مقالة منهجية

عزل واستزراع الخلايا الشحمية الأولية في الفئران من الفئران الخالية من الدهون والسمنة

4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67846

⸱

يناير 24, 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

أدى حجم وهشاشة الخلايا الشحمية الناضجة إلى الحد من التقنيات والأدوات المتاحة لدراستها وعزلها. هنا ، يتم وصف بروتوكول لعزل الخلايا الشحمية الناضجة من الفئران ، والتي يمكن تكييفها بسهولة مع مستودعات الدهون المختلفة ووجبات الفئران.

الملخص

تتكون الأنسجة الدهنية بشكل أساسي من الخلايا الشحمية الناضجة المحملة بالدهون من حيث الحجم. تلعب خلايا ما بعد الانقسام هذه دورا مهما في تخزين الطاقة وتعبئتها ، والتنظيم الحراري ، وإفراز عوامل الغدد الصماء. يؤدي توسع الأنسجة الدهنية البيضاء بسبب عدم توازن السعرات الحرارية إلى تضخم الخلايا الشحمية الموجودة وتوليد الخلايا الشحمية الإضافية من الخلايا السلفية الشحمية. ترتبط التغييرات التي تسببها السمنة في الأنسجة الدهنية البيضاء ، بما في ذلك تلك التي تصيب الخلايا الشحمية ، بالعديد من الأمراض المصاحبة ، مثل مرض السكري من النوع 2 و 13 نوعا من السرطان. من العوائق الكبيرة لدراسة كيفية مساهمة الخلايا الشحمية في المرض عدم القدرة على عزل الخلايا الشحمية الناضجة وثقافتها بسهولة. تصف هذه المقالة بروتوكولا لعزل الخلايا الشحمية الخالية من الدهون والسمنة من مستودعات الدهون تحت الجلد والحشوية للفئران C57BL / 6 من الذكور والإناث يوضح البروتوكول بالتفصيل كيف يمكن استزراع الخلايا الشحمية الأولية المعزولة في نظام تجميع الخلايا الشحمية الغشائية لمدة تصل إلى أسبوعين ، مما يسهل تحليلها الوظيفي في تجارب الزراعة المشتركة ، أو فحوصات تحلل الدهون ، أو من خلال جمع الوسائط المكيفة التي تحتوي على عوامل تفرز الخلايا الشحمية. بالإضافة إلى ذلك ، يحدد البروتوكول طرقا لزراعة نباتات الأنسجة الدهنية في قباب مصفوفة الغشاء القاعدي وتصوير الخلايا الشحمية الأولية المعزولة. الأهم من ذلك ، يمكن دمج هذا النهج مع البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا السلفية للخلايا الشحمية المقيمة في الأنسجة الدهنية باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). معا ، توفر هذه البروتوكولات للباحثين أدوات لدراسة الخلايا الشحمية وظيفيا ، والخلايا السلفية للخلايا الشحمية ، والأنسجة الدهنية الكاملة من الفئران النحيلة والسمنة الذكور والإناث.

المقدمة

من المتوقع أن يصل انتشار السمنة لدى البالغين في الولايات المتحدة إلى 50٪ بحلول عام 20301 ، مما يجعل من الضروري فهم الآثار الخلوية والفسيولوجية للسمنة بشكل أفضل. تتميز السمنة بعدم توازن السعرات الحرارية مما يؤدي إلى تمدد الأنسجة الدهنية البيضاء بسبب زيادة تخزين الطاقة على شكل دهون. يمكن أن يحدث توسع الأنسجة الدهنية من خلال توليد خلايا شحمية جديدة (تضخم) أو من خلال زيادة حجم الخلايا الشحمية الموجودة (تضخم). على الرغم من أن كلتا العمليتين تؤديان إلى توسيع الأنسجة الدهنية ، إلا أن التمدد الضخامي يتزامن مع انخفاض صحة التمثيل الغذائي وارتفاع حالات اضطرابات التمثيل الغذائي2،3. سيوفر الفهم الأفضل لتعقيدات الأنسجة الدهنية نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية التي تنظم اضطرابات التمثيل الغذائي وغيرها من الأمراض المصاحبة المرتبطة بالسمنة ، بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 والسرطانات.

لطالما حظيت الأنسجة الدهنية بتقدير دورها في تخزين الطاقة والتنظيم الحراري. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، ظهرت الأنسجة الدهنية كنسيج إشارات استقلابي مهم ، مسؤول عن إفراز المستقلبات والدهون والببتيدات4،5. هذه الجزيئات المشتقة من الأنسجة الدهنية ، والتي تسمى الأديبوكينات ، تشير محليا ونظاميا ويمكن أن تنظم توازن الطاقة ، ووظيفة المناعة ، وديناميكيات الأوعية الدموية ، وأكثرمن ذلك 5،6،7. تشكل الخلايا الشحمية الناضجة ما يقرب من 50٪ من الخلايا في الأنسجة الدهنية وتمثل الغالبية العظمى من حجم الأنسجة الدهنية8. الأهم من ذلك ، وجدت الدراسات أن الخلايا الشحمية تتكون من العديد من المجموعات السكانية الفرعية9،10. على هذا النحو ، تولد الخلايا السلفية الشحمية مجموعات متميزة من الخلايا الشحمية الناضجة بناء على عوامل مثل الجنس ومستودع الأنسجة الدهنية. يمكن تعديل هذه الخلايا الشحمية الناضجة بشكل أكبر من خلال التغييرات في النظام الغذائي والسمنة ، مما يؤدي إلى إنشاء مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الشحمية المتميزة من الناحية النسخية وتعبر عن توقيعات مختلفة من الباراكرين9،11،12،13،14،15،16. على الرغم من تعقيدها وأهميتها الفسيولوجية ، إلا أن القدرة على عزل الخلايا الشحمية الناضجة واستزراعها تظل عائقا واضحا أمام دراسة هذه الخلايا.

تستخدم الطرق المتاحة حاليا المستخدمة لعزل الخلايا الشحمية الناضجة التمايز عن الخلايا السلفية للخلايا الشحمية (APCs) ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت ، والتقنيات القائمة على الطرد المركزي ، على الرغم من أن كل هذه لها عيوبها الخاصة. يستخدم التمايز في المختبر أو خارج الجسم الحي من APCs إلى خلايا شحمية ناضجة على نطاق واسع لتطوير الخلايا الشحمية الناضجة. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا المتمايزة صناعيا متعددة الجذور ، وتحتوي على العديد من قطرات الدهون الصغيرة ، بدلا من النمط الظاهري أحادي الموقع للخلايا الشحمية الناضجة في الجسم الحي ، والتي تحتوي على قطرة دهنية كبيرة17. علاوة على ذلك ، وجدت الدراسات أن الخلايا المتمايزة في المختبر تختلف من الناحية النسخية عن الخلايا الشحمية الناضجة المعزولة الموجودة في الجسم الحي17. الأهم من ذلك ، أن التمايز في المختبر غير قادر على التقاط الفرق بين الخلايا الشحمية الخالية من الدهون والسمنة. يشيع استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS) لعزل مجموعات خلايا معينة من الأنسجة. ومع ذلك ، يمكن أن تنفجر الخلايا الشحمية الناضجة بسهولة في ظل ظروف FACS نظرا لحجمها الكبير وأغشيتها الهشة ، مما يجعلها طريقة غير فعالة لعزل الخلايا الشحمية الناضجة. تؤدي البروتوكولات الأخرى الموجودة إلى تراكم كميات كبيرة من الدهون الحرة ، والتي يمكن أن تكون سامة للخلايا الشحمية الناضجة في الثقافة بمرور الوقت.

هنا ، نصف بروتوكولا لعزل الخلايا الشحمية الناضجة في الفئران من الأنسجة الدهنية البيضاء. تم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول المزارع المجمعة للخلايا الشحمية الناضجة التي أنشأها في الأصل Harms et al.17; ومع ذلك ، فإن النهج القائم على الطرد المركزي الموصوف هنا يستخدم معدات مختبرية شائعة وقادر على عزل الخلايا الشحمية بكفاءة من كميات صغيرة (~ 0.5 جم) من الأنسجة الدهنية. هذا نظام قابل للتكيف بسهولة ، ويتم تضمين تعديلات لعزل الخلايا الشحمية الناضجة في الفئران من ذكور وإناث الفئران ، ومستودعات الدهون الحشوية وتحت الجلد ، وظروف النظام الغذائي المختلفة.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على الموصوفة من قبل لجنة استخدام ورعايتها بجامعة يوتا. تم تحسين هذا البروتوكول لعزل الخلايا الشحمية الناضجة من ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 8-16 أسبوعا ، مع أوزان جسم تتراوح من 20-45 جم. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد الحل

  1. تحضير الكولاجيناز عازلة. أضف 100 مجم من مسحوق الكولاجيناز ، و 1 مل من 1 M HEPES المؤقت ، و 500 ميكرولتر من 100x P188 ، و 50 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، و 0.05 جم من BSA ، و 48.45 مل من Medium 199. قم بتصفية المحلول المعقم ، وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. اصنع وسائط زراعة الخلايا. امزج 500 مل من DMEM و 50 مل من FBS و 5 مل من البنسلين الستربتومايسين و 5 مل من مكمل L-glutamine.

2. مجموعة مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء من الفئران

  1. قم بإعداد طبق 1 × 10 سم مع 200 ميكرولتر من HBSS لكل مستودع وحالة مختلفة حسب الاقتضاء وضعها على الجليد.
  2. استرجع من بيت وقتل الفئران رحيما وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدامه في المؤسسة. هنا ، تم القتل الرحيم للحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق.
  3. قم بوزن وتسجيل وزن كل فأر إذا كان ذلك مناسبا.
  4. عقم الماوس عن طريق رش 70٪ من الإيثانول لتغطية السطح الخارجي.
  5. حصاد منصات الدهون المناسبة من الفأر18،19.
    ملاحظة: احرص على إزالة الغدد الليمفاوية من المستودع تحت الجلد قبل وضع الأنسجة في الطبق.
  6. قم بوزن كل دهون وسجل الوزن.
  7. ضع وسادة الدهون في طبق 10 سم على الثلج.

3. تحضير مستخلصات الأنسجة الدهنية البيضاء

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.

  1. قبل 12 ساعة على الأقل من بدء التشريح، قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (Matrigel) عند 4 درجات مئوية على الجليد وقم بتبريد صندوق واحد من أطراف الماصة المعقمة سعة 200 ميكرولتر عند 4 درجات مئوية.
  2. باستخدام أطراف الماصة المبردة، ضع الماصة 80 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في وسط كل بئر من صفيحة استزراع مكونة من 24 بئرا لإنشاء قبة (الشكل 1 أ). ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) لمدة 30 دقيقة لتصلب المصفوفة جزئيا.
  3. تحضير الأنسجة: باستخدام مقص تشريح معقم ، قم بوزن 0.1 غرام من الأنسجة من كل عينة وضعها في PBS على الجليد.
  4. باستخدام ملقط معقم ، قم بتضمين الأنسجة الموزونة مسبقا في قبة المصفوفة الصلبة جزئيا. أضف 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي أعلى الأنسجة المضمنة. أعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة لتثبيت الأنسجة في مصفوفة الغشاء القاعدي.
    ملاحظة: يعد تضمين الأنسجة في مصفوفة الغشاء القاعدي أمرا بالغ الأهمية لضمان بقاء الأنسجة في الثقافة بدلا من الطفو. هذا يحافظ على صحة وجودة الأنسجة (الشكل 1 ب).
  5. أضف 1 مل من وسائط النمو (DMEM مع 10٪ FBS) إلى كل بئر والعودة إلى الحاضنة.

4. علاج الكولاجيناز

  1. احسب كمية محلول الكولاجيناز المطلوب. انظر الجدول 1.
  2. تحضير محلول الكولاجيناز باستخدام DNase. أضف 0.00017 جم من DNase لكل 1 مل من محلول الكولاجيناز. دوامة للخلط.
  3. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بفرم الأنسجة الدهنية المعزولة حتى تبدو الأنسجة متجانسة (الشكل 2 أ). انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
    ملاحظة: لا تفرط في اللحم المفروم. يكتمل الفرم عندما تبدو الأنسجة متجانسة وشبيهة بالعجينة. تبدو الأنسجة المفرومة مكتنزة وغير متجانسة ، وستؤدي الأنسجة المفرومة بشكل مفرط إلى إطلاق الدهون الحرة (الشكل 2 ب).
  4. أضف محلول الكولاجيناز المحضر ومحلول DNase إلى الأنسجة الدهنية المفرومة باستخدام الأحجام المحسوبة في الخطوة 4.1. دوامة بأقصى سرعة لمدة 7-10 ثوان للجمع جيدا. ضع 50 مل من الأنابيب المخروطية أفقيا في شاكر مضبوطة على 220 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية.
  5. احتضن الاهتزاز لمدة 10 دقائق ، ثم الدوامة لمدة 5 ثوان وتحقق من العينات. ستظهر العينات المهضومة بالكامل متجانسة مع عدم وجود كتل أو قطع نسيجية مرئية. إذا لم يتم هضم العينات بالكامل ، فاستمر في الهضم في الخلاط ، وتحقق كل دقيقتين (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: لا تفرط في الهضم. يمكن أن يؤدي الوقت المفرط في محلول الكولاجيناز إلى انهيار الخلايا الشحمية وإطلاق الدهون.
  6. استخدم ماصة مصلية لتمرير الأنسجة المهضومة عبر غربال إلى مخروطي جديد سعة 50 مل. أضف حجما من FBS يساوي حجم الأنسجة + محلول الكولاجيناز من خلال الغربال إلى مخروطي لتحييد الكولاجيناز.
    ملاحظة: ستبقى كمية صغيرة من الأنسجة في المنخل بعد التصفية.

5. غسل المناديل

ملاحظة: أكمل جميع الخطوات التالية في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة.

  1. قم بإعداد أنبوب 1 × 15 مل مع 10 مل من وسائط الاستزراع الدافئة لكل حالة.
  2. قم بتدوير الأنابيب من الخطوة 4.6 عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند درجة الحرارة المحددة في الجدول 1.
    ملاحظة: يجب تعديل درجة حرارة الطرد المركزي بناء على جنس الفئران التي تم عزل الأنسجة الدهنية منها. درجات الحرارة هذه متوفرة في الجدول 1.
  3. تأكد من أنه بعد الدوران ، ينفصل النسيج إلى أربع طبقات (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: الطبقة العليا هي الدهون الحرة ، والطبقة الثانية هي طبقة الخلايا الشحمية الناضجة ، والطبقة الثالثة هي الكولاجيناز و FBS ، والطبقة الرابعة هي الجزء الوعائي اللحمي (SVF) الذي ينتقل إلى أسفل20،21.
  4. تخلص بعناية من الطبقة العليا من الدهون الحرة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  5. بعد إزالة الطبقة العليا ، استخدم ماصة p1000 مع قطع الجزء السفلي لنقل الخلايا الشحمية الناضجة إلى أنبوب 15 مل مع 10 مل من وسائط النمو (الشكل 3 ب).
    1. اختياري: لعزل الخلايا السلفية الشحمية الأولية (APCs) ، قم بتدوير الأنابيب مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. ثم انتقل إلى عزل الخلايا السلفية الشحمية بواسطة Liu et al.22 أو Cho et al.23 أو ما شابه ذلك.
  6. اقلب الأنابيب سعة 15 مل مع الخلايا الشحمية الناضجة برفق 3-5 مرات حتى تنتشر الطبقة البيضاء في جميع أنحاء الوسائط.
  7. دع الأنابيب ترتاح في وضع مستقيم لمدة 10 دقائق عند درجة الحرارة الموضحة في الجدول 1 للسماح بفصل طبقات الخلايا الشحمية والوسائط.
  8. بعد 10 دقائق من الراحة ، قم بتدوير الأنابيب عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعزيز فصل الطبقات. بعد الدوران ، سيتم فصل العينات مرة أخرى إلى أربع طبقات ، كما هو موضح في الشكل 3 أ.
  9. قم بإزالة الطبقة العليا من الدهون الحرة والتخلص منها باستخدام ماصة.
  10. باستخدام إبرة 21 جم متصلة بحقنة سعة 5 مل ، حرك الإبرة لأسفل حافة الأنبوب حتى يصبح قاع الإبرة خاليا من طبقة الخلايا الشحمية الناضجة (الشكل 3 ج). تأكد من أن الجزء العلوي من الإبرة وأسفل المحقنة لا يزعجان طبقة الخلايا الشحمية الناضجة.
  11. اسحب المحقنة ببطء لإزالة وسائط الثقافة وأي حطام خلوي.
    ملاحظة: عند إزالة الوسائط ، تأكد من أن طرف الإبرة خال من طبقة الخلايا الشحمية الناضجة.
  12. أضف برفق 10 مل من وسائط الثقافة إلى كل أنبوب.
  13. كرر الخطوات 5.6-5.11. لا تضيف المزيد من وسائط الثقافة.
  14. باستخدام أطراف الماصة التي تحمل الجل، حرك طرف الماصة لأسفل حافة الأنبوب لإزالة الوسائط المتبقية من أسفل طبقة الخلايا الشحمية الناضجة.

6. التعبئة

  1. خلايا الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة عند درجة الحرارة الموضحة في الجدول 1. قم بإزالة الدهون الحرة (طبقة الزيت الشفافة فوق الخلايا) باستخدام ماصة. قم بإزالة وسائط المزرعة أسفل الخلايا الشحمية باستخدام طرف تحميل الجل. احرص على تقليل اضطراب طبقة الخلايا الشحمية (الشكل 4).
  2. كرر الخطوة 6.1 حتى تتم إزالة جميع وسائط المزرعة والدهون الحرة (عادة 3-5 مرات). يجب أن تكون حزمة الخلايا بيضاء اللون مع عدم وجود دهون حرة مرئية فوق الخلايا أو الوسائط أسفل الخلايا (الشكل 4).

7. الطلاء والمقايسات الوظيفية

  1. طلاء الخلايا الشحمية الناضجة لزراعة الخلايا
    1. قم بإزالة إدخالات مزرعة الخلايا من صفيحة 24 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة وضعها مع وضع جانب الغشاء لأعلى على سطح الغطاء.
    2. املأ الآبار المتناوبة من اللوحة ب 1 مل من وسائط الثقافة الدافئة.
    3. باستخدام طرف ماصة p200 مقطوع ، ضع 30 ميكرولتر من الخلايا الشحمية الناضجة المعبأة من الخطوة 6.2 على الجزء العلوي من ملحق الآبار (الشكل 5 أ ، ب).
    4. التقط بعناية وقم بعكس ملحق البئر وضعه في بئر مملوء مسبقا في اللوحة المكونة من 24 بئرا (الشكل 5 أ). ضع اللوحة بحذر في الحاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: يجب أن تشكل الخلايا الشحمية المعبأة بشكل صحيح طبقة معتمة مع عدم وجود قطرات دهنية خالية من الوضوح عند النظر إليها من الأعلى (الشكل 5 ج).
    5. قم بتغيير الوسائط على الخلايا الشحمية الناضجة كل 2-7 أيام لمدة تصل إلى 14 يوما.
      1. لإزالة الوسائط من الآبار ، أمسك البئر في مكانه ، واستخدم ماصة p200 لإزالة الوسائط بعناية من خلال الفتحات الصغيرة الموجودة على جانب ملحق البئر (الشكل 5 د).
      2. بمجرد إزالة الوسائط ، مع الاستمرار في تثبيت البئر في مكانه ، أضف ببطء شديد 1 مل من الوسائط إلى الجدار الجانبي للبئر.
        ملاحظة: احرص على إضافة الوسائط وإزالتها ببطء شديد. يمكن بسهولة إزاحة الخلايا الشحمية من الغشاء إذا تم تغيير الوسائط بسرعة.
  2. فحص تحلل الدهون
    1. نباتات الأنسجة الدهنية الصفيحية كما هو موضح في الخطوة 3.4 أو الخلايا الشحمية الناضجة كما هو موضح في الخطوة 7.1.
      ملاحظة: يجب زراعة الخلايا أو الأنسجة في وسائط خالية من الفينول الأحمر لمدة 24 ساعة على الأقل قبل إجراء فحص تحلل الدهون.
    2. تحضير المحلول: تحضير محلول 5٪ BSA في DMEM (بدون فينول أحمر) عن طريق إذابة 5 جم من BSA في 100 مل من DMEM. اقلبها برفق حتى تمتزج حتى يذوب BSA تماما.
      1. إعداد حلول العمل لوسائط التحكم والتحفيز. بالنسبة لوسائط التحكم ، اجمع بين وسائط BSA DMEM بنسبة 5٪ مع السيارة. بالنسبة لوسائط التحفيز، اجمع بين وسائط BSA DMEM بنسبة 5٪ مع 5 ميكرومتر من CL-316،243. قم بتسخين وسائط التحكم والتحفيز إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    3. قم بإزالة الوسائط من الآبار واغسلها ب 1 مل من DPBS الدافئ. املأ الآبار ب 500 ميكرولتر لكل بئر من وسائط التحكم أو التحفيز. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    4. في 1 ساعة و 2 ساعة و 4 ساعات و 24 ساعة بعد بدء مقايسة تحلل الدهون ، اجمع 100 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر في أنبوب طرد مركزي دقيق واستبدلها ب 100 ميكرولتر من وسائط التحكم أو التحفيز المناسبة.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية في هذه المرحلة.
    5. قم بتشغيل مقايسة الجلسرين اللونية باستخدام مجموعة الجلسرين المجانية المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) أو ما شابه ذلك.
      1. تحضير الكواشف حسب التوجيهات في المجموعة.
      2. قم بإذابة العينات وتخلط برفق عن طريق سحب العينات.
      3. قم بإعداد منحنى قياسي مع تخفيف تسلسلي من سبع نقاط و 2 أضعاف باستخدام محلول الجلسرين القياسي.
      4. انقل 25 ميكرولتر من العينة أو المعيار إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا ذات قاع شفاف.
      5. أضف 100 ميكرولتر من كاشف فحص الجلسرين الحر إلى كل بئر يحتوي على عينة أو محلول قياسي.
      6. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اقرأ الامتصاص عند 540 نانومتر (الشكل 6A-D).
  3. التصوير
    1. قم بإعداد شرائح التصوير. لإعداد الشرائح، قم بإزالة طبقة الورق الخلفي من كل فاصل تصوير وضعه على الشريحة. يمكن وضع فواصل تصوير جنبا إلى جنب في كل شريحة.
    2. باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 200 ميكرولتر، انقل 30 ميكرولتر من الخلايا الشحمية المعبأة من الخطوة 6.2 إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق.
    3. تحضير مزيج التلوين. تحضير 200 ميكرولتر لكل عينة من محلول تلطيخ غشاء البلازما عند 5 ميكروغرام / مل و Hoechst عند 4.5 ميكروغرام / مل في PBS. أضف مزيج البقع إلى العينات ورجه برفق.
    4. بقع عينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حماية العينات من الضوء.
    5. بعد اكتمال التلوين ، اغسل العينات. أضف 500 ميكرولتر PBS إلى كل عينة ورجه برفق حتى تمتزج. اتركه لمدة 5 دقائق. قم بالدوران بحجم 100 × جم لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بإزالة الوسائط من أسفل الخلايا بطرف ماصة تحميل الجل.
    6. تحضير الشرائح. قم بإزالة الفيلم البلاستيكي الشفاف من الجانب العلوي من فواصل التصوير لكشف الطبقة اللاصقة.
    7. أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب الخلايا الشحمية الملطخة واخلطها برفق.
    8. بسرعة ، حتى لا تسمح بالوقت للخلايا الشحمية الناضجة للارتفاع إلى السطح ، استخدم طرف ماصة p200 مقطوعا لوضع 35 ميكرولتر من الخلايا الشحمية داخل الفاصل على شريحة التصوير.
    9. ضع زلة غطاء على الفاصل.
    10. انتقل على الفور إلى التصوير (الشكل 6 ج). قد يؤدي التأخير في التصوير إلى نزيف علامة الغشاء.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 2 ، فإن الفرم المناسب (الشكل 2 ب) والهضم (الشكل 2 ج) مهمان لعزل الخلايا الشحمية الناضجة السليمة. يمكن أن يؤدي نقص الفرم ونقص الهضم إلى انخفاض إنتاجية الخلايا الشحمية الناضجة بسبب عدم كفاية الانفصال عن النسيج الضام. بصريا ، يمكن ملاحظة ذلك مع بقاء الأنسجة الخيطية بعد الفرم والكتل المرئية في محلول الكولاجيناز. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي الإفراط في فرم الهضم والإفراط في الهضم أيضا إلى انخفاض الغلة بسبب انفجار الخلايا الشحمية الناضجة. بصريا ، ينتج عن هذا فقدان الطبقة البيضاء غير الشفافة وتراكم طبقة دهنية كبيرة وواضحة وحرة. ستؤدي المستويات غير المناسبة من الفرم أو الهضم إلى ضعف عزل الخلايا الشحمية.

سيؤدي التحضير والهضم المناسبان للأنسجة الدهنية إلى فصل الأنسجة إلى أربع طبقات مميزة ، كما هو موضح في الشكل 3. بعض انفجار الخلايا الشحمية مما يؤدي إلى إطلاق الدهون الحرة أمر لا مفر منه. ومع ذلك ، فإن الفرم والهضم المناسبين سيضمن الحد الأدنى من تمزق الخلايا الشحمية. ستتم إزالة طبقة الدهون الحرة المتبقية والوسائط أثناء تعبئة الخلايا الشحمية (الشكل 4). التعبئة المناسبة للخلايا الشحمية ضرورية للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة. ستؤدي أي دهون أو وسائط حرة متبقية إلى ضعف العزلة وتؤثر سلبا على المقايسات الوظيفية النهائية ، مثل الطلاء وتحلل الدهون وتصوير الخلايا.

يولد هذا البروتوكول تحضيرا نظيفا للخلايا الشحمية الناضجة. يمكن إجراء تصوير الخلايا وفحوصات تحلل الدهون لتقييم الوظيفة الخلوية وإثبات أن الخلايا الشحمية الناضجة تحتفظ بالوظيفة بعد العزلة وبعد الاستزراع لمدة تصل إلى أسبوعين. يشير اختبار تحلل الدهون إلى أن الخلايا الشحمية الناضجة تحافظ على القدرة على الاستجابة للإشارات الخلوية من خلال إطلاق الجلسرين الحر عند تحفيز مستقبلات الأدرينالية β-3 (الشكل 6 أ ، ب). يتم الاحتفاظ بهذه القدرة حتى بعد أسبوعين في الثقافة وهي قابلة للمقارنة بشكل كبير مع نشاط تحلل الدهون لمصانع الأنسجة الدهنية المستزرعة لمدة 24 ساعة (الشكل 6C ، D). سوف تظهر الخلايا الشحمية ذات الجودة الرديئة تحلل الدهون المخفف. يظهر تصوير الخلايا الشحمية المعزولة الخلايا الشحمية الناضجة أحادية الموضع المستديرة والسليمة التي تحتوي على قطرة دهنية كبيرة واحدة. ستظهر عزلات الخلايا الشحمية ذات الجودة الرديئة في المقام الأول قطرات زيت كبيرة خارج الخلية تدل على انفجار الخلايا الشحمية.

figure-results-1
الشكل 1: تضمين مستخلصات الأنسجة الدهنية. (أ) صورة لقبة مصفوفة الغشاء القاعدي الصلبة جزئيا قبل تضمين الأنسجة. (ب) صور تمثيلية لتضمين الأنسجة بشكل غير لائق ومناسب. يظهر التضمين غير الصحيح حيث يبدو أن الأنسجة تطفو جزئيا أو كليا فوق القبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط الفرم والهضم السليم للأنسجة الدهنية. (أ) التمثيل التخطيطي لفرم الأنسجة وخطوات الهضم 4.2-4.6. (ب) صور تمثيلية للأنسجة السفلية والمثلى والأكثر فرصا. تحتوي الأنسجة المفرومة على قطع كبيرة تحتفظ بشكلها الأصلي. ينتج عن الأنسجة المفرومة زيادة واضحة في الدهون الحرة المحيطة بالأنسجة ، والتي تبدو شفافة وزيتية. (ج) صور تمثيلية للأنسجة تحت الأنسجة المثلى والمفرطة الهضم. تحتوي الأنسجة غير المهضومة على أجزاء من الأنسجة الكاملة المتبقية في المحلول. تظهر الأنسجة التي يتم هضمها بشكل مفرط طبقة دهنية حرة كبيرة تنفصل بسرعة عن المحلول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: فصل طبقات الأنسجة الدهنية المهضومة. (أ) صورة تخطيطية وتمثيلية للطبقات الموجودة بعد الخطوة 5.3. (ب) استخدام طرف ماصة مقطوع لإزالة طبقة الخلايا الشحمية الناضجة من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. (ج) التقنية المناسبة ووضعها للإبرة والحقنة لإزالة وسط الثقافة من أسفل طبقة الخلايا الشحمية الناضجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التعبئة المتسلسلة للخلايا الشحمية الناضجة. صور متسلسلة لتعبئة الخلايا الشحمية الناضجة. يتم تصنيف طبقات من الدهون الحرة والخلايا الشحمية والوسائط. بعد كل دورة ، تتم إزالة الدهون والوسائط الحرة. يتكرر هذا حتى لا تنفصل أي وسائط أو دهون حرة عن الخلايا الشحمية بعد الدوران. الصورة النهائية تمثل الخلايا الشحمية الناضجة المعبأة جيدا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: طلاء واستزراع الخلايا الشحمية الناضجة. (أ) تخطيطي لطلاء الخلايا الشحمية الناضجة. باستخدام طرف ماصة p200 مقطوع ، يتم وضع الخلايا الشحمية المعبأة على غشاء ملحق زراعة الخلايا. ثم يتم قلب الملحق في آبار مملوءة مسبقا من وسائط الثقافة. (ب) صورة تمثيلية للخلايا الشحمية الناضجة المطلية تصور طرف الماصة المقطوعة التي ترسيب الخلايا الشحمية على إدراج الآبار. (ج) المخططات والصور التمثيلية للخلايا الشحمية المعبأة بشكل صحيح والمعبأة بشكل سيئ المطلية بالآبار ، كما يتضح من فوق الآبار. تظهر الخلايا الشحمية المعبأة بشكل صحيح بيضاء وغير شفافة ، في حين أن الخلايا الشحمية المعبأة بشكل سيئ تؤدي إلى تكوين قطرات دهنية واضحة. (د) تخطيطي للتقنية المستخدمة لتغيير وسائط الثقافة. يتم استخدام طرف ماصة p200 لإزالة الوسائط بعناية من خلال الفتحات الموجودة في الجدار الجانبي لملحق البئر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تصوير الخلايا الشحمية الناضجة ومقايسة تحلل الدهون. (أ ، ب) إطلاق الجلسرين من الخلايا الشحمية الناضجة تحت الجلد (A) والحشوية (B). تم عزل الخلايا الشحمية من ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 16 أسبوعا والتي تغذت على نظام غذائي عادي. تم طلاء 30 ميكرولتر من الخلايا الشحمية كما هو موضح في الخطوة 7.1 وتم زراعتها لمدة 1 أو 10 أيام. عولجت الخلايا الشحمية ب 5 ميكرومتر من CL-316،243 لمدة ساعة واحدة و 2 ساعة و 4 ساعات ، وتم جمع المواد الطافية وتحليلها بحثا عن الجلسرين الحر. (ج، د) إطلاق الجلسرين من مستخلصات الأنسجة الدهنية تحت الجلد (C) والحشوية (D). تم عزل الأنسجة الدهنية من إناث الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 18 أسبوعا والتي تغذت على نظام غذائي طبيعي. تم طلاء 0.1 جم من مستخلصات الأنسجة الدهنية كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.4 وتم زراعتها لمدة 24 ساعة. عولجت الخلايا الشحمية ب 5 ميكرومتر من CL-316،243 لمدة ساعة واحدة و 2 ساعة و 4 ساعات ، وتم جمع المواد الطافية وتحليلها بحثا عن الجلسرين الحر. N = 3 مكررات تقنية ل A-D. جميع البيانات متوسطة ± انحراف معياري. (ه) صور تمثيلية للخلايا الشحمية الناضجة المعزولة تحت الجلد والحشوية. تم عزل الخلايا الشحمية من ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 16 أسبوعا والتي تغذت على نظام غذائي عادي. تم تلطيخ الخلايا الشحمية بصبغة غشاء البلازما (حمراء) وصبغة نوى Hoechst (زرقاء). قضبان المقياس: 50 ميكرومتر ؛ التكبير: 60x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جنسالنظام الغذائيمستودعصعوبة الفرمالكولاجيناز: نسبة الأنسجةوقت الهضم المقترح (دقيقة)تدور درجة الحرارة.درجة حرارة الغسيل.
أنثىطعام عاديتحت الجلدشاق2:112RT37 درجة مئوية
الحشويهمتوسط1:18RT37 درجة مئوية
نظام غذائي غني بالدهونتحت الجلدسهل1:18RT37 درجة مئوية
الحشويهسهل1:18RT37 درجة مئوية
ذكرطعام عاديتحت الجلدشاق2:1144 درجة مئويةRT
الحشويهمتوسط1:1104 درجة مئويةRT
نظام غذائي غني بالدهونتحت الجلدسهل1:1104 درجة مئويةRT
الحشويهسهل1:1104 درجة مئويةRT

الجدول 1: الجنس والمستودع والتعديلات الخاصة بالنظام الغذائي. صعوبة فرم كل نسيج ، الموصوفة بأنها "سهلة" أو "متوسطة" أو "صلبة" فيما يتعلق بالمستودعات الأخرى. لاحظ أن وقت الفرم الفعلي سيختلف حسب الباحث والأنسجة. الكولاجيناز: نسبة الأنسجة المدرجة على أنها حجم (مل) من محلول الكولاجيناز + DNase المحضر في الخطوة 4.1 إلى وزن الأنسجة (جم). وقت الهضم هو تقدير تقريبي ، لكن وقت الهضم الفعلي سيختلف وفقا للفرم والأنسجة. يجب على الباحثين تقييم الهضم كما هو موضح في البروتوكول. تختلف درجة حرارة الدوران ودرجة حرارة الغسيل بين ذكور الإناث والفئران. يشير RT إلى درجة حرارة الغرفة.

المناقشة

من المعروف أن الخلايا الشحمية الأولية يصعب عزلها وثقافتها لأنها تتمزق بسهولة ، كما أن حجمها الكبير يمنع استخدام أدوات عزل الخلايا الأولية الشائعة مثل قياس التدفق الخلوي. ينتج عن البروتوكول الموصوف هنا خلايا شحمية ناضجة نظيفة ووظيفية ، والتي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية. الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول يسمح بفصل الخلايا الشحمية الناضجة عن الحطام الخلوي الآخر وطبقة الدهون الحرة ، مما يسمح بالتصوير الفعال ، والثقافة ، ومقايسات تحلل الدهون. يمكن دمج البروتوكول بسهولة مع البروتوكولات المنشورة22،23 لعزل جزء الأوعية الدموية اللحمية و APCs. يوضح هذا البروتوكول أيضا بالتفصيل إجراء لإعداد واستزراع نباتات الأنسجة الكاملة من الأنسجة الدهنية ، والتي يمكن استخدامها في التطبيقات النهائية مثل فحوصات تحلل الدهون وجمع العوامل المفرزة من الأنسجة الدهنية الكاملة.

تشمل الجوانب الحاسمة الفرم السليم والهضم وإزالة طبقة الدهون الحرة. لضمان الفرم المناسب ، من المهم مراقبة المظهر المرئي للأنسجة عن كثب طوال العملية. يختلف الوقت والجهد اللازمان لتحقيق اللحم المفروم الأمثل للأنسجة اعتمادا على مستودع الأنسجة الدهنية والتدخلات الغذائية (مثل اتباع نظام غذائي غني بالدهون) والباحث. يمكن دمج أدوات أخرى للفرم ، مثل المقص ، إذا لزم الأمر ، ولكن لم يتم استكشاف ذلك هنا. وتجدر الإشارة إلى أنه يجب تجنب الإفراط في الفرم لأنه سيؤدي إلى تمزق الخلايا الشحمية ، مما لا يقلل فقط من العائد الفوري ولكن يقلل أيضا من إجمالي المحصول وجودة الخلايا الشحمية بسبب التأثير الضار لطبقة الدهون الحرة على الخلايا الشحمية المتبقية. يعتمد الهضم السليم ، على غرار اللحم المفروم المناسب ، على مستودع الأنسجة الدهنية ، والتدخلات الغذائية ، وعمر الفئران ، وما إلى ذلك. تساعد إضافة DNase إلى الكولاجيناز على منع تراكم الخلايا الشحمية أثناء الهضم ، والذي يمكن أن ينتج عن الحطام الخلوي. لذلك ، فإن وقت هضم الأنسجة متغير للغاية. تعمل التقديرات المقدمة لأوقات الهضم كدليل ، والذي يمكن العثور عليه في الجدول 1. ومع ذلك ، فإن أفضل طريقة لضمان هضم الأنسجة بشكل صحيح هي فحص الأنسجة بصريا طوال العملية وكما هو موضح في البروتوكول. تعتبر درجات حرارة الطرد المركزي والغسيل المختلفة المفصلة في الجدول 1 ، المقترحة بناء على الجنس ، ضرورية للفصل الصحيح للخلايا الشحمية الناضجة عن كل من الطبقة الدهنية الحرة وكذلك الحطام الخلوي الآخر و SVF. قد يؤدي استخدام درجات الحرارة البديلة إلى فقدان الخلايا الشحمية الناضجة بسبب التراكم وانفجار الخلايا الشحمية.

تعد إزالة طبقة الدهون الحرة في كل خطوة ذات أهمية حاسمة ، وسيؤدي عدم القيام بذلك إلى مضاعفات نهائية للطلاء والتصوير ومقايسة تحلل الدهون. علاوة على ذلك ، فإن الوجود المستمر لطبقة الدهون الحرة طوال الإجراء سيؤدي إلى موت إضافي للخلايا الشحمية بسبب السمية الدهنية ، مما يؤثر بشكل كبير على المحصول الإجمالي والجودة. في حين أن تعظيم كفاءة عزل الخلايا الشحمية الناضجة أمر مرغوب فيه بشكل عام ، فإن إزالة طبقة الدهون الحرة ، حتى على حساب بعض الخلايا الشحمية الناضجة ، سيؤدي إلى زيادة إجمالية في غلة الخلايا الشحمية الناضجة في نهاية البروتوكول.

تشمل قيود الإجراء عدد العينات. نظرا للصرامة والوقت المستغرقين في إزالة الوسائط وطبقة الدهون الحرة ، يقتصر الإجراء بشكل عام على ست عينات في المرة الواحدة. ستؤدي معالجة المزيد من العينات بشكل ملحوظ إلى تعرض الخلايا الشحمية الأولية للدهون الحرة لفترة طويلة جدا وتقليل العائد الإجمالي. ومع ذلك ، قد يسمح الموظفون الإضافيون بزيادة عدد العينات. يعد الوقت من الفرم إلى الفحص الوظيفي أمرا بالغ الأهمية لأن التأخير المفرط في إزالة الوسائط وطبقة الدهون الحرة يؤدي إلى انفجار إضافي للخلايا الشحمية الناضجة. البروتوكول محدود أيضا في القدرة على فصل مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الشحمية الناضجة.

تعتمد الطرق الحالية لدراسة الخلايا الشحمية الناضجة بشكل أساسي على عزل الخلايا المدرعة المدرعة والتمايز اللاحق لهذه الخلايا خارج الجسم الحي . بدأ تطوير طرق إضافية ، بما في ذلك نموذج الأعضاء على الرقاقة والثقافات المشتركة عبر البئر، 18،24. ومع ذلك ، فقد ثبت أن هذه الخلايا الشحمية المتمايزة خارج الجسم الحي متميزة من الناحية النسخية والشكلية عن الخلايا الشحمية الناضجة في الأنسجة الدهنية17. من الناحية الشكلية ، الخلايا الشحمية المتمايزة خارج الجسم الحي متعددة النوايا ، بينما الخلايا الشحمية المعزولة في الجسم الحي غير محصلة. تم تعديل هذا البروتوكول وتحسينه من التقارير السابقة17،25 لعزل وزراعة الخلايا الشحمية الناضجة بنجاح من أقل من 0.5 غرام من الأنسجة الدهنية مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي تتطلب ما لا يقل عن 5 غرام من الأنسجة الدهنية25 . أخيرا ، هدفت هذه الدراسة إلى توضيح الإكمال الناجح للخطوات الرئيسية في البروتوكول بدلا من الأوقات الملموسة ودرجات حرارة الطرد المركزي وكميات الكولاجيناز ، على الرغم من تضمين الإرشادات في الجدول 1. يجب تعديل هذه المعلمات وفقا لعوامل مثل مستودع الأنسجة الدهنية والجنس والسمنة لدى ، وكلها يمكن أن تؤثر على كفاءة الهضم والفصل النظيف للخلايا الشحمية الناضجة في هذا البروتوكول.

في المجموع ، يستغرق الإجراء من 3 إلى 4 ساعات ، اعتمادا على عدد الفئران المجمعة وعدد عينات الأنسجة الدهنية الفردية. من المتوقع أن تتيح القدرة على استزراع وتقييم الدور الوظيفي للخلايا الشحمية الناضجة العديد من التطبيقات النهائية لدراسة بيولوجيا الخلايا الشحمية نفسها (على سبيل المثال ، التمثيل الغذائي ، واستخدام المغذيات ، والتتبع) وتفاعل الخلايا الشحمية مع أنواع الخلايا الأخرى ، مثل APCs والخلايا السرطانية وخلايا الجهاز المناعي.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يرغب المؤلفون في الاعتراف بدعم المنح من 5 For The Fight and Huntsman Cancer Institute (KIH) ، ومؤسسة V لأبحاث السرطان (KIH) ، و DK133455 (KIH). مخططات البروتوكول التي تم إنشاؤها باستخدام Biorender. بالإضافة إلى ذلك ، يود المؤلفون أن يشكروا ستيفاني جيجنوكافو ومركز تصوير الخلية في جامعة يوتا للمساعدة في التصوير ، ومارك لي على التعليقات على المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100x Poloxamer 188 solutionSigmaP5556-100mL
15 مل مخروطيCellstar188261
21 جم إبرةBD305165
5 مل حقنةBD309646
50 مل مخروطيCellstar227261
6.5 مم Transwell مع 0.4 & micro ؛ m Pore Poly Membrane InsertCorning3413
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2< / sub>SigmaC1016-500gm
بقع غشاء البلازما CellMaskThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 ملح ثنائي الصوديومTocris1499
مسحوق الكولاجينازSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM no pheonol RedGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
مصل الأبقار الجنيني (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus GoldSlides Fisher Scientific1518848
جل تحميل Pipet TipFisher Scientific02-707-181
GlutaMAX SupplementGibco35050061
Glycerol Assay KitAbcamAB133130
Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Megafuge 16R الطرد المركزيThermo Scientific 75004271
Hoechst 33342 SolutionThermo Fisher Scientific62249
احتضان شاكر صغيرVWR12620-942
متوسط 199نظارات غطاء مجهر Sigma-AldrichM4530
VWR16004-302
PBSGibco10010023
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140-122
فواصل التصوير SecureSealGrace Biolabs654006
Seive (مصفاة كوكتيل شبكية دقيقة من SteeL)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html

المراجع

  1. Ward, Z. J., et al. Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity. N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).
  2. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  3. Longo, M., et al. Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications. Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).
  4. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  5. Johnston, E. K., Abbott, R. D. Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity. Cells. 12 (3), 407(2023).
  6. Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction. Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).
  7. Liu, P., et al. Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates. Sci Data. 10 (1), 453(2023).
  8. Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).
  9. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  10. Nahmgoong, H., et al. Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics. Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).
  11. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  12. Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. Adipose tissue at single-cell resolution. Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).
  13. Gao, Y., et al. Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).
  14. Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation. Cells. 8 (9), 1100(2019).
  15. Verma, S., et al. Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis. Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).
  16. Min, S. Y., et al. Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).
  17. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).
  18. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  19. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice. J Vis Exp. 167, e62005(2021).
  20. Farrar, J. S., Martin, R. K. Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes. Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).
  21. You, X., Gao, J., Yao, Y. Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review. Regen Ther. 27, 120-125 (2024).
  22. Liu, Q., et al. Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction. STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).
  23. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. J Vis Exp. 162, e61694(2020).
  24. Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. Next-generation human adipose tissue culture methods. Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).
  25. Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. 156, e60485(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة