مقالة منهجية

قياس قياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية للنمط الميكانيكي الخلوي بناء على تمزق وتوصيل مجسات توتر الحمض النووي إلى الخلايا

DOI:

10.3791/67852

⸱

يونيو 13, 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقيس هذه الطريقة ميل الخلية إلى تمزق ثنائي الحركة في الحمض النووي للإبلاغ عن قوى الجر الخلوية النسبية. يتم تسليم أوليغوس الفلورسنت الممزق إلى الخلية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتسجيل التاريخ الميكانيكي للخلية. يسمح هذا بقياس عالي الإنتاجية لتوليد القوة الخلوية في سياق التنميط الميكانيكي الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجه القوى الميكانيكية العديد من العمليات الخلوية الحرجة ، ويتعطل النمط الظاهري الميكانيكي الخلوي في العديد من الأمراض. الطريقة الأكثر استخداما لتحديد القوى الخلوية هي الفحص المجهري لقوة الجر ، والذي يلتقط تقليديا القوى التي تمارسها الخلايا على محيطها عن طريق الفحص المجهري عالي الدقة للخلايا التي تشوه ركائز مرنة تحتوي على حبات فلورية ، أو تنحرف المنشورات الدقيقة ، أو تغيير شكل مستشعرات التوتر الجزيئي الثابتة. نقدم هنا طريقة عالية الإنتاجية لقياس قوى الجر الخلوية النسبية باستخدام مجسات توتر الحمض النووي الراسخة وقياسها كميا عن طريق قياس التدفق الخلوي. هناك خمس خطوات عامة متضمنة في هذه الطريقة الموضحة أدناه. أولا ، التعبير عن وتنقية التدقيق عالي التقارب ينتجرين الإيكيستاتين المدمجة في علامة HUH المرتبطة بالحمض النووي. ثانيا ، إعداد مجسات الحمض النووي المزدوجة التي تحتوي على المراسلين والترابط. ثالثا ، إعداد السطح وتثبيت المجسات ؛ رابعا ، تنفيذ تجربة "التمزق والتسليم" لمقياس التوتر وقراءة التدفق. أخيرا ، سنصف تحليل البيانات وتفسير النتائج التجريبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجه القوى الميكانيكية العديد من العمليات الخلوية الحرجة ، من الهجرة1 إلى تمايز الخلاياالجذعية 2 إلى قدرة الخلية التائية على الارتباط وتنشيط الخلية الصحيحة العارضة للمستضد3. المتغيرات الميكانيكية غير منظمة في المرض مما يؤدي إلى اختلافات قابلة للقياس في النمط الظاهري الميكانيكي الخلوي ، أو النمط الميكانيكي ، للخلايا4،5. النمط الميكانيكي هو مصطلح شامل للخصائص الميكانيكية للخلايا والأنسجة ويمكن أن يشمل معلمات مثل الانقباض والهجرة والالتصاق والتشوه. تصلب الخلية أو الأنسجة هو الجانب الأكثر شيوعا في النمط الميكانيكي الذي تم قياسه حيث يمكن قياسه بإنتاجية عالية. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون الخلايا السرطانية أكثر صلابة من الخلايا الطبيعية بينما غالبا ما تكون الخلايا النقيلية أكثر امتثالا6،7. يعد توليد القوة بواسطة الخلايا جانبا مهما من جوانب النمط الميكانيكي الذي تم تغييره في المرض8 لأنه يحقق في تفاعلات محددة من خلية إلى بيئة. الفحص المجهري لقوة الجر هو الطريقة الأكثر شيوعا لقياس توليد القوة الخلوية ويتضمن طلاء الخلايا على ركائز مرنة قابلة للتشوه مدمجة بخرز الفلورسنت أو على مصفوفات من المنشورات الدقيقة وتتبع التغييرات في حركة الخرزة أو ما بعد الانحراف لحساب القوى التي تمارسها الخلايا. كما تم استخدام مستشعرات التوتر الجزيئي لقياس قوى الجر وتوفر ميزة الحساسية لمقادير القوة الأصغر وقياس القوى الناتجة عن أزواج محددة من مستقبلات الترابط9،10. ومع ذلك ، فإن قياس القوى الخلوية باستخدام TFM التقليدية ومستشعرات التوتر الجزيئي يعتمد على التصوير عالي الدقة ، مما يحد من إنتاجية القياس.

لقد قمنا مؤخرا بتكييف مجسات التوتر المزدوجة للحمض النووي في قراءة عالية الإنتاجية لتوليد القوة الخلوية في سياق التنميط الميكانيكي الخلوي11 (الشكل 1). باختصار ، يتم تثبيت الطباعة المزدوجة للحمض النووي المقتبسة من مجسات حبل مقياس التوتر (TGT) المستخدمة على نطاقواسع 12 في آبار ألواح 96 بئرا عبر كيمياء البيوتين والنيوترافيدين لخيط "المرساة" 13. يمكن ضبط قوة التمزق المطلوبة لوحدات الإرسال على الوجهين TGT عن طريق تغيير موضع البيوتين على خيط المرساة ، مما يغير هندسة الإرسال على الوجهين مما يؤدي إما إلى قوة تمزق منخفضة لفك الضغط (الشكل 2 أ) أو تشكيل قص قوة تمزق عالية (الشكل 2 ب). يحتوي حبلا المرساة على البيوتين ومبرد التألق ، بينما يحتوي خيط "الترابط" للحمض النووي على مسبار فلوري ورابط يتعرف على مستقبل سطح الخلية المشارك في الاستشعار الميكانيكي مثل الإنتجرين. يرتبط الترابط تساهميا بالحمض النووي (الشكل 3) عن طريق استخدام علامة اندماج مرتبطة بالحمض النووي تسمى علامة HUH المدمجة في الترابط14،15. علامات HUH هي مجالات نوكلياز داخلي HUH صغيرة تشارك في تكاثر الفيروس والعمليات الأخرى التي تتعرف على تسلسل / هيكل 9 نقاط أساس للحمض النووي أحادي الشريطة ، وتثبيته ، وتشكل مقربا تساهميا من الفوسفوتيروزين إلى نهاية 5 بوصات من الحمض النووي المقطوع.

ترتبط الخلايا المطلية فوق هذه المجسات بالترابط وتمزق نسبة مئوية من المجسات تتناسب مع القوى التي تولدها. يتم تسليم خيط الترابط الفلوري المرتبط بمستقبله لاحقا إلى الخلية. وبالتالي ، يتم تسجيل التاريخ الميكانيكي للخلايا في الخلايا ذات الأهمية من خلال حجم تألقها. يمكن قياس التألق باستخدام قياس التدفق الخلوي. نسمي هذه الطريقة تمزق وتسليم-TGTS أو RAD-TGTs. لا تقيس هذه الطريقة فقط التألق ، وبالتالي القوة النسبية الناتجة عن آلاف الخلايا في وقت واحد ، ولكن أيضا قراءة قياس التدفق الخلوي توفر إمكانية فرز الخلايا حسب نمطها الميكانيكي ، مما يسمح بقراءات المصب ، بالإضافة إلى CRISPR-KO أو شاشات الأدوية التي قد تحدد الجينات أو الأدوية التي تغير النمط الميكانيكي الخلوي.

في البروتوكول أدناه ، نوضح كيفية إعداد وتنفيذ تجربة RAD-TGT. سنسلط الضوء على التعبير عن نوع من HUH وتنقيه يعرف باسم WDV (من فيروس قزم القمح) في حد ذاته ليكون بمثابة تحكم سلبي ومدمج مع الإكيستاتين ، وهو رابط يربط بإحكام عائلة من مستقبلات الالتصاق التي تنقل القوة بين الخلية والبيئة المعروفة باسم الإنتجرينات المرتبطة ب RGD ، لتكون بمثابة حالة تجريبية. من هذا ، سوف نوضح كيفية تحضير RAD-TGTs للاستخدام التجريبي. سنشرح كيفية المضي قدما في التجارب وكيفية تحليل البيانات الناتجة. سنسلط الضوء أيضا على تطبيق RAD-TGTs من خلال قياس كيفية تغيير مثبط ROCK للقوى بوساطة الإنتجرين في خلايا CHO-K1 (الشكل 4). باختصار ، نأمل أن يكون هذا البروتوكول بمثابة مدخل إلى علم الأحياء الميكانيكي بغض النظر عن الخبرة السابقة. الحقل في مرحلته الأولى وجميع الخلفيات ضرورية لمزيد من الفهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HUH التعبير والتنقية

  1. قم بتحويل الإشريكية القولونية باستخدام بلازميد WDV (± Echistatin) ، حوالي 1.5 ميكرولتر من ~ 50 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد لكل تحول ، وتنمو على ألواح أجار الأمبيسلين.
  2. تلقيح 5 مل من LB بمستعمرة واحدة وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
  3. تلقيح 1 لتر من LB بالثقافة الليلية وتنمو حتى يصل OD600 إلى ~ 0.8.
  4. اخفض درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية ، وقم بتحفيز 500 ميكرومتر من الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ، واحتضانه طوال الليل.
  5. تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3,750 × جم لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات ب 40 مل من المخزن المؤقت للتحلل (300 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي درجة الحموضة ثلاثية 7.5 ، 1 ملي مولار EDTA).
  6. Lyse الخلايا مع صوتنة 3 × 90 ثانية على الجليد في دورة عمل 70٪ ، قوة 7. قم بالدوران عند 24,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية واسكب المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 50 مل.
  7. ضع ملاط راتنج Ni-NTA في أنبوب مخروطي سعة 15 مل (1 مل من معلق الخرزة / لتر من المزرعة) ، وقم بالدوران عند 700 × جم لمدة دقيقتين ، وقم بإزالة المادة الطافية.
  8. أضف 6 مل من الماء إلى الراتنج وكرر عملية الغسيل في الخطوة 1.7.
  9. كرر الغسيل مرتين باستخدام محلول الغسيل (300 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي تريس [درجة الحموضة 7.5] ، 1 ملي EDTA ، 20 ملي إيميدازول) بدلا من الماء. أعد تعليق الخرزات في 5 مل من محلول الغسيل.
  10. أضف ملاط الخرزة (الخطوة 1.9) إلى الخلايا المحللة (الخطوة 1.6) واخلطه جيدا. قم بتدوير الخلايا والخرز المحلل لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لبقية هذا البروتوكول ، لا تدع الراتنج يجف أبدا واجمع جميع العينات التي تتدفق عبر العمود.
  11. يسكب المزيج على عمود سعة 20 مل ويجمع التدفق. اغسل العمود ب 4 × 25 مل من محلول الغسيل.
  12. قم بإزالة 1 × 10 مل من محلول الشطف (300 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 7.5] ، 1 ملي مولار EDTA ، 250 ملي إيميدازول) في أنبوب جديد سعة 15 مل ، يجمع الشطف المبكر والمتأخر بشكل منفصل (الشطف المبكر هو أول 1 مل ، والشطف المتأخر هو 1 مل الأخير).
  13. قم بتحليل جميع الكسور التي تم جمعها عن طريق الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) للتأكد من جمع HUH أثناء الشطف (انظر الشكل التكميلي S1). للحصول على أفضل النتائج ، قم بتحميل جل بنسبة 4-20٪ وقم بتشغيله لمدة 45 دقيقة عند 35 واط و 200 فولت.
  14. أضف البروتين المغطى إلى أنبوب غسيل الكلى واحتضنه طوال الليل في عازلة غسيل الكلى (مثل المخزن المؤقت للتحلل) عند 4 درجات مئوية. لإزالة علامة HIS، أضف ULP1 بدون عامل اختزال مباشرة إلى البروتين الملوطح قبل وضع البروتين في أنبوب غسيل الكلى.
  15. في صباح اليوم التالي ، قم بإعداد راتنج Ni-NTA كما هو موضح في الخطوات 1.7-1.9 واحتضان البروتين المتحلل. صب خليط البروتين وراتنج Ni-NTA في عمود واجمع التدفق. اغسل العمود ب 10 مل من محلول غسيل الكلى واجمع أي تدفق.
  16. قم بتقييم الجزء الذي تم جمعه على SDS-PAGE باتباع الإعدادات المذكورة أعلاه للتأكد من وجود البروتين ، والتركيز على التركيز المطلوب باستخدام مرشح طرد مركزي فائق سعة 15 مل مع قطع الوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون (انظر الشكل التكميلي S1).
    ملاحظة: يتراوح تركيز البروتين النهائي المثالي بين 40 ميكرومتر و 100 ميكرومتر.

2. تحضير RAD-TGT

  1. قم بتجميع الطباعة على الوجهين بنسبة مولارية 1.1: 1 من خيط المرساة (مع التبريد) إلى خيط الترابط (مع الفلوروفور) بتركيز نهائي يبلغ 40 ميكرومتر من خيط الترابط في محلول 10 ملي مولار تريس (الرقم الهيدروجيني 7.5) و 50 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي مولار EDTA.
  2. التلدين عن طريق الحضانة عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعا بالتبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ؛ حماية من الضوء.
    ملاحظة: تتبخر العينات منخفضة الحجم بسهولة وقد يكون من الصعب استردادها تماما. تحضير حجم أكبر من اللازم.
  3. تفاعل المزدوجات الملدنة مع HUH (باستخدام تركيز الخيط الأقل وفرة عند التلدين ؛ في هذه الحالة ، خيط الترابط) بنسبة مولار 1: 2 بتركيز نهائي من 10 ميكرومتر على الوجهين و 20 ميكرومتر HUH في محلول يحتوي على 1 ملي مولار MnCl2 ، 50 ملي مولار HEPES (الرقم الهيدروجيني 8) ، 50 ملي كلوريد الصوديوم.
  4. احتضان التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري أو كتلة حرارية محمية من الضوء. بعد الحضانة ، ارفعها عن النار واستخدم جهاز صغير على سطح الطاولة لتدوير TGTs المجمعة الآن.

3. تحضير السطح

  1. فور فتح صفيحة سفلية زجاجية مكونة من 96 بئرا ، قم بتغطية جميع الآبار بورق لوح PCR لاصق للحفاظ على الآبار غير المستخدمة لاستخدامها لاحقا. استخدم شفرة حلاقة لقطع الرقاقة فوق الآبار ذات الأهمية (يفضل الآبار غير الحافة) وإضافة 100 ميكرولتر من PBS البارد إلى الآبار المرغوبة.
    ملاحظة: بمجرد إضافة السائل إلى الآبار ، لا تدع الآبار تجف. في حالة حدوث التجفيف ، فإن الامتصاص غير المحدد للجزيئات الحيوية على السطح سيؤثر سلبا على البيانات. احتفظ ب 100 ميكرولتر من الحجم الزائد باستمرار في البئر لمنع أي جفاف.
  2. أضف 200 ميكرولتر من PBS البارد إلى الآبار ، وخلط الماصة برفق 2-5x ، وقم بإزالة 200 ميكرولتر من PBS. كرر لمدة ثلاث غسلات.
    ملاحظة: عند إضافة السائل وإزالته من الآبار ، احتفظ بطرف الماصة على حافة البئر بزاوية 45 درجة لتجنب إزعاج السطح. افعل ذلك لجميع عمليات التعامل مع اللوحة إلا عند طلاء الخلايا.
  3. بالنسبة للآبار التجريبية ، قم بإعداد محلول 0.1 مجم / مل بيوتينيل - BSA في PBS وأضف 80 ميكرولتر من المحلول إلى الآبار المرغوبة. بالنسبة لآبار التحكم ، قم بإعداد نفس المحلول مع إضافة 18.75 ميكروغرام / مل من الفيبرونيكتين وإضافة 80 ميكرولتر إلى الآبار المعنية. اخلطي الماصة برفق جميع الآبار المستخدمة ، وضعي الغطاء على الطبق ، وغطيها بورق الألمنيوم. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  4. قم بإزالة 80 ميكرولتر من الحجم من الآبار واغسل الآبار بتكرار الخطوة 3.2. أضف 80 ميكرولتر من 0.1 مجم / مل نيوترافيدين في محلول PBS بنفس طريقة الخطوة 3.3.
  5. بعد الحضانة ، قم بإزالة 80 ميكرولتر من الحجم من الآبار وكرر الخطوة 3.2. قم بتخفيف TGTs المجمعة (الخطوة 2 لإعداد RAD-TGT) إلى 0.1 ميكرومتر في PBS و 80 ميكرولتر محلول إلى الآبار بطريقة مماثلة للخطوة 3.3. إما أن تغطي الآبار بورق لاصق وتخزن في الظلام عند 4 درجات مئوية أو تحميها من الضوء وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة قبل الشروع في التجارب.
    ملاحظة: نوصي بالتعامل مع الخطوة 3.5 كنقطة توقف والانتظار حتى اليوم التالي لمتابعة التجارب.

4. بروتوكول RAD-TGT التجريبي

  1. بعد أن يكون لدى TGTs الوقت الكافي للالتصاق ، اغسل الآبار (انظر الخطوة 3.2) 3x باستخدام PBS ، متبوعا بغسلتين بوسائط خالية من المصل. اترك الوسائط في الآبار بعد الغسيل النهائي. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى الآبار الطرفية للتخفيف من أي تأثيرات للحافة ونقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لتسخين اللوحة.
  2. استرجع الخلايا ذات الأهمية عند التقاء ~ 80٪ ، واستنشاق الوسائط متبوعة بإضافة وطموح PBS لغسل الخلايا. أضف حجما مناسبا من التربسين وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا (~ 5-10 دقائق).
  3. بمجرد فصل الخلايا ، أضف الحجم الأصلي لوسائط الخلية الكاملة المستخدمة للحفاظ على الخلايا إلى اللوحة وأعد تعليقها باستخدام ماصة مصلية. أضف معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  4. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 4 دقائق ، وشفط الوسائط ، وأعد تعليق الحبيبات في PBS. كرر الطرد المركزي والشفط ، ثم أعد التعليق في 5 مل من الوسائط الخالية من المصل وكرر الطرد المركزي والشفط. أعد تعليق الخلايا في ~ 2 مل من الوسائط الخالية من المصل.
  5. تحديد كثافة الخلايا المعلقة وضبط التركيز حسب الرغبة.
    ملاحظة: نهدف إلى صفيحة ~ 15,000 خلية لكل بئر ، لذلك نقوم بإعداد الخلايا لتكون بتركيز 150,000 خلية / مل ، مما يسمح بطلاء 15,000 خلية ب 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة.
    1. اختياري: إذا كان سيتم اختبار تأثير الأدوية أو العوامل الدوائية الأخرى ، أضف التركيز المناسب من الدواء إلى الخلايا وأعد الخلايا إلى الحاضنة. اترك وقتا كافيا قبل الحضانة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  6. استرجع اللوحة من الحاضنة (الخطوة 4.1) وقم بإزالة حجم الوسائط المتبقية من الغسيل من الآبار التجريبية في اللوحة الدافئة مسبقا. اغسل مرة واحدة بالوسائط المرغوبة. قم بعمل ماصة 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة بعناية إلى الآبار المرغوبة. انقل الخلايا المطلية إلى الحاضنة لمدة 90 دقيقة.
    ملاحظة: قم بتمرير الخلايا في وسط الآبار برفق ، في محاولة لإبقاء الماصة عمودية.
  7. بعد الحضانة ، قم بإزالة ~ 125-170 ميكرولتر من الحجم من الآبار. إذا لزم الأمر ، اغسل الخلايا برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS الدافئ. أضف 50 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر وأعد اللوحة إلى الحاضنة حتى تبدأ الخلايا في الانفصال (5-10 دقائق).
    ملاحظة: تأكد من أن البئر لا يجف أبدا وأن الإفراط في التربسين لا يحدث.
  8. أضف 160 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق المحضر حديثا (1 ملي مولار EDTA ، 2٪ وزن / حجم من ألبومين مصل الأبقار ، في PBS البارد) إلى الآبار. قم بربط الماصة برفق لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا ، وأضف 196 ميكرولتر من معلق الخلية هذا إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل متبوعا ب 4 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم ، واخلطه برفق. قم بإعداد عينة تحكم واحدة بدون يوديد البروبيديوم لتكون بمثابة عنصر تحكم في بوابات الجدوى.
  9. ضع الأنابيب في دلو ثلج مع حجب الغطاء للضوء واستمر في قياس شدة التألق باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

5. جمع البيانات وتحليلها

  1. قم بتحليل كل عينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تهدف إلى جمع ما لا يقل عن 2,000 خلية مفردة حية لكل عينة.
    ملاحظة: قلل من التعرض للضوء للعينات التي لم يتم تحليلها بعد واستمر في وضع الثلج.
  2. بمجرد جمع جميع البيانات ، انقل الملفات إلى البرنامج الذي تختاره وقم ببوابة الخلايا.
    1. بوابة للخلايا حسب منطقة الانتثار الأمامي (FSC-A) مقابل منطقة التشتت الجانبية (SSC-A).
    2. بوابة للمفردات داخل مجموعة الخلايا بواسطة FSC-A مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H).
    3. بوابة للخلايا الحية من المجموعة المفردة عن طريق وضع بوابة رأسية على الرسم البياني لكثافة منطقة يوديد البروبيديوم بأعلى قيمة للتحكم في عدم وجود يوديد بروبيديوم المحضر في الخطوة 4.8. أي أحداث لا تتجاوز البوابة هي خلايا حية
    4. قم بتعيين بوابة رأسية على رسم بياني لشدة منطقة Cy5 (Cy5-A) للمفردات لإزالة أي حدث غير فلوري على قناة Cy5-A ناتج عن حطام الخلية. تأكد من أن هذه البوابة الرأسية بقيمة أقل من الخلايا غير المسماة التي تم تحليلها ولكنها أكبر من 0 شدة فلورسنت.
    5. لتحليل مجموعات الخلايا ، قم بتعيين بوابة نصف القطاع عندالنسبة المئوية 99 لكل عنصر تحكم سلبي معني.
    6. قم بتطبيق بوابة بنفس شدة الظروف التجريبية المقابلة ، واجمع النسبة المئوية للخلايا التي تتجاوز بوابة التحكم السلبية لكل حالة.
      ملاحظة: يمكن مقارنة النسب المئوية مباشرة بين التكرارات البيولوجية عن طريق التحليل الإحصائي المناسب. انظر البيانات التمثيلية.
  3. قم بتحليل البيانات باستخدام متوسط مضان Cy5 ، واقسم متوسط شدة الترابط WDV على متوسط WDV وحده وقارن هذه القيم بين التكرارات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات فائدة وسهولة استخدام RAD-TGTs ، قمنا بتحليل تأثيرات مثبطات Rho Kinase (ROCK) على النمط الميكانيكي لخلايا CHO-K1. يشارك مسار ROCK في تنظيم الأكتين وتنشيط الميوسين. أظهرت الدراسات السابقة باستخدام TGTs أن تثبيط ROCK يقلل من تمزق قص TGTs16،17،18. يبلغ القص أو TGTs عالية القوة عن قوى الانقباض التي تمارس من خلال الالتصاقات البؤرية ، في حين أن فك الضغط أو TGTs منخفضة القوة حساسة للقوى الخلوية المنخفضة المشاركة في الالتصاق الأول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قدمنا بروتوكولات حول كيفية إعداد وتنفيذ تجارب RAD-TGT بهدف تشجيع العلماء عبر علوم الحياة على دمج الأنماط الميكانيكية في سير عملهم. تتمثل الميزة الرئيسية ل RAD-TGTs ، خاصة بالنسبة لأولئك الذين لديهم قدرات إنتاج البروتين ، في استخدام نوكليازات HUH لربط الروابط بأحجار مزدوجة للحمض النووي بدقة عالية دون أي تشابك كيميائي و / أو تنقية. تشمل نوكليازات HUH عائلة من نوكليازات النوكليازات التي ترتبط بالحمض النووي أحادي الشريطة بطريقة خاصة بالموقع. تعتبر HUHs مثيرة للاهتمام بشكل خاص ، حيث أنها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. يقر بالتمويل من R35GM119483 المعاهد الوطنية للصحة. تم استخدام Biorender لعمل مخططات الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنبوب مخروطيSarstedt62.554.205
96 لوحة سفلية زجاجيةجيدة CellvisP96-1.5H-N
رقائق لوحة PCR لاصقةThermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicillinApex Bioresearch Products 25-530
Bio-Rad 20 مل عمودBio-Rad7321010
البيوتينيل BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) المختص E. القولوني< / em>نيو إنجلاند BiolabsC2527H
مصل الأبقار الألبومينالحراري فيشر العلميBP9703100
حاضنة ثقافة الخلاياثيرمو فيشر 51030284
علمي أجهزة الطرد المركزيالحرارية فيشرالعلمية 75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
أنابيب غسيل الكلىالحرارية فيشر العلميةPI88242
DMSOثيرمو فيشر العلمي D12345
EDTAثيرمو فيشر العلميS311-100
التدفق مقياس الخلويBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazoleThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
Ligand Standتقنيات الحمض النووي المتكاملةالمصممة من قبل المستخدم oligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT / 3Cy5Sp /
Lysogeny Broth (LB) ThermoFisher ScientificBP1426-500
MnCl2< / sub> ThermoFisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidinProtein Thermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA الراتنج ثيرمو فيشر Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Petri DishVWR25384-342
محلول بروبيديوم يوديدكايمان للكيماويات10008351
SDS-PAGE جلBio-Rad4561096
مصل مجانيThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem المستخدمة ، الوسائط البديلة الخالية من المصل جيدة لاستخدام
Shearing Anchor Strandتقنيات الحمض النووي المتكاملةالمصممة من قبل المستخدم oligo/ 5IAbRQ // iBiodT / G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
Thermal CyclerBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
الفائق 12605036TrypinThermo Fisher
Scientific ، قطع 10 كيلو دالتونAmikon
Unzipping Anchor Strandتقنيات الحمض النووي المتكاملةالمصممة للمستخدم oligo/ 5IAbRQ / GG GTG GTC GCT GCG GGC C / 3Bio /
WDV PlasmidAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAddGene 226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049أعيد تشكيلها في DMSO
مرشح الطرد المركزي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
  2. He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation. Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).
  4. Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).
  5. Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications. Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).
  6. Swaminathan, V., et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).
  7. Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression. Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).
  8. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), e32572(2012).
  9. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).
  10. Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface. Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).
  11. Pawlak, M. R., et al. RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes. Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).
  12. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  13. Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).
  14. Tompkins, K. J., et al. Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering. Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).
  15. Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).
  16. Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells. Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).
  17. Wang, X., et al. Integrin molecular tension within motile focal adhesions. Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  18. Ma, R., et al. Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging. Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).
  19. Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia. J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).
  20. Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns. Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).
  21. Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane. J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).
  22. Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance. Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).
  23. Rashid, S. A., et al. All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

مقالات ذات صلة