مقالة منهجية

عزل وتحديد السلالات البكتيرية من جلد البرمائيات الأرضية

DOI:

10.3791/67862

⸱

يونيو 17, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه طريقة لأخذ عينات وعزل البكتيريا القابلة للزراعة من الجراثيم الجلدية للسمندل الأوروبي (جنس Speleomantes). هنا ، نقدم بروتوكولا لأخذ عينات من جلد السمندل بالمسحات ومعالجتها باستخدام مناهج قابلة للزراعة. نصف أخذ العينات والعزل وإنشاء ثقافة محورية مع توصيف السلالة البكتيرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر الجراثيم عنصرا حيويا في الكائنات الحية العليا ، حيث تساهم الجراثيم الجلدية بشكل كبير في دفاع الكائن الحي ضد العوامل الخارجية. لا توجد طريقة قياسية لأخذ عينات من المجتمعات الميكروبية الجلدية Speleomantes (البرمائيات: Plethodontidae) لنهج الزراعة الميكروبية. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بتطوير بروتوكول عملي لعزل البكتيريا عن جلد الأفراد وأفضل الممارسات للتعامل مع العينات وتخزينها. الخطوات مباشرة: يتم تخزين المسحات في محلول ملحي فسيولوجي مكمل بالجلسرين عند أخذ العينات. بمجرد نقلها في المختبر ، يمكن تخزين المسحات عند +4 درجة مئوية لمدة أقصاها 10 أيام لضمان سلامة المجتمع الميكروبي. تقدم هذه الدراسة رؤى مثيرة للاهتمام حول التحقيق في الجراثيم الجلدية لأنواع البرمائيات الأرضية ، مثل تلك التي تنتمي إلى جنس Speleomantes. يساهم هذا النهج في تنفيذ ومراقبة وحفظ تدابير الأنواع المهددة بالانقراض وقد يحسن المعرفة بوظيفة الكائنات الحية الدقيقة في صحة البرمائيات وبيئتها. قد يكون لهذا البروتوكول أيضا أهمية أوسع لأبحاث الميكروبيوم في العديد من سيناريوهات الحفاظ على الحياة البرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي جميع الكائنات الحية على مجموعة متنوعة من المتعايشين الميكروبيين على أسطحها الظهارية وأنسجتها وأعضائها1. الجلد هو الواجهة الأساسية بين المضيف وبيئته ، مما يوفر موطنا للكائنات الحية الدقيقةالمتنوعة 2. الجلد هو أكبر عضو من الفقاريات ويعمل كحاجز أمام الاعتداءات الميكانيكية والكيميائية والميكروبية3. ومع ذلك ، فإن هذا التعرض الواسع للجلد للظروف البيئية يجعله على الأرجح الحدود البيئية الأكثر أهمية التي تتوسط تفاعل الكائن الحي مع العوامل الحيوية واللاأحيائيةالخارجية 4.

تمت دراسة الجراثيم الجسدية للبرمائيات بشكل مكثف في العقد الماضي ، وتم استكشاف العلاقة بين هذا المجتمع الميكروبي ومضيفه بعمق5،6،7،8،9،10. يتم تحديد التنوع البيولوجي لميكروبات الجلد إلى حد كبير حسب نوع المضيف (أي مجتمع خاص بالأنواع) ، ولكن يمكن للعوامل البيئية الإضافية أن تعزز تنوعا أعلى بين الأنواع11. الجراثيم الجلدية للبرمائيات لها تركيبة مميزة عن الأخرى. من المعروف أن البرمائيات قد ثبت أن لها علاقة متبادلة مع ميكروبات جلدها ، حيث تكون قادرة على التخليق الحيوي للمركبات المضادة للميكروبات أو حماية مضيفها من الأمراض المعديةالناشئة 12.

عادة ما يتم الوصول إلى عزل البكتيريا عن الجلد بعد إنجاز خطوات مختلفة. تتضمن الخطوة الأولى الحصول على مجموعة عينات تمثيلية عن طريق المسح وتجنب التلوث الخارجي. يتم تعليق العينات الميكروبية في محلول ملحي معقم أو عازلة. قد يؤدي استكمال سوائل التعليق بمواد واقية (مثل الجلسرين) إلى تحسين سلامة المجتمع البكتيري أثناء النقلالمختبري 13 ، 14. بمجرد نقلها إلى المختبر ، يمكن معالجة العينات على الفور أو بعد وقت قصير للحفاظ على سلامة المجتمع الميكروبي. يتضمن النهج الميكروبي الكلاسيكي معالجة العينات عن طريق التخفيف التسلسلي لتقليل الكثافة الميكروبية وضمان فصل أفضل للمستعمرة على ألواح بتري. ثم يتم وضع العينات والتخفيفات التسلسلية على وسائط غير محددة وغير انتقائية مثل أجار لوريا بيرتاني (LBA) 15 أو فول الصويا الترابتي (TSA) 16 أو مستخلص خميرة التربتون أجار (TYEA) 17،18،19 أو المغذيات (NA) 20 التي تدعم نمو مجموعة واسعة من البكتيريا. يتم استخدام مواد التخصيب غير الانتقائية أثناء أخذ العينات والمعالجة لأنه من الضروري استزراع مجموعة واسعة من الميكروبات. توزع طرق الخطوط أو الألواح المنتشرة التعليق الميكروبي بالتساوي على سطح أجار21. يسمح التوزيع المتساوي للأنواع الميكروبية المختلفة الموجودة في العينة بتكوين مستعمرات متميزة. بعد الحضانة عند 20-37 درجة مئوية لمدة 2-7 أيام ، يتم حساب المستعمرات الميكروبية وتمييزها بناء على التشكل. تم إجراء التوصيف المورفولوجي للمستعمرة البكتيرية على أساس التصبغ والشكل والارتفاع والهامش والتعتيم والسطح. يتم استزراع المستعمرات المعزولة جيدا على أعلى التخفيفات إلى ألواح أجار طازجة لتنقية الثقافات الميكروبية. يتم ضمان نقاء المستعمرات بناء على توحيد الخلية وتقاربها مع تلطيخ الجرام. يمكن أيضا إجراء العديد من الاختبارات الكيميائية الحيوية أو الجزيئية للتحقق من نقاء المستعمرات22. يمكن تخزين الثقافات النقية للسلالات المعزولة إما على ألواح أجار عند 4 درجات مئوية للاستخدام على المدى القصير أو حفظها على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية في المواد البردية (على سبيل المثال ، نسبة الجلسرين إلى المتوسطة 20:80 أو 50:50) 23.

في هذا البروتوكول ، أبلغنا عن نهج أفضل الممارسات لعزل البكتيريا عن الجراثيم الجلدية لسمندل الكهف Speleomantes ، البرمائيات الأرضية الصارمة التي يمكن أن تعيش في كل من البيئات السطحية والجوفية24. نظرا لعدم وجود بروتوكولات مطبقة عالميا في الأدبيات ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير أفضل الممارسات لأخذ عينات من الجراثيم الجلدية وحفظها من هذه البرمائيات الأرضية. لاختبار هذا البروتوكول ، استخدمنا السمندل الكهفي الإيطالي (Speleomantes italicus) كنموذج ، حيث أخذنا عينات من 12 فردا من مجموعة من الكهوف الموجودة في أبروتسو (إيطاليا). تم جمع الأفراد يدويا ومسحهم بشكل متكرر (5 مرات على الأقل) على الجوانب الظهرية والبطنية والأجنحة. تم نقع المسحات المستخدمة في ماء مقطر معقم. ثم تم غمر المسحات في محلول ملحي فسيولوجي بنسبة 0.9٪ مع أو بدون مكملات الجلسرين. عند نقلها إلى المختبر ، تم اختبار حفظ العينة في ظل ظروف مختلفة: درجة حرارة الغرفة غير المنضبطة ، 4 درجات مئوية ، و -20 درجة مئوية لمدة 10 أيام. تمت مقارنة المجتمعات الميكروبية القابلة للزراعة باستخدام الأساليب القائمة على الثقافة على الوسائط العامة وشبه الانتقائية (LBA ، TSYEA ، TSA ، NA).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول أفضل الممارسات للحصول على عينات جلد Speleomantes والتعامل معها من أجل نهج ميكروبيولوجي قابل للزراعة لعزل السلالات البكتيرية. المواد المفيدة في الخطوات التالية مدرجة في جدول المواد. يتبع البروتوكول إرشادات رعاية الواردة في المادة 11 من DPR 357/97 بناء على إذن من وزارة البيئة الإيطالية (PNM 74554 بتاريخ 22/04/2024).

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. احسب ووزن كمية مسحوق المكونات (انظر تعليمات الشركة المصنعة لمعرفة كمية المسحوق المستخدمة في LBA أو TSYEA أو TSA أو NA أو غيرها من الوسائط).
  2. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإذابة المكونات في الماء المقطر. اعتمادا على المنتج الوسيط والمنتج الذي تم شراؤه ، قد تكون هناك حاجة إلى خطوات الغليان.
  3. اجلب الوسط إلى الحجم النهائي عندما تذوب المكونات تماما وتحكم في درجة الحموضة. إذا كانت القيمة أعلى أو أقل من المتوقع، فقم بضبطها باستخدام الحلول المقترحة في تعليمات الشركة المصنعة. تستخدم محاليل حمض الهيدروكلوريك و هيدروكسيد الصوديوم بشكل شائع لتقليل وزيادة درجة الحموضة ، على التوالي.
  4. يضاف أجار (2٪ وزن / حجم) ، ويسخن حتى 95 درجة مئوية ، ويغلى لمدة 1 دقيقة تقريبا لإذابة الأجار قبل التعقيم.
  5. تعقيم الوسيط عن طريق التعقيم باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تشمل عمليات التعقيم الشائعة 121-134 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة من العلاج.
  6. بعد التعقيم ، قم بتبريد وسط الأجار إلى حوالي 45-50 درجة مئوية واسكبه في أطباق بتري معقمة تحت غطاء تدفق رقائقي معقم مسبقا
  7. بعد التصلب ، قم بتسمية الألواح وفقا للنوع المتوسط وتاريخ التحضير.

2. جمع العينات

  1. اشطف جلد السمندل (جنس Speleomantes) بالماء المقطر المعقم لإزالة المجتمعات الميكروبية العابرة.
  2. اجمع مسحات الجلد من البرمائيات باستخدام مسحات قطنية معقمة في أنبوب اختبار. افركي المسحات برفق على سطح الجلد لجمع العينات الميكروبية دون الإضرار بالفرد.
    1. مرر مسحة مبللة بالماء المقطر المعقم على كل جانب من الجسم كله ، بما في ذلك جميع الأطراف ، خمس مرات (خمس ضربات ذهابا وإيابا) لأخذ عينات من الأفراد.
      ملاحظة: لا ينصح بتناول مكملات مع الإضافات لأنها قد تضر الأفراد.
    2. ضع المسحات في أنابيب تحتوي على محلول ملحي فسيولوجي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) مكمل بالجلسرين (20٪).
  3. امزج العينة مع المحلول ، وادفع المسحة نحو جدران الأنبوب أثناء الضغط على الأنبوب وتدوير المسحة جيدا (10 مرات في اتجاه عقارب الساعة و 10 مرات عكس اتجاه عقارب الساعة).
  4. بعد الخلط ، أغلق المسحة داخل الأنبوب وانقل العينات الميكروبيولوجية إلى المختبر ، مع الحفاظ على العينة عند 4 درجات مئوية حتى التحليل الميكروبي.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام مواد وقفازات معقمة جديدة لكل فرد لتجنب التلوث وتعرض المشغل للملوثات البيولوجية والكيميائية.

3. التلقيح والحضانة

  1. امزج العينة الميكروبيولوجية جيدا قبل المعالجة.
  2. تحضير التخفيفات التسلسلية للعينة الجلدية بمحلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) ، تتراوح من 10-1 إلى 10-6.
  3. تلقيح 100 ميكرولتر من العينة كما هي والتخفيفات التسلسلية على ألواح الأجار المحضرة. باستخدام حلقة معقمة على شكل حرف L ، قم بربط العينة عبر سطح وسط الأجار ، ووزعها بالتساوي دون ممارسة ضغط مفرط لتجنب إتلاف الأجار.
  4. اقلب الألواح الملقحة في حاضنة عند 20-25 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام. نطاق درجة الحرارة هذا مناسب لزراعة العديد من البكتيريا البيئية المتوسطة والمؤثرات العقلية التي تعيش في جلد البرمائيات.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام مادة معقمة تحت غطاء رقائقي معقم مسبقا. يتم إعداد خمس مكررات مستقلة لكل وحدة تجريبية. نظرا لأن كثافة البداية غير معروفة ولا يمكن التنبؤ بها ، فإن تضمين مجموعة واسعة من التخفيفات مفيد دائما.

4. تنقية السلالة وتحديدها

  1. حدد مستعمرات بكتيرية ذات أشكال مميزة لمزيد من التحليل بعد الحضانة.
    1. أولا ، اختر مستعمرات معزولة جيدا لتجنب التلوث أو التداخل وتجنب المناطق المزدحمة حيث يمكن أن تندمج المستعمرات. علاوة على ذلك ، اختر مستعمرات ذات مظاهر مختلفة (على سبيل المثال ، اللون أو الحجم أو الشكل أو الحافة أو السطح أو الملمس) لضمان أخذ عينات من الأنواع أو السلالات المختلفة المحتملة.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لاختيار السلالات البكتيرية المختلفة القابلة للزراعة من ميكروبات الجلد.
  2. الثقافة الفرعية للمستعمرات المختارة.
    1. انقل مستعمرة معزولة جيدا من صفيحة الأجار الأصلية بشكل إسهمي إلى صفيحة أجار جديدة باستخدام حلقة تلقيح. خط المستعمرة لعزلها ثم احتضانها بشكل مناسب.
    2. كرر هذه الخطوة عدة مرات على ألواح أجار طازجة للحصول على ثقافات نقية من كل عزلة بكتيرية حتى تبدو المستعمرات المعزولة متشابهة. كرر التثقيف الفرعي باستخدام وسائط انتقائية وجنيمة.
      ملاحظة: يضمن الجمع بين المناولة المعقمة والفحص البصري والمجهري والتحديد الجزيئي إجهادا خاليا من التلوث.
  3. تحقق من نقاء الثقافات الميكروبية من خلال الملاحظات المجهرية (من 5x إلى 100x goals) ، وتقارب تلطيخ الجرام (تثبيت المستعمرات ، والتلوين ، والمراقبة) ، والاختبارات الكيميائية الحيوية (على سبيل المثال ، اختبار الكاتلاز والأكسيديز واليورياز والسكر) 21،25.
    ملاحظة: يجب أن تظهر الثقافات النقية مورفولوجيا مستعمرة موحدة وخصائص مجهرية متسقة وسمات كيميائية حيوية.
  4. إجراء تحديد الجزيئ.
    1. استخرج الحمض النووي من المستعمرات البكتيرية المنقاة وقم بإجراء تسلسل جيني 16S rRNA لتحديد الأنواع البكتيرية. قم بتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين 16S rRNA باستخدام بادئات عالمية بكتيرية ، متبوعا بالتسلسل والمقارنة مع التسلسلات المعروفة في قواعد البيانات مثل GenBank26.
  5. إنشاء ثقافات البنوك الحيوية.
    1. اختبر الثقافات المحورية (أو النقية) للعقم عن طريق تلقيحها في وسط غير انتقائي والتحقق من عدم نمو الملوثات. قم بتخزين الثقافات المحورية للاستخدام على المدى المتوسط والطويل.
      ملاحظة: تشمل الطرق القياسية خطوط المستعمرات على ألواح أجار للوسط الانتقائي وتخزين درجة حرارة الغرفة ، وتعليق الثقافة في محاليل المخزون المحضرة بمزيج من الوسط الانتقائي والجلسرين (20:80 أو 50:50) ، أو التجميد بثقافة المرق (التجفيف بالتجميد) والتجميد عند -80 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توضيح سير عمل النهج التجريبي في الشكل 1.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل أخذ عينات الجلد البرمائية ومعالجتها ومعالجتها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تتمثل الخطوة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورنا بروتوكولا لأفضل الممارسات للحصول على مجتمع البكتيريا القابلة للزراعة من الجراثيم الجلدية البرمائية وأظهرنا ذلك على Speleomantes italicus. كما هو موضح في التطبيق أعلاه ، يجب اتخاذ عدة خطوات لضمان عزل الميكروبات الناجح عن جلد البرمائيات. يعد الجمع ، باستخدام تقنية مسحة لطيفة ومواد معقمة ، أمرا مهما جدا لجمع المواد الميكروبية الكافية وتجنب التلوث. يعد النقل والتخزين عند 4 درجات مئوية ، مع تغطية المسحات بمحلول ملحي مكمل بالجلسرين ، ضروريين للحفاظ على الجدوى الميكر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر الدعم المالي المقدم من جامعة لاكويلا ضمن مشاريع "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: علم السموم البيئية لسمندل الكهوف الأوروبي المهدد بالانقراض" و "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" بواسطة Biodiversa + ، الشراكة الأوروبية للتنوع البيولوجي ، في سياق Sub-BioMon - تطوير واختبار مناهج لمراقبة التنوع البيولوجي تحت الأرض في المشروع الكارستي في إطار مشروع 2022-2023 دعوة مشتركة ل BiodivMon ، والخطة الوطنية للتعافي والمرونة (NRRP) ، المهمة 4 ، المكون 2 ، الاستثمار 1.1 ، دعوة لتقديم المناقصة رقم 1409 المنشورة في 14.9.2022 من قبل وزارة الجامعة والبحث الإيطالية (MUR) ، بتمويل من الاتحاد الأوروبي - NextGenerationEU - رمز المشروع: P2022CYF9L ، عنوان المشروع هل أنواع الكهوف الاختيارية هي محركات الملوثات المعدنية في البيئات الجوفية؟ (METALCAVE) - كوب E53D23015380001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Lauria-Bertani agarMerk MilliporeL3027
Tryptic Soy AgarMerk Millipore22091
مستخلص خميرة الصويا التربتون أجارميرك ميليبور17221
المغذيات أجارميرك ميليبور70148
محلول الجلسرينميرك ميليبور49781

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Belkaid, Y., Tamoutounour, S. The influence of skin microorganisms on cutaneous immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 353-366 (2016).
  3. Kligman, A. M. What is the 'true' function of skin. Exp Dermatol. 11 (2), 159-187 (2002).
  4. Ross, A. A., Rodrigues Hoffmann, A., Neufeld, J. D. The skin microbiome of vertebrates. Microbiome. 7 (1), 79(2019).
  5. Kueneman, J. G., et al. Community richness of amphibian skin bacteria correlates with bioclimate at the global scale. Nat Ecol Evol. 3 (3), 381-389 (2019).
  6. Rebollar, E. A., MartínezUgalde, E., Orta, A. H. The amphibian skin microbiome and its protective role against chytridiomycosis. Herpetologica. 76 (2), 167(2020).
  7. Wuerthner, V. P., HernándezGómez, O., Hua, J. Amphibian skin microbiota response to variable housing conditions and experimental treatment across space and time. J Herpetol. 53 (4), 324(2019).
  8. HernándezGómez, O., Wuerthner, V., Hua, J. Amphibian host and skin microbiota response to a common agricultural antimicrobial and internal parasite. Microb Ecol. 79 (1), 175-191 (2020).
  9. SotoCortés, E., et al. Host species and environment shape the skin microbiota of Mexican axolotls. Microb Ecol. 87 (1), 98(2024).
  10. Cramp, R. L., McPhee, R. K., Meyer, E. A., Ohmer, M. E., Franklin, C. E. First line of defence: the role of sloughing in the regulation of cutaneous microbes in frogs. Conserv Physiol. 2 (1), cou012-cou012 (2014).
  11. Colston, T. J., Jackson, C. R. Microbiome evolution along divergent branches of the vertebrate tree of life: what is known and unknown. Mol Ecol. 25 (16), 3776-3800 (2016).
  12. Rebollar, E. A., et al. The skin microbiome of the neotropical frog Craugastor fitzingeri: inferring potential bacterialhostpathogen interactions from metagenomic data. Front Microbiol. 9, 466(2018).
  13. Li, X., Ricke, S. C. Comparison of cryoprotectants for Escherichia coli lysine bioavailability assay culture. J Food Process Preserv. 28 (1), 39-50 (2004).
  14. Patra, J. K., Das, G., Das, S. K., Thatoi, H. Isolation, Culture, and Biochemical Characterization of Microbes. In A Practical Guide to Environmental Biotechnology. , Springer. Singapore. (2020).
  15. Bertani, G. Studies on lysogenesis i. J Bacteriol. 62 (3), 293-300 (1951).
  16. Forbes, B. A., Sahm, D. F., Weissfeld, A. S. Diagnostic Microbiology. , Mosby. St Louis. (2007).
  17. O'Reilly, T., Niven, D. F. Tryptoneyeast extract broth as a culture medium for Haemophilus pleuropneumoniae and Haemophilus parasuis to be used as challenge inocula. Can J Vet Res. 50 (3), 441(1986).
  18. O'Reilly, T., Rosendal, S., Niven, D. F. Porcine haemophili and actinobacilli: characterization by means of API test strips and possible taxonomic implications. Can J Microbiol. 30 (10), 1229-1238 (1984).
  19. Niven, D. F. The cytochrome complement of Haemophilus parasuis. Can J Microbiol. 30 (6), 763-773 (1984).
  20. Lapage, S., Shelton, J. E., Mitchell, T. Methods in Microbiology. , Academic Press. London. (1970).
  21. Smibert, R. M. General Characterization. Manual of Methods for General Bacteriology. , American Society for Microbiology. Washington, DC. (1981).
  22. Sharma, N., Sharma, N., Sharma, S., Sharma, P., Devi, B. Identification, Morphological, Biochemical, and Genetic Characterization of Microorganisms. Basic Biotechniques for Bioprocess and Bioentrepreneurship. , Elsevier, Academic Press. (2023).
  23. Hubálek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 46 (3), 205-229 (2003).
  24. Lanza, B., Pastorelli, C., Laghi, P., Cimmaruta, R. A review of systematics, taxonomy, genetics, biogeography and natural history of the genus Speleomantes Dubois, 1984 (amphibia caudata plethodontidae). Atti Museo Civ St Natl, Trieste. 52, 5-135 (1984).
  25. Cappuccino, J. G., Welsh, C. T. Microbiology: A Laboratory Manual, Global Edition. , Pearson Education Limited: Pearson. Essex, England. (2017).
  26. Farda, B., et al. The "Infernaccio" gorges: microbial diversity of black deposits and isolation of manganesesolubilizing bacteria. Biology (Basel). 11 (8), 1204(2022).
  27. Lunghi, E., et al. Thermal equilibrium and temperature differences among body regions in European plethodontid salamanders. J Therm Biol. 60, 79-85 (2016).
  28. Woodhams, D. C., et al. Hostassociated microbiomes are predicted by immune system complexity and climate. Genome Biol. 21 (1), 23(2020).
  29. Stolp, H., Starr, M. P. Principles of Isolation, Cultivation, and Conservation of Bacteria. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1981).
  30. El Baz, S., et al. Resistance to and accumulation of heavy metals by actinobacteria isolated from abandoned mining areas. Sci World J. 2015 (1), 761834(2015).
  31. Le Pioufle, O., Declerck, S. Reducing water availability impacts the development of the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis MUCL 41833 and its ability to take up and transport phosphorus under in vitro conditions. Front Microbiol. 9, 1254(2018).
  32. Freitas, F., Alves, V. D., Reis, M. A. M. Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trends Biotechnol. 29 (8), 388-398 (2011).
  33. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  34. De Paoli, P. Biobanking in microbiology: from sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol Rev. 29 (5), 897-910 (2005).
  35. Dal Pizzol, M., et al. Antifungal efficacy and safety of cycloheximide as a supplement in OptisolGS. Drug Des Devel Ther. 15, 2091-2098 (2021).
  36. Overmann, J. Principles of Enrichment, Isolation, Cultivation, and Preservation of Prokaryotes. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).
  37. Madhuri, R. J., et al. Recent Approaches in the Production of Novel Enzymes from Environmental Samples by Enrichment Culture and Metagenomic Approach. Recent Developments in Applied Microbiology and Biochemistry. , Elsevier, Academic Press. (2019).
  38. BaichmanKass, A., Song, T., Friedman, J. Competitive interactions between culturable bacteria are highly nonadditive. Elife. 12, e83398(2023).
  39. Cevallos, M. A., et al. Genomic characterization of antifungal Acinetobacter bacteria isolated from the skin of the frogs Agalychnis callidryas and Craugastor fitzingeri. FEMS Microbiol Ecol. 98 (12), fiac126(2022).
  40. Lauer, A., Simon, M. A., Banning, J. L., Lam, B. A., Harris, R. N. Diversity of cutaneous bacteria with antifungal activity isolated from female fourtoed salamanders. ISME J. 2 (2), 145-157 (2008).
  41. Niederle, M. V., et al. Skinassociated lactic acid bacteria from North American bullfrogs as potential control agents of Batrachochytrium dendrobatidis. PLoS One. 14 (9), e0223020(2019).
  42. MuletzWolz, C. R., et al. Antifungal bacteria on woodland salamander skin exhibit high taxonomic diversity and geographic variability. Appl Environ Microbiol. 83 (9), e00186-e00217 (2017).
  43. Woodhams, D. C., et al. Antifungal isolates database of amphibian skin-associated bacteria and function against emerging fungal pathogens. Ecology. 96 (2), 595-595 (2015).
  44. Woodhams, D. C., et al. Interacting symbionts and immunity in the amphibian skin mucosome predict disease risk and probiotic effectiveness. PLoS One. 9 (4), e96375(2014).
  45. Pessier, A. P. An overview of amphibian skin disease. Sem Avian Exot Pet Med. 11 (3), 162-174 (2002).
  46. HernándezGómez, O., Hua, J. From the organismal to biosphere levels: environmental impacts on the amphibian microbiota. FEMS Microbiol Rev. 47 (1), fuad002(2023).
  47. Stevens, E. J., Bates, K. A., King, K. C. Host microbiota can facilitate pathogen infection. PLoS Pathog. 17 (5), e1009514(2021).
  48. Kostanjšek, R., Prodan, Y., Stres, B., Trontelj, P. Composition of the cutaneous bacterial community of a cave amphibian, Proteus anguinus. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz007(2019).
  49. Indriani, S., Karnjanapratum, S., Nirmal, N. P., Nalinanon, S. Amphibian skin and skin secretion: an exotic source of bioactive peptides and its application. Foods. 12 (6), 1282(2023).
  50. Gao, Y., et al. Targeted modification of a novel amphibian antimicrobial peptide from Phyllomedusa tarsius to enhance its activity against MRSA and microbial biofilm. Front Microbiol. 8, 628(2017).
  51. Wang, Y., Zhang, Y., Lee, W., Yang, X., Zhang, Y. Novel peptides from skins of amphibians showed broad-spectrum antimicrobial activities. Chem Biol Drug Des. 87 (3), 419-424 (2016).
  52. Barra, D., Simmaco, M. Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides. Trends Biotechnol. 13 (6), 205-209 (1995).
  53. RollinsSmith, L. A. The importance of antimicrobial peptides (AMPs) in amphibian skin defense. Dev Comp Immunol. 142, 104657(2023).
  54. RomeroContreras, Y. J., et al. Bacteria from the skin of amphibians promote growth of Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum by modifying hormonerelated transcriptome response. Plant Mol Biol. 114 (3), 39(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة