تمت الموافقة على جميع التجارب على التي يتم إجراؤها في هذا العمل من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة فودان (رقم الموافقة: 2022JS-004). يتبع البروتوكول بدقة إرشادات رعاية لجامعة فودان لضمان المعاملة الإنسانية للحيوانات. قبل البدء التجريبي ، يجب السماح للفئران بفترة أسبوع واحد للتأقلم البيئي ، يتم خلالها تزويدهم بالعلف والماء الكافيين. يتم تنظيم الفترة الضوئية بعناية وفقا لإيقاعاتها البيولوجية لضمان الحفاظ على الحالات الفسيولوجية الطبيعية. في نهاية التجربة ، يتم إجراء القتل الرحيم باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران المستنشق.
ملاحظة: يظهر الإعداد التجريبي في الشكل 1A-H.
1. تحضير لتصوير ULM
- تخدير
- تحفيز التخدير في الفئران عن طريق إعطاء خليط من 3.5٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين بمعدل تدفق 3 لتر / دقيقة. بعد حوالي 4 دقائق ، أخرج من الغرفة وضعه على منصة تصوير دافئة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. تأكد من عمق التخدير من خلال عدم وجود منعكس انسحابي على قرصة إصبع القدم الصلبة للطرف الخلفي للفئران.
- ضع أنف الجرذ في قناع تنفس متصل بنظام التخدير. حافظ على تخدير مستقر عن طريق إعطاء خليط من 1.5٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة.
ملاحظة: تتبع طرق التخدير وجرعاته بدقة إرشادات الشركة المصنعة.
- تحضير قبل الجراحة
- قم بتأمين القواطع العلوية للفئران في شق شريط القاطع ، ووضع الفك السفلي أسفل الشريط. استخدم قضبان الأذن لتثبيت رأس الفئران عن طريق وضعها في المسافة البادئة العظمية الأمامية قليلا وأعلى من قناة الأذن (يمكن لمسها باليد) ، مما يضمن بقاء سطح الجمجمة بالكامل أفقيا (الشكل 1 أ).
- تحقق برفق من استقرار التثبيت عن طريق تطبيق قدر صغير من الضغط على أجزاء مختلفة من الرأس. تأكد من عدم وجود حركة أو انزلاق من الموضع الأصلي.
- اضبط ارتفاع منصة التصوير واضبط زاوية رأس الجرذ بدقة عن طريق رفع أو خفض شق شريط القاطع لضمان التنفس دون عائق.
- ضع مرهم الإريثروميسين أو محلول الجلسرين بنسبة 30٪ على عيون الفئران لمنع التلف الناتج عن التعرض المطول للأضواء الجراحية وللحفاظ على رطوبة العينين تحت التخدير. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم ملاقط مستديرة الرأس لسحب لسان الجرذ برفق إلى جانب واحد من الفم لمنع الاختناق أثناء الجراحة.
- استخدم ماكينة قص كهربائية محمولة باليد واحلق رأس الجرذ عكس اتجاه نمو الشعر (من الخلف إلى الأمام) ، عادة بين الأذنين ، من العينين إلى بداية الرقبة (الشكل 1 ب). نظف المنطقة المحلوقة بمحلول اليود 1٪ للتحضير للشق الجراحي.
- حج قحف الفئران
- قم بعمل شق على طول الخيط السهمي لجمجمة الفئران ، بدءا من خلف العظم القذالي مباشرة ويمتد حوالي 4 سم إلى الأمام. استخدم المرقئ لسحب الجلد على كلا الجانبين (الشكل 1 ج). اختياريا ، قم باستئصال الجلد بالكامل فوق الجمجمة لتوفير وصول جراحي أكبر ، ولكن هذا قد يزيد من خطر الإصابة بالعدوى.
- استخدم مقصا صغيرا لإزالة السمحاق من الجمجمة ، مما يؤدي إلى تعريض طبقة العظام الصلبة بالكامل.
- قم بإجراء حج القحف باستخدام مثقاب قمجمة صغير محمول باليد مزود بمثقاب كروي (الشكل 1 د). ابدأ بمثقاب خشن (قطر 2.5 مم) واضغط برفق لكشط العظم ، وقم بتطبيق المثقاب لمدة 2-3 ثوان في المرة الواحدة. ابدأ في المنطقة المركزية وتقدم نحو المناطق السميكة على الجانبين.
ملاحظة: يؤثر النزيف المفرط أثناء حج القحف على الدورة الدموية ، مما يؤدي إلى نقص إعادة بناء الأوعية الدموية في المناطق القشرية (الشكل 1H).
- توقف مؤقتا كل 2-3 ثوان لمنع ارتفاع درجة الحرارة ، وكل دقيقتين ، قم بحقن ما يقرب من 1 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم في منطقة الحفر باستخدام حقنة لتبريد وشطف الحطام.
- بمجرد أن لا تظهر أنسجة العظام البيضاء متصلة باستمرار ، قم بالتبديل إلى مثقاب أدق (قطر 1 مم). استمر في الحفر حتى تظهر الأوعية الدموية الرئيسية المركزية بوضوح باللون البني الداكن ، وتظهر المنطقة المحيطة باللون الوردي ، مع ظهور الأوعية الدقيقة على شكل حمراء قليلا (الشكل 1F).
ملاحظة: نطاق حج القحف النهائي هو من Bregma +3 مم إلى Lambda الأمامي الخلفي و 7 مم على كل جانب على طول خط الوسط للجمجمة (الشكل 1E). بعد الانتهاء من الجراحة ، اسمح للفأر بالراحة لمدة 10 دقائق تقريبا لضمان ظروف فسيولوجية مستقرة نسبيا قبل البدء في جمع البيانات.
2. الإعداد قبل جمع البيانات
- تحضير عامل التباين والحقن
- قم بإذابة عامل التباين (قارورة واحدة تحتوي على 59 مجم من غاز SF6 و 25 مجم من المسحوق المجفف بالتجميد) ، وفقا للإرشادات الرسمية ، في 5 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم. رج الخليط بقوة لتشكيل تعليق MB. التركيز النهائي ل SF6 في المعلق هو 8 ميكرولتر / مل.
- اسحب 0.8 مل من معلق MB في حقنة سعة 1 مل وثبته في مضخة حقن دقيق مبرمجة للنقع بسرعة 100 ميكرولتر / دقيقة.
- أدخل إبرة ساكنة 26 جم بقسطرة متصلة في وريد ذيل الجرذ (الشكل 1G).
- تحديد مستوى التصوير
- قم بتركيب مسبار بتردد مركزي يبلغ 15.625 ميجاهرتز على ذراع مناور الأداة التجسيمية للدماغ ، ومجهز بمشبك (نطاق الحركة: رأسي ، أفقي ، وأمامي خلفي يصل إلى 80 مم ؛ دقة القراءة: 0.1 مم).
- ضع مسبار الموجات فوق الصوتية مباشرة فوق دماغ الفئران المكشوف. ضع جل التوصيل على سطح الدماغ المكشوف لضمان نقل الإشارات الأمثل.
- افتح الواجهة الرئيسية للبرنامج ، والتي تدمج أطلس دماغ الفئران مع برامج التحكم في الحركة الحركية.
- قم بتعيين نقطة Bregma كالأصل. توفر واجهة البرنامج عرضا في الوقت الفعلي لمسار المسبار وموقع شريحة دماغ الفئران المقابل. حدد مستوى التصوير المستهدف ؛ على سبيل المثال ، بريجما -1 مم.
3. جمع البيانات (التوقيت ~ 20 دقيقة)
ملاحظة: يوفر Verasonics (نظام الموجات فوق الصوتية) نصوص MATLAB الأصلية للاستخدام مع نظام Vantage ولم يتم تعديله.
- بدء تشغيل البرمجيات
- قم بتشغيل برنامج MATLAB 2021a.
- أدخل البرنامج النصي للحصول على البيانات في MATLAB 2021a.
- في الدليل الجذر، اكتب activate في نافذة سطر الأوامر لتنشيط بيئة وقت التشغيل.
- تكوين المعلمات واكتساب إشارات التردد اللاسلكي
- اضبط أعماق بدء ونهاية جمع البيانات على 5 و 120 طولا موجيا ، على التوالي ، لالتقاط المنطقة محل الاهتمام بشكل فعال.
ملاحظة: يجب إجراء التعديلات بناء على مستوى التصوير المحدد الذي تتم دراسته.
- اضبط زوايا توجيه نقل الموجة المستوية من -5 درجات إلى 5 درجات بزيادات قدرها 2.5 درجة لتحسين دقة الصورة والتباين.
ملاحظة: اضبط هذه الإعدادات بناء على متطلبات التصوير المحددة والخصائص المستهدفة.
- اضبط جهد الإرسال على 20 فولت لضمان الاختراق الكافي ونسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى للمنطقة ذات الاهتمام.
- انقر فوق الزر تشغيل لبدء جمع البيانات وحفظ إشارات التردد اللاسلكي (RF) بتنسيق ملف .mat.
ملاحظة: ابدأ في جمع البيانات بعد 30 ثانية من بدء تشغيل مضخة الحقن المجهري لضمان توزيع ميغابايت موحد ومستقر داخل جسم الفئران.
4. معالجة البيانات وتحليلها (التوقيت ~ 8 ساعات)
- معالجة البيانات
- قم باستيراد بيانات التردد اللاسلكي إلى MATLAB 2021a وقم بإلغاء تشكيلها لإنشاء بيانات في الطور والتربيع (I / Q) (انظر جدول المواد).
- انقر فوق الزر تشغيل لاستخدام خوارزمية التأخير والمجموع (DAS) لتشكيل الحزمة على بيانات I/Q (انظر جدول المواد).
ملاحظة: معدل الإطارات اللاحقة للمركب يبلغ 800 هرتز، بإجمالي 120,000 إطار.
- تصوير ULM
- قم بتطبيق خوارزمية التصفية الزمانية المكانية لتحلل القيمة المفردة (SVD)17 على بيانات IQ لإزالة ضوضاء الخلفية والفوضى. يتم تخزين كل 800 إطار ككتلة بيانات، ويتم تعيين عتبة SVD إلى [15، 800].
- حدد موقع مركز كل ميغابايت باستخدام خوارزمية التركيب الغوسية18.
- استخدم خوارزمية Kuhn-Munkres لتتبع مسارات MB عبر إطارات متتالية بناء على مواقعها (انظر جدول المواد).
- قم بتعيين مسارات MB على شبكة تم أخذ عينات منها 8x ، باستخدام خريطة ألوان ساخنة لعرض عدد مسارات MB وخريطة ألوان نفاثة لتشفير سرعة التدفق عن طريق تعيين السرعة المحسوبة في كل موضع داخل الأوعية الدموية الدقيقة.
- قم بتطبيق نظام ألوان مخصص للتمييز بين اتجاهات التدفق لأعلى ولأسفل ، مما ينتج عنه صور عالية الدقة لتحسين المرئيات.
- قم بتقسيم مسارات MB الأصلية بشكل عشوائي إلى مجموعتين لإنشاء صورتين فرعيتين ، وإجراء تحويل فورييه على كل منهما ، وحساب ارتباط حلقة فورييه (FRC) كارتباط طبيعي لأطيافها. حدد الاستبانة على أنها معكوس التردد المكاني حيث ينخفض FRC إلى ما دون العتبة19.