تقيس هذه الطريقة ميل الخلية إلى تمزق ثنائي الحركة في الحمض النووي للإبلاغ عن قوى الجر الخلوية النسبية. يتم تسليم أوليغوس الفلورسنت الممزق إلى الخلية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتسجيل التاريخ الميكانيكي للخلية. يسمح هذا بقياس عالي الإنتاجية لتوليد القوة الخلوية في سياق التنميط الميكانيكي الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس قياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية للنمط الميكانيكي الخلوي بناء على تمزق وتوصيل مجسات توتر الحمض النووي إلى الخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توجه القوى الميكانيكية العديد من العمليات الخلوية الحرجة ، ويتعطل النمط الظاهري الميكانيكي الخلوي في العديد من الأمراض. الطريقة الأكثر استخداما لتحديد القوى الخلوية هي الفحص المجهري لقوة الجر ، والذي يلتقط تقليديا القوى التي تمارسها الخلايا على محيطها عن طريق الفحص المجهري عالي الدقة للخلايا التي تشوه ركائز مرنة تحتوي على حبات فلورية ، أو تنحرف المنشورات الدقيقة ، أو تغيير شكل مستشعرات التوتر الجزيئي الثابتة. نقدم هنا طريقة عالية الإنتاجية لقياس قوى الجر الخلوية النسبية باستخدام مجسات توتر الحمض النووي الراسخة وقياسها كميا عن طريق قياس التدفق الخلوي. هناك خمس خطوات عامة متضمنة في هذه الطريقة الموضحة أدناه. أولا ، التعبير عن وتنقية التدقيق عالي التقارب ينتجرين الإيكيستاتين المدمجة في علامة HUH المرتبطة بالحمض النووي. ثانيا ، إعداد مجسات الحمض النووي المزدوجة التي تحتوي على المراسلين والترابط. ثالثا ، إعداد السطح وتثبيت المجسات ؛ رابعا ، تنفيذ تجربة "التمزق والتسليم" لمقياس التوتر وقراءة التدفق. أخيرا ، سنصف تحليل البيانات وتفسير النتائج التجريبية.
المقدمة
توجه القوى الميكانيكية العديد من العمليات الخلوية الحرجة ، من الهجرة1 إلى تمايز الخلاياالجذعية 2 إلى قدرة الخلية التائية على الارتباط وتنشيط الخلية الصحيحة العارضة للمستضد3. المتغيرات الميكانيكية غير منظمة في المرض مما يؤدي إلى اختلافات قابلة للقياس في النمط الظاهري الميكانيكي الخلوي ، أو النمط الميكانيكي ، للخلايا4،5. النمط الميكانيكي هو مصطلح شامل للخصائص الميكانيكية للخلايا والأنسجة ويمكن أن يشمل معلمات مثل الانقباض والهجرة والالتصاق والتشوه. تصلب الخلية أو الأنسجة هو الجانب الأكثر شيوعا في النمط الميكا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. HUH التعبير والتنقية
- قم بتحويل الإشريكية القولونية باستخدام بلازميد WDV (± Echistatin) ، حوالي 1.5 ميكرولتر من ~ 50 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد لكل تحول ، وتنمو على ألواح أجار الأمبيسلين.
- تلقيح 5 مل من LB بمستعمرة واحدة وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
- تلقيح 1 لتر من LB بالثقافة الليلية وتنمو حتى يصل OD600 إلى ~ 0.8.
- اخفض درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية ، وقم بتحفيز 500 ميكرومتر من الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ، واحتضانه طوال الليل.
- تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3,750 × جم لمدة 30 دقيقة. أعد تعل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لإثبات فائدة وسهولة استخدام RAD-TGTs ، قمنا بتحليل تأثيرات مثبطات Rho Kinase (ROCK) على النمط الميكانيكي لخلايا CHO-K1. يشارك مسار ROCK في تنظيم الأكتين وتنشيط الميوسين. أظهرت الدراسات السابقة باستخدام TGTs أن تثبيط ROCK يقلل من تمزق قص TGTs16،17،18. يبلغ القص أو TGTs عالية القوة عن قوى الانقباض التي تمارس من خلال الالتصاقات البؤرية ، في حين أن فك الضغط أو TGTs منخفضة القوة حساسة للقوى الخلوية المنخفضة المشاركة في الالتصاق الأول.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد قدمنا بروتوكولات حول كيفية إعداد وتنفيذ تجارب RAD-TGT بهدف تشجيع العلماء عبر علوم الحياة على دمج الأنماط الميكانيكية في سير عملهم. تتمثل الميزة الرئيسية ل RAD-TGTs ، خاصة بالنسبة لأولئك الذين لديهم قدرات إنتاج البروتين ، في استخدام نوكليازات HUH لربط الروابط بأحجار مزدوجة للحمض النووي بدقة عالية دون أي تشابك كيميائي و / أو تنقية. تشمل نوكليازات HUH عائلة من نوكليازات النوكليازات التي ترتبط بالحمض النووي أحادي الشريطة بطريقة خاصة بالموقع. تعتبر HUHs مثيرة للاهتمام بشكل خاص ، حيث أنها .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
W.R.G. يقر بالتمويل من R35GM119483 المعاهد الوطنية للصحة. تم استخدام Biorender لعمل مخططات الشكل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 15 مل أنبوب مخروطي | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 96 لوحة سفلية زجاجية | جيدة Cellvis | P96-1.5H-N | |
| رقائق لوحة PCR لاصقة | Thermo Fisher Scientific | AB-0626 | |
| Ampicillin | Apex Bioresearch Products | 25-530 | |
| Bio-Rad 20 مل عمود | Bio-Rad | 7321010 | |
| البيوتينيل BSA | Thermo Fisher Scientific | 29130 | |
| BL21 (DE3) المختص E. القولوني< / em> | نيو إنجلاند Biolabs | C2527H | |
| مصل الأبقار الألبومين | الحراري فيشر العلمي | BP9703100 | |
| حاضنة ثقافة الخلايا | ثيرمو فيشر | 51030284 | |
| علمي أجهزة الطرد المركزي | الحرارية فيشر | العلمية 75009521 | |
| CHO-K1 | ATCC | CCL-61 | |
| أنابيب غسيل الكلى | الحرارية فيشر العلمية | PI88242 | |
| DMSO | ثيرمو فيشر العلمي D12345 | ||
| EDTA | ثيرمو فيشر العلمي | S311-100 | |
| التدفق مقياس الخلوي | BD | Accuri C6 Plus | |
| FlowJo | BD | FlowJo v10.10 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Thermo Fisher Scientific | O3196-500 | |
| IPTG | IBI Scientific | IB02125 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| Ligand Stand | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | المصممة من قبل المستخدم oligo | GCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT / 3Cy5Sp / |
| Lysogeny Broth (LB) Thermo | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| MnCl2< / sub> Thermo | Fisher Scientific | M87-100 | |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NeutrAvidin | Protein Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nickel-NTA الراتنج | ثيرمو فيشر Scientific | 88222 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Petri Dish | VWR | 25384-342 | |
| محلول بروبيديوم يوديد | كايمان للكيماويات | 10008351 | |
| SDS-PAGE جل | Bio-Rad | 4561096 | |
| مصل مجاني | Thermo Fisher Scientific | A4124801 | Gibco Optimem المستخدمة ، الوسائط البديلة الخالية من المصل جيدة لاستخدام |
| Shearing Anchor Strand | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | المصممة من قبل المستخدم oligo | / 5IAbRQ // iBiodT / G GGT GGT CGC TGC GGG CC |
| Sonicator | Thermo Fisher Scientific | 15-345-139 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific | BP152-500 | |
| الفائق 12605036 | Trypin | Thermo Fisher | |
| Scientific ، قطع 10 كيلو دالتون | Amikon | ||
| Unzipping Anchor Strand | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | المصممة للمستخدم oligo | / 5IAbRQ / GG GTG GTC GCT GCG GGC C / 3Bio / |
| WDV Plasmid | AddGene | 226983 | |
| WDV-Echistatin Plasmid | AddGene 226985 | ||
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | أعيد تشكيلها في DMSO |
المراجع
- Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
- He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
