Method Article

تحديد وتصنيف متغيرات المعنى الخاطئ لمستقبلاتGABA A الخاصة بالموقف لدورها في الخلايا العصبية الهرمية في الحصين

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة إطارا متعدد النطاقات ، يمتد من الحمض النووي إلى وظيفة البروتين والسلوك العصبي. يقدم نهجا جديدا للتحقيق في الطفرات المسببة للأمراض المتوقعة في الوحدة الفرعية لمستقبلات GABAA ، بافتراض أن طفرات الصرع والطفرات القريبة ، التي يتم التنبؤ بها على أنها مسببة للأمراض ، قد تنتج تأثيرات مماثلة على نموذج الخلايا العصبية الهرمية CA1.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم تأثيرات المتغيرات غير المعروفة وظيفيا في الجينات المرتبطة بالصرع أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للمرض وتطوير علاجات مخصصة. من خلال إطار متعدد النطاقات ، يمتد من تسلسل الحمض النووي إلى وظيفة البروتين والسلوك العصبي ، نصف نهجا جديدا للتنبؤ وافحص الطفرات المسببة للأمراض ، بافتراض أن طفرات الصرع في الوحدة الفرعية لمستقبلات GABAA والطفرات المتوقعة القريبة قد تنتج تأثيرات مماثلة على نموذج الخلايا العصبية الهرمية CA1. من خلال استكشاف العلاقات المميزة بين الطفرات المسببة للأمراض المتوقعة والطفرات الصرعية القريبة ، تهدف الدراسة إلى تقدير آثار الطفرات المتوقعة بناء على تأثيرات طفرات الصرع على محاكاة الخلايا العصبية الهرمية في الحصين.

تبدأ المنهجية بجمع البيانات الجينية للوحدة الفرعية لمستقبلات GABAA γ2 ، متبوعة بتنظيف البيانات وتنسيقها التي يتم إجراؤها في R باستخدام برنامج نصي مخصص. بعد ذلك ، سيتم تطبيق تنبؤات المجموعة لتحديد وتحديد أولويات المتغيرات الخاطئة المسببة للأمراض للوحدة الفرعية γ2 . سيتم توضيح رسم خريطة متغير ممرض معين (متوقع) إلى المجالات الهيكلية للوحدة الفرعية التي تشترك فيها طفرات الصرع ، مصحوبة بالنمذجة الجزيئية لآثارها والنظر في الحفظ التطوري. بعد ذلك ، سيتم إجراء التحليل التلوي الخاص بالمتغير وتطبيع المعلمات ، متبوعا بتحليل الارتباط لتحديد أي علاقات ذات دلالة إحصائية بين الطفرات المتوقعة وطفرات الصرع القريبة. باستخدام محاكي عصبي قائم على Python ، سيتم وصف نموذج الخلايا العصبية القائم على التوصيل متعدد المقصورات ، والذي يعكس تأثير الطفرات البرية والصرع. سيتم النظر في محاكاة الاستجابات العصبية الناتجة عن النوع الفرعي لمستقبلاتGABA A المنشأ للصرع من أجل التقدير التقريبي لتأثير المتغيرات المسببة للأمراض المتوقعة على الاستجابة العصبية. على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول يستكشف إطارا متعدد النطاقات لتقدير تأثيرات متغيرات مستقبلات GABAA على السلوك العصبي ، وهو أمر بالغ الأهمية لأبحاث الصرع. يمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة أساس لتعزيز التنبؤات بالأنماط الظاهرية الخلوية الناجمة عن المتغيرات المسببة للأمراض المحتملة لمستقبلات GABAA المرتبطة بالصرع.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لجميع الأمراض البشرية تقريبا ، يلعب التباين الجيني دورا مهما في القابلية الفردية. لذلك ، فإن فهم كيفية ارتباط اختلافات التسلسل بمخاطر المرض يوفر طريقة قيمة للكشف عن العمليات الرئيسية التي ينطوي عليها تطور المرض وتحديد مناهج جديدة للوقاية والعلاج1. ينطبق هذا أيضا على اضطرابات النمو العصبي ، والتي تصنف من بين الحالات الطبية المزمنة الأكثر انتشارا في الرعاية الأولية للأطفال2. توضح حالات مثل اضطراب طيف التوحد والإعاقة الذهنية والصرع كيف يؤثر التباين الجيني بشكل كبير على قابلية الفرد أثناء التطور3.

يكون الدماغ النامي أكثر عرضة لنوبات الصرع من الدماغ البالغ بسبب عدم تطابق النمو العصبي المبرمج وراثيا في التوازن الحاسم بين الإثارة والتثبيط4. نظرا لأن GABA (حمض جاما أمينوبوتيريك) ، وهو الناقل العصبي المثبط الأساسي في دماغ البالغين ، مثير أثناء التطور الجنيني والمبكر بعد الولادة ، فإن هذا ليس مواتيا للاستقرار اللازم لمنع النوبات في أدمغة الشباب. هذه الحالة المؤقتة ، الناجمة عن عدم وجود تعبير كاف عن الناقلات المشتركة K-Cl5 ، يمكن أن تسهم في زيادة خطر نشاط النوبة في وجود مستقبلات GABAA المختلة. تتوسط مستقبلات GABAA الإجراءات المثيرة والمثبطة ل GABA, اعتمادا على التركيز داخل الخلايا من Cl- أيون6. وبالتالي ، مع نضوج الدماغ ، يمكن أن تسبب الطفرات في جينات ترميز مستقبلات GABAA ، وكذلك في القنوات الأيونية الأخرى ، الاستثارة ، والطفرات في الجينات المشاركة في التمثيل الغذائي للخلايا العصبية ، وإشارات الخلايا ، وتكوين المشبك7 ، حالات مثل صرع غيابالطفولة 8.

تستفيد التدخلات السريرية بشكل متزايد من التحليل الجيني لتحسين الدقة في علاج اضطرابات النمو العصبي2. يقدم الاختبار الجيني في صرع الأطفال أهدافا محتملة لمناهج الطب الدقيق9 ، مما يسلط الضوء على أهمية المتغيرات الجينية في توجيه قرارات العلاج. بالإضافة إلى ذلك ، يتلقى ~ 25٪ من مرضى الصرع الذين يعانون من طفرات من جديد تشخيصات جينية تحدد الأهداف المحتملة للطب الدقيق ، مما يؤكد القيمة الكبيرة للمتغيرات الجينية في توجيه قراراتالعلاج 10. وقد تم تغذية ذلك من خلال التطورات في تقنيات تسلسل الجيل التالي ، مثل لوحات الجينات المستهدفة ، وتسلسل الإكسوم الكامل ، وتسلسل الجينوم الكامل ، والتي أدت إلى تسريع الاكتشافات الجينية بشكل كبير11. ومع ذلك ، فإن العدد المتزايد من الاكتشافات الجينية الجديدة يأتي مع تحد عندما تسفر النتائج عن متغير غير معروف الأهمية (VUS) ، وهو تصنيف يعكس أدلة متضاربة أو معلومات غير كافية فيما يتعلق بالدور الجزيئي للمتحور في التسبب في المرض. تتوافق المتغيرات المصنفة على أنها VUS مع فئة واحدة ضمن نظام تصنيف المتغيرات المكون من خمسة مستويات الذي اقترحته الكلية الأمريكية لعلم الوراثة الطبية وعلم الجينوم (ACMG) وجمعية علم الأمراض الجزيئي (AMP) 12.

تتطلب معالجة التحدي المتمثل في المتغيرات الجينية غير المعروفة وظيفيا بذل جهود عبر بعدين رئيسيين: الممارسة السريرية والبحث. سريريا ، يمكن أن يؤدي عدم اليقين المحيط ب VUS إلى تعقيد إدارة المرضى واتخاذ القرار13. من منظور البحث العلمي ، يعد تحديد المتغيرات المسببة للأمراض بين العدد المتزايد من المتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة وتحديد أدوارها في الفيزيولوجيا المرضية للمرض وتأثيرات النمط الظاهري أمرا بالغ الأهمية1. قد يتضمن أحد السيناريوهات المثالية التنبؤ بدقة بالتأثيرات الجزيئية والعصبية ومستوى الشبكة لجميع المتغيرات غير المميزة وظيفيا ، وبالتالي تقليل الموارد والوقت والجهد المطلوب للتحقيقات المعملية تؤكد هذه الجوانب على أهمية تصنيف المتغيرات الجينية بدقة لتمكين التشخيص الدقيق للصرع الوراثي ، ودعم العلاج الشخصي ، وتسهيل اكتشاف الأهداف الدوائية المحتملة. الأدوات التنبؤية الحالية14،15،16،17 دقيقة نسبيا ولكنها عادة ما توفر تصنيفات ثنائية فقط (مسببة للأمراض مقابل حميدة) وتفتقر إلى رؤى خاصة بالمرض في الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية ، والعواقب المظهرية ، والآليات الأساسية. مع التركيز على المتغيرات غير المعروفة للمعنى الخاطئ لجينات ترميز الوحدة الفرعية لمستقبلات GABAA المختارة ، تقدم هذه الورقة إطارا يهدف إلى تعزيز التوجيه البحثي من خلال دمج العوامل السياقية للمتغيرات مثل الجوانب الجزيئية والتطورية والهيكلية ، بالإضافة إلى محاكاة علم الأمراض العصبي المستمدة من البيانات الفيزيائية الحيوية في المختبر للطفرات المرتبطة بالصرع. تتناول منهجيتنا تحديد المتغيرات المسببة للأمراض غير المعروفة للوحدة الفرعية γ2 لمستقبلات GABAA ، وهي وحدة فرعية رئيسية تشارك في الفيزيولوجيا المرضية للصرع18،19،20. يتبع ذلك استكشاف المطابقة الخاصة بالموضع لهذه المتغيرات المتوقعة مع الطفرات المرتبطة بالصرع التي تتميز بالبيانات الهيكلية والفيزيولوجية الكهربية. ثم يتم استخدام هذه البيانات لتقدير التأثير المتغير على نموذج للخلايا العصبية الهرمية في الحصين التي تعبر عن نوع فرعي لمستقبلات GABAA ، تتكون من وحدات فرعية γ2 و α1 و β3 (مستقبلات γ2-GABAA) ، المسؤولة عن التثبيط المشبكيالسريع 6. من المهم ملاحظة أن مستقبلات GABAA تتجمع من مجموعة وحدات فرعية كبيرة (α1-α6 ، β1-β3 ، γ1-γ3 ، δ ، Ε ، θ ، π ، و ρ1-ρ3) واعتمادا على تكوين الوحدة الفرعية ، تختلف مستقبلات GABAA في تعديلها ، وخصائصها الفيزيائية الحيوية ، بالإضافة إلى أنماط التعبير الإقليمية والخلوية وتحت الخلوية إلى جانب وظائف محددة6،21،22،23 ، 24،25. وبالتالي ، تركز الدراسة الحالية على مستقبلات γ2-GABAA أو مستقبلات GABAA المحتوية على γ2 فقط.

تتكون الوحدات الفرعية لمستقبلات GABAA من سمات هيكلية مميزة - مجال طويل خارج الخلية الطرفية N (ECD) ، وأربعة مجالات تمتد عبر الغشاء (TM1 إلى TM4) ، ورابط داخل الخلايا يربط TM1 و TM2 ، ورابط خارج الخلية يربط TM2 و TM3 ، وحلقة كبيرة داخل الخلايا بين TM3 و TM4 (حلقة TM3-TM4) ، ومحطة C قصيرة خارج الخلية6،26 ، 27. يقترح أن يعمل مستقبل GABAA عبر آلية معقدة "قفل وسحب" ، حيث يقوم ربط GABA بقفل الوحدات الفرعية β و α ، مما يجعلها تسحب المجالات خارج الخلية (ECDs) للوحدات الفرعية ، وتدويرها عكس اتجاه عقارب الساعة27. تعمل هذه الحركة على ثني مجالات الغشاء (TMDs) ، وبالتالي فتح القناة الأيونية27. وبالتالي ، يبدو أن نشاط القناة منسق مع الكاسيت الهيكلي داخل مستقبلات GABAA. اتضح أن طفرات الصرع تسبب خللا وظيفيا في نشاط القناة عن طريق تشويه هذه الكاسيت الهيكلية28. وبالتالي ، تستند دراستنا إلى فكرة أن المتغيرات المسببة للأمراض المتوقعة بالقرب من طفرات الصرع المحددة وظيفيا في الكاسيتات الهيكلية المحددة للوحدات الفرعية لمستقبلات GABAA قد تظهر أنماطا مماثلة من التشويه الفيزيائي الكهربي أو الفيزيائي الحيوي في وظيفة القناة ، كما لوحظ في حالات هذه الطفرات الصرعية. في حين أن وجود أشرطة هيكلية مسببة للصرع في الوحدات الفرعية لمستقبلات GABAA 28 يدعم هذه الفكرة بشكل غير مباشر ، توضح دراستنا تعقيد وتحدي ربط المعلمات الفيزيائية الحيوية لطفرات الصرع مع تلك الخاصة بالطفرات المسببة للأمراض المتوقعة. للكشف عن هذه العلاقات المعقدة ، يعد إطار عملنا مهما لأنه يسلط الضوء على نهج متعدد النطاقات يتراوح من الحمض النووي إلى وظيفة البروتين والسلوك العصبي الحاسم لأبحاث الصرع. يدمج هذا النهج علم الوراثة الحسابي مع النمذجة الجزيئية والمحاكاة العصبية مع التأكيد أيضا على أهمية الأساليب التكميلية ، مثل التعلم الآلي المدرب على مجموعات البيانات الكبيرة ، والتي يمكن أن تلتقط تأثيرات الطفرات على بنية القناة والنشاط والاستثارة العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح محاكاة نشاط مستقبلات γ2-GABAA المنشأ للصرع على نموذج الخلايا العصبية الهرمية للحصين بتكرار النمط الظاهري الخلوي في المختبر المرتبط باعتلال قناة مستقبلات GABAA وإظهار استجابات الخلايا العصبية المفردة المتغيرة في مركز الخلل الوظيفي في الشبكة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. في التنبؤ بالسيليكو للمتغيرات المسببة للأمراض

  1. جمع بيانات المتغير
    1. باستخدام قاعدة بيانات ClinVar29 ، ابحث عن المتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة (VUS) في منطقة الترميز للجين محل الاهتمام عبر موقع الويب: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. أدخل رمز الجين (على سبيل المثال ، GABRG2) في شريط البحث وقم بتصفية النتائج لتشمل فقط الأنواع المطلوبة من المتغيرات ، مثل المتغيرات أحادية النيوكليوتيدات ، والمتغيرات الخاطئة ذات الأهمية غير المؤكدة. قم بتنزيل البيانات وحفظها ك data.xlxs (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S1). سجل تاريخ البيانات التي تم تنزيلها.
      ملاحظة: في البروتوكول الحالي ، سيتم تحليل الوحدة الفرعية البشرية γ2 لمستقبلاتGABA A ، وتحديدا الوحدة الفرعية لمستقبلات حمض جاما أمينوبوتيريك من النوع A Homo sapiens gamma2 (GABRG2) ، متغير النسخ 1 ، mRNA (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4) ، المعروف أيضا باسم γ2L. من المهم تسجيل النسخة المرجعية للجين محل الاهتمام بالإضافة إلى المعرفات المقابلة الأخرى عبر قواعد البيانات المختلفة (UniProt و ENSEMBL و PDB) نظرا لأن الطرق الحسابية المختلفة قد تتطلب معرفات مختلفة (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S2). في حالة عدم تعرف قاعدة البيانات أو الأداة الحسابية على أرقام إصدارات معرفات التسلسل، جرب كلا من المعرف برقم الإصدار (NM_198904.4) وبدون رقم الإصدار (NM_198904).
    2. المعلومات الأساسية للبروتين المرجعي
      1. في https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ قاعدة بيانات NCBI ، حدد النيوكليوتيدات في خيارات البحث وأدخل NCBI Ref. seq. معرف الجين محل الاهتمام (NM_198904.4). بعد ذلك ، من خلال التمرير لأسفل في العمود الأيمن ، انقر فوق البروتين ضمن فئة المعلومات ذات الصلة للعثور على البروتين (NP_944494.1) المشفر بواسطة النص NM_198904.4. باستخدام المعلومات المقدمة للبروتين NP_944494.1 ، سجل مواضع التسلسل للمناطق المحددة في شكل جدول (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S3).
        ملاحظة: من المهم تحديد المعلومات الأولية المعروفة لموضع التسلسل للمناطق أو الزخارف أو المخلفات الحرجة وظيفيا وهيكليا مثل مجالات البروتين ومواقع الفسفرة ومواقع ربط الترابط وواجهات التفاعل الجزيئي. يمكن تحقيق ذلك من خلال الجمع بين قاعدة البيانات (NCBI و ENSEMBL و UniProt ...) والبحث في الأدبيات.
  2. تنظيم البيانات المتغيرة
    1. تنظيم البيانات لتلبية متطلبات الإدخال للتنبؤات المختارة. تأكد من تنظيم تنسيق البيانات التي تم استردادها ليتوافق مع متطلبات http://database.liulab.science/dbNSFP خادم dbNSFP. للقيام بذلك، قم بإزالة الأعمدة غير الضرورية من الملف data.xlsx (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S1 من الخطوة 1.1.1)، مع الاحتفاظ بالأعمدة التالية فقط بالترتيب المحدد:
      "كروموسوم GRCh38" ، "GRCh38Location" ، "الاسم" ، "تغيير البروتين".
    2. احفظ الملف تحت اسم ملف جديد: "data1.xlsx" (الجدول التكميلي S4). قم بتهيئة الملف data1.xlsx في R عن طريق تشغيل التعليمات البرمجية (الملف التكميلي 1: Data_GABAA. R) ، والتي ستحفظ البيانات المنسقة بصيغة data1_output.xlsx (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S5) في دليل العمل ذي الصلة بمشروع R.
      ملاحظة: تتطلب الطرق الحسابية المختلفة أنواعا وتنسيقات بيانات مختلفة. يمكن أن يكون جمع البيانات وتنظيمها وفقا لمتطلبات التنسيق المحددة ، حتى بالنسبة لعشرات المتغيرات ، عرضة للأخطاء وتستغرق وقتا طويلا ، لذا فإن هذه الخطوة مهمة ما لم يكن تجمع المتغيرات يتكون من عدد قليل من المتغيرات فقط. بعد ذلك ، قد يكون التنظيم اليدوي للبيانات ممكنا.
  3. التنبؤ بالإمراضية
    1. انقل محتوى الملف data1_output.xlsx إلى الإصدار الأكاديمي من خادم dbNSFP30،31 الذي تم الوصول إليه عبر http://database.liulab.science/dbNSFP. للقيام بذلك ، قم بنسخ / لصق الملف أو تحميله مباشرة بتنسيق .txt .
    2. تأكد من تحديد الخيارات التالية مسبقا وتأكيدها في الخادم: HG38 (بناء الجينوم) و ClinPred32 و BayesDEL33 قبل الإرسال. في غضون بضع دقائق ، سيقوم الخادم بإنشاء النتائج.
      ملاحظة: في البروتوكول الحالي ، تم اختيار اثنين من المتنبئين الجماعيين ، وهما BayesDEL33 و ClinPred32 ، للدقةالعالية 34 والتطبيق العملي. ومع ذلك ، يمكن أيضا تحديد تنبؤات أخرى ، مثل AlphaMissense ، المتوفرة في قاعدة بيانات dbNSFP30،31 . يعتمد اختيار أدوات السيليكو على عدة عوامل ، بما في ذلك توليد خطوط متعددة كافية من الأدلة الحسابية للتنبؤ القوي12. يمكن أن تخدم التنبؤات الجماعية التي تدمج تحليل الخوارزميات التنبؤية المتعددة هذا الغرض.
    3. قم بتنزيل ملف الإخراج (بتنسيق .txt) واحفظه بتنسيق data2.xlsx (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S6).
    4. قم بتعيين المرشحات في data2.xlsx (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S6) بالنقر فوق خيار التصفية في القائمة وتحديد متغيرات الإجماع في كلا العمودين عن طريق التصفية ل D. سيعطي هذا قائمة بأكثر المتغيرات مسببة للأمراض. احفظه (انظر علامة تبويب الإجماع في الجدول التكميلي S6 [الملف التكميلي 4]).
  4. اختيار المتغير
    1. من بين التنبؤات المسببة للأمراض بالإجماع ، حدد المتغيرات في قرب طفرات الصرع التي تم الحصول عليها من الأدبيات. تأكد من أن هذا الأخير يحتوي على معلمات هيكلية وفيزيائية حيوية مناسبة لنمذجة الخلايا العصبية.
      ملاحظة: هذه الخطوة استكشافية وترتبط أيضا بمسح البروتين محل الاهتمام من حيث معاييره الهيكلية والفيزيائية الكيميائية والفيزيائية الحيوية. في هذه الدراسة ، تم الحصول على هذه البيانات من Brünger et al.35 و Guo et al.36 بالإضافة إلى مسح الطفرات المرتبطة بالصرع. إلى جانب ذلك ، كخيار ، تم الوصول إلى درجات AlphaMissense37 من قاعدة بيانات dbNSFP30،31 تكرارا الخطوة 1.3 (الملف التكميلي 4: الجدول التكميلي S7). ويرد مزيد من التفاصيل في قسمي البروتوكول 2-1-1 و2-1-2 وفي النتائج (انظر "المتغيرات التجميعية للمعلمات الهيكلية والفيزيائية الحيوية").
    2. للتصور الأساسي ، استخدم خوادم Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) و HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) لفحص المتغيرات في الخطوة السابقة في سياق طفرات جينية GABRG2 المختارة: P302L40 و K328M (أو K289M41 ، عند استبعاد ببتيد إشارة 39 متبقيا).
      ملاحظة: نظرا للتعقيد الهائل ، يجب إجراء التقييم الهيكلي للتأثيرات المتغيرة على مستويات متعددة من التحليل. ستسمح أدوات مثل Protter38 بالتصور الواضح للمتغيرات في سياق الميزات الطوبولوجية للبروتين ، وستعطي الخوادم سهلة الاستخدام مثل HOPE39 نظرة ثاقبة للتأثير المتغير عن طريق النمذجة الجزيئية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد مراجعة الأدبيات الشاملة للبروتين محل الاهتمام أمرا بالغ الأهمية لتحديد ودمج المعلومات حول الطفرات المرتبطة بالصرع.
    3. تحليل الحفظ التطوري والرؤى الهيكلية
      1. افتح Jalview42،43،44 ، وهو برنامج مفتوح المصدر لتحرير البروتينات وتصورها وتحليلها.
      2. استيراد التسلسلات للمحاذاة. انقر فوق ملف في القائمة العلوية | جلب التسلسلات. حدد قاعدة البيانات في مربع الحوار (مثل UniProt) ؛ انقر فوق علامة التبويب استرداد المعرفات ؛ وكما هو موضح في مربع الحوار ، أدخل معرفات انضمام UniProt للجين محل الاهتمام (GABRG2) من الأنواع البشرية والفقاريات الأخرى: P18507 ، P22723 ، Q6PW52 ، A0A2I3TKX0 ، F1RR72 ، A0A8I3MDZ2 ، A0A8M1P4D6. انقر فوق موافق.
        ملاحظة: أرقام انضمام UniProt للبروتينات المشفرة بواسطة GABRG2 هي كما يلي: P18507 (P18507-2) ل Homo sapiens ، P22723 ل Mus musculus ، A0A2I3TKX0 ل Pan troglodytes ، F1RR72 ل Sus scrofa ، A0A8I3MDZ2 ل Canis familiaris ، و A0A8M1P4D6 ل Danio rerio.
      3. اعتمادا على الجين محل الاهتمام ، قد لا يتم شرح بعض التسلسلات. لذلك ، قم بإجراء بحث BLAST لتحديد المعلومات ذات الصلة والمتماثلات المحتملة لفهم سياقي أفضل. في هذه الحالة ، قم بتحميل تنسيق FASTA لتسلسلات البروتين عبر خيار إضافة تسلسلات / من ضمن ملف القائمة لإنتاج محاذاة تسلسل متعددة للتسلسلات المطلوبة.
      4. بمجرد تحميل المحاذاة ، راقب التسلسلات المعروضة لمقارنة التسلسل المتعدد. يمثل كل صف تسلسلا، ويمثل كل عمود موضعا في المحاذاة. لتحديد أفضل طريقة للمحاذاة ، استخدم مناهج مختلفة ؛ على سبيل المثال ، انقر فوق خدمات الويب في قائمة التسلسل وحدد خيار تشغيل T-Coffee مع الضبط المسبق ، والذي يسمح بالمحاذاة المثلى.
      5. انقر بزر الماوس الأيمن على التسلسل P18507 Homo sapiens (التسلسل المرجعي في الدراسة الحالية) وقم بتعيينه كتسلسل مرجعي. اختر تنسيق في القائمة العلوية وانقر على التفاف لتصور المحاذاة الكاملة في الشاشة. في نفس قائمة التنسيق ، انقر فوق المقياس أعلاه لتحسين تصور أرقام بقايا معينة. لزيادة تحسين التصور ، اضبط أنظمة الألوان بالانتقال إلى اللون وتحديد خيارات مختلفة (على سبيل المثال ، اللون المزخرف ، الخاصية الكيميائية) ؛ قم بتعديل حجم الخط إذا لزم الأمر.
      6. انقر فوق حساب في شريط القائمة وحدد حساب تلقائي للإجماع لتمييز المناطق المحفوظة.
      7. ركز على موضع المتغيرات ذات الأهمية المحددة في خطوة التنبؤ في السيليكو وفحص مواضع متغيرة محددة. قم بالتعليق على بقايا معينة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن عليها وتحديد إضافة تعليق توضيحي. اكتب التسمية (على سبيل المثال ، معرف المتغير) برمز اللون المناسب واحفظها.
        ملاحظة: في التحليل الحالي ، تم اختيار P302L (أرجواني) و A303T (أحمر) لتصورهما في محاذاة التسلسل المتعدد جنبا إلى جنب مع البيانات الهيكلية (انظر القسم التالي).
    4. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبروتين الكامل تظهر المخلفات المحفوظة المختارة
      1. في الملف الذي تم الحصول عليه من الخطوة السابقة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق التسلسل المرجعي (GABRG2 human) وحدد بيانات الهيكل ثلاثي الأبعاد.
      2. حدد البيانات الهيكلية المناسبة (7QNE، السلسلة C)26 من القائمة المنسدلة وحدد فتح عرض هيكل جديد باستخدام Jmol.
        ملاحظة: سيسمح ذلك بدمج المخلفات المحددة في محاذاة التسلسل المتعدد في البيانات الهيكلية بواسطة Jmol ، وهو عارض مفتوح المصدر قائم على Java للهياكل الكيميائية ثلاثية الأبعاد.

2. اختيار المعلمة والنمذجة الفيزيائية الحيوية

  1. التحليل التلوي الخاص بالمتغير وتطبيع المعلمات
    1. مسح الأدبيات الحالية لجمع متغيرات الوحدة الفرعية المحددة مع توصيل قناة البيانات الفيزيولوجية الكهربية (gGABAA) ، ووقت التعطيل (إلغاء تنشيط τ) ، ووقت الارتفاع (ارتفاع τ) ، والحد الأقصى للسعة الحالية (Imax). قم بتوفير تركيبات الوحدات الفرعية ونوع الخلية وقياسات النوع البري لكل حالة. قم بتسمية المتغيرات ومراقبتها وفقا لذلك (على سبيل المثال ، المعروفة بالمتغيرات ذات الخصائص الفيزيائية الحيوية المحددة والتحكم المعروف لقياسات النوع البري لكل متغير).
    2. الحصول على درجات الإمراضية AlphaMissense للمتغيرات ذات الخصائص الفيزيائية الحيوية المحددة.
      ملاحظة: انظر قسم البروتوكول 1.3 لمزيد من التفاصيل.
    3. قم بإنشاء إطار بيانات مع الوحدة الفرعية وموضع الأحماض الأمينية لكل متغير ، والأحماض الأمينية الأصلية والمتغيرة ، ودرجة الإمراضية ، والمعلمات الفيزيائية الحيوية التي تم الحصول عليها من الأدبيات. لتجنب التناقضات التجريبية ، قم بتطبيع المعلمات الفيزيائية الحيوية للمتغيرات المحددة كتغييرات x في قياسات النوع البري.
  2. تحليل المتغيرات المقارن حسب الخصائص الهيكلية والوظيفية
    1. تنظيم المتغيرات المتوقعة على إطار البيانات ؛ التسمية وفقا لذلك (على سبيل المثال ، متوقعة للمتغيرات التي لا تتوفر فيها الأدبيات حول خصائصها الفيزيائية الحيوية).
    2. تصنيف المتغيرات حسب موقعها في تسلسل الأحماض الأمينية والبنية الثالثة. أضف معلمات التصنيف الهيكلي (على سبيل المثال ، التوطين في حلزونات ألفا ، والملفات ، وأوراق بيتا ، والمجالات خارج الخلية ، أو داخل الخلايا أو عبر الغشاء ، وبطانة المسام ، وربط ناهض ، وتفاعلات البروتين والبروتين) على إطار البيانات وقدم معلومات لكل متغير فيما يتعلق بموضع الأحماض الأمينية.
    3. صنف المتغيرات حسب المسافة إلى مركز الغشاء ومحور المسام. أضف مسافة إلى محور المسام والمسافة إلى معلمات مركز الغشاء على إطار البيانات.
    4. تحليل العلاقة بين المعلمات الهيكلية والفيزيائية الحيوية على المتغيرات المعروفة. إذا أمكن ، قم بتقييم المتغيرات المتوقعة فيما يتعلق بالارتباطات التي تم الحصول عليها.
  3. بناء نموذج المشبك والخلايا العصبية
    1. استخدم Brian245 ، وهو محاكي عصبي مفتوح المصدر تم تطويره في Python لنمذجة ومحاكاة الشبكات العصبية المتصاعدة ، لبناء نموذج فيزيائي حيوي متعدد الأجزاء لمشبك GABAergic على خلية عصبية هرمية متعددة الأجزاء قائمة على الموصلية متعددة الجزءات.
    2. صمم النموذج القائم على الموصلية من خلال تحديد حركية بوابات القناة الأيونية والمعلمات السلبية والنشطة وموصلات ما بعد المشبكي. حدد النموذج المستند إلى الموصلية كما هو موضح في الملف التكميلي 2 ، والذي يصف المعادلات المستخدمة في النموذج.
      1. اضبط سعة الغشاء (Cm) على أنها 1 μF / cm2 والمقاومة داخل الخلايا (Ra) على أنها 200 Ω.cm.
      2. استخدم الموصليات المعدلة من نوع هودجكين هكسلي للخلايا العصبية الهرمية للحصين39 مع gL = 0.0003 S / cm2 ، gK = 0.036 S / cm2 ، EL = -76.5 mV ، ENa = 50 mV ، و EK = -90 mV.
      3. اضبط توزيع كثافة قنوات NaV على gNa ك 0.05 S / cm2 ل soma ، و 0.5 S / cm2 للمقطع الأولي المحوري (AIS) وعقدة Ranvier (NR) ، و 0.005 S / cm2 للتشعبات. اضبط gK و gNa على أنها 0 في المقاطع النخاعي.
      4. بناء حركية بوابات القناة الأيونية ل NaV و KV كما هو موضح في الملف التكميلي 2.
      5. إدخال التيارات المشبكية (أناsyn) كمجموع لجميع نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاماتيرجيك و GABAergic في مقصورة. قم بتضمين كل من التيار السريع بوساطة مستقبلات AMPA (IAMPA) والتيار البطيء بوساطة مستقبلات NMDA (INMDA) في التيار الغلوتاماتيرجيك (Iglu). قم بتضمين تيار سريع بوساطة مستقبلات GABAA فقط في تيار GABAergic (IGABA). افترض أن كمية ثابتة من الغلوتامات يتم إطلاقها إلى المشبك لكل ارتفاع قبل المشبكي. لذلك ، فإن تنشيط المستقبلات يعتمد على وقت السنبلة (sAMPA وs NMDA) وتعكس الموصليات الكلية للمستقبلات (gAMPA و gNMDA) كمية الغلوتامات التي يتم إطلاقها بواسطة كل حدث.
      6. استخدم النموذج المشبكي كما هو موضح في الملف التكميلي 2.
        ملاحظة: للحصول على شرح مفصل للمعادلات ، راجع الملف التكميلي 2 الذي يصف المعادلات المستخدمة في النموذج.
    3. احصل على القطر المقاس تجريبيا للسوما والعصبيات وطول كل حجرة عصبية وأنماط متفرعة من الأدبيات السابقة46،47. تقليل مورفولوجيا الخلايا العصبية الحقيقية إلى نموذج متعدد الأجزاء ، عن طريق تقسيم الخلية إلى مقصورات متعددة ، تحافظ بدقة على الهيكل المتفرع الرئيسي وتحافظ على التماثل الثنائي.
    4. اضبط المورفولوجية (طول القطعة وقطرها ؛ أي d_soma: 30 ميكرومتر ؛ l_AH: 5 ميكرومتر ؛ d_AH_i: 1.5 ميكرومتر ؛ d_AH_f: 1.3 ميكرومتر ؛ l_AIS: 40 ميكرومتر ؛ d_axon: 1 ميكرومتر ؛ l_myseg: 100 ميكرومتر ؛ l_NR: 2 ميكرومتر ؛ l_AxTer: 4 ميكرومتر ؛ d_AxTer: 2 ميكرومتر ؛ l_approx: 100 ميكرومتر ؛ l_apmed: 100 ميكرومتر ؛ l_apdis: 200 ميكرومتر ؛ d_approx_i: 4 ميكرومتر ؛ d_approx_f: 3 ميكرومتر ؛ d_apmed : 2 ميكرومتر ؛ d_apdis: 2 ميكرومتر ؛ l_apLM: 70 ميكرومتر ؛ d_apLM: 2 ميكرومتر ؛ l_nAcDbasal: 400 ميكرومتر ؛ d_nAcDbasal: 1.4 ميكرومتر؛ l_nAcDbasal_stem: 20 ميكرومتر ؛ d_nAcDbasal_stem: 1.5 ميكرومتر) والمعلمات الفيزيائية الحيوية (كما هو موضح في القسم 2.3.2) لكل جزء من نموذج الخلايا العصبية الهرمية46،47 كما هو مفصل أيضا في نص بايثون (الملف التكميلي 3: GABAAvar.py).
    5. تحديد المعلمات الفيزيائية الحيوية لنموذج المشبك GABAergic من خلال تقييم قياسات التحكم من النوع البري التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.1.1.
  4. تصميم طوبولوجيا نموذج الخلايا العصبية وتعيين المعلمات المورفولوجية والفيزيائية الحيوية ، والتي تشمل تحديد الترتيب المكاني والترابط للمقصورات ، بناء على المعلومات المورفولوجية والمتفرعة التي تم الحصول عليها مسبقا. قم بتعيين المعلمات المورفولوجية المناسبة (على سبيل المثال ، طول القطعة وقطرها) والمعلمات الفيزيائية الحيوية (القسم 2.3.2) لكل جزء من النموذج ، كما هو موضح في الملف التكميلي 3: GABAAvar.py.
  5. بناء نقاط الاشتباك العصبي والحقن الحالي
    1. قم بإنشاء نشاط ما قبل المشبكي باستخدام SpikeGeneratorGroup (فئة من مكتبة Brian2) كما هو موضح في "GABAAvar.py" (الملف التكميلي 3). قم بتوصيل مولد السنبلة بالمقصورة المستهدفة للخلايا العصبية النموذجية باستخدام فئة Synapses لنمذجة الوصلات المتشابكة.
    2. قم بتعيين تيار ثابت مستمر (Iinj) على أنه 0.85 nA وضعه في soma لتقليد نشاط العتبة الفرعية المدفوع بحمل التيار الأيوني الأساسي في وقت معين كما هو موضح في الملف التكميلي 3: GABAAvar.py.
  6. لإنشاء شاشات تسجيل ، قم بتسجيل آثار الجهد من المقصورات المستهدفة باستخدام StateMonitor.
  7. بناء الشبكة وتشغيلها.
    1. قم ببناء الشبكة باستخدام الخلية العصبية النموذجية والاتصالات والشاشات باستخدام الشبكة.
    2. قم بتعيين الخطوة الزمنية للمحاكاة بواسطة defaultclock.dt (على سبيل المثال ، 0.01 مللي ثانية).
    3. قم بتشغيل المحاكاة على الشبكة باستخدام network.run(T*ms)، حيث يتم تعيين T على أنه 1,000 مللي ثانية في المثال.
  8. اختبار تأثير طفرات سوء فهم مستقبلاتGABA A
    1. حدد تأثير كل طفرة خاطئة على حركية القناة من خلال المعلمات الفيزيائية الحيوية التي تم جمعها في الخطوة 2.1.1.
    2. قم بتشغيل التحفيز عن طريق تغيير هذه المعلمات ورسم النتائج باستخدام "matplotlib.pyplot" كما هو موضح في "GABAAvar.py" (الملف التكميلي 3).
  9. مجموعات المعلمات التجريبية لتحليل التغييرات في أنماط ومعدلات إطلاق النار. ارسم نتائج المقارنات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم هذه الدراسة نهجا متعدد النطاقات للتنبؤ بالمتغيرات المسببة للأمراض وتوصيفها في الوحدة الفرعية γ2 لمستقبلات GABAA ، وهو مكون رئيسي في الفيزيولوجيا المرضية للصرع. من خلال استخدام النماذج التنبؤية ، والنمذجة الجزيئية ، والحفظ التطوري ، والفحص الهيكلي ، وتحليل الارتباط ، والمحاكاة العصبية ، يعزز هذا النهج تصنيف المتغيرات ، مع أهمية كبيرة لأبحاث الصرع وربما للاستخدام السريري. يتم عرض الملخص العام للمنهجية في الشكل 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال تطبيق مزيج من علم الوراثة الحسابي والنمذجة الجزيئية والمحاكاة العصبية ، فإن النهج المقدم في هذه الورقة لديه القدرة على تحسين تصنيف متغيرات مستقبلات GABAA ، مما يوفر رؤى قيمة لكل من أبحاث الصرع والتطبيقات السريرية. يتم تقديم تحليل شامل لتحديد الطفرات المسببة للأمراض المتوقعة وتحديد أولوياتها وتوسيعه في إطار من المحتمل أن يسد الفجوة بين التأثيرات المتغيرة على البروتين والنمط الظاهري الخلوي. يسمح تقييم تأثير نشاط مستقبلاتGABA A المنشأ الصرع على محاكاة الخلايا ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Çağla Koca على مساعدتها في بناء الخلايا العصبية النموذجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
بريان2 جامعة السوربون ، INSERM ، CNRS ، معهد الرؤية ، فرنسا. إمبريال كوليدج لندن ، المملكة المتحدة2.8.0.4ستيمبرج وآخرون ، 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
خادم dbNSFP    جينوس المعلوماتية الحيوية ذ.م.م ، الولايات المتحدة الأمريكيةالإصدار 3.0ليو وآخرون ، 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
الأمل   مركز المعلوماتية الجزيئية والجزيئية الحيوية CMBI ، جامعة رادبود ، هولندا   ؛1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
جالفيو    جامعة دندي ، المملكة المتحدةجي في 2ووترهاوس وآخرون ، 2009 (https://www.jalview.org/)
دفتر جوبيترمشروع Jupyter ، الولايات المتحدة الأمريكيةhttps://jupyter.org/install 
فيتونمؤسسة بايثون للبرمجيات ، الولايات المتحدة الأمريكية3.13https://www.python.org/downloads/
بروتر   ؛  ETH زيورخ، سويسراالإصدار 1.0Omasits، وآخرون، 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R مؤسسة R للحوسبة الإحصائية ، الولايات المتحدة الأمريكيةR الإصدار 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RStudioبرنامج Posit ، PBC ، الولايات المتحدة الأمريكيةRStudio 2023.12.1+402 إصدار "عاصفة المحيط"https://posit.co/downloads/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claussnitzer, M., et al. A brief history of human disease genetics. Nature. 577 (7789), 179-189 (2020).
  2. Savatt, J. M., Myers, S. M. Genetic testing in neurodevelopmental disorders. Front Pediatr. 9, 526779(2021).
  3. Hoischen, A., Krumm, N., Eichler, E. Prioritization of neurodevelopmental disease genes by discovery of new mutations. Nat Neurosci. 17, 764-772 (2014).
  4. Holmes, G., Ben-Ari, Y. The neurobiology and consequences of epilepsy in the developing brain. Pediatr Res. 49, 320-325 (2001).
  5. Rivera, C., Voipio, J., Kaila, K. Developmental switches in GABAergic signalling: the K+-Cl- cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII. J Physiol. 562, 27-36 (2005).
  6. Goetz, T., et al. GABA(A) receptors: structure and function in the basal ganglia. Prog Brain Res. 160, 21-41 (2007).
  7. Guerrini, R., et al. Monogenic epilepsies: disease mechanisms, clinical phenotypes, and targeted therapies. Neurology. 97 (17), 817-831 (2021).
  8. Matricardi, S., et al. Current advances in childhood absence epilepsy. Pediatr Neurol. 50 (3), 205-212 (2014).
  9. Sands, T. T., Choi, H. Genetic testing in pediatric epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 17 (5), 45(2017).
  10. Møller, R. S., et al. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1531-1538 (2015).
  11. Møller, R. S., et al. From next-generation sequencing to targeted treatment of non-acquired epilepsies. Expert Rev Mol Diagn. 19 (3), 217-228 (2019).
  12. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  13. Rehm, H. L., et al. The landscape of reported VUS in multi-gene panel and genomic testing: time for a change. Genet Med. 25 (12), 100947(2023).
  14. Katsonis, P., et al. Genome interpretation using in silico predictors of variant impact. Hum Genet. 141 (10), 1549-1577 (2022).
  15. Arslan, A. Pathogenic variants of human GABRA1 gene associated with epilepsy: a computational approach. Heliyon. 9 (9), e20218(2023).
  16. Abdullah, N. K., Arslan, A. Integrated bioinformatic approach for precision medicine: prediction of human GABRG2 gene pathogenic variants, characterized with cellular pathology and epilepsy phenotype severity. SDU J Nat Appl Sci. 28 (33), 300-315 (2024).
  17. Arslan, A. Algorithmic assessment reveals functional implications of GABRD gene variants linked to idiopathic generalized epilepsy. Int J Neurosci. 135 (5), 533-543 (2025).
  18. Kang, J. Q., Macdonald, R. L. Molecular pathogenic basis for GABRG2 mutations associated with a spectrum of epilepsy syndromes, from generalized absence epilepsy to Dravet syndrome. JAMA Neurol. 73 (8), 1009-1016 (2016).
  19. Komulainen-Ebrahim, J., et al. Novel variants and phenotypes widen the phenotypic spectrum of GABRG2-related disorders. Seizure. 69, 99-104 (2019).
  20. Lorenz-Guertin, J. M., et al. γ2 GABA(A)R trafficking and the consequences of human genetic variation. Front Cell Neurosci. 12, 265(2018).
  21. Korpi, E. R., Gründer, G., Luddens, H. Drug interactions at GABA(A) receptors. Prog Neurobiol. 67 (2), 113-159 (2002).
  22. Rudolph, U., Möhler, H. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr Opin Pharmacol. 6, 18-23 (2006).
  23. Whiting, P. J. GABAA receptors: a viable target for novel anxiolytics. Curr Opin Pharmacol. 6, 24-29 (2006).
  24. Arslan, A. Extrasynaptic δ-subunit containing GABAA receptors. J Integr Neurosci. 20 (1), 173-184 (2021).
  25. Arslan, A. Distinct roles of gamma-aminobutyric acid type A receptor subtypes: a focus on phasic and tonic inhibition. J Neurobehav Sci. 2, 72-76 (2015).
  26. Sente, A., et al. Differential assembly diversifies GABAA receptor structures and signalling. Nature. 604 (7904), 190-194 (2022).
  27. Masiulis, S., et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 565 (7740), 454-459 (2019).
  28. Hernandez, C. C., Macdonald, R. L. A structural look at GABAA receptor mutations linked to epilepsy syndromes. Brain Res. 1714, 234-247 (2019).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46 (D1), 1062-1067 (2018).
  30. Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. dbNSFP: a lightweight database of human non-synonymous SNPs and their functional predictions. Hum Mutat. 32 (8), 894-899 (2011).
  31. Liu, X., et al. dbNSFP v4: a comprehensive database of transcript-specific functional predictions and annotations for human nonsynonymous and splice-site SNVs. Genome Med. 12 (1), 103(2020).
  32. Alirezaie, N., et al. ClinPred: prediction tool to identify disease-relevant nonsynonymous single-nucleotide variants. Am J Hum Genet. 103 (4), 474-483 (2018).
  33. Feng, B. J. PERCH: a unified framework for disease gene prioritization. Hum Mutat. 38 (3), 243-251 (2017).
  34. Tian, Y., et al. REVEL and BayesDel outperform other in silico meta-predictors for clinical variant classification. Sci Rep. 9 (1), 2204(2019).
  35. Brünger, T., et al. Conserved patterns across ion channels correlate with variant pathogenicity and clinical phenotypes. Brain. 146 (3), 923-934 (2023).
  36. Guo, F., et al. Identifying protein-protein interface via a novel multi-scale local sequence and structural representation. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 483(2019).
  37. Cheng, J., et al. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense. Science. 381 (6664), eadg7492(2023).
  38. Omasits, U., et al. Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30 (6), 884-886 (2014).
  39. Venselaar, H., et al. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases: an e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics. 11 (548), 548(2010).
  40. Hernandez, C. C., et al. Altered channel conductance states and gating of GABAA receptors by a pore mutation linked to Dravet syndrome. eNeuro. 4 (1), (2017).
  41. Baulac, S., Huberfeld, G., Gourfinkel-An, I. First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy: a mutation in the γ2-subunit gene. Nat Genet. 28 (1), 46-48 (2001).
  42. Waterhouse, A. M., et al. Jalview version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  43. Troshin, P. V., et al. Java bioinformatics analysis web services for multiple sequence alignment-JABAWS:MSA. Bioinformatics. 27 (14), 2001-2002 (2011).
  44. Troshin, P. V., et al. JABAWS 2.2 distributed web services for bioinformatics: protein disorder, conservation and RNA secondary structure. Bioinformatics. 34 (11), 1939-1940 (2018).
  45. Stimberg, M., Brette, R., Goodman, D. F. M. Brian 2, an intuitive and efficient neural simulator. eLife. 8, e47314(2019).
  46. Traub, R. D., et al. A model of a CA3 hippocampal pyramidal neuron incorporating voltage-clamp data on intrinsic conductances. J Neurophysiol. 66 (2), 635-650 (1991).
  47. Hodapp, A., et al. Dendritic axon origin enables information gating by perisomatic inhibition in pyramidal neurons. Science. 377 (6613), 1448-1452 (2022).
  48. Abdulzahir, A., et al. Changes in memory, sedation, and receptor kinetics imparted by the β2-N265M and β3-N265M GABAA receptor point mutations. Int J Mol Sci. 24 (6), 5637(2023).
  49. Fisher, J. L. A mutation in the GABAA receptor alpha1 subunit linked to human epilepsy affects channel gating properties. Neuropharmacology. 46 (5), 629-637 (2004).
  50. Gallagher, M. J., et al. The juvenile myoclonic epilepsy GABAA receptor alpha1 subunit mutation A322D produces asymmetrical, subunit position-dependent reduction of heterozygous receptor currents and α1 subunit protein expression. J Neurosci. 24 (24), 5570-5578 (2004).
  51. Hernandez, C. C., et al. Dravet syndrome-associated mutations in GABRA1, GABRB2 and GABRG2 define the genetic landscape of defects of GABAA receptors. Brain Commun. 3 (2), fcab033(2021).
  52. Lin, S. X. N., et al. Correlations of receptor desensitization of gain-of-function GABRB3 variants with clinical severity. Brain. 147 (1), 224-239 (2024).
  53. Krampfl, K., et al. Molecular analysis of the A322D mutation in the GABA receptor α-subunit causing juvenile myoclonic epilepsy. Eur J Neurosci. 22 (1), 10-20 (2005).
  54. Shen, D., et al. De novo GABRG2 mutations associated with epileptic encephalopathies. Brain. 140 (1), 49-67 (2017).
  55. Janve, V. S., et al. Epileptic encephalopathy de novo GABRB mutations impair γ-aminobutyric acid type A receptor function. Ann Neurol. 79 (5), 806-825 (2016).
  56. Scheller, M., Forman, S. A. Coupled and uncoupled gating and desensitization effects by pore domain mutations in GABAA receptors. J Neurosci. 22 (19), 8411-8421 (2002).
  57. Hernandez, C. C., et al. GABAA receptor coupling junction and pore GABRB3 mutations are linked to early-onset epileptic encephalopathy. Sci Rep. 7 (1), 15903(2017).
  58. Homanics, G. E., et al. A gain-of-function mutation in the GABA receptor produces synaptic and behavioral abnormalities in the mouse. Genes Brain Behav. 4 (1), 10-19 (2005).
  59. Jatczak-Śliwa, M., et al. GABAA receptor β2E155 residue located at the agonist-binding site is involved in the receptor gating. Front Cell Neurosci. 14 (2), 2(2020).
  60. Đurišić, N., et al. SAHA (vorinostat) corrects inhibitory synaptic deficits caused by missense epilepsy mutations to the GABAA receptor γ2 subunit. Front Mol Neurosci. 11, 89(2018).
  61. Bai, Y. F., et al. Pathophysiology of and therapeutic options for a GABRA1 variant linked to epileptic encephalopathy. Mol Brain. 12 (1), 92(2019).
  62. Macdonald, R. L., et al. Mutations linked to generalized epilepsy in humans reduce GABA(A) receptor current. Exp Neurol. 184 (Suppl 1), S58-S67 (2003).
  63. Buhr, A., et al. Functional characterization of the new human GABA(A) receptor mutation β3(R192H). Hum Genet. 111 (2), 154-160 (2002).
  64. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  65. Sperk, G., et al. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience. 80 (4), 987-1000 (1997).
  66. Connor, J. X., et al. A GABAA receptor α1 subunit tagged with green fluorescent protein requires a β subunit for functional surface expression. J Biol Chem. 273 (44), 28906-28911 (1998).
  67. Kittler, J. T., et al. Analysis of GABAA receptor assembly in mammalian cell lines and hippocampal neurons using γ2 subunit green fluorescent protein chimeras. Mol Cell Neurosci. 16 (4), 440-452 (2000).
  68. Oflaz, F. E., Son, ÇD., Arslan, A. Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit. J Integr Neurosci. 18 (4), 341-350 (2019).
  69. Arslan, A., et al. Cytoplasmic domain of δ subunit is important for the extra-synaptic targeting of GABAA receptor subtypes. J Integr Neurosci. 13, 617-631 (2014).
  70. Lombardi, J. P., et al. Visualizing GABAA receptor trafficking dynamics with fluorogenic protein labeling. Curr Protoc Neurosci. 92 (1), 97(2020).
  71. Gadhia, A., et al. Functional analysis of epilepsy-associated GABAA receptor mutations using Caenorhabditis elegans. Epilepsia Open. 9 (4), 1458-1466 (2024).
  72. Ritter, D. M., et al. In silico predictions of KCNQ variant pathogenicity in epilepsy. Pediatr Neurol. 118, 48-54 (2021).
  73. Holland, K. D., et al. Comparison and optimization of in silico algorithms for predicting the pathogenicity of sodium channel variants in epilepsy. Epilepsia. 58 (7), 1190-1198 (2017).
  74. Leong, I. U., et al. Assessment of the predictive accuracy of five in silico prediction tools, alone or in combination, and two metaservers to classify long QT syndrome gene mutations. BMC Med Genet. 16, 34(2015).
  75. Tang, B. Optimization of in silico tools for predicting genetic variants: individualizing for genes with molecular sub-regional stratification. Brief Bioinform. 21 (5), 1776-1786 (2020).
  76. Dong, C., et al. Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Hum Mol Genet. 24 (8), 2125-2137 (2015).
  77. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  78. Anderson, D., Lassmann, T. An expanded phenotype centric benchmark of variant prioritisation tools. Hum Mutat. 43 (5), 539-546 (2022).
  79. Roy, R., Al-Hashimi, H. M. AlphaFold3 takes a step toward decoding molecular behavior and biological computation. Nat Struct Mol Biol. 31, 997-1000 (2024).
  80. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  81. Imrie, F., et al. AutoPrognosis 2.0: democratizing diagnostic and prognostic modeling in healthcare with automated machine learning. PLOS Digit Health. 2 (6), e0000276(2023).
  82. Zhu, S., et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor. Nature. 559 (7712), 67-72 (2018).
  83. Sun, C., Zhu, H., Clark, S. Cryo-EM structures reveal native GABAA receptor assemblies and pharmacology. Nature. 622, 195-201 (2023).
  84. Scott, S., Aricescu, A. R. A structural perspective on GABAA receptor pharmacology. Curr Opin Struct Biol. 54, 189-197 (2019).
  85. Kim, J. J., et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 585 (7824), 303-308 (2020).
  86. Stimberg, M., et al. Equation-oriented specification of neural models for simulations. Front Neuroinform. 8, 6(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GABAa Receptor VariantsMissense VariantsEpileptogenic MutationsHippocampal Pyramidal NeuronsPathogenic Mutation PredictionMolecular ModelingNeural SimulationEnsemble PredictorsEvolutionary ConservationConductance Based Model

Related Articles