يصف هذا التقرير طريقة لقياس ذبابة الفاكهة السوداء البالغة وقت الضربة القاضية باستخدام مراقب نشاط ذبابة الفاكهة (DAM2) استجابة لضغط حراري لتوصيل الهواء داخل غرفة الحاضنة. يقيس DAM2 النشاط عن طريق تسجيل حركات الذباب الفردية أثناء عبورها شعاع الأشعة تحت الحمراء. يتم تسهيل تحليل البيانات من خلال ملف تنفيذي جديد تم إنشاؤه بواسطة المؤلفين.
مقالة منهجية
فحوصات تحمل الحرارة باستخدام نظام مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة : دليل لتطبيق قابل للتنفيذ لتحليل البيانات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كانت دراسة تحمل الحرارة في ذبابة الفاكهة السوداء ذات أهمية خاصة للباحثين لعقود من الزمن ، مع اتباع نهج شائع لتقييم تحمل الحرارة وهو مراقبة وقت الضربة القاضية (TKD) بعد التعرض لدرجة حرارة مرتفعة. بشكل كلاسيكي ، يتم وضع الذباب في قوارير فردية ويوضع داخل حمام مائي ساخن. ثم يتم رصد TKD يدويا من قبل الباحثين. على الرغم من أنها راسخة للغاية ، إلا أنها لا تزال هناك مشاكل ذاتية وتطبيق ثابت لتعريف ملموس لوقف كل حركة ، بما في ذلك التشنجات العضلية ، عند تنفيذ هذه المقايسات اليدوية. لقد طورنا طريقة عالية الإنتاجية لأتمتة فحوصات تحمل الحرارة باستخدام أجهزة مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة TriKinetics (DAM2). لمرافقة نظام DAM2 ، قمنا بكتابة برنامج وأنشأنا ملف تنفيذي سهل الاستخدام لقراءة آخر مرة للحركة تلقائيا من بيانات النشاط التي تم إنشاؤها. ثم يكتب هذا البرنامج النصي إلى ملف .csv وقت الشلل الحراري (TKD) لكل ذبابة. تظهر بياناتنا أن طريقة DAM2 الآلية هذه متسقة وموثوقة. وفي الوقت نفسه ، فإن ملفات تعريف النشاط التي تم إنشاؤها من بيانات عدد الأنشطة ذات أهمية. يمكن تجميع ملفات تعريف النشاط هذه ولديها القدرة على توسيع فحوصات تحمل الحرارة لتشمل المكونات السلوكية غير المدروسة نسبيا لتحمل الحرارة. سيصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية استخدام نظام DAM2 و HoTDAM! برنامج لتقدير تحمل الحرارة في D. melanogaster.
المقدمة
تستجيب الحرارة الخارجية عادة للإجهاد الحراري مع زيادة النشاط الحركي. كانت هذه الظاهرة واضحة للباحثين لعقود من الزمن ، مع الاستجابة السلوكية المميزة التي وصفها كاولز وبوجيرت في عام 19441. وصفوا كيف سيظهر الكائن الحي الخاضع للإجهاد الحراري أولا زيادة في الحركة الحركية. مع تزايد الإجهاد الحراري ، تتخللها رشقات نارية قصيرة من النشاط فترات من الخمول. درجة الحرارة التي لم يعد بإمكان الكائن الحي أن يظهر عندها حركة منسقة هي الحد الأقصى الحراري الحرج (CTmax). تتبع البريد العشوائي العضلي ، وفي النهاية ينهار الكائن الحي1،2. يصعب تعريف هذا الانهيار ويمثل شيئا يشبه "الصرامة الحرارية أو الغيبوبة أو الموت"2. هنا سنستخدم مصطلح الانهيار الفسيولوجي للإشارة نظريا إلى نقطة النهاية الضبابية هذه للإجهاد الحراري.
ذبابة الفاكهة السوداء والحشرات الصغيرة الأخرى كانت نماذج قيمة لدراسة الإجهاد الحراري. لتقدير جزء على الأقل من المجموعة المعقدة من السمات التي تشكل تحمل الحرارة ، لاحظ العديد من الباحثين يدويا الوقت ودرجة الحرارة التي يحدث فيها الانهيار الفسيولوجي ، مما يمثل وقت الضربة القاضية (TKD) و CTmax ، على التوالي. على الرغم من أنها راسخة جدا ، إلا أن طرق الفحص اليدوي هذه تعاني من بعض العيوب. قد يكون من الصعب إنشاء تعريف تشغيلي للانهيار الفسيولوجي وتطبيقه بشكل مناسب على جميع الحالات ، خاصة عندما يكون المراقبون أقل خبرة. على سبيل المثال ، في أي نقطة ينتقل الكائن الحي من التشنجات العضلية إلى الانهيار؟ يمكن أن يكون نمط التشنجات العضلية ونشاط النوبات قبل الانهيار غير متوقع ويمكن أن يعقد الملاحظة الدقيقة2،3 ، مما يهدد الدقة والدقة. وفي الوقت نفسه ، فإن صعوبة الملاحظة تحد أيضا من عدد الكائنات الحية التي يمكن فحصها في وقت واحد ، مما يحد من قابلية التوسع.
نظرا لأن الزيادة في النشاط هي استجابة ثابتة للحرارة و TKD و CTmax هما في النهاية النقطة التي يتوقف عندها النشاط ، فقد سعينا إلى استخدام أجهزة مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة (DAM2) من TriKinetics لأتمتة فحوصات تحمل الحرارة. لقد نشرنا مؤخرا طريقة للفحص الآلي ، جنبا إلى جنب مع برنامج سهل الاستخدام ، باستخدام نظام DAM24. تم التحقق من صحة الاختبار من خلال مقارنة مقاييس تحمل الحرارة من حيث TKD بمقايسة TKD الكلاسيكية القائمة على المراقبة اليدوية عبر عدة عوامل. استكشفنا أيضا مكون النشاط الحركي لمقايسات TKD لتوصيف النمط الظاهري للتحمل الحراري المحفز. أطلقنا على الفحص والبرنامج المصاحب HoTDAM! (فحوصات تحمل الحرارة باستخدام نظام مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة). نقدم هنا وصفا تفصيليا لطريقة فحص تحمل الحرارة الآلي باستخدام نظام DAM2 و HoTDAM! برمجيات. الاختبار سهل الاستخدام وقابل للتطوير بسهولة للسماح بقياس العديد من الكائنات الحية في وقت واحد.
في هذه المخطوطة ، أجرينا فحوصات TKD على الذباب المتحور الحسي الحراري (مستقبلات عابرة محتملة ankyrin 1 ؛ TRPA1) وضوابطها الجينية (أبيض1118 ؛ ث1118). تم اختيار هذه الكائنات الحية للتأكيد على أهمية النشاط المتزايد المميز الذي شوهد أثناء الإجهاد الحراري للمقايس. وهي أن كائنات TRPA1 لا تظهر سلوك الهروب هذا، مما يوضح العلاقة الجوهرية بين الاستجابات السلوكية المحفوظة وتقديرات تحمل الحرارة، مثل المعارف التقليدية التقليدية. أجرينا الفحص لكل من الإناث والذكور ، جنبا إلى جنب مع تنفيذ معالجة مسبقة للتصلب الحراري. النتائج التمثيلية المعروضة هنا هي بيانات من فحوصات جديدة تماما من تلك المستخدمة في فحوصات التحقق الأصلية المنشورة سابقا.
البروتوكول
1. تربية الذباب
- اختر مخزون / خط الذباب المناسب للتحقيق.
ملاحظة: لتوضيح الفحص ، استخدمنا مخزون الضربة القاضية المحتمل للمستقبلات العابرة TRPA1 والتحكم الجيني فيه ، مخزون w1118 . - الحفاظ على مخزون الذباب في ظل ظروف متسقة حسب الاقتضاء. لاتباع هذا البروتوكول ، يتم تخزين المنزل عند 25 درجة مئوية تحت دورة نهارية 12:12 على الطعام القياسي (دقيق الذرة والدبس وخميرة التورولا).
- افصل بين الذكور والإناث بالتخدير الخفيف.
ملاحظة: اعتمادا على التجربة ، يمكن استخدام الذباب البكر أو المتزاوج.- اسمح للذكور والإناث البالغين (بشكل منفصل لكلا السلالتين) بالتزاوج والبيض لمدة 5 أيام. امسح البالغين من الزجاجات.
- عندما يبدأ البالغون في الإغلاق بعد عدة أيام ، قم بمسح الزجاجات مرة أخرى. بعد يومين ، افصل بين الذكور والإناث باستخدام تخدير الأثير الخفيف واتركهم ينضجون بشكل منفصل بكثافة 25 ذبابة لكل قارورة.
2. المعالجة المسبقة
- قم بتطبيق المعالجة المسبقة أو المتغير المستقل الذي سيحدد المجموعات التجريبية (الوراثية أو البيئية أو الدوائية أو غير ذلك).
- لاتباع هذا البروتوكول ، افصل البالغين حسب الجنس ، وبعد 5 أيام ، قم بمعالجة نصف البالغين مسبقا عن طريق غمر قارورة محكمة الغلق تحتوي على الكائنات الحية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. احتفظ بأدوات التحكم في الحاضنة عند 25 درجة مئوية. اسمح للذباب بالتعافي لمدة 24 ساعة بعد المعالجة المسبقة ، قبل فحص تحمل الحرارة.
3. إعداد نظام DAM2
- قم بتحميل الذباب في أنابيب مراقبة DAM2 وقم بتغطية الأنابيب في كلا الطرفين بالقطن. إذا كان سيتم تقييم الذباب لتحمل الحرارة على الفور ، فلا تستخدم أي تخدير أثناء تحميل الكائنات الحية في أنابيب الشاشة لتجنب أي آثار مربكة محتملة مرتبطة بالتعرض للتخدير. بدلا من ذلك ، قم بشفط الذباب الفردي من قوارير التثبيت إلى أنابيب الشاشة.
- ضع أنابيب الفحص في شاشات النشاط ، مع ملاحظة أرقام الفتحات التي يتم تحميل المجموعات المختلفة.
ملاحظة: قد تكون عشوائية اعتمادا على التجربة إذا كان الموقع داخل الشاشة يمكن اعتباره متغيرا مربكا. - برنامج الحصول على البيانات DAM2
ملاحظة: تم وصف نظام وبرنامج DAM2 بدقة في ورقة بيانات برنامج DAMSystem3 المتوفرة على موقع الشركة على الويب (انظر جدول المواد). ارجع إلى إرشادات DAM2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها المحددة والوظائف العامة. نقدم هنا إرشادات لاستخدام النظام في سياق اختبار تحمل الحرارة لدينا.- يراقب نظام DAM2 عدد المرات التي تكسر فيها ذبابة فردية داخل كل أنبوب شعاع الأشعة تحت الحمراء. ثم يقوم برنامج الحصول على البيانات بفهرسة هذا العدد وإعادة تعيينه في كل فترة زمنية محددة. ضمن التفضيلات، حدد الفاصل الزمني للقراءة لاستخدامه في المقايسة. لقد وجدنا فاصلا زمنيا للقراءة يبلغ 15 ثانية لتحقيق توازن جيد بين الدقة وأخطاء القراءة.
ملاحظة: يوصى بألا يكون الفاصل الزمني للقراءة أقصر بالثواني من عدد الشاشات المستخدمة. سيعطي الفاصل الزمني الأقصر للقراءة دقة زمنية أفضل للمقايسة ولكن من المحتمل أيضا أن يزيد من حالات أخطاء القراءة. يمكن أن يتخلف البرنامج عن الركب أثناء محاولة فهرسة القراءات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكمبيوتر الأحدث والأسرع يقطع شوطا طويلا في منع أخطاء القراءة. - أثناء التفكير في أخطاء القراءة ، تأكد من ضبط الكمبيوتر المستخدم لتشغيل برنامج الحصول على بيانات DAM2 على عدم السكون أو السبات أبدا حتى لا يقاطع الفحص. علاوة على ذلك، تأكد من تعيين التحديثات التلقائية (بما في ذلك أي تحديثات شبكة تسيطر عليها المؤسسة) إلى إيقاف التشغيل أثناء جمع البيانات.
- تحقق من أن جميع الشاشات متصلة وتتواصل مع البرنامج. تأكد من أن حالة كل جهاز عرض خضراء ضمن علامة تبويب البيانات الحالية .
ملاحظة: راجع ورقة بيانات برنامج DAMSystem3 للحصول على تفاصيل حول المشكلات التي تشير إليها رموز الألوان المختلفة. - سيقوم برنامج الحصول على البيانات تلقائيا بكتابة أعداد الأنشطة إلى الملفات النصية في مجلد البيانات داخل ملفات النظام. لتسهيل تحليل البيانات ، احذف أي ملفات نصية داخل مجلد البيانات هذا قبل بدء تشغيل برنامج الحصول على البيانات لأي فحص.
ملاحظة: سيتم ملء الملفات النصية تلقائيا ، لذلك يجوز إزالتها من هذا المجلد لمسح البيانات القديمة دون إعاقة البرنامج.
- يراقب نظام DAM2 عدد المرات التي تكسر فيها ذبابة فردية داخل كل أنبوب شعاع الأشعة تحت الحمراء. ثم يقوم برنامج الحصول على البيانات بفهرسة هذا العدد وإعادة تعيينه في كل فترة زمنية محددة. ضمن التفضيلات، حدد الفاصل الزمني للقراءة لاستخدامه في المقايسة. لقد وجدنا فاصلا زمنيا للقراءة يبلغ 15 ثانية لتحقيق توازن جيد بين الدقة وأخطاء القراءة.
4. فحص تحمل الحرارة
- قم بتحميل الشاشات في حاضنة الفحص.
- ابدأ تشغيل برنامج الاستحواذ واترك فهرس البرنامج لفترة زمنية محددة (على سبيل المثال ، 40 فهرسا أو 10 دقائق إذا تم ضبط الفاصل الزمني للقراءة على 15 ثانية) قبل تطبيق الإجهاد الحراري.
ملاحظة: هذا يسمح ببعض التأقلم مع الأنابيب والتعافي من حركة الشاشات أثناء إعدادها. خاصة إذا تم تحليل النشاط أثناء الفحص ، فإن وقت التأقلم هذا سيؤسس نشاطا أساسيا قبل تحريض الإجهاد الحراري. اعتمادا على الطبيعة المحددة للفحص الذي يتم إجراؤه ، يمكن تخطي مرحلة التأقلم هذه ، مع وضع الشاشات مباشرة في الحاضنة بالفعل في درجة حرارة الإجهاد. - في حالة إجراء اختبار ثابت (TKD) ، اضبط الحاضنة على المنحدر في أسرع وقت ممكن إلى درجة الحرارة الضارة المحددة بعد فترة التأقلم. وسيبدأ تشغيل متغير الاستجابة باعتباره آخر وقت مسجل للحركة (أي آخر مؤشر غير صفر) لتقدير المعارف التقليدية.
- في حالة إجراء فحص ديناميكي ، حدد معدل زيادة درجة الحرارة بعد فترة التأقلم. هنا يكون متغير الاستجابة المقاس تقنيا وقت ثانية. سيتزامن الوقت الذي يتم فيه تسجيل الحركة الأخيرة مع درجة حرارة (CTmax) ، اعتمادا على معدل الارتفاع.
- راقب عدد النشاط في الوقت الفعلي على شاشة نظام DAM في برنامج الاستحواذ أو افحص الملفات النصية مباشرة في مجلد البيانات في ملفات برنامج DAMSystem3. انسخ الملفات النصية وافتح النسخة بدلا من الملف الأصلي داخل مجلد البيانات لتجنب التسبب في أي مشاكل في تسجيل البيانات الحية.
- بعد عدم رؤية أي حركة في أي من الذباب لعدة دقائق ، أوقف برنامج الاستحواذ.
ملاحظة: من خلال فحوصاتنا ، وجدنا أن بضع إلى عدة دقائق من الخمول يدل على الانهيار الفسيولوجي بسبب الإجهاد الحراري المشابه لتلك التي شوهدت في فحوصات TKD اليدوية الكلاسيكية. ومع ذلك ، فإن هذا يعتمد على سلوك الهروب التلقائي. على هذا النحو ، ضع في اعتبارك المتغيرات المربكة المحتملة إذا كان العلاج المحدد في التحقيق قد يغير هذه الاستجابة السلوكية. علاوة على ذلك ، اعتمادا على المعلمات المحددة للفحص (على سبيل المثال ، درجة الحرارة والعلاج) ، من الواضح أن طول الفحص سيختلف
5. تنظيم البيانات وتحليلها
ملاحظة: راجع الفيديو التكميلي S1 للحصول على إرشادات حول كيفية تنزيل التطبيق القابل للتنفيذ من GitHub ، بالإضافة إلى الوظائف الأساسية للبرنامج.
- بمجرد الحصول على البيانات، امسح الملفات النصية بحثا عن الأخطاء باستخدام البرنامج المشار إليه (راجع جدول المواد) وحدد نقاط بدء وإيقاف محددة لتجميع بيانات النشاط. إذا تم تنفيذ فاصل زمني للتأقلم مدته 10 دقائق، فابدأ التجميع لمدة 10 دقائق في تسجيل النشاط. راجع المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل حول binning.
- افتح HoTDAM! برنامج التحليل واستيراد ملفات بيانات الشاشة الممسوحة ضوئيا بالنقر فوق ملف | تحميل بيانات المراقبة.
ملاحظة: يتوفر البرنامج والتطبيق القابل للتنفيذ من GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) أو من موقع الشركة على الويب ضمن قسم برامج التحليل . لاحظ أن التطبيق القابل للتنفيذ متوافق فقط مع أنظمة تشغيل Windows في الوقت الحالي. - أضف تسميات المجموعة للإشارة إلى مجموعات العلاج التي تتوافق مع الخلية الموجودة داخل شاشات DAM2.
ملاحظة: يتوافق تخطيط واجهة البرنامج مع تخطيط الشاشات. - انقر فوق بدء تعريف المجموعات المتعددة لسحب مربع حوار لإضافة تعيين مجموعة سيتم تطبيقه على خلايا متعددة. بمجرد قبول تعيين المجموعة ، انقر فوق الخلايا لتطبيق تعيين المجموعة ، ثم انقر فوق إيقاف تعيين المجموعة المتعددة.
ملاحظة: يقوم البرنامج بتنظيم وتصدير بيانات DAMSystem3 إلى ملفات .csv لتحليلها في برامج الإحصاء. - قم بتصدير TKD (أي آخر فهرس غير صفر) لكل ذبابة داخل الشاشات إلى ملف .csv بالنقر فوق ملف | تصدير بيانات الضربة القاضية | تصدير جميع الشاشات أو تصدير الشاشات المحددة. سيتم تنظيم TKD لكل ذبابة في الإخراج حسب تعيين المجموعة.
- تصدير بيانات النشاط لكل ذبابة بالنقر فوق ملف | بيانات نشاط التصدير | قم بتصدير جميع الشاشات أو تصدير الشاشات المحددة إلى ملف .csv ، مع الاحتفاظ فقط بالطابع الزمني وبيانات العد ، مما يجعل ملف البيانات أسهل في العمل معه ، مع تعيين تسميات مجموعة مخصصة لكل ذبابة.
ملاحظة: تتوافق الأعمدة العديدة الأولى في ملفات بيانات DAMSystem3 مع البيانات الداخلية للشاشات (على سبيل المثال ، مراقبة الضوء أو رسائل الخطأ) أثناء الاستحواذ. توجد بيانات العد في الأعمدة 11-42 (راجع ورقة بيانات DamSystem3 للحصول على التفاصيل). سيؤدي تصدير بيانات النشاط باستخدام برنامج التحليل إلى إزالة جميع الأعمدة باستثناء عمودي الطابع الزمني وبيانات العدد. - في حالة إجراء تجربة CTmax، استخدم TKD لتحديد CTmax باستخدام معدل تكثيف درجة الحرارة.
ملاحظة: تمت كتابة برنامج التحليل بطريقة موجهة للكائنات في C # (كود المصدر المتاح على GitHub ؛ https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) بحيث يمكن تعديل جوانب البرنامج بسهولة للسماح بالتخصيص لتلبية أغراض محددة.
6. الإحصاء
ملاحظة: يمكن استخدام العديد من الاختبارات المختلفة لتحليل بيانات TKD، اعتمادا على تفاصيل الإعداد التجريبي.
- استخدم تحليل البقاء على قيد الحياة (على سبيل المثال ، انحدار كوكس ، كابلان ماير) لتصور الضربة القاضية على أنه حدث ستواجهه كل ذبابة داخل الفحص.
ملاحظة: للحصول على مراجعة مفصلة ، راجع سلسلة برادبورن وكلارك المكونة من 4 أوراق تناقش تحليل البقاء على قيد الحياة وتنفيذه5،6،7،8. - استخدم ANOVA لتقييم الاختلافات في المجموعة ومقارنة الطرائق ، خاصة عند التحقق من صحة الفحص الآلي لظروف معينة.
- تحليل بيانات TKD باستخدام تحليل بقاء كابلان ماير. قم بتقسيم الملف حسب المخزون بحيث يتم إجراء التحليل بشكل منفصل (على سبيل المثال ، لخطوط الأسهم TRPA1 و w1118). اختر متغير الوقت ك TKD (بالدقيقة) ، والضربة القاضية كحدث ، والمعالجة المسبقة كعامل ، والجنس كطبقات.
- قم بإجراء اختبارات رتبة السجل ، و Breslow ، و Tarone-Ware لمقارنة المعالجة المسبقة لكل طبقة (أي الجنس) ، لأغراض توضيحية توضح عدة طرق.
- بناء مؤامرات البقاء على قيد الحياة.
النتائج
أجريت تحليلات مخزونات TRPA1 و w1118 بشكل منفصل. يمكن العثور على أوقات TKD المئوية وغيرها من الأوصاف في الجدول 1.
| النسبالمئوية أ | ||||||||
| جنس | العلاج | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | تقدير | خطأ في الخطأ المنقول | تقدير | خطأ في الخطأ المنقول | تقدير | خطأ في الخطأ المنقول | ||
| W1118 | ||||||||
| أنثى | تحكم | 16 | 42.50 | 0.43 | 40.75 | 2.00 | 38.75 | 0.43 |
| تصلب | 16 | 48.75 | 4.55 | 43.25 | 2.50 | 38.50 | 1.95 | |
| ذكر | تحكم | 16 | 43.25 | 1.88 | 39.75 | 0.25 | 37.00 | 2.38 |
| تصلب | 16 | 46.50 | 5.63 | 35.50 | 2.00 | 30.75 | 3.03 | |
| TRPA1 | ||||||||
| أنثى | تحكم | 16 | 34.25 | 2.17 | 29.25 | 7.50 | 21.50 | 0.72 |
| تصلب | 15 | 37.25 | 4.84 | 28.75 | 1.77 | 25.75 | 0.86 | |
| ذكر | تحكم | 15 | 38.25 | 3.29 | 32.00 | 1.29 | 24.50 | 7.92 |
| تصلب | 16 | 27.50 | 0.72 | 25.75 | 1.00 | 22.75 | 6.06 | |
الجدول 1: إحصائيات وصفية لتحليلات بقاء كابلان ماير لذباب w1118 و TRPA1 . يتم إعطاء قيم TKD المئوية بالدقائق. يشير المتصلب إلى المعالجة المسبقة بزاوية 37 درجة مئوية متبوعة بالتعافي لمدة 24 ساعة قبل الصدمة الحرارية عند 39 درجة مئوية. تم الاحتفاظ بعناصر التحكم عند 25 درجة مئوية طوال مدة المعالجة المسبقة. ملاحظة: في تحليلات البقاء على قيد الحياة ،فإن النسبة المئوية 75 هي أحدث مرة يستمر فيها 75٪ من العينة في إظهار النشاط.
بالنسبة للذباب w1118 ، وجد اختبار رتبة السجل فرقا كبيرا في احتمال الضربة القاضية بين الإناث المتصلبات والتحكم (ص = 0.026) ، بحيث يكون لدى الإناث المتصلبات احتمال أقل للسقوط بواسطة الإجهاد الحراري على مدار الفحص. وفي الوقت نفسه ، لم يجد اختبار رتبة السجل فرقا كبيرا في احتمال الضربة القاضية بين المتصلبين والتحكم مع 1118 ذكرا (ص = 0.798). بالنسبة لإناث TRPA1 ، لم يتم العثور على فرق كبير في احتمال الضربة القاضية بين الكائنات المتصلبة والكائنات الضابطة (ص = 0.547) باستخدام اختبار رتبة اللوغاريتم. أخيرا ، بالنسبة لذكور TRPA1 ، وجد اختبار رتبة السجل فرقا كبيرا في احتمال الضربة القاضية بين الكائنات المتصلبة والتحكم (ص = 0.014) ، بحيث كان لدى الكائنات الحية الضابطة احتمال أقل للسقوط بواسطة الإجهاد الحراري. انظر الجدول 2 للحصول على جميع نتائج تحليلات البقاء على قيد الحياة (بما في ذلك اختبارات Wilcoxon و Tarone-Ware المعممة) والشكل 1 لمنحنيات البقاء على قيد الحياة.
| جنس | χ2 | مدافع | قيمة p | |
| W1118 | ||||
| أنثى | رتبة السجل (مانتل كوكس) | 4.96 | 1 | 0.026 |
| بريسلو (ويلكوكسون معمم) | 1.72 | 1 | 0.190 | |
| تارون وير | 3.07 | 1 | 0.080 | |
| ذكر | رتبة السجل (مانتل كوكس) | 0.07 | 1 | 0.798 |
| بريسلو (ويلكوكسون معمم) | 0.86 | 1 | 0.353 | |
| تارون وير | 0.32 | 1 | 0.572 | |
| TRPA1 | ||||
| أنثى | رتبة السجل (مانتل كوكس) | 0.36 | 1 | 0.547 |
| بريسلو (ويلكوكسون معمم) | 0.45 | 1 | 0.503 | |
| تارون وير | 0.36 | 1 | 0.549 | |
| ذكر | رتبة السجل (مانتل كوكس) | 6.01 | 1 | 0.014 |
| بريسلو (ويلكوكسون معمم) | 4.19 | 1 | 0.041 | |
| تارون وير | 5.20 | 1 | 0.023 |
الجدول 2: اختبار الأهمية الذي يقارن احتمالية البقاء نشطا بين الذباب المعالج مسبقا والضابط مع1118 و TRPA1 من الذباب الإناث والذكور. يشير المتصلب إلى المعالجة المسبقة بزاوية 37 درجة مئوية متبوعة بالتعافي لمدة 24 ساعة قبل الصدمة الحرارية عند 39 درجة مئوية. تم الاحتفاظ بالكائنات الضابطة عند 25 درجة مئوية طوال مدة المعالجة المسبقة.
الشكل 1: منحنيات البقاء على قيد الحياة التي تصور نسبة الكائنات الحية ذات النشاط المتبقي على مدار اختبار TKD للذباب w 1118 و TRPA1. يشير المتصلب إلى المعالجة المسبقة بزاوية 37 درجة مئوية متبوعة بالتعافي لمدة 24 ساعة قبل الصدمة الحرارية عند 39 درجة مئوية. تم الاحتفاظ بالكائنات الضابطة عند 25 درجة مئوية طوال مدة المعالجة المسبقة. TKD في دقائق منذ إدخال الإجهاد الحراري 39 درجة مئوية. الاختصارات: TKD = وقت الضربة القاضية. TRPA1 = مستقبلات عابرة محتملة أنكيرين 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن رؤية متوسط النشاط المرسوم مع الوقت في الشكل 2 للصلابة والتحكم TRPA1 و w1118 من الذكور والإناث.
الشكل 2: متوسط النشاط مقابل الوقت للذبابw 1118 و TRPA1 طوال مدة اختبار TKD. الاختصارات: TKD = وقت الضربة القاضية. TRPA1 = مستقبلات عابرة محتملة أنكيرين 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
من المحتمل أن تكون هناك طرق عديدة وجديدة لتحليل بيانات النشاط ، خاصة عند النظر في تأثيرات المجموعة ودمج TKD. نظرا لأن تحليل النشاط أثناء تحمل الحرارة غير مدروس نسبيا ، لم نستكشف مناهج إحصائية جديدة محتملة لتحليل بيانات النشاط. مثل هذا الاختبار الإحصائي يستدعي مراجعة ومناقشة الأدبيات أكثر شمولا مما هو مناسب هنا. بدلا من ذلك ، قمنا ببساطة برسم متوسط النشاط لكل مجموعة (المعالجة المسبقة أو التحكم) مقابل الوقت ، لأننا نشرنا سابقا هذه الطريقة لتوضيح النشاط من خلال مراجعة الأدبيات المناسبة.
الفيديو التكميلي S1: إرشادات لتنزيل التطبيق القابل للتنفيذ من GitHub والوظائف الأساسية للبرنامج. يمكن العثور على أحدث إصدار (متوافق فقط مع Windows في الوقت الحالي) على GitHub المشار إليه (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) أو من خلال رابط مفهرس في قسم برامج التحليل على موقع الشركة على الويب. بمجرد تنزيل الإصدار ، ستحتاج الملفات إلى الاستخراج و HoTDAM! يمكن فتح الطلب. قد يمنع برنامج مكافحة الفيروسات تشغيل التطبيق. قد يلزم منح الأذونات للتطبيق. بمجرد تشغيل الواجهة ، يمكن تحميل DAM2 (برنامج فحص الملفات) الممسوح ضوئيا (ملف | تحميل بيانات مراقبة). تمثل واجهة تعيين المجموعة تخطيط مراقبة النشاط وتسمح للمستخدم بتعيين مجموعات المعالجة إلى الأنابيب بشكل فردي واحدة تلو الأخرى أو عدة مرات في وقت واحد باستخدام ميزة تحديد المجموعة متعددة التحديد. وجميع الشاشات متعارضة فيما يتعلق بوظيفة تعيين المجموعة ويجب تعريفها بشكل منفصل. يمكن بعد ذلك تصدير بيانات TKD والنشاط إلى ملفات .csv (ملف | تصدير بيانات أو ملف ضربة قاضية | تصدير بيانات النشاط) لجهاز عرض محدد بشكل فردي أو لجميع الشاشات في وقت واحد. إذا تم تصدير جميع أجهزة المراقبة مرة واحدة، تصدير بيانات TKD أو بيانات النشاط إلى ملف .csv واحد، ولكن سيتم فصل البيانات الخاصة بكل جهاز عرض داخل الملف. ستقوم ملفات TKD المصدرة بتجميع الذباب في مجموعات تعرض آخر فهرس غير صفري للنشاط لكل أنبوب. ستحافظ ملفات النشاط على جميع الأنابيب منفصلة ولكنها ستربط تسميات المجموعة وستزيل جميع المعلومات من الملفات ولكن الطابع الزمني وبيانات العد لكل أنبوب. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
طريقة فحص تحمل الحرارة التي نصفها هنا متعددة الاستخدامات وقابلة للتطوير. لقد نشرنا سابقا دراسة التحقق حيث قارنا HoTDAM! إلى اختبار TKD الكلاسيكي القائم على الملاحظة ووجد أن الاختبار الآلي يعطي نفس الاتجاه العام عبر عدة عوامل4 (الشكل 3). بمعنى آخر ، بنفس طريقة اختبار TKD اليدوي الكلاسيكي ، كان الاختبار الآلي DAM2 قادرا على التمييز بين الكائنات الحية حسب الجنس ، ودرجة حرارة الفحص ، والمعالجة المسبقة للتصلب ، ووقت التعافي بعد المعالجة المسبقة للتصلب قبل المقايسة. في حين يفترض أن يكون الاختبار الآلي أكثر موضوعية من حيث أن TKD لا يعتمد على ملاحظة الباحث ، فإن بياناتنا لا تشير إلى أن هذا يجعل مقايسة DAM2 متفوقة بشكل ملحوظ على الفحص اليدوي من حيث اكتشاف التأثير. وجدنا أن المقايسات متشابهة تماما من حيث الدقة ، وإذا كان هناك أي شيء ، فإن أحجام التأثير داخل الفحص الآلي أصغر قليلا (انظر المواد التكميلية Rokusek et al.4 للحصول على بيانات إحصائية وصفية مفصلة وبيانات ANOVA لكل من DAM2 الآلي والمقايسات القائمة على الملاحظة اليدوية من دراسات التحقق الخاصة بنا). ومن المحتمل أن يكون السبب في ذلك متعلقا بالاختلاف المتأصل في ما تقيسه المقايسات من حيث المعارف التقليدية التي ترد مناقشتها بالتفصيل أدناه.
الشكل 3: مقارنة المقايسة المؤتمتة DAM2 بمقايسة TKD الكلاسيكية القائمة على الملاحظة. تظهر المؤامرات يعني TKD بالدقائق وأشرطة الخطأ هي الخطأ القياسي للمتوسط. العوامل المستقلة التي تمت مقارنتها هي (أ) الجنس عن طريق درجة حرارة الفحص ، (ب) التصلب عن طريق درجة حرارة الفحص ، (ج) الجنس حسب وقت الشفاء ، (د) التصلب حسب الجنس ، (ه) درجة حرارة الفحص حسب وقت الاسترداد ، و (F) التصلب بحلول وقت الاسترداد. يميل TKD المطلق إلى أن يكون أطول في الفحص الآلي ، لكن الاتجاهات العامة عبر العوامل متسقة بين المقايسات. هذا الرقم مأخوذ من Rokusek et al. 4. الاختصار: TKD = وقت الضربة القاضية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تمثل البيانات التوضيحية المقدمة هنا تجارب منفصلة تماما عن تجارب التحقق الأصلية ، والتي استخدمت أيضا خطوط طيران مختلفة. كان الاختبار (TKD والنشاط) حساسا لتأثيرات المعالجة المسبقة للتصلب في مخزون w1118 (استخدمنا سلالة من النوع البري Canton S في التجارب الأصلية) مما يوفر دعما بأن الوظيفة الأساسية للمقايسة مستقرة في ظل ظروف متغيرة ، على الرغم من أنه تم اختبار عدد قليل فقط من الأسطر حتى الآن. الاختبار متعدد الاستخدامات من حيث أنه لا يقتصر على قياس TKD. نظرا لأن TKD في فحصنا يعرف بأنه توقف النشاط الحركي ، يمكن تحديد CTmax إذا كان معدل تصاعد درجة الحرارة معروفا. أخيرا ، الاختبار مؤتمت بالكامل ويمكن توسيع نطاقه بسهولة عن طريق إضافة المزيد من أجهزة مراقبة النشاط ، مما يسمح بأحجام أخذ عينات أكبر بكثير مما هو ممكن باستخدام طريقة المراقبة اليدوية.
فيما يلي بعض النقاط الرئيسية التي يجب مراعاتها أثناء إجراء الفحص والتحليل. استخدم حاضنة يمكنها الوصول بسرعة إلى درجة حرارة محددة ، بحيث يمكن تحميل الشاشات في الحاضنة عند درجة حرارة التربية والسماح لها بالجلوس بهدوء للتأقلم مع البيئة الجديدة قبل تطبيق الإجهاد الحراري. إذا كانت درجة الحرارة تنخفض ببطء شديد ، فسيبدأ الاختبار في التشابه إلى حد كبير مع اختبار CTmax الديناميكي بدلا من اختبار TKD الثابت. على سبيل المثال ، إذا سمح للبرنامج بفهرسة 40 ضعفا قبل تحريض الإجهاد الحراري لإنشاء خط أساس ، فيمكن للبرنامج إخراج ملف البيانات بدءا من الفهرس 40 لتحديد TKD وتحليل البيانات. نقطة البداية هي من حيث الطابع الزمني المسجل بواسطة البرنامج ، لذا كن على دراية بفاصل الفهرس (على سبيل المثال ، 40 فهرسا هو 10 دقائق إذا كان الفاصل الزمني للفهرس 15 ثانية).
يمكن أيضا استخدام برنامج فحص الملفات في "سلة" الفهارس ويمكنه إما جمع أو حساب متوسطها. على سبيل المثال ، عندما قمنا برسم بيانات النشاط بيانيا (انظر أدناه) قمنا بتجميع كل أربعة فهارس معا لجمع الأعداد (على سبيل المثال ، قمنا بتصدير النشاط كل دقيقة بدلا من كل 15 ثانية). لاحظ أن برنامج فحص الملفات لن يسمح بأوقات بدء دقيقة جزئية عند تجميع البيانات ، من حيث الطابع الزمني. على سبيل المثال، إذا كان الفهرس الأول عند الساعة 12:10:15، مع ضبط الفاصل الزمني للفهرس على 15 ثانية، فسيبدأ التجميع عند دقيقة واحدة في أقرب دقيقة تالية (على سبيل المثال، 12:11:00). على هذا النحو، إذا كان سيتم استخدام النشاط بزيادات دقيقة للتحليل ولكن كان من المطلوب استبانة فواصل زمنية قدرها 15 ثانية ل TKD، فابدأ برنامج الاقتناء في غضون 15 ثانية من أقرب دقيقة كاملة (على سبيل المثال، في وقت ما بعد 12:09:45 وقبل 12:10:00). يرجع هذا التعقيد إلى حقيقة أن برنامج الحصول على البيانات يستخدم ساعة نظام الكمبيوتر كطابع زمني ، حيث من المحتمل أن يكون DAMSystem3 قد تم إنشاؤه مع وضع دراسات النوم في الاعتبار.
فيما يتعلق بالمناهج الإحصائية لمقارنة TKD ، فإننا نجادل بأن تحليل البقاء على قيد الحياة يقدم معلومات أكثر من مجرد مقارنة متوسط أو متوسط أوقات الضربة القاضية بين المجموعات. يمكن أن تقدم منحنيات البقاء على قيد الحياة نظرة ثاقبة للمسار الزمني للضربة القاضية للسكان أثناء الفحص. وبالمثل ، يمكن تصميم الاختبار الإحصائي وفقا للسؤال المحدد المطروح في الدراسة. على سبيل المثال ، تضع اختبارات Wilcoxon المعممة وزنا أكبر على الأحداث المبكرة ، بينما تعطي اختبارات رتبة السجل وزنا متساويا لجميع النقاط الزمنية وتكون أكثر حساسية للاختلافات في النقاط الزمنية اللاحقة. إذا كانت نسب الخطر غير متناسبة (أي منحنيات البقاء على قيد الحياة متقاطعة) ، فإن Tarone-Ware يكون أكثر صرامة. نظرا لأنه لا ينبغي أن يكون هناك رقابة على البيانات لأن جميع الكائنات الحية ستكون قد تعرضت للحدث (ضربة قاضية) ، يمكن تقديم حجة لاستخدام اختبارات ترتيب الرتب غير البارامترية مثل Mann-Whitney U و Kruskal-Wallis جنبا إلى جنب مع منحنيات بقاء Kapan-Meier9. إذا كان التحقيق مهتما بالضربة القاضية بعد فترة زمنية محددة بدلا من TKD بعد تدمير جميع الكائنات الحية ، فإن استخدام تحليل البقاء على قيد الحياة واختبار الرتبة اللوغاريتمية أو اختبارات ويلكوكسون المعممة سيكون قويا للبيانات الخاضعة للرقابة (أي سيناريو لم تتوقف فيه جميع الكائنات الحية عن الحركة أو انهيار بنهاية الفحص). قدمنا النتائج من رتبة السجل ، وويلكوكسون المعمم ، و Tarone-Ware في الجدول 2 للتوضيح.
أثناء الإجهاد الحراري وقبل CTmax ، تعمل التغيرات السلوكية (على سبيل المثال ، سلوك الهروب) كآليات للتأقلم. يتم الحفاظ على هذه الاستراتيجيات السلوكية الفطرية في جميع أنحاء مملكة ولكنها مهمة بشكل خاص للحرارة الخارجية نظرا لقدرتها المنخفضة على التنظيم الحراري الأيضي10،11. من الواضح أن السلوك هو جانب مهم من النمط الظاهري للإجهاد الحراري الخارجي ، لكن الأبحاث المتناثرة نسبيا فحصت هذه الجوانب السلوكية لتحمل الحرارة. بالنظر إلى أن الاختبار الذي نصفه يعتمد على الزيادة المميزة في النشاط الحركي استجابة للإجهاد الحراري ، فهو مناسب تماما لاستكشاف الجوانب الحركية لاستجابات الإجهاد الحراري. في الوقت نفسه ، فإن هذا الاعتماد على النشاط التلقائي يحمل معه بعض القيود. من المهم أن تتذكر ، خاصة عند استكشاف مكونات الاستجابات الحركية للإجهاد الحراري ، أن كلا من TKD والنشاط مرتبطان ارتباطا جوهريا. لإثبات الموقف الذي يكون فيه هذا مقيدا لمحصننا ، قدمنا هنا بيانات من كائنات TRPA1 التي تعاني من نقص في التحسس الحراري. عندما تكون الكائنات الحية ناقصة في مستقبلات TRPA1 ، لا يظهر الذباب الاستجابة الحركية المميزة للحرارة12. في البيانات التمثيلية الموضحة هنا ، تكون استجابة النشاط في كائنات TRPA1 ضعيفة. ولن تكون قياسات TKD سهلة المقارنة مع الكائنات البرية لأن المقياس يمثل استجابة حركية مختلفة.
تعد قابلية التعميم والمقارنة المباشرة للنتائج ، خاصة مع فحوصات تحمل الحرارة الكلاسيكية ، أيضا قيدا محتملا (الشكل 3). في كثير من الأحيان ، ستتضمن المقايسات القائمة على الملاحظة حافزا ميكانيكيا أو محفزا آخر للتأكد من أن الكائن الحي غير المتحرك يعاني بالفعل من انهيار فسيولوجي وليس مجرد إظهار نقص في النشاط التلقائي3،13. وبما أن فحصنا يعتمد على النشاط التلقائي، فإن هناك اختلافا متأصلا في التعريف التشغيلي للمعارف التقليدية يمكن أن يعقد المقارنة. بمعنى آخر ، حددنا TKD على أنه توقف النشاط الحركي ، بينما تعرف المقايسات الكلاسيكية عموما TKD على أنه انهيار فسيولوجي. علاوة على ذلك ، تعتمد المقايسات الآلية مثل تلك التي وصفها على الهواء الساخن ، بينما تتضمن المقايسات اليدوية عموما حماما مائيا ، وبالتالي نقل حرارة أكثر كفاءة. تمثل كل هذه القيود على المقارنة بين طرائق الفحص جوانب سلبية لقابلية تعميم الطريقة الآلية. في الوقت نفسه ، تم الإبلاغ عن أن الأساليب القائمة على الملاحظة تعاني من مضاعفات مع مقارنات مباشرة بين التحقيقات أيضا2،14،15. نحن نجادل بأنه على الرغم من القيود ، فإن المقايسات الآلية هي وسيلة قابلة للتطبيق لتقدير تحمل الحرارة من حيث TKD أو CTmax.
تم تنفيذ فحوصات تحمل الحرارة الآلية الأخرى ل TKD و CTmax ووصفها سابقا في الأدبيات16،17،18،19 ، مع استخدام بعضها لشاشات نشاط DAM218،19. علاوة على ذلك ، استخدمت بعض التحقيقات على الأقل طرقا قائمة على الفيديو16،20،21 ، بالإضافة إلى أجهزة مراقبة نشاط DAM220 ، لفحص ملامح نشاط ذبابة الفاكهة من حيث صلتها بتحمل الحرارة في سياق الإجهاد الحراري الحاد. على هذا النحو ، فإن أتمتة فحوصات تحمل الحرارة ، بما في ذلك نظام DAM2 ، ليست فكرة جديدة. ما هو جديد وذو قيمة في فحصنا هو سهولة إدارة البيانات كما يسهلها HoTDAM! (تحليل) البرمجيات. يصعب التعامل مع بيانات النشاط ، وقد يستغرق الأمر وقتا طويلا ومرهقا لسحب حتى أبسط التدابير ، (على سبيل المثال ، TKD) من مجموعات البيانات الكبيرة دون استخدام برامج أو نصوص تحتاج إلى أن تكون مخصصة لكل سيناريو. هوتدم! مجاني ومتاح كتطبيق قابل للتنفيذ يعمل بكامل طاقته مع واجهة بسيطة وسهلة الاستخدام. لا توجد خبرة سابقة في الترميز ضرورية. علاوة على ذلك ، تمت كتابة البرنامج بطريقة موجهة للكائنات مع وثائق لتسهيل التعديل. على هذا النحو ، HoTDAM! يمكن تخصيصها بسهولة لتناسب الاحتياجات الخاصة. الكود المصدري متاح جنبا إلى جنب مع التطبيق القابل للتنفيذ. نأمل أن تفعل HoTDAM! يمكن أن تخدم المختبرات الجديدة في فحوصات تحمل الحرارة من خلال توفير وسيلة سهلة لقياس TKD و CTmax ، بالإضافة إلى خدمة المختبرات ذات الخبرة في فحوصات تحمل الحرارة من خلال تقديم برامج قابلة للتخصيص لتسهيل إدارة البيانات.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم المشروع الموصوف من خلال منح جائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة (5P20GM103427 و 1U54GM115458). برنامج زملاء الباحثين الجامعيين في جامعة الأمم المتحدة وبرنامج الأبحاث الصيفي لطلاب الطب بجامعة UNMC.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 14 مل أنابيب اختبار البوليسترين Falcon | 352057 | ||
| 30 جالونا خزان السمك | وول مارت | ||
| 8 أوقية | زجاجات Genesee | 32-129F | |
| غرفة المناخ المستمر | Memmert | HPP750eco | |
| الذرة | مختبر العلمية | FLY801010 | |
| DAM2 & nbsp ؛ ذبابة الفاكهة مراقبة نشاط | TriKinetics | DAM2 | (ورقة بيانات DAMSystem3) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| DAMSystem الحصول على البيانات | TriKinetics | تحميل مجاني | |
| ذبابة الفاكهة أجار | مختبر العلمي | FLY80201 | |
| الإيثانول | فيشر BP82011 | ||
| الأثير | برنامج Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan | TriKinetics | للمسح بحثا عن أخطاء النص ، وتجميع البيانات ، وإخراج | |
| FlyStuff Flugs للزجاجات | Genesee | 49-100 | |
| FlyStuff Flugs للقوارير | Genesee | 49-102 | |
| قوارير FlyStuff | Genesee | 32-113RL | |
| برنامج HoTDAM | Github أو Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| سخان دائري الغمر | PolyScience | MX-CA11B | |
| دبس | السكر مختبر FLY80084 | ||
| علمي حمض البروبيونيك | فيشر Scientific | A258-500 | |
| أنابيب زجاجية Pyrex 5 × 65 مم ل DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| فرشاة طلاء صغيرة | وول مارت | ||
| SPSS إحصائيات | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| خميرة تورولا | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 < / em> الأسهم المتحولة | مركز بلومنجتون للمخزون | 26504 | w [1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | مركز بلومنجتون للمخزون | 3605 |
المراجع
- Cowles, R. B., Bogert, C. M. A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles. Bull Am Mus Nat Hist. 83, 261-296 (1944).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Funct Ecol. 33 (4), 629-642 (2019).
- Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part III: Multivariate data analysis - Choosing a model and assessing its adequacy and fit. Br J Cancer. 89 (4), 605-611 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part I: Basic concepts and first analyses. Br J Cancer. 89 (2), 232-238 (2003).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 9: survival analysis. Indian J Dermatol. 62 (3), 251-257 (2017).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am Nat. 126 (3), 362-386 (1985).
- Grigg, G. C., Beard, L. A., Augee, M. L. The evolution of endothermy and its diversity in mammals and birds. Physiol Biochem Zool. 77 (6), 982-997 (2004).
- Soto-Padilla, A., et al. Thermosensory perception regulates speed of movement in response to temperature changes in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 221 (10), jeb174151(2018).
- Hoffmann, A. A., Sørensen, J. G., Loeschcke, V. Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches. J Therm Biol. 28 (3), 175-216 (2003).
- Terblanche, J. S., et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures. J Exp Biol. 214 (22), 3713-3725 (2011).
- Rezende, E. L., Castaneda, L. E., Santos, M. Tolerance landscapes in thermal ecology. Funct Ecol. 28 (4), 799-809 (2014).
- MacLean, H. J., Hjort Hansen, J., Sørensen, J. G. Validating the automation of different measures of high temperature tolerance of small terrestrial insects. J Insect Physiol. 137, 104362(2022).
- Gioia, A., Zars, T. Thermotolerance and place memory in adult Drosophila are independent of natural variation at the foraging locus. J Comp Physiol A. 195, 777-782 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. The effect of developmental temperature fluctuation on wing traits and stressed locomotor performance in Drosophila melanogaster, and its dependence on heterozygosity. Evol Ecol Res. 14 (7), 803-819 (2012).
- Bak, N. K., Rohde, P. D., Kristensen, T. N. Strong sex-dependent effects of malnutrition on life- and healthspan in Drosophila melanogaster. Insects. 15 (1), 9(2023).
- Bettencourt, B. R., et al. Natural variation in Drosophila stressed locomotion meets or exceeds variation caused by Hsp70 mutation: analysis of behavior and performance. Behav Genet. 393, 306-320 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. Locomotor activity of Drosophila melanogaster in high temperature environments: plastic and evolutionary responses. Clim Res. 43 (1-2), 127-134 (2010).
إعادة الطباعة والأذونات
