة اختراق عامل التثبيت في الخطوة 4.1. - باستخدام فرشاة ، ضع الرؤوس برفق في أنابيب 1.5 مل على الجليد حتى يتم جمع مجموعات ELAV / + و ELAV>ApoE4.
4. تثبيت الأنسجة الكاملة
- قم بإزالة الأنابيب من الثلج والماصة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد في محلول PBS في كل أنبوب ، مما يضمن غمر جميع الرؤوس في المحلول. إذا كانت الرؤوس تلتصق بجدران الأنبوب وتتجنب ملامسة المحلول ، فاستخدم فرشاة لدفعها برفق لأسفل أو اضغط برفق على سطح أفقي لضمان الاتصال المناسب.
- ضعه على شاكر مداري باستخدام إعداد متوسط لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، تخلص من محلول Paraformaldehyde واستبدله ب 1x PBS لمدة 10 دقائق ، مع التأكد من غمر جميع الرؤوس في المحلول.
- تخلص من المحلول السابق في كل مرة ، اغسل المنديل باستخدام PBS 2x لمدة 10 دقائق لكل منهما ، ليصبح المجموع 3 غسلات.
- بعد الغسيل النهائي ، انقل الرؤوس إلى 10٪ سكروز في محلول PBS ، مع ضمان غمر الرؤوس داخل الأنبوب. اتركها طوال الليل للحصول على التشبع الأمثل.
ملاحظة: إذا كان التصوير في نفس اليوم مطلوبا ، فيمكن تقليل ضخ السكروز. ومع ذلك ، سيتم أيضا تقليل تأثيرات الحمالات البردية بشكل متناسب.
5. تحضير القالب
- املأ القالب الملصق بنسبة 50٪ تقريبا بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، مما يسمح له بالانتشار إلى جميع زوايا القالب الأربعة
- باستخدام فرشاة ، ضع الرؤوس بعناية على سطح OCT داخل القالب. عند وضع مجموعات تجريبية متعددة في نفس القالب ، تأكد من فصل هذه المجموعات داخل القالب لمنع الالتباس.
ملاحظة: من المهم منع تخفيف مركب OCT من خلال التلوث بمحلول السكروز السابق عبر الفرشاة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التنسيب العميق في OCT باستخدام الفرشاة إلى إنشاء العديد من الفقاعات حول الرؤوس. تجنب هذه الأخطاء لمنع مشكلات التقسيم لاحقا. - باستخدام طرف الملقط ، ادفع كل رأس ببطء إلى أسفل القالب مع توجيه العينين إلى الأسفل. يتم تحديد هذا الاتجاه لقطع المستوى الإكليلي.
- تجنب ثقب أو سحق الرؤوس في قاع القالب أثناء هذه العملية. قم بمحاذاة جميع الرؤوس في أبعاد X و Y و Z بحيث يحتوي كل قسم على جميع الموضوعات في وقت واحد. تأكد من الغمر البطيء لتقليل تكوين فقاعة الهواء.
- بمجرد محاذاة جميع الرؤوس بشكل صحيح ، ضع القوالب بعناية مباشرة في -20 درجة مئوية للتجميد.
ملاحظة: إذا لوحظ أن محاذاة الرؤوس متوقفة بشكل كبير أثناء التقسيم ، ففكر في استخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل للتجميد الأولي للقالب. - بمجرد تجميد القالب في الغالب ، املأ الباقي ب OCT واتركه يتجمد قبل تخزينه على المدى الطويل عند - 80 درجة مئوية.
6. التقطيع بالتبريد للقوالب
ملاحظة: ينصح عموما بإعداد قالب فارغ وقطعه قبل قطع قوالب المجموعة التجريبية. هذا يسمح بضمان الوظيفة المناسبة للعجلة والشفرة والزجاج المضاد للانزلاق مباشرة قبل تقسيم الأنسجة.
- قم بتوصيل لقمة الظرف بالقالب عن طريق وضع كمية وفيرة من OCT على القالب ووضع القطعة في الأعلى ، والضغط عليها بشكل مسطح. اترك هذا يتجمد تماما في ناظم البرد ، عادة في غضون 5 دقائق.
- حرر البتة وكتلة OCT من القالب وضعها في ظرف الظرف ، مع ضمان بقاء القالب موجها بشكل صحيح من أعلى إلى أسفل. شد مفتاح الظرف حتى يتم تأمين البت.
- قم بمحاذاة الكتلة مع الشفرة باستخدام مقابض الضبط وأدوات التحكم في عمق الظرف.
- اضبط عرض القسم على 20 ميكرومتر. قص كل شريحة باستخدام حركة بطيئة ولكن متسقة ، مما يسمح للزجاج المضاد للدحرجة بالتقاط كل شريحة. التقط الأقسام باستخدام الشرائح الدافئة عن طريق لمس الشريحة إلى الحافة الأقرب للقسم والسماح للقسم بالارتفاع إلى الشريحة. يمكن وضع ما يصل إلى ثمانية أقسام على شريحة بحجم قياسي (25 مم × 75 مم × 1 مم) عند التباعد بشكل مناسب.
ملاحظة: هناك مسألة اختيار يجب اتخاذها عند اختيار الأقسام التي يجب جمعها. نتيجة لاتجاه التضمين ، ستكون الأقسام السابقة من الأمام ، وستكون الأقسام اللاحقة من الأجزاء الخلفية من الرأس. على هذا النحو ، إذا كان الاهتمام يكمن في مجال معين أكثر من الآخر ، فيمكن تعديل اختيار القسم وفقا لذلك. بدلا من ذلك ، يمكن جمع جميع الأقسام على شرائح متعددة حتى لا يتبقى أي نسيج. - اترك الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل ولكن ليس أكثر من 1 ساعة.
7. تلطيخ و IHC
ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، ستقوم الطريقة بتفصيل IHC باستخدام جسم مضاد أولي غير مترافق. يجب استخدام الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم ، أو بقع التألق الأخرى التي يمكن إجراؤها في مرحلة واحدة ، مع الجسم المضاد الثانوي إذا كان سيتم استخدام كلاهما معا.
- مباشرة بعد فترة التجفيف ، قم بإزالة OCT على حواف الشريحة باستخدام شفرة حلاقة ، مما يترك مساحة لحدود كارهة للماء. ارسم حدا كارها للماء على كل شريحة باستخدام العلامة. اترك هذا يجف لمدة 5 دقائق.
- اغسل جميع الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام PBS عن طريق سحب العينة برفق أعلى الشريحة، وتجنب سحب العينة مباشرة فوق الأنسجة عندما يكون ذلك ممكنا.
ملاحظة: الماصة سعة 1000 ميكرولتر مفيدة للغاية هنا. يجب تغطية الشريحة ذات الحجم القياسي مع الأنسجة بالكامل ب 750 ميكرولتر من أي محلول. يمكن أيضا استخدام رفوف الشرائح والجراء. - بعد غسل الشرائح، قم بتعبئة الماصة 3٪ BSA في محلول منع TBS على الشرائح. اتركيه للاحتضانة لمدة 30 دقيقة.
- تخلص من محلول الانسداد وقم بسحب محلول الجسم المضاد الأساسي على الشرائح. في هذه الحالة ، تخفيف 1: 250 من SC-13521 ApoE في 3٪ BSA في TBS. اسمح للجسم المضاد بالحضانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدم مناديل مبللة أو مناشف ورقية لمنع المحلول من الجفاف طوال الليل.
- تخلص من الجسم المضاد الأساسي واستخدم الماصة ، واغسلها 3 مرات لمدة 5 دقائق مع كل منها باستخدام PBS.
- أضف محلول الجسم المضاد الثانوي. في هذه الحالة ، تخفيف 1: 500 من AF 750 Goat Anti-Mouse بالإضافة إلى تركيز 5 ميكروغرام / مل من Nile Red ، كل ذلك في 3٪ BSA في TBS. دع هذا يحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: نقوم في نفس الوقت باحتضان صبغة فلورية وجسم مضاد ثانوي في نفس المخزن المؤقت ، 3٪ BSA في TBS. يفضل هذا طالما لا توجد تعارضات معروفة بين الكاشفين. في حالة وجود تعارضات ، احتضن بشكل منفصل وقم بإجراء 3 غسلات إضافية بين الحضانات. - اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها. بعد الغسيل النهائي ، اترك كمية صغيرة من PBS على الشريحة.
8. التركيب والتحضير للتصوير
- باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر، أضف 3-5 قطرات من وسائط التثبيت الصلبة التي تحتوي على DAPI (0.9 ميكروغرام/مل)، بالتساوي عبر الشريحة لتجنب السقوط المباشر على الأنسجة.
- ضع الغطاء على الشريحة ، وتجنب أي تكوين فقاعة هواء.
ملاحظة: يمكن أن يساعد استخدام الملقط في ذلك عن طريق السماح للغطاء بالانزلاق بالقرب من سطح الشريحة قبل إطلاقه في النهاية. - تعامل مع الشرائح المثبتة حديثا بعناية واحفظها بشكل مسطح حتى تجف تماما. قم بإغلاق الشرائح باستخدام طلاء الأظافر إذا كان التخزين طويل الأمد متوقعا.
- التقط الصور في أسرع وقت ممكن لتجنب تسوس الفلورسنت.
9. الحصول على الصور
ملاحظة: لالتقاط الصور ، سيتم تفصيل استخدام برنامج Olympus Cell Sense Dimensions.
- قبل التصوير ، افحص الشرائح وامسحها باستخدام 70٪ من الإيثانول في محلول مائي. إذا تم تصوير الشرائح مباشرة بعد التركيب، فاحرص على توخي الحذر الشديد عند التنظيف لتجنب إزعاج الغطاء. اترك أسطح الشريحة والغطاء تجف لمدة 5 دقائق قبل التصوير.
- حدد كل قناة مطلوبة للالتقاط، في هذه الحالة، قنوات DAPI وNile Red وAF 750.
- حدد التكبير المطلوب كما هو موضح أدناه. اختيار التكبير يعتمد على التجربة. هنا ، استخدم التكبير 10x.
ملاحظة: جميع التكبيرات قابلة للاستخدام، بما في ذلك العدسات الزيتية. إذا رغبت في ذلك ، ضع زيت الغمر على سطح الشريحة. - لكل قناة، قم بمعايرة أوقات التعريض الضوئي المناسبة بناء على ألمع موضوعات التألق في التجربة. تجنب التعرض المفرط أثناء إنشاء صورة ساطعة قدر الإمكان.
ملاحظة: بشكل عام ، فإن المحددين الرئيسيين لالتقاط العملية السيئة هما التعرض المفرط ، مما يؤدي إلى فقدان التعريف ، والكثير من إشارات الخلفية ، والتي يصعب فصلها عن الإشارة الحقيقية. بالإضافة إلى ذلك، يجب ضبط التعريضات الضوئية بشكل مستقل لكل تكبير فريد مستخدم. - حدد المجلد المراد حفظه وقم بتسمية الصور المدمجة داخل القائمة. بعد الالتقاط ، ستكون جميع الصور موجودة في هذا المجلد وتحمل الاسم المحدد هنا.
- التقط الصور من خلال التركيز أولا على هدف في القناة يسمح بأفضل نقطة محورية ثم ابدأ في الجمع. حافظ على إجراء التركيز على كل موضوع في نفس القناة لتحقيق الاتساق عبر التجربة.
- التقط جميع المجموعات التجريبية المستخدمة للمقارنات اللاحقة في نفس اليوم لتجنب اضمحلال الفلورسنت بين المجموعات المقارنة.
- حدد التكبير المطلوب كما هو موضح أدناه. اختيار التكبير يعتمد على التجربة. هنا ، استخدم التكبير 10x.
10. القياس الكمي
ملاحظة: يمكن إجراء القياس الكمي باستخدام مجموعة متنوعة من البرامج. هنا ، تمت الإشارة إلى استخدام أبعاد Olympus CellSense.
- بعد المجموعة ، راجع الصور. قم بإزالة الأقسام التي تحتوي على عيوب أو أقسام البيانات الاصطناعية من مجلد القياس الكمي. حدد الصور التي تعكس هدف القياس الكمي. ومن أمثلة العيوب الفقاعات والأقسام الممزقة والأنسجة المتداخلة والغبار أو الحطام.
- لتحديد الصور المناسبة ، تأكد من استخدام جميع الصور التي تظهر أنسجة المخ للقياس الكمي لتعكس التعبير الكلي في جميع أنحاء الدماغ. بدلا من ذلك ، استخدم الصور التي تعكس فقط الدماغ الأمامي أو الأوسط أو الخلفي لإعطاء نظرة ثاقبة للاختلافات في التعبير في هذه المناطق.
- ضمن قوائم العد والقياس ، حدد معلمات الاهتمام وحدودها للقياس الكمي للصور.
- للقياس الكمي لتعبير ApoE من خلال مقارنة قيمة متوسط الشدة ، حدد قيم العتبة بحيث يتم اعتبار جميع وحدات البكسل لتلك القناة (0-ما لا نهاية). بالإضافة إلى ذلك ، حدد مناطق الاهتمام باستخدام أدوات الرسم المتاحة.
- قم بتشغيل العد والقياس إما دفعة واحدة لجميع الملفات أو بشكل فردي على كل صورة.
- لمعالجة الدفعات ، قم بتسجيل الإعدادات وتنفيذ القياس الكمي ثم حدد المجلد لإجراء القياس الكمي. يمكن الوصول إلى المعالجة دفعة واحدة من خلال علامة التبويب مدير الماكرو وتسريع سير العمل بشكل كبير.
- تصدير جدول البيانات إلى جدول بيانات لتخطيطه. للقيام بذلك، استخدم قائمة الجرد وقياس النتائج أثناء فتح جدول أو تصديره تلقائيا عند الأداء دفعة واحدة. وستحتوي جداول البيانات هذه على جميع المعلمات المحددة المختارة في الخطوة 2.10.
- للتحليل الإحصائي والتخطيط ، قم برسم البيانات باستخدام جدول بيانات مباشرة ، أو من خلال برامج أخرى. يعد الإلمام بالبرنامج المختار أمرا أساسيا لإنشاء تمثيل دقيق للنتائج التجريبية. هنا ، تم تطبيع قيم الشدة المطلقة لتعبير ApoE في دماغ الطفرة إلى وحدة التحكم ثم رسمها باستخدام GraphPad Prism.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تسمح الطريقة الموضحة أعلاه بالتصوير الفلوري لأدمغة الذباب البالغة بشكل موثوق وبدون تشريح ممل. موضحة ببساطة في الشكل 1 ، الطريقة واضحة ومباشرة ويمكن إجراؤها بسرعة إذا كانت جميع العينات والمعدات والمواد متاحة بسهولة. بدلا من ذلك ، باستخدام تخزين -80 درجة مئوية خلال مرحلة قالب OCT ، يمكن الاحتفاظ بالعينات للاستخدام بعد عدة أسابيع. لا يحتاج الباحثون إلى التدريب لفترة طويلة لتعلم تقنيات التشريح والتضمين البسيطة ، مما يجعل هذه الطريقة في متناول الجميع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، نقدم بروتوكولا للتصوير الفلوري الدقيق لرؤوس ذبابة الفاكهة المقطوعة بالتبريد. هذا نهج مباشر له العديد من الإيجابيات المهمة. وبالتحديد ، فإن الطرق بسيطة بما يكفي يمكن لأي شخص لديه تدريب أساسي على السلامة المختبرية إكمالها ، فهي قابلة للتكيف لقياس التعبير عن أي بروتين توجد له أجسام مضادة عالية الجودة ، وتسمح بقياس دقيق لكل من مقدار البروتين ذي الأهمية الذي يتم التعبير عنه ومكان حدوث هذا التعبير في جميع أنحاء الرأس. إذا كانت جودة الأنسجة والصورة عالية بما فيه الكفاية ، فمن الم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر ملكاني على مساعدتهم في تقديم ملاحظات قيمة لتطوير البروتوكول. تم الحصول على مخزون الذبابة ، Elav-Gal4 (BL # 458) و UAS-ApoE4 (BL # 76607) من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (بلومنجتون ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) AG065992 و RF1NS133378 إلى G.C.M. يتم دعم هذا العمل أيضا من قبل صناديق UAB Startup 3123226 و 3123227 إلى G.C.M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1000 ميكرولتر ماصة | Eppendorf | 3123000063 | |
| 1000 uL أطراف ماصة | أوليمبوس بلاستيك | 23-165R | |
| 10X محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS) | فيشر | J62036.K7 | درجة الحموضة = 7.4 |
| 200 مختبرات ديكون الإيثانول المقاومة | 64-17-5 | ||
| 20X تريس محلول ملحي | مخزن حراري علمي | J60877.K2 | درجة الحموضة = 7.4 |
| AF750 الماعز المضاد للفأر الأجسام المضادة الثانوية | Alexa Fluor | A21037 | |
| الزجاج المضاد للدحرجة | IMEB | AR-14047742497 | |
| ApoE الفأر الجسم المضاد الأساسي | سانتا كروز | SC13521 | |
| الأبقار مصل الألبومين | فيشر | 9048-46-8 | |
| أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل | فيشر | 05-408-129 | |
| الشرائح المشحونة | Globe Scientific | 1415-15 | |
| قوالب التقطيع بالتبريد | فيشر | 2363553 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| شفرات التبريد | CL Sturkey | DT554N50 | |
| الماء | |||
| الثلج الجاف | ??? | ??? | |
| ملقط ناعم | أدوات العلوم | الدقيقة 11254-20 | |
| Fly Pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| تصلب الوسائط المتصاعدة مع Dapi | Vectashield | H-1800 | |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | |
| مجهر | أوليمبوس | SZ61 | |
| النيل الأحمر | سيجما | N3013 | |
| مركب درجة حرارة القطع الأمثل | فيشر | 4585 | |
| شاكر مداري | OHAUS | SHLD0415DG | |
| بارافورمالدهيد 20٪ | علوم المجهر الإلكتروني | 15713 | |
| شفرات الحلاقة | Gravey | # 40475 | |
| مقص الربيع | أدوات العلوم الدقيقة | 15000-10 | |
| سكروز | فيشر | S5-500 |
المراجع
- Fabbri-Destro, M., Rizzolatti, G. Mirror neurons and mirror systems in monkeys and humans. Physiology. 23, 171-179 (2008).
- Faust, T. E., Gunner, G., Schafer, D. P. Mechanisms governing activity-dependent synaptic pruning in the developing mammalian CNS. Nat Rev Neurosci. 22, 657-673 (2021).
- Roozendaal, B., McEwen, B. S., Chattarji, S. Stress, memory and the amygdala. Nat Rev Neurosci. 10, 423-433 (2009).
- Arber, S., Costa, R. M. Networking brainstem and basal ganglia circuits for movement. Nat Rev Neurosci. 23, 342-360 (2022).
- GBD 2019 Dementia Forecasting Collaborators. Estimation of the global prevalence of dementia in 2019 and forecasted prevalence in 2050: an analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Public Health. 7, e105-e125 (2022).
- Huang, Y., Li, Y., Pan, H., Han, L. Global, regional, and national burden of neurological disorders in 204 countries and territories worldwide. J Glob Health. 13, 04160(2023).
- Crick, F. Central dogma of molecular biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9, 235-244 (2016).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the Fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201, 815-842 (2015).
- Larkin, A., et al. FlyBase: updates to the Drosophila melanogaster knowledge base. Nucleic Acids Res. 49, D899-D907 (2021).
- Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. Int J Mol Sci. 10, 407-440 (2009).
- Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379, eadd9330(2023).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312, 752-754 (1984).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39, 369-376 (1984).
- Huang, R. C. The discoveries of molecular mechanisms for the circadian rhythm: The 2017 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biomed J. 41, 5-8 (2018).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4, 429-434 (2012).
- Ong, S. E., Foster, L. J., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 (2003).
- Behnke, J. A., Ye, C., Moberg, K. H., Zheng, J. Q. A protocol to detect neurodegeneration in Drosophila melanogaster whole-brain mounts using advanced microscopy. STAR Protoc. 2, 100689(2021).
- Moraes, R. C. M., et al. Apolipoprotein E induces lipid accumulation through Dgat2 that is prevented with time-restricted feeding in Drosophila. Genes. 15 (11), 1376(2024).
- Roth, J. R., et al. Rapamycin reduces neuronal mutant huntingtin aggregation and ameliorates locomotor performance in Drosophila. Front Aging Neurosci. 15, 1223911(2023).
- Currier, T. A., Pang, M. M., Clandinin, T. R. Visual processing in the fly, from photoreceptors to behavior. Genetics. 224, (2023).
- McKellar, C. E., Siwanowicz, I., Dickson, B. J., Simpson, J. H. Controlling motor neurons of every muscle for fly proboscis reaching. Elife. 9, (2020).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
