مقالة منهجية

الاستفادة من الواقع الافتراضي للتجزئة الغامرة وتحليل بيانات التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني

DOI:

10.3791/67849

⸱

يناير 24, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Stony Brook University, 2Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 3Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) التصور ثلاثي الأبعاد للبنية فوق الخلوية بدقة نانومتر ، لكن التجزئة اليدوية لا تزال تستغرق وقتا طويلا ومعقدة. نقدم سير عمل جديدا يدمج برامج الواقع الافتراضي المتقدمة لتقسيم التصوير المقطعي بالتبريد ، مما يعرض فعاليته من خلال تجزئة الميتوكوندريا في خلايا الثدييات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) هو تقنية قوية لتصور البنية الفوقية للخلايا في ثلاثة أبعاد (3D) بدقة نانومتر. ومع ذلك ، فإن التجزئة اليدوية للمكونات الخلوية في بيانات cryo-ET لا تزال تمثل عنق الزجاجة الكبير نظرا لتعقيدها وطبيعتها التي تستغرق وقتا طويلا. في هذا العمل ، نقدم سير عمل تجزئة جديد يدمج برنامج الواقع الافتراضي المتقدم (VR) لتعزيز كفاءة ودقة تجزئة مجموعات بيانات cryo-ET. يستفيد سير العمل هذا من أداة الواقع الافتراضي الغامرة مع تفاعل ثلاثي الأبعاد بديهي ، مما يتيح للمستخدمين التنقل والتعليق على الهياكل الخلوية المعقدة في بيئة أكثر طبيعية وتفاعلية. لتقييم فعالية سير العمل ، قمنا بتطبيقه على تجزئة الميتوكوندريا في خلايا ظهارة صبغة الشبكية (RPE1). تظهر الميتوكوندريا ، الضرورية لإنتاج الطاقة الخلوية والإشارات ، تغيرات مورفولوجية ديناميكية ، مما يجعلها عينة اختبار مثالية. سهل برنامج الواقع الافتراضي التحديد الدقيق لأغشية الميتوكوندريا والهياكل الداخلية ، مما يتيح التحليل النهائي لهياكل الأغشية المجزأة. نوضح أن سير عمل التجزئة المستند إلى الواقع الافتراضي يحسن بشكل كبير تجربة المستخدم مع الحفاظ على التجزئة الدقيقة للهياكل الخلوية المعقدة في بيانات cryo-ET. يحمل هذا النهج وعدا بتطبيقات واسعة في بيولوجيا الخلية الهيكلية وتعليم العلوم ، مما يوفر أداة تحويلية للباحثين المشاركين في التحليل الخلوي التفصيلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدث التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) ثورة في قدرتنا على تصور المكونات الخلوية في حالتها شبه الأصلية بدقةعالية 1،2. تسمح هذه التقنية القوية للباحثين بتوصيف البنية الفوقية الخلوية ، مما يوفر رؤى غير مسبوقة للبنية الخلوية ووظيفتها. ومع ذلك ، فإن cryo-ET لا يخلو من قيوده ، وأهمها شرط أن تكون العينات رقيقة بما يكفي لتكون شفافة للإلكترون (عادة <0.5 ميكرومتر) للتصوير في المجاهر الإلكترونية القياسية القادرة على التبريد. مكنت التطورات الحديثة في طحن الحزمة الأيونية التي تركز على التبريد من ترقق العينات السميكة لتحليل cryo-ET3،4.

تبدأ مهام سير عمل cryo-ET النموذجية بجمع سلسلة إمالة ، حيث يتم تصوير العينة بزوايا مختلفة ، تتراوح من +60 درجة إلى -60 درجة. ثم تتم محاذاة هذه الصور حسابيا وإسقاطها إلى الخلف لإنشاء حجم ثلاثي الأبعاد (3D) أو مخطط مقطعي5،6،7. يعمل هذا التصوير المقطعي كخريطة ثلاثية الأبعاد مفصلة للمشهد الخلوي ، ويقدم معلومات مكانية وزمانية حول الهياكل الخلوية. يمكن أن يؤدي التحسين الإضافي من خلال متوسط المخطط الفرعي ، حيث تتم محاذاة نسخ متعددة من نفس الهيكل ومتوسطه ، إلى دفع حدود الدقة إلى أبعد من ذلك ، وأحيانا تحقيق دقة دون النانومتر7،8،9،10.

خطوة حاسمة في استخراج معلومات بيولوجية ذات مغزى من هذه التصوير المقطعي هي التجزئة. تتضمن هذه العملية التعليق على هياكل خلوية معينة ، مثل الأغشية ، داخل الحجم ثلاثي الأبعاد. يتيح التجزئة إجراء تحليلات متقدمة ، بما في ذلك حساب المسافات بين الأغشية وانحناء الغشاء ، مما يوفر رؤى قيمة للعمليات الخلوية11،12. في حين أن العديد من حزم البرامج متاحة لهذه المهمة ، بما في ذلك Dragonfly و Amira و MemBrain و EMAN2 و tomomemsegtv13،14،15،16،17 ، تظل عملية التجزئة عنق الزجاجة الكبير في تحليل بيانات cryo-ET. غالبا ما تكون عملية يدوية كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا ، ومن المحتمل أن تستغرق أسابيع إلى شهور لإكمالها. تقدم العديد من هذه الحزم ميزات تجزئة تلقائية ولكنها تتطلب في كثير من الأحيان تصحيحا يدويا مكثفا لإزالة الإيجابيات الخاطئة ، وهي عملية يمكن أن تكون شاقة وغير بديهية عند إجراؤها شريحة تلو الأخرى أو ثلاثية الأبعاد.

نقترح نهجا بديلا من خلال الاستفادة من تقنية الواقع الافتراضي (VR) لمواجهة هذه التحديات. يوفر الواقع الافتراضي طريقة غامرة وتفاعلية لتصور البيانات ، مما يسمح للمستخدمين بالتنقل عبر الحجم المقطعي كما لو كان داخل البيئة الخلوية نفسها. يوفر هذا النهج أيضا منصة قيمة لتعليم العلوم والاستكشاف العلمي واكتشاف بيانات cryo-ET في الموقع من خلال توفير تجربة غامرة وجذابة بشكل فريد. في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا لتجزئة بيانات cryo-ET باستخدام syGlass18 ، برنامج VR المصمم للتصور العلمي. يوفر هذا البرنامج مجموعة أدوات شاملة لتحليل بيانات cryo-ET ، بما في ذلك التجزئة اليدوية ، وتحسين التجزئة التي تم إنشاؤها تلقائيا ، وحتى انتقاء الجسيمات داخل التصوير المقطعي. توضح دراستنا جدوى الواقع الافتراضي كأداة قوية لتنظيف التجزئة وانتقاء الجسيمات والتجزئة اليدوية في تحليل بيانات cryo-ET.

لتوضيح فائدة برنامج VR لتجزئة cryo-ET ، نركز على تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في خلايا ظهارة صبغة الشبكية (RPE1). تعمل الميتوكوندريا كحالة اختبار ممتازة للتجزئة نظرا لهيكلها المعقد ووجود ميزات قابلة للقياس الكمي بسهولة ، مثل المسافة بين أغشية الميتوكوندريا الخارجية والداخلية. يمكن قياس هذه الميزات بدقة باستخدام أدوات تحليل القياس السطحي12 ، مما يوفر مقاييس قوية لتقييم جودة التجزئة. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لتجزئة بيانات cryo-ET باستخدام syGlass ، مما يدل على فائدتها داخل خط أنابيب تجزئة cryo-ET. من خلال دمج التجزئة المستندة إلى الواقع الافتراضي في سير عمل cryo-ET ، نهدف إلى تحسين كفاءة ودقة التحليل الهيكلي اليدوي في البيولوجيا الخلوية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد بيانات cryo-ET للتجزئة

  1. قم بتحويل المخططات المقطعية Cryo-ET الخام إلى تنسيق بيانات متوافق مع syGlass ، مثل مكدسات TIFF. اضبط الإشارة بحيث تكون الجسيمات بيضاء على سوداء ، وقم بإجراء معادلة الرسم البياني باستخدام ImageJ19.
    ملاحظة: لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، يوصى بإزالة التشويش المقطعي باستخدام برامج مثل Warp20 أو Topaz Denoise21 أو cryoCARE22,23 أو IsoNet24 قبل استيرادها إلى البرنامج.
  2. قم بتشغيل برنامج VR على الكمبيوتر. انتقل إلى قائمة "ملف" وحدد "إنشاء مشروع".
  3. انقر فوق إنشاء مشروع جديد | إضافة ملفات. انتقل إلى الموقع الذي يتم فيه حفظ ملفات TIFF ، واستيرادها إلى البرنامج.
  4. عند مطالبتك بتأكيد ما إذا كانت الملفات عبارة عن سلاسل زمنية، انقر فوق لا.
  5. قم بتسمية المشروع، ثم انقر على حفظ لإنشاء مشروع جديد ضمن قائمة المشاريع.
  6. انقر نقرا مزدوجا فوق المشروع لفتح التصوير المقطعي وتحميله في بيئة الواقع الافتراضي التفاعلية للبرنامج.

2. إعداد الواقع الافتراضي (VR)

  1. قم بتوصيل سماعة رأس VR ووحدات التحكم اليدوية بالكمبيوتر.
  2. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لمعايرة بيئة الواقع الافتراضي.
    ملاحظة: تشير المعايرة إلى المساحة ثلاثية الأبعاد حيث سيتم إجراء التجزئة. يجب تحديد المعلمات (الطول والعرض والارتفاع) لمساحة العمل قبل عرض عرض VR. سيكون إسقاط الواقع الافتراضي مرئيا فقط في هذه المعلمات.
  3. سيتم التجزئة فقط داخل مساحة العمل ثلاثية الأبعاد المحددة. تأكد من أن مجال الرؤية يحتوي على المنطقة المطلوب العمل عليها في بيئة الواقع الافتراضي.

3. تحسين التصور ثلاثي الأبعاد

  1. انقر فوق الزر "المرئي" في واجهة البرنامج. اضبط خيارات التصور المختلفة مثل أشرطة تمرير التباين والنوافذ والسطوع والعتبة لتحسين الإشارة وتقليل الضوضاء.
  2. استخدم وحدات التحكم اليدوية لسحب التصوير المقطعي بالقرب أو دفعه بعيدا حسب الحاجة.
  3. قم بتنشيط أداة القص باستخدام وحدة التحكم اليسرى لفحص الشرائح المختلفة داخل التصوير المقطعي بصريا.

4. عملية التجزئة

  1. انتقل عبر التصوير المقطعي إلى الشريحة المطلوبة حيث سيبدأ التجزئة.
  2. قم بتنشيط خيار منطقة الاهتمام (ROI) ضمن قائمة التعليقات التوضيحية باستخدام وحدات التحكم اليدوية. سيظهر مربع أخضر داخل التصوير المقطعي.
  3. اضبط حجم المربع الأخضر وموضعه ، وانقله إلى المنطقة المراد تقسيمها.
  4. قم بقفل عائد الاستثمار باستخدام وحدة التحكم اليسرى وابدأ التجزئة. بعد قفل عائد الاستثمار ، تتحول الأداة تلقائيا إلى وضع الطلاء الذي يسمح بتجزئة البيانات الحجمية.
  5. قم بتكبير أو تصغير المخطط المقطعي للتجزئة بدقة.
  6. اضبط حجم فرشاة الطلاء عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة للتحكم الأمثل.
  7. قم بتقسيم عائد الاستثمار بعناية (على سبيل المثال ، أغشية الميتوكوندريا) داخل المنطقة ثلاثية الأبعاد المحددة. في حالة حدوث خطأ أثناء التجزئة، اضغط مع الاستمرار على مشغل وحدة التحكم الثانوية لتشغيل وضع المسح ، ثم امسح الخطأ باستخدام نفس حركة التجزئة.
  8. كرر هذه العملية منطقة تلو الأخرى حتى يتم تقسيم المخطط المقطعي بالكامل.

5. تصدير البيانات المجزأة والتحليل

  1. بعد الانتهاء من التجزئة ، حدد المشروع بالنقر فوقه للتأكد من تمييزه.
  2. انقر على علامة التبويب "المشاريع" في الزاوية العلوية اليمنى، ثم حدد عائد الاستثمار.
  3. اختر تصدير وحدة التخزين بأكملها أو عائد استثمار معين. حدد موقع التصدير للبيانات المجزأة.
  4. قم بتحميل وتحليل البيانات المجزأة باستخدام البرنامج المفضل وإنشاء أرقام للنشر.

6. استيراد قناع ثنائي إلى البرنامج للتنظيف

  1. قم بتنفيذ الخطوات 1.1-1.6.
  2. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المشروع وانقر فوق إضافة بيانات القناع. بعد ذلك، انتقل إلى مكان حفظ التجزئة الأولية واستيراده ضمن نفس المشروع.
  3. قم بإشراك التعليق التوضيحي لعائد الاستثمار لإجراء تعديلات على التجزئة الأولية.
  4. إضافة/مسح التجزئة لتنظيف التجزئة الأولية.
  5. اضبط عائد الاستثمار للقناع ضمن خيار عائد الاستثمار في علامة التبويب الأقنعة . لتغيير عائد الاستثمار للقناع من واحد إلى آخر ، قم بتشغيل خيار القناع فوق الكتابة الوحيد وانتقل إلى وضع الطلاء باستخدام وحدة التحكم اليدوية. سيقوم هذا الوضع فقط بالكتابة فوق بيانات القناع المرئية.
  6. قم بتصدير عائد الاستثمار للقناع المعدل باستخدام الخطوات الموضحة في الخطوات 5.1-5.3.

7. انتقاء إحداثيات الجسيمات باستخدام برنامج VR

  1. قم بإنشاء مشروع باستخدام التصوير المقطعي (مكدس TIFF) باستخدام الخطوات الموضحة في القسم 1.
  2. انقر فوق التعليق التوضيحي | Count ، مما يفتح نافذة بها خيارات يدوية أو آلية .
    1. بالنسبة للخيار اليدوي ، اختر لونا للتهم ، وابدأ في وضع علامة على الإحداثيات.
    2. بالنسبة للخيار التلقائي، اختر حجم الخلية وأدخل الدقة. انقر فوق تشغيل العد التلقائي ، وقم بتحرير التهم (احتفظ بالاختيارات الجيدة وتجاهل الاختيارات السيئة) ، واحفظ التقدم.
  3. قم بتصدير إحداثيات العد بالنقر فوق علامة التبويب المشروع | التعليقات التوضيحية.
    1. بالنسبة لأصل التعليقات التوضيحية، اختر الزاوية السفلية اليسرى وبالنسبة لوحدات التعليقات التوضيحية، اختر Voxels.
    2. انقر فوق خلية نقاط العد لتمييز الخلية.
    3. انقر فوق تصدير المحدد لحفظ إحداثيات التحديد في ملف .csv.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا الملف لاستخراج المخططات الفرعية من التصوير المقطعي لمتوسط المخطط الفرعي

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، قمنا بتقسيم الصور المقطعية التي تحتوي على الميتوكوندريا والعضيات الغشائية الإضافية (على سبيل المثال ، الحويصلات والشبكة الإندوبلازمية) باستخدام syGlass. تم إعادة بناء التصوير المقطعي في البداية في Warp باستخدام الإسقاط الخلفي المرجح عند 16.00 Å / بكسل وتعرضت لتصحيح الإسفين المفقود وتقليل الضوضاء باستخدام برنامج IsoNet. تم إخضاع التصوير المقطعي التالي لمعالجة إضافية للاستيراد كما هو موضح في الشكل 1 أ (انظر أيضا الفيديو التكميلي S1 ، والفيديو التكميلي S2 ، والفيديو التكميلي S3 ، والفيديو التكميلي S4).

بعد المعالجة المسبقة ، تم تحويل المخططات المقطعية بتنسيق MRC إلى مكدسات TIFF باستخدام ImageJ ، مع تطبيق انعكاس التباين لجعل الأغشية تبدو بيضاء على خلفية سوداء. ثم تم إجراء معادلة الرسم البياني لتعزيز التباين بشكل أكبر. هذا يسمح أيضا بتحديد عتبات أكثر فعالية. تم استيراد مداخن TIFF وتصورها في 3D في بيئة VR غامرة ، مما يوفر فحصا مفصلا للهياكل الغشائية باستخدام أداة القطع في البرنامج الموضح في الشكل 1 ب.

تم إجراء التجزئة اليدوية في البرنامج ، مع ضبط النوافذ على تعديلات تلقائية والسطوع / العتبة لتحسين رؤية الميزة الخلوية. تم تحديد عائد الاستثمار حول الميتوكوندريا والهياكل الأخرى باستخدام وحدات التحكم في الواقع الافتراضي. سمحت أداة التجزئة بتحديد دقيق لحدود الغشاء ، مع تصحيح الأخطاء باستخدام وظيفة المسح. يضمن التنقل شريحة تلو الأخرى أو ثلاثي الأبعاد باستخدام أداة عائد الاستثمار لتجميع المناطق في جميع أنحاء التصوير المقطعي ، جنبا إلى جنب مع أداة فرشاة الطلاء القابلة للتعديل ، تجزئة دقيقة لأغشية الميتوكوندريا والعضيات الأخرى كما هو موضح في الشكل 1 ج.

تم تصور البيانات المجزأة عن طريق إنشاء شبكة باستخدام خيار أسطح أداة عائد الاستثمار ، مع ضبط التكرارات على 12 وضبط مستوى الدقة على 3. توضح العروض ثلاثية الأبعاد النهائية بوضوح هياكل الميتوكوندريا ، بما في ذلك الأغشية الخارجية والداخلية ، والكريستا ، ورواسب فوسفات الكالسيوم كما هو موضح في الشكل 1D (انظر أيضا الفيديو التكميلي S5 ، والفيديو التكميلي S6 ، والفيديو التكميلي S7 ، والفيديو التكميلي S8).

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل تصور التصوير المقطعي والتجزئة والعرض ثلاثي الأبعاد باستخدام syglass. (أ) شرائح التصوير المقطعي لخلايا RPE1 ذات الحواف الرفيعة. المخططات المقطعية المصححة ب IsoNet التي أعيد بناؤها في Warp واستخدامها للتجزئة باستخدام syGlass ، والتي تم تصورها باستخدام IMOD25. تم جمع التصوير المقطعي على مجهر Titan-Krios 300 كيلو فولت المجهز بكاشف K3 وركزت على الحواف الرقيقة لخلايا ظهارة الشبكية. يحتوي كل مخطط مقطعي على ميتوكوندريا واحدة على الأقل إلى جانب العديد من العضيات الأخرى المرتبطة بالغشاء. هذه الصور ثابتة هي صور من مقاطع فيديو معروضة في الفيديو التكميلي S1 والفيديو التكميلي S2 والفيديو التكميلي S3 والفيديو التكميلي S4. (ب) التصوير المقطعي المقابل المرئي في البرنامج. تم إنشاء شريحة التصوير المقطعي باستخدام أداة القطع في برنامج الواقع الافتراضي بعد تحسين العتبة والسطوع والنوافذ ، مما يكشف عن الهياكل الخلوية المميزة. (ج) التصوير المقطعي المرئي في البرنامج باستخدام أغشية مجزأة. شريحة التصوير المقطعي التي تم إنشاؤها باستخدام أداة القطع في برنامج VR ، متراكبة مع التجزئة المقابلة. تظهر رواسب فوسفات الكالسيوم باللون الأصفر ، وأغشية الميتوكوندريا في السماوي ، وأغشية أخرى مثل الحويصلات وغشاء البلازما باللون الأرجواني. (د) عرض ثلاثي الأبعاد للأغشية المجزأة في syGlass. تظهر أغشية الميتوكوندريا ، بما في ذلك أغشية الميتوكوندريا الكريستا والخارجية والداخلية ، باللون السماوي. رواسب فوسفات الكالسيوم باللون الأصفر أو الأخضر ، والحويصلات وغشاء البلازما باللون الأرجواني ، والشبكة الإندوبلازمية باللون البني. هذه الصور ثابتة هي صور من مقاطع فيديو معروضة في مقاطع الفيديو التكميلية S5 والفيديو التكميلي S6 والفيديو التكميلي S7 والفيديو التكميلي S8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو التكميلي S1: التصوير المقطعي لعينة RPE-1_1 المستخدمة للتجزئة في هذه الدراسة. يتم إعادة بناء هذا التصوير المقطعي بمعدل 16 Å / بكسل باستخدام الاعوجاج ، ثم إزالة الضوضاء وتصحيحه للإسفين المفقود باستخدام IsoNet. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S2: التصوير المقطعي لعينة RPE-1_2 المستخدمة للتجزئة في هذه الدراسة. يتم إعادة بناء هذا التصوير المقطعي بمعدل 16 Å / بكسل باستخدام الاعوجاج ، ثم إزالة الضوضاء وتصحيحه للإسفين المفقود باستخدام IsoNet. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S3: التصوير المقطعي لعينة RPE-1_3 المستخدمة للتجزئة في هذه الدراسة. يتم إعادة بناء هذا التصوير المقطعي بمعدل 16 Å / بكسل باستخدام الاعوجاج ، ثم إزالة الضوضاء وتصحيحه للإسفين المفقود باستخدام IsoNet. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S4: التصوير المقطعي لعينة RPE-1_4 المستخدم للتجزئة في هذه الدراسة. يتم إعادة بناء هذا التصوير المقطعي بمعدل 16 Å / بكسل باستخدام الاعوجاج ، ثم إزالة الضوضاء وتصحيحه للإسفين المفقود باستخدام IsoNet. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S5: التجزئة الناتجة للعينة RPE-1_1 بعد توليد الأسطح. تظهر أغشية الميتوكوندريا باللون السماوي. يتم تصوير فوسفات الكالسيوم داخل الميتوكوندريا باللون الأصفر. تظهر الشبكة الإندوبلازمية في تان ؛ ويتم عرض الأغشية الأخرى باللون الأرجواني. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S6: التجزئة الناتجة للعينة RPE-1_2 بعد توليد الأسطح. تظهر أغشية الميتوكوندريا باللون السماوي. يتم تصوير فوسفات الكالسيوم داخل الميتوكوندريا باللون الأصفر. تظهر الشبكة الإندوبلازمية في تان ؛ ويتم عرض الأغشية الأخرى باللون الأرجواني. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S7: التجزئة الناتجة للعينة RPE-1_3 بعد توليد الأسطح. تظهر أغشية الميتوكوندريا باللون السماوي. يتم تصوير فوسفات الكالسيوم داخل الميتوكوندريا باللون الأصفر. تظهر الشبكة الإندوبلازمية في تان ؛ ويتم عرض الأغشية الأخرى باللون الأرجواني. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S8: التجزئة الناتجة للعينة RPE-1_4 بعد توليد الأسطح. تظهر أغشية الميتوكوندريا باللون السماوي. يتم تصوير فوسفات الكالسيوم داخل الميتوكوندريا باللون الأصفر. تظهر الشبكة الإندوبلازمية في تان ؛ ويتم عرض الأغشية الأخرى باللون الأرجواني. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل ، أوضحنا كيف يمكن دمج الواقع الافتراضي ، على وجه التحديد باستخدام syGlass ، في خط أنابيب cryo-ET لتقسيم الهياكل الخلوية بشكل فعال. على الرغم من أن تركيزنا كان في المقام الأول على الأغشية ، إلا أنه لا يوجد قيد متأصل يمنع تجزئة الهياكل الخلوية الأخرى ، مثل الخيوط أو الريبوسومات ، حيث يمكن للمرء ضبط شكل الفرشاة وحجمها ، والعتبة لضمان وضع علامة فقط على voxels المقابلة للكائنات الخلوية المطلوبة. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية للواقع الافتراضي في التجزئة في التفاعل البديهي والعملي مع البيانات ، مما يسمح للمستخدمين بتصور وحدات التخزين ومعالجتها كما لو كانت بداخلها فعليا. عادة ما تتضمن الطرق التقليدية للتجزئة اليدوية أو تنظيف أقنعة التجزئة الأولية العمل مباشرة على جهاز كمبيوتر ، والذي يمكن أن يكون أقل غامرة وأبطأ في التعليق التوضيحي.

من خلال دمج الواقع الافتراضي في سير عمل cryo-ET ، لا يمكن للمستخدمين التفاعل بسرعة مع أقنعة التجزئة التي تم إنشاؤها بواسطة برامج أخرى فحسب ، بل يمكنهم أيضا استخدام الواقع الافتراضي لتوجيه تجزئة الهياكل المجزأة جزئيا وتنظيف الإيجابيات الخاطئة بكفاءة. حاليا، لا يزال التجزئة اليدوية مطلوبا لمعظم حالات استخدام التعليقات التوضيحية، ويمكن سير العمل المقدم المستخدمين من إنشاء تجزئة مناسبة للتحليل المتدفق بسهولة وسرعة محسنة. في هذه الدراسة ، استخدمنا سماعة الرأس HTC Vive VR ، لكن البرنامج متوافق مع الأجهزة التي تدعم SteamVR أو OculusVR.

للتطبيق الأمثل لهذا البروتوكول ، يجب أن تفي بيانات cryo-ET بمعايير محددة ، مثل التصوير المقطعي عالي الجودة مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (SNR). يعد SNR معلمة أساسية ، حيث يؤثر وضوح الميزات الهيكلية بشكل مباشر على فعالية التجزئة اليدوية في الواقع الافتراضي. تعد خطوات المعالجة المسبقة مثل تصحيح الوتد المفقود وتقليل الضوضاء أجزاء رئيسية من سير العمل. في هذا البروتوكول ، استخدمنا IsoNet لهذه الأغراض. يجب إعادة بناء المخططات المقطعية بدقة مناسبة - باستخدام حجم فوكسل يوفر تفاصيل هيكلية كافية وفصلا كافيا بين الهياكل الخلوية لتمكين التجزئة الفعالة بين الهياكل مع الحفاظ على أحجام البيانات التي يمكن التحكم فيها لتصور الواقع الافتراضي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تطبيق التباين المقلوب مع الهياكل الخلوية التي تظهر باللون الأبيض على خلفية سوداء ومعادلة الرسم البياني لتعزيز رؤية الأغشية والهياكل الأخرى داخل بيئة syGlass.

يجب النظر في العديد من النقاط الحاسمة لضمان نجاح هذا البروتوكول. أولا ، أثناء المعالجة المسبقة للبيانات ، يعد التطبيق الدقيق لانعكاس التباين ومعادلة الرسم البياني أمرا حيويا. يمكن أن تؤدي التعديلات غير الصحيحة إلى تصور دون المستوى الأمثل في الواقع الافتراضي ، مما يجعل التجزئة أمرا صعبا. ثانيا ، داخل برنامج VR ، تعد التعديلات المناسبة لإعدادات النوافذ والسطوع والعتبة ضرورية للتصور الأمثل للهياكل. يجب على المستخدمين تجربة هذه الإعدادات لتحقيق أفضل النتائج لمجموعات البيانات المحددة وإعدادات الواقع الافتراضي.

عندما يتعلق الأمر باستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، قد يواجه المستخدمون مشكلات مثل قيود أداء نظام الواقع الافتراضي ، خاصة عند التعامل مع مجموعات بيانات التصوير المقطعي الكبيرة. إذا أصبحت بيئة الواقع الافتراضي بطيئة أو غير مستجيبة ، ففكر في تقليل أخذ عينات البيانات أو تقسيم المخطط المقطعي إلى أقسام أصغر عن طريق ضبط المربع المحيط في أدوات عائد الاستثمار في syGlass وتحريكه على طول المخطط المقطعي أثناء إجراء التجزئة. يمكن أيضا ضبط شريط تمرير الأداء في قائمة المرئيات لتقليل التأخير أثناء عملية التجزئة. بالإضافة إلى ذلك ، للتخفيف من دوار الحركة ، يمكن للمستخدمين ضبط إعدادات الواقع الافتراضي لتقليل تأثيرات الحركة أو أخذ فترات راحة منتظمة أثناء جلسات التجزئة.

يوفر بروتوكول التجزئة المستند إلى الواقع الافتراضي الخاص بنا مزايا كبيرة لسير عمل تجزئة cryo-ET الحالي. غالبا ما تتضمن طرق التجزئة اليدوية التقليدية تعليقا توضيحيا ثنائي الأبعاد على الشرائح الفردية ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وقد لا تلتقط استمرارية ثلاثية الأبعادبالكامل 13. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم التجزئة المستندة إلى الواقع الافتراضي رؤية أكثر غامرة للهياكل الخلوية ، مما يساعد في التصور. تبرز تجزئة التعلم الآلي الآلي كطريقة قوية للحصول على تجزئة من التصوير المقطعي الخلوي14،16،17 ، على الرغم من أن مستويات الضوضاء العالية والهياكل المعقدة الموجودة في بيانات cryo-ET تؤدي إلى فجوات وإيجابيات خاطئة تتطلب تدخلا يدويا. يقدم هذا البروتوكول نهجا بديلا لتقسيم المقطعيات الإلكترونية بالتبريد يدويا ، لإنشاء تجزئة أولية يمكن استخدامها كبيانات تدريب لبرامج الشبكة العصبية الأخرى ، أو لتنظيف التجزئة الأولية التي تم إنشاؤها من الأساليب الآلية الأخرى.

في الختام ، تسلط هذه الدراسة الضوء على التجزئة المستندة إلى الواقع الافتراضي كأداة واعدة لتحليل بيانات التبريد والتعليم ، مما يوفر كفاءة محسنة وتجربة مستخدم أكثر غامرة. مع مزيد من التطوير ، تتمتع تقنية الواقع الافتراضي بالقدرة على إحداث ثورة في الطريقة التي نفسر بها وننشر الاكتشافات العلمية للهياكل الخلوية المعقدة في مجموعات بيانات cryo-ET ، مما يوفر بديلا قيما لأساليب التجزئة والتعليم التقليدية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا العمل في المركز الوطني للوصول إلى CryoEM والتدريب (NCCAT) ومركز Simons Electron المجهري الموجود في مركز نيويورك للبيولوجيا الهيكلية ، بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (Common Fund U24GM129539 و U24GM139171 و NIGMS R24GM154192) ومؤسسة Simons (SF349247) وجمعية ولاية نيويورك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بياناتCryoET: مكدس TIFF ، TIFF
HTC VIVE CosmosHTC99HARL000-00https://www.vive.com/sea/product/vive-cosmos/features/
Intel (R) Core (TM) i7-10870H وحدة المعالجة المركزية @ 2.20 جيجاهرتز 2.21 جيجاهرتزIntelhttps://ark.intel.com/content/www/us/en/ark/products/208018/intel-core-i7-10870h-processor-16m-cache-up-to-5-00-ghz.html
NVIDIA GeForce RTX 3070 كمبيوتر محمول GPUNVIDIAhttps://www.nvidia.com/en-us/geforce/laptops/compare/30-series/
syGlass SoftwaresyGlassمثبت على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام Windows متوافق
VIVE Cosmos Hand ControllerHTC99HAFR001-00https://www.vive.com/us/accessory/cosmos-controller-right/
Windows 11 HomeMicrosoftمايكروسوفت ويندوز 11 هوم
تنسيق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Plitzko, J. M., Schuler, B., Selenko, P. Structural biology outside the box-inside the cell. Curr Opin Struct Biol. 46, 110-121 (2017).
  2. Beck, M., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends Cell Biol. 26 (11), 825-837 (2016).
  3. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. Methods Mol Biol. 2215, 49-82 (2021).
  4. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  5. Watson, A. J. I., Bartesaghi, A. Advances in cryo-ET data processing: meeting the demands of visual proteomics. Curr Opin Struct Biol. 87, 102861(2024).
  6. Pyle, E., Zanetti, G. Current data processing strategies for cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Biochem J. 478 (10), 1827-1845 (2021).
  7. Wan, W., Briggs, J. A. G. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods Enzymol. 579, 329-367 (2016).
  8. Ni, T., Liu, K., Zhang, J., Atanasov, I., Mladenov, M. G., Jiang, W. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nat Protoc. 17 (2), 421-444 (2022).
  9. Obr, M., et al. Exploring high-resolution cryo-ET and subtomogram averaging capabilities of contemporary DEDs. J Struct Biol. 214 (2), 107852(2021).
  10. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  11. Salfer, M., Collado, J. F., Baumeister, W., Fernández-Busnadiego, R., Martínez-Sánchez, A. Reliable estimation of membrane curvature for cryo-electron tomography. PLoS Comput Biol. 16 (8), e1007962(2020).
  12. Barad, B. A., et al. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. J Cell Biol. 222 (2), e202204093(2023).
  13. Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V., Fernandez, J. J. Robust membrane detection based on tensor voting for electron tomography. J Struct Biol. 186 (1), 49-61 (2014).
  14. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  15. Garza-López, E., Robles-Flores, M. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  16. Chen, M., et al. Convolutional neural networks for automated annotation of cellular cryo-electron tomograms. Nat Methods. 14 (10), 983-985 (2017).
  17. Lamm, L., et al. MemBrain v2: an end-to-end tool for the analysis of membranes in cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  18. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality head-mounted displays. arXiv. , (2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  21. Bepler, T., Kelley, K., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nat Commun. 11, 5208(2020).
  22. Buchholz, T. -O., Berninger, L., Maurer, M., Jug, F. Cryo-CARE: content-aware image restoration for cryo-transmission electron microscopy data. Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging. 16, 502-506 (2019).
  23. Buchholz, T. -O., Jordan, M., Pigino, G., Jug, F. Content-aware image restoration for electron microscopy. Methods Cell Biol. 152, 277-289 (2019).
  24. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13, 6482(2022).
  25. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cryo Electron TomographyVirtual Reality SegmentationImmersive Data AnalysisMitochondrial Membranes3D Cell UltrastructureManual SegmentationRetinal Pigment EpitheliumROI AnnotationHistogram EqualizationMembrane Visualization

مقالات ذات صلة