مقالة منهجية

بروتوكول حقن العصب المبهم المباشر للفئران

DOI:

10.3791/67820

⸱

مارس 14, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UT Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, UT Southwestern Medical Center, 3Department of Neurology, UT Southwestern Medical Center, 4Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center, 5McDermott Center for Human Growth and Development, UT Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا للحقن المباشر للعصب المبهم في الفئران ، مما يتيح توصيل الدواء مباشرة إلى العصب دون مضاعفات بعد الحقن. تنطبق هذه الطريقة على الدراسات العصبية قبل السريرية التي تنطوي على التلاعب بالجهاز العصبي اللاإرادي. يمكن استخدامه لحقن الأعصاب المباشر للأعصاب الأخرى في الفئران والأنواع الأخرى ، مع التعديلات اللازمة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك وفرة نسبية من الاستراتيجيات والمنهجيات لتسهيل توصيل الدواء إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن توصيل الدواء مباشرة إلى الجهاز العصبي المحيطي أقل شيوعا ، مع وجود عدد أقل من منشورات الطرق التفصيلية لمساعدة الباحثين. هنا ، نصف طريقة حقن العصب المباشر لتوصيل أدوية الجهاز العصبي المحيطي ، باستخدام العصب المبهم كعصب نموذجي. يمكن استخدام هذه الطريقة في علاج اضطرابات الجهاز العصبي اللاإرادي من خلال استهداف العصب المبهم الأيسر ، على الرغم من أن طريقة الحقن العامة هذه يمكن استقراءها لحقن أعصاب أخرى مع تعديل طفيف. تشرح هذه الطريقة جميع الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها الإجراء الذي يتضمن الجراحة المجهرية في الفئران البالغة المخدرة تحت مجهر تشريح. يتم وصف استخدام صبغة التتبع لتسهيل مراقبة دقة الحقن في الوقت الفعلي. يتم توفير الرسوم التوضيحية للحقن الناجحة والفاشلة. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يمكن إجراء حقن العصب المبهم المباشر بطريقة آمنة يتحملها الفئران جيدا دون مضاعفات ما بعد الولادة. على سبيل المثال ، بمجرد تدريب الجراحين على هذه الطريقة ، تم حقن ستة من أصل ستة فئران بنجاح دون أي مضاعفات. هذه الطريقة للحقن المباشر للأعصاب لدراسات الفئران قبل السريرية قادرة على توصيل العوامل (بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر العلاج الجيني) إلى الأعصاب الطرفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تطبيق الطريقة الصحيحة لإعطاء الدواء أحد العوامل الحاسمة في تحقيق نتائج علاجية ناجحة. على الرغم من وفرة طرق توصيل العامل العلاجي إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، إلا أنه تم الإبلاغ عن طرق قليلة فقط لتوصيل الجهاز العصبي المحيطي (PNS) عن طريق الحقن المباشر للأعصاب. تمت تجربة الحقن المباشر للأعصاب ، مثل الحقن في العقد الجذرية الظهرية (DRG) في الفئران ، في دراسات قبل السريرية لفهم أفضل لآليات الألم ، وسمية الدواء ، ونقل الجينات1،2،3 ، وتطوير الطريقة العامة1،4. تشمل التقارير الإضافية عن الحقن المباشر للأعصاب حقن العصب الشوكي4 ، وحقن العصب الوركي1 ، وحقن العصب المبهم في الفئران5 والفئران6. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح طريقة للحقن فوق الغضروفي لتوزيع أفضل للعلاجات في رأس العصب البصري في الأرانب7.

يعتبر DRG الموقع المثالي للحقن المباشر للنواقل المحملة بالجينات المعدلة وراثيا مثل الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) بسبب الوظيفة الحسية لأجسام الخلايا في DRG2. تم وصف كل من الطرق الجراحية وغير الجراحية لحقن DRG1،8. ومع ذلك ، فقد تم العثور على استنتاجات مثيرة للجدل حول اتساق النتائج مع الطريقة غير الجراحية لحقن DRG1. تم اقتراح أن الطريقة الجراحية التي تنطوي على استئصال الصفيحة الفقرية الجزئية ناجحة بنسبة 100٪ لحقن DRG في الفئران دون أي تغيير في نتائج السلوك3 ، بالإضافة إلى طريقة تنطوي على قطع العظم الجزئي في الفئران9. تشير العديد من الدراسات إلى طرق حقن DRG لتوصيل الأدوية ، والتي تم استخدامها في أبحاث العلاج الجيني قبل السريري في الفئرانوالفئران 1،2،10. قد تتضمن دراسات العلاج الجيني القائم على النواقل التي تتضمن الحقن الموضعي الفوائد التالية: انخفاض التعبير خارج الهدف ، وتقليل السمية الجهازية ، وتقليل الأحمال الفيروسية وأحجام الحقن ، وانخفاض خطر حدوث مضاعفات مناعية11 ، 12.

تمت تجربة طريقة الحقن المباشر في العصب الوركي ، وهو أطول عصب في الجسم ، عن طريق تعريض العصب الوركي الأيمن عند مستوى منتصف الفخذ للفئران. استخدمت الطريقة ماصة زجاجية مسحوبة مزودة بنظام حقن يتم التحكم فيه بواسطة المعالجة الدقيقة لحقن حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر صبغة بمعدل تدفق 1.2 ميكرولتر / دقيقة1. أظهرت هذه التجربة نقصا في توزيع الصبغة على مستوى DRG ، وكان التوزيع محدودا في الغالب حول موقع الحقن. وبالمثل ، تم تجربة طرق أخرى لحقن الأعصاب المباشرة ، مثل حقن العصب الشوكي ، بالصبغة لتقييم الكمية المناسبة من حجم الحقن ونمط توزيع الصبغة في الفئران. يقترح أن يكون 2 ميكرولتر مثاليا لحقن العصب الشوكي ، بينما أظهر 3 ميكرولتر من الصبغة عن طريق حقن DRG التوزيع في كل من العقد الجذرية الظهرية والبطنية في الفئران1. تم الإبلاغ عن أن حجم حقن DRG في الفئران هو الأمثل من 1.0 ميكرولتر إلى 1.5 ميكرولتر بناء على السلالة وحجم الجسم2،9.

تم استخدام طريقة حقن العصب المبهم المباشر في الفئران5 والفئران6 لتقييم دور الإصابة العصبية أو السلامة الخلوية في نقل α السينوكلين البشري. تصف هاتان الدراستان ، اللتان أجرتهما نفس المجموعة من الباحثين ، طريقة موجزة لحقن ناقلات AAV مباشرة في العصب المبهم الأيسر في منطقة عنق الرحم. في الفئران ، تضمنت الطريقة شعيرات دموية زجاجية بقطر طرف 60 ميكرومتر لحقن ناقل 2 ميكرولتر بمعدل تدفق 0.5 ميكرولتر / دقيقة مع حقنة هاميلتون 5 ميكرولتر. في الفئران ، تم حقن حجم إجمالي قدره 750 نانولتر محلول ناقل بمعدل تدفق 160 نانولتر / دقيقة باستخدام إبرة فولاذية حادة 36 جم مثبتة على حقنة NanoFil سعة 10 ميكرولتر6. أظهرت هذه التجارب أن الجين المعدل تم تسليمه والتعبير عنه في محاور عصبية في الجسر والدماغ المتوسط للجرذان والفئران. وبالمثل ، أظهرت النواة الحركية الظهرية للعصب المبهم الأيسر تفاعلا مناعيا إيجابيا مع الجينات المعدلة وراثيا. توضح هذه الأدلة أن طريقة حقن العصب المبهم المباشر قد تكون طريقة موثوقة في العلاج الجيني حيث يمتد التنبيغ الخلوي إلى عدة مواقع من الدماغ ، والتي تعرض المحاور من خلال العصب المبهم. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تذكر استخدام أي صبغة لتتبع دقة الحقن.

هنا ، يتم وصف طريقة للحقن المباشر في العصب المبهم الأيسر باستخدام أصباغ تتبع غير سامة قابلة للتطبيق إلى حد كبير على الباحثين في الدراسات قبل السريرية. وتناقش المزالق المحتملة التي قد تسبب صعوبات في إيصال الدواء وسبل التغلب عليها. يتم توضيح هذه المواقف بالصور لإظهار ما الذي يجعل التسليم غير ناجح وطريقة إنجاحه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء البروتوكول التالي وفقا لإرشادات الأخلاقيات المؤسسية وموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC).

1. إعداد السكن

ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص للفئران البالغة التي لا تقل أعمارها عن شهرين. الصغيرة (بما في ذلك الفئران والجرذان الأصغر سنا) ممكنة ولكن لا ينصح بها وستكون أكثر صعوبة.

  1. قدم طعاما رطبا أو أي طعام طري آخر (جل التعافي البيطري) لمدة 48 ساعة قبل جراحة العصب المبهم. نظرا لأن قد تواجه صعوبة في تناول الطعام بعد العملية ، فقم بإدخال هذه العناصر للحيوانات قبل الجراحة لمساعدتها على التعرف على مذاق هذه العناصر وتحفيز الدافع على تناول الطعام.
  2. الفئران البيوية بشكل فردي في قفص على الأقل 1 قبل الجراحة ، وكذلك أسبوع واحد بعد الجراحة. سيمكنهم ذلك من التأقلم مع ضغوط البقاء بمفردهم ومنع خدش الجروح بعد الجراحة من قبل زميل القمامة.

2. تحضير العناصر الجراحية والمساحة

  1. قم بعمل قائمة بجميع العناصر الضرورية في وقت مبكر وتحقق جيدا من توفر جميع العناصر للجراحة.
  2. تعقيم جميع العناصر بطرق التعقيم المناسبة قبل الجراحة.
  3. قم بإعداد المساحة الجراحية المعقمة تحت المجهر التشريح. ضع وسادة تدفئة تحت المجهر للحفاظ على دفء الجرذ أثناء الجراحة.
  4. ضع جميع المواد الجراحية على طاولة جراحية على ستارة معقمة. احتفظ بمساحة كافية للجراحة تحت مجهر التشريح. تأكد من أن تركيز المجهر هو الأمثل ويشمل المنطقة الجراحية لتصور العصب.
  5. ضع مضخة الحقنة بالقرب من المرحلة الجراحية بحيث يكون طول الأنبوب كافيا للوصول إلى موقع الحقن.
  6. ضع الأدوات الجراحية باتجاه جانب يد الجراح المهيمنة.

3. تحضير خليط من الدواء المرشح وصبغة التتبع

  1. تأكد من تخفيف الدواء المرشح لتحقيق التركيز المطلوب في المخفف الموصى به بحيث يعطي 5 ميكرولتر من الدواء الممزوج بالصبغة الكمية المطلوبة من الدواء المرشح المراد توصيله. يوصى بالحد الأقصى لحجم الحقن بطريقة العصب المبهم المباشر ب 5 ميكرولتر (بما في ذلك صبغة التتبع ، انظر الخطوة 3.2).
  2. امزج صبغة متوافقة مع الدواء المرشح لتمكين تتبع دقة الحقن في الوقت الفعلي. على سبيل المثال ، التركيز النهائي إما 1٪ Luxol Fast Blue أو 0.002٪ فلورسين هي أصباغ متوافقة للاستخدام.
    تنبيه: استخدم الصبغة بتركيزها الأمثل في خليط الصبغة والأدوية المرشحة. عندما يكون تركيز الصبغة في الخليط منخفضا جدا ، فقد لا يكون من المرئي تتبع الحقن. عندما يكون تركيز الصبغة مرتفعا جدا ، فقد ينتج عنه خليط سميك جدا ولزوجة عالية ، مما يؤدي إلى سد إبرة الحقن.

4. تحميل خليط الدواء والصبغة المرشح في الأنبوب

  1. قم بتوصيل حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر مع إزالة المكبس بإبرة 27 جراما.
  2. قم بتوصيل أحد طرفي ما يقرب من 45 سم من أنابيب البولي إيثيلين المعقمة بإبرة 27 G.
  3. خذ حقنة بلاستيكية سعة 3 مل وقم بتثبيتها بإبرة 27 جراما. قم بتحميل المحقنة بحوالي 0.5 مل من محلول ملحي عادي بنسبة 0.9٪.
  4. املأ أنبوب البوليثين بالمحلول الملحي العادي بنسبة 0.9٪ من الطرف المفتوح لملء الطول الكامل للأنبوب وبرميل المحقنة الزجاجية بالكامل حتى يفيض للخارج.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب احتجاز فقاعات الهواء داخل الأنبوب.
  5. قم بإزالة وتخلص من المحقنة والإبرة سعة 3 مل.
  6. أدخل مكبس المحقنة في برميل المحقنة الزجاجية وادفعه للأمام قليلا حتى منتصف البرميل.
  7. ضع المحقنة الزجاجية في مضخة المحقنة.
  8. اسحب المكبس للخلف قليلا باستخدام مضخة الحقنة لإنشاء مساحة هوائية تبلغ حوالي 1.5 سم في الطرف المفتوح بطول الأنبوب.
  9. ماصة ما لا يقل عن 5 ميكرولتر من الصبغة وخليط الدواء المرشح مع ماصة دقيقة سعة 10 ميكرولتر وإسقاطها على قطعة معقمة من البارافيلم
  10. اسحب خليط الدواء المرشح إلى الأنبوب عن طريق سحب المكبس للخلف عبر مضخة المحاقنة. حافظ على فقاعة الهواء بين محلول ملحي بنسبة 0.9٪ ومحلول الحقن ، ولكن بخلاف ذلك ، تجنب حبس أي فقاعات هواء داخل محلول الحقن. ضع علامة على مستوى خليط الحقن في الأنبوب بعلامة.
    ملاحظة: تعد فجوة الهواء بين خليط صبغة الدواء المرشح والمحلول الملحي المعقم داخل الأنبوب أمرا بالغ الأهمية لمنع خلط المحلولين.
  11. تناسب الإبرة 35 جم مع الأنبوب. ثبت الإبرة على السطح النظيف للمرحلة الجراحية بشريط لاصق حتى لا تكون الإبرة فضفاضة ولا تتحرك وتلمس أي شيء آخر وتظل معقمة.

5. فتيلة إبرة الحقن

  1. اضبط برنامج مضخة الحقنة على توزيع 0.5 ميكرولتر / دقيقة.
  2. ابدأ مضخة الحقنة لمدة 10-15 ثانية ، حتى يبدأ محلول الحقن في الخروج من طرف الإبرة. تشير كمية صغيرة من الخليط عند طرف الإبرة دون تسرب في مفصل الأنبوب وإبرة الحقن (أو في أي مكان آخر على طول المحقنة أو الأنبوب أو الإبرة) إلى أن الإعداد صحيح.
    ملاحظة: إذا لم تظهر قطرة صغيرة عند طرف الإبرة ، فهذا يشير إلى انسداد الإبرة. قد يحدث انسداد الإبرة بسبب اللزوجة العالية للدواء المرشح وخليط الصبغة ، والهواء الزائد المحبوس داخل النظام ، وعدم وضع المحقنة الزجاجية بشكل صحيح داخل مضخة الحقنة. انظر الشكل 1 للحصول على مثال على التسرب عند التقاطع بين الإبرة والأنبوب. يعد التحضير أمرا بالغ الأهمية لأنه يساعد على تحديد ما إذا كانت الإبرة خالية من العوائق وأن الحقن داخل العصب سيمر بسلاسة.

6. تحضير الفئران للجراحة

  1. الحصول على وزن جسم الجرذ لحساب الجرعة اللازمة من المسكنات. على سبيل المثال ، يستخدم الكاربروفين بمعدل جرعة 5 مجم / كجم تحت الجلد في الفئران.
    ملاحظة: يوصى بتخزين الكاربروفين في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الحقن.
  2. قم بتخدير الجرذ باستخدام مبخر الأيزوفلوران باستخدام معدل تدفق 3٪ -4٪ لتحريض التخدير لمدة 2-3 دقائق. تقليل معدل تدفق الأيزوفلوران إلى حوالي 1.75٪ -2٪ للحفاظ على التخدير.
  3. انقل الجرذ إلى طاولة منفصلة مع إعداد لإزالة الشعر وإعداد الموقع. تأكد من أن هذا الجدول قريب من مساحة الجراحة.
  4. ضع مرهما اصطناعيا للدموع في كلتا عيني الفئران لمنع الجفاف المفرط.
  5. قم بإدارة المسكنات وفقا لبروتوكول المؤسسي المعتمد للسيطرة على الألم عند عودة الجرذ إلى الوعي.
  6. حلق المنطقة الجراحية باستخدام ماكينة قص الشعر في الجانب البطني من الرقبة في منطقة عنق الرحم. حلق مسافة تصل إلى حوالي 2 سم عموديا من خط الوسط على كلا الجانبين من الذقن إلى القص.
  7. تعقيم المنطقة ب 70٪ كحول إيثيلي و 10٪ بيتادين ، وامسح المنطقة ثلاث مرات بالتناوب باستخدام مسحة كحولية وبوفيدون يود. امسح من وسط المنطقة إلى الخارج بنمط دائري.
  8. انقل الفئران إلى المرحلة الجراحية تحت المجهر في وضع ضعيف. اضبط تركيز المجهر لتصور منطقة الجراحة في منطقة عنق الرحم.

7. إجراء جراحة الفئران لحقن الدواء المرشح مباشرة في العصب المبهم الأيسر (الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4)

ملاحظة: سيتطلب هذا الجزء من الطريقة شخصا ثانيا لمساعدة الجراح.

  1. ضع الجرذ على وسادة تسخين في وضع ضعيف تحت مجهر التشريح المرتبط بضوء مركب.
  2. اربط أسنان الفك العلوي الأمامي للفأر بقطعة من الخيط غير القابل للامتصاص وقم بتثبيت الطرف المفتوح للخياطة داخل مخروط الأنف بحيث يكون فتحة الأنف دائما داخل مخروط الأنف طوال فترة التخدير.
  3. ضع الجرذ بحيث يقع رأسه على الجانب الأيسر من الجراح الأيمن (أو الجانب الأيمن من الجراح الأيسر). في هذا الوضع ، يكون الجانب الأمامي للجراح عموديا على جسم الفئران. ضع وسادة من المقياس المعقم تحت الرقبة واضبط زاوية منطقة عنق الرحم للفأر بحيث تصبح منطقة عنق الرحم مستقيمة. سيسهل ذلك تحديد موقع العصب المبهم الأيسر وإجراء الحقن.
  4. ثنى جسم الجرذ بالكامل بستارة معقمة ، مع إبقاء مساحة الجراحة مفتوحة.
  5. قم بإصلاح أربعة دبابيس ضام بشكل فردي باستخدام 4 مثبتات مغناطيسية مع اللدائن وضع المثبتات في الزوايا الأربع للمرحلة الجراحية.
  6. حقن التخدير الموضعي في الجلد في خط الوسط لمنطقة عنق الرحم حيث يتم إجراء الشق. على سبيل المثال ، عادة ما يتم استخدام مزيج من الليدوكائين والبوبيفاكين.
  7. قم بعمل شق جلدي طولي بطول 2 سم عند خط الوسط بين الذقن والقص بشفرة مشرط في الجانب البطني من الرقبة في منطقة عنق الرحم (الشكل 3 أ).
  8. افصل الحواف المقطوعة للجلد بأطراف قطنية معقمة.
  9. اسحب حواف الجلد في اتجاهين متعاكسين من موقع الشق بمساعدة أطراف الضام.
  10. افصل الواجهة بأطراف قطنية للتعمق أكثر. ادفع الغدد اللعابية نحو الجانب الجانبي.
  11. افصل عضلات القص بأطراف قطنية واسحبها جانبا باستخدام المسامير. مع تقدم انفصال العضلات القصية على نطاق واسع ، تظهر القصبة الهوائية في المنتصف ، مغطاة بالعضلة القصية (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: احرص على عدم الضغط على القصبة الهوائية.
  12. تقدم في فصل الأنسجة على الجانب الأيسر من القصبة الهوائية للفئران حتى يظهر غمد الشريان السباتي ، والذي يحتوي على الشريان السباتي المشترك الذي يمتد مع العصب المبهم الأيسر.
  13. قم بعمل ثقب صغير في غمد الشريان السباتي بعناية باستخدام ملقط ناعم ، مع الانتباه حتى لا تصيب الشريان السباتي تحت المجهر. افصل العصب المبهم الأيسر عن الشريان السباتي المشترك باستخدام ملقط دقيق.
    ملاحظة: المنطقة الجراحية حرجة من الناحية التشريحية. جدار الشريان السباتي سميك وزلق ولا يصاب بسهولة ، لكن الطرف الحاد من الملقط الناعم قد يصيبه ، وقد يحدث نزيف. في الوقت نفسه ، انتبه حتى لا تؤذي العصب.
  14. بمجرد فصل العصب عن الشريان بواسطة الملقط ، استخدم إبرة منحنية 25 جم مثبتة على حقنة 1 مل من تلك الفتحة إلى "الخطاف" وإمساك العصب باليد غير المهيمنة (الشكل 4 أ).
    ملاحظة: يكون طرف الإبرة المنحنية غير حاد حتى لا يؤذي العصب والشرايان. يتم تصنيع زاوية انحناء طرف الإبرة حسب الطلب إلى حوالي 90 درجة باستخدام hemostat (الشكل 2).
  15. باستخدام اليد المهيمنة ، أمسك الإبرة المحملة بخليط صبغة الأدوية المرشح وخز العصب برفق في نفس الاتجاه الذي يعمل فيه العصب بحيث يكون شطبة الإبرة متجها لأعلى.
    1. لسهولة الوخز ، حافظ على استقامة العصب عن طريق السحب برفق باستخدام خطاف 25 جيجا. أدخل الإبرة في العصب وتقدم للأمام ، أكثر من 0.5 سم ، مع الحفاظ على الإبرة موازية للعصب المبهم. ثم اسحب للخلف قليلا بحيث تبقى إبرة حوالي 0.4-0.5 سم داخل العصب.
      ملاحظة: يجب أن تكون زاوية الإبرة ضحلة بما يكفي لاختراق العصب دون المرور إلى الجانب الآخر.
  16. قد تكون هناك حالات تكون فيها الإبرة غير عائق خارج العصب في وقت التحضير ، لكن خليط صبغة الدواء المرشح لا يمر بسلاسة داخل العصب. لتجنب هذا الموقف ، قلل من عدد وخز الأعصاب بإبرة واحدة لا تزيد عن 3 مرات. إذا كانت الإبرة ضعيفة ، فستزداد فرص الانسداد أو الحقن الضعيف.
  17. تأكد من أن الإبرة داخل العصب بالكامل. احتفظ بالوضع غير المتحرك وقم بتشغيل مضخة المحقنة.
    ملاحظة: تحقق بعناية في موقع الحقن للتأكد من أن خليط صبغة الدواء المرشح لا يتدفق مرة أخرى من العصب.
  18. أثناء الحقن ، افحص باستمرار أن التسريب يبقى داخل العصب ويتدفق بسلاسة. استخدم العلامة الموجودة على أنبوب التسريب لمراقبة حركة خليط صبغة الدواء من نقطة البداية.
    1. إذا كان خليط صبغة الدواء المرشح لا يتدفق بسلاسة ، اسحب الإبرة للخارج وكرر خطوة التحضير (الخطوة 5.2). ثم أعد إدخال الإبرة في العصب واستأنف التسريب.
  19. يبدأ العصب في تطوير لون الصبغة (الشكل 4 ب). استمر في التسريب عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة لمدة 10 دقائق لنقع كل 5 ميكرولتر من خليط صبغة الدواء المرشح.
    ملاحظة: يوصى بري الأنسجة المكشوفة بكمية صغيرة من محلول ملحي معقم دافئ بنسبة 0.9٪ حسب الحاجة لمنع الجفاف المفرط والتلف.
  20. بعد حقن 5 ميكرولتر وتوقف مضخة الحقنة ، احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 1 دقيقة إضافية للسماح لكل خليط صبغة الدواء المرشح بالانتشار من موقع الحقن. إزالة الإبرة.
  21. قم بإزالة الإبرة المنحنية 25 جم. استخدم أطراف قطنية معقمة لتحريك المناديل برفق إلى موقعها الأصلي. قم بإزالة أطراف الضام.
  22. أغلق الجرح بخياطة غير قابلة للامتصاص (يمكن أيضا استخدام خياطة قابلة للامتصاص). ضع كمية صغيرة من غراء الأنسجة بين الغرز إذا لزم الأمر لإغلاق الجرح تماما.

8. رعاية ما بعد الجراحة للفئران

  1. نقع حوالي 3 مل من محلول ملحي دافئ 0.9٪ تحت الجلد بعد إغلاق الجرح. هذا يساعد الفئران على إعادة الترطيب على الفور.
  2. ضع الجرذ في مصدر حرارة حتى يتعافى تماما من التخدير إلى الحالة الطبيعية. لاحظ أي شيء لوحظ غير طبيعي أثناء عملية الشفاء.
    ملاحظة: قد تكون مدة الشفاء أطول إذا استغرق إجراء حقن العصب وقتا طويلا.
  3. انقل الجرذ إلى قفص منزله مع طعام رطب على أرضية القفص. تأكد من توفر المياه طوال الوقت. راقب الجرذ بعد الجراحة لمدة ساعتين تقريبا للتأكد من أن الفئران لا تشعر بالبرد.
    ملاحظة: ضع الجرذ في مصدر حرارة لساعات إضافية إذا شعرت بالبرد.
  4. راقب الجرذ في 12 ساعة و 24 ساعة و 36 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد الجراحة مع ملاحظات مكتوبة بالملاحظات. كرر المسكنات وفقا لبروتوكول المؤسسي المعتمد للسيطرة على الألم. على سبيل المثال ، يتم إعطاء جرعات الكاربروفين بمعدل 5 مجم / كجم تحت الجلد مرتين بفاصل 24 ساعة. استشر طبيبا بيطريا إذا بقي الألم في الفئران لأكثر من 48 ساعة.
  5. كرر الحقن تحت الجلد بحوالي 3 مل 0.9٪ محلول ملحي دافئ في 24 ساعة بناء على ظروف الفئران.
  6. استمر في تقييم الجرح. تأكد من جفاف الجرح وأنه في طور الشفاء.
    ملاحظة: يمكن أن يكون احمرار وتورم وحالة الألم للجرح مع خمول وبهتان الفئران مؤشرا على التهاب الجرح وقد يستدعي استشارة بيطرية إضافية. سيظهر الجرذ المصاب بالألم ظهرا منحنيا ومعطفا مكشكشا وعيون حمراء وحالة غير نشطة. توجد عادة في زاوية من القفص.
  7. قم بإزالة الغرز غير القابلة للامتصاص في غضون أسبوعين بمجرد التئام الجرح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام ستة فئران بالغة (3 ذكور و 3 إناث) في هذه الدراسة. من بين ستة ، تم حقن فأر واحد عدة مرات لإثبات حالة فشل الحقن التي تظهر انتشار الصبغة حول موقع الحقن الشكل 5 أ. أظهرت جميع الفئران الأخرى حقنا سلسا وتلطيخا للأعصاب ، كما هو موضح في الشكل 4 ب والشكل 5 ب.

يوضح الشكل 1 حالة يحدث فيها تسرب الصبغة بين الإبرة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إجراء طريقة الحقن المباشر في العصب المبهم الأيسر بأمان وبدون مضاعفات ما بعد الجراحة في الفئران. يمكن استخدام توصيل الدواء إلى العصب المبهم لاستهداف الجهاز العصبي اللاإرادي (ANS). يتضمن ذلك بعض الخطوات الحاسمة التي تتطلب ممارسة ودرجة متوسطة إلى عالية من المهارة الجراحية.

يتطلب هذا الإجراء الجراحي تخديرا عاما متوازنا في الفئران. يهدف الجراح إلى إنهاء الجراحة في غضون فترة أقصر للحد من التعرض للتخدير من أجل تعافي أفضل ، خاصة في الفئران القديمة. تفترض هذه الط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفان NR و XC ليس لديهما تضارب في المصالح. RMB و SJG مخترعان للملكية الفكرية المتعلقة بنقل الجينات إلى ANS عن طريق حقن العصب المبهم (براءة اختراع الولايات المتحدة # 11،753،655). حصلت SJG و RMB على دخل من الإتاوات من Taysha Gene Therapies ، وحصلت SJG على دخل استشاري من Taysha Gene Therapies.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مرفق مركز موارد الجنوبي الغربي في UT لترتيب مساحة جراحية للفئران. تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل المصادر التالية ل SJG: NIH / NINDS R01 NS087175 ، وصندوق Hannah's Hope Fund ، و Taysha Gene Therapies.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل BD  حقنة توبركولين قابلة للفصل 25 جم × 5/8 بوصة. NeedleBecton و Dickinson and CompanySKU:309626تستخدم للاتصال بإبرة منحنية لسحب العصب المبهم والاحتفاظ به في وقت الحقن.
0.5٪ حقن هيدروكلوريد بوبيفاكائينHospiraNDC 0409-1162-19مخدر موضعي يستخدم لتخدير الأنسجة المحلية.
100 مل 0.9٪ ري كلوريد الصوديوم USPStericare Solutionsالبند # 6240محلول ملحي عادي ، يستخدم لترطيب الفئران والأنسجة.
20 بلانت ، أطراف ضام ، 7.5 ممKent Scientific CorporationSurgi 5018تستخدم لتفكيك الأنسجة والاحتفاظ بها في وقت الجراحة.
3 مل BD-Luer-Lok حقنة ، معقمة ، للاستخدام مرة واحدة Becton و Dickinson and CompanySKU # 309657تستخدم لحقن المحلول الملحي في الفئران وملء المحلول الملحي في أنبوب البوليثين.
AK-Fluor10٪AkornNDC 17478-253-10صبغة الفلورسين مرئية داخل العصب. تستخدم لتتبع دقة الحقن.
مقياس وزن شركةكينت العلميةSCL 4000يستخدم لقياس وزن جسم الفئران.
قفازات جراحية Ansell ENCORE Perry Style 42 PFAnsellASTM D3577Sterilie ، يتم استخدامه في وقت الجراحة من قبل الجراح.
مرهم الدموع الاصطناعية 3.5 جرامPivetalNDC 46066-753-55يستخدم في العين لمنع الجفاف المفرط للعينين.
بيبي ميكستر هيموستات أدوات العلوم الدقيقة13013-14تستخدم لوقف النزيف في حالة الطوارئ. تستخدم أيضا لثني الإبرة 25 جم × 5/8 بوصة.
BD Intramedic PE TubingBecton و Dickinson and Company14-170-12Aتستخدم في نظام إعداد الحقن للاتصال بإبرة هاميلتون وإبر NanoFil. كما أنه يحمل خليط الحقن.
إبرة BD Precison Glide ، 25 جم × 5/8 بوصةبيكتون وديكنسون وشركاهREF # 305122تستخدم لحقن المحلول الملحي في الفئران ولعمل إبرة منحنية.
إبرة انزلاقية BD Precison ، 27 جم × frac12 ؛ "بيكتون وديكنسون وشركاهREF # 301629تستخدم لملء المحلول الملحي المعقم في أنبوب BD Indermmic.
معيار Accuris " التاليبيت" مجموعة بدء تشغيل الماصات الدقيقة متغيرة الحجم تشتمل على 4 ماصات: 10/20/200/1000 مو ؛ L ، بالإضافة إلى حاملMilliporeSigmaBMSP7700S1يستخدم لمزق محلول معقم.
بيتادين, بوفيدين اليود 10٪ صادقيستخدم لتطهير منطقة الجراحة.
محلول الكاربروفين القابل للحقن 50 مجم / ملالمزود من Covtrus (6451506845)SKU 591149في حالتنا ، استخدمنا الكاربروفين المخفف بمعدل جرعة 5 مجم / كجم المقدم من مركز الموارد الحيوانية التابع للمركز الطبي بجامعة تكساس ساوث وسترن
إبرة منحنية (حسب الطلب)Becton و Dickinson and CompanyREF # 305122BD PrecisionGlide 25 G × 5/8 بوصة في إبرة منحنية إلى 90 درجة بمساعدة مرقئ. طرف الإبرة غير حاد. يجب تعقيمه قبل الاستخدام. يتم استخدامه لربط العصب المبهم والاحتفاظ به في وقت الانفصال والحقن.
تشريح المجهرMotic SMZ-171-BLED (مجهر مع أضواء)يستخدم لتكبير المنطقة التشريحية الحرجية في وقت انفصال العصب المبهم ، والإنجيسيتون ، والتحقق من تسرب الحقن.
ورقة الستارة DynarexReorder # 8122يستخدم كستارة بعد التعقيم.
قضيب طرف القطن Dukal ،دوكال9003يستخدم لتخفيف فصل الأنسجة ، يحتاج إلى التعقيم قبل الاستخدام.
Dumont # 7 -العلوم الدقيقة11274-20تستخدم لفصل العصب المبهم الأيسر عن الشريان السباتي المشترك. إنه منحني وسهل الاستخدام.
خياطة الشعيرات الأحادية غير المصبوغة من Ethicon PDS II - خياطة ، 4/0 18 PDS II CLR MONO PSEthiconVA - Z682Gتستخدم في خياطة الجرح.
خياطة Ethilon Nylon Black MonofilamentEthicon1856Gتستخدم في خياطة الجرح إذا تم استخدام خياطة غير ماصة. تستخدم أيضا لربط أسنان الفئران لإصلاح الأنف داخل مخروط الأنف.
ملقط ناعم - أدوات العلوم الدقيقة لإنهاء المرآة11412-11تستخدم في وقت انفصال العصب المبهم عن الشريان السباتي المشترك. هذا مستقيم.
مقص ناعم -أدوات العلوم الدقيقةشارب 14060-09تستخدم لقطع الأنسجة.
محلول تنظيف هاميلتونHT18311يستخدم لتنظيف هاميلتون بعد الاستخدام.
إبرة هاميلتون ، 27G ، إبرة RN ذات محور صغير ، 2 بوصة ، PT3 ، 6 / PKHamilton7762-01تستخدم لتوصيل BD Intramedic & trade ؛ أنابيب PE.
حقنة هاميلتون ، 710RN   ؛هاميلتون7638-01يستخدم لحمل المخدرات في وقت حقن العصب المبهم.
حقنة الأنسولينEXEL INT ، نقطة الراحةREF 26027تستخدم لحقن الكاربروفين والتخدير الموضعي.
ليدوكائين 2٪ حقنكوفيتروسإعادة ترتيب #002468يستخدم للخلط مع بوبيفاكائين والحقن في موقع الشق.
Luxol Fast Blue MBSNAcros Organics212170250صبغة مرئية داخل العصب ، وتستخدم للخلط مع الدواء بحيث يكون خليط الحقن مرئيا.
معقم الخرز الصغير مع أدواتالعلوم الدقيقةالزجاجي البند رقم 18090-46يستخدم لتعقيم الأدوات الجراحية بين جراحة الفئران.
إبر NanoFil-NF35BV-2 أداة الدقةالعالمية NC9708956لحقن خليط الصبغة المخدرات داخل العصب المبهم.
حاملات الإبر Olsen-Hegar مع قواطع خياطةأدوات العلوم الدقيقة12002-12تستخدم في خياطة الجروح.
فيلم تغليف مختبر Parafilm M ، 4 بوصات × 125 قدما ، 1 لفة لكل صندوق ، 12 عدصادقPM # 996يستخدم لعقد 5 ميكرولتر من خليط صبغة المخدرات بحيث يكون تحميل خليط صبغة الدواء في أنابيب BDTM< / sup> دقيقة  
PDI Alcohol Prep PadsHonestmedNDC 10819-3914-2تستخدم لتطهير المنطقة الجراحية.
إسفنج شاش معقم من النوع السابع للعناية المميزة ، 8 طبقات ، 2 × 2 بوصةدوكالالبند C5119يستخدم ككوشون تحت عنق الفئران في وقت الجراحة.
صحافة' n فيلم تتشبث الختمسعيديستخدم لتغطية فأر في وقت الجراحة مثل الستارة.
مجموعة ضام الفئرانKent Scientific CorporationSurgi 5002تستخدم لإبقاء الشق مفتوحا بحيث يسهل فصل العصب المبهم عن الشريان السباتي.
رايت تيمب جونيوركينت العلمية20.3 سم عرض × 25.4 سم طول (8 بوصات عرض × 10 بوصة طول) ، تستخدم للحفاظ على دفء الفئران.
رز & ملقط T - نصائح SuperGripأدوات العلوم الدقيقة00632-11تستخدم في وقت الخياطة لتثبيت الأنسجة دون تلف.
رز & T خياطة ربط ملقطأدوات العلوم الدقيقة00272-13تستخدم لتشديد الخياطة.
شفرة مشرط # 15أدوات العلوم الدقيقة10015-00تستخدم لعمل شق في الجلد في الجانب البطني من الرقبة.
مقبض مشرط- # 7أدوات العلوم الدقيقة10007-12تستخدم لحمل شفرة المشرط.
مضخة حقنة  دينار كويتي العلمي78-81-8052GL  #D107034 التسلسلي ، الموديل # LEGATO-180 ، عبارة عن مضخة قابلة للبرمجة يمكنها ضخ كمية صغيرة من الخليط تحت برنامج.
TipOne مرشح تلميح إعادة تعبئة أنظمة بدءالتشغيل الولايات المتحدة الأمريكية البند العلمي# 1120-3510تستخدم لماصة خليط الدواء والصبغة.
مبخر للإيزوفلوران ، مملوء بالقمعكينت العلميةVetflow 1231يستخدم لتخدير الفئران.
اللاصقة للأنسجة Vetbond3M Science المطبقة على LifeID B00016067تستخدم لإغلاق الأنسجة في موقع الجرح المقطوع إذا لم تكن الخياطة مثالية.
Wahl BravMini + Professional Cordless Clipper KitKent Scientific CorporationCL7300-Kitتستخدم لقص شعر الفئران.
قفاز 67618015017 عنصر غير معقم أدوات للخرز تستخدم شركة شركة المواد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: Technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
  2. O'donnell, M., Fontaine, A., Caldwell, J., Weir, R. Direct dorsal root ganglia (drg) injection in mice for analysis of adeno-associated viral (AAV) gene transfer to peripheral somatosensory neurons. J Neurosci Methods. 411, 110268(2024).
  3. Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).
  4. Rueter, L. E., Kohlhaas, K. L., Curzon, P., Surowy, C. S., Meyer, M. D. Peripheral and central sites of action for a-85380 in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. Pain. 103 (3), 269-276 (2003).
  5. Ulusoy, A., et al. Neuron-to-neuron alpha-synuclein propagation in vivo is independent of neuronal injury. Acta Neuropathol Commun. 3, 13(2015).
  6. Helwig, M., et al. Brain propagation of transduced alpha-synuclein involves non-fibrillar protein species and is enhanced in alpha-synuclein null mice. Brain. 139 (Pt 3), 856-870 (2016).
  7. Chiang, B., et al. Development of a novel suprachoroidal-to-optic-nerve (scone) drug delivery system. Drug Deliv. 31 (1), 2379369(2024).
  8. Ferrari, L. F., Cunha, F. Q., Parada, C. A., Ferreira, S. H. A novel technique to perform direct intraganglionar injections in rats. J Neurosci Methods. 159 (2), 236-243 (2007).
  9. Yuan, X. M., et al. Rapid injection of lumbar dorsal root ganglia under direct vision: Relevant anatomy, protocol, and behaviors. Front. Neurol. 14, 1138933(2023).
  10. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  11. Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
  12. Ertl, H. C. J. Immunogenicity and toxicity of AAV gene therapy. Front Immunol. 13, 975803(2022).
  13. Wayman, C., et al. Performing permanent distal middle cerebral with common carotid artery occlusion in aged rats to study cortical ischemia with sustained disability. J Vis Exp. (108), e53106(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AAV9

مقالات ذات صلة