تحليل المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان

Zoi Laspa; Anne-Katrin Rohlfing; Meinrad P. Gawaz

doi:10.3791/67878

مقالة منهجية

تحليل المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان

DOI:

10.3791/67878

⸱

يونيو 10, 2025

Zoi Laspa¹ , Anne-Katrin Rohlfing¹ , Meinrad P. Gawaz¹

¹Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان للصفائح الدموية تحديد أنواع فرعية جديدة من الصفائح الدموية داخل المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية الكلاسيكية ، مثل الصفائح الدموية المريحة ، والمتراكمة ، والتخثر ، والصفائح الدموية المبرمجة. هذا يسمح بمقارنة أنماط المجموعات السكانية الفرعية المختلفة التي تسببها ناهضات الصفائح الدموية المختلفة. هنا ، يتم وصف إجراء لإنشاء لوحة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان بالتفصيل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصفائح الدموية ، أو الصفيحات ، هي خلايا دم صغيرة منوية النواة تلعب دورا مهما في الإرقاء والتخثر. يمكن أن تسبب العيوب في وظائف الصفائح الدموية نزيفا أو حدثا تخثرية لدى المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية. لذلك ، من المهم توصيف الصفائح الدموية بشكل ظاهري لتكون قادرة على تعيين مجموعات سكانية فرعية للصفائح الدموية لوظيفة الصفائح الدموية. يؤدي تحفيز الصفائح الدموية البشرية بناهضات ومنشطات الصفائح الدموية إلى حدوث تغيرات مورفولوجية وفسيولوجية في الصفائح الدموية ، مصحوبة بتغيرات في مجموعة المستقبلات السطحية. هذا يؤدي إلى مجموعات سكانية فرعية متنوعة وظيفيا من الصفائح الدموية. المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية المحددة تقليديا هي الصفائح الدموية المريحة ، والمتراكمة ، والتخثر ، والخلايا المبرمجة. لتوصيف تأثير ناهضات على الأنواع الفرعية للصفائح الدموية ، أنشأنا فحصا باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان الذي يتكون من 10 أجسام مضادة وأصباغ مختلفة (مضاد CD62P ، مضاد ل CD63 ، مضاد ل CD61 ، مضاد ل CD41 ، مضاد ل CD42b ، مضاد للإنتجرين_αIIbβ3 (استنساخ: PAC-1) ، مضاد ل CXCR4 ، مضاد ACKR3 ، Annexin V ، Zombie NIR). تم تحضين الصفائح الدموية البشرية المعزولة بناهضات الصفائح الدموية وتلطيخها بأجسام مضادة وأصباغ محددة مترافقة بالفلوروفور. بعد ذلك ، تم قياسها عن طريق قياس التدفق الخلوي. هذا يسمح لنا بتحديد الأنواع الفرعية الخاصة بالناهض ضمن المجموعات الفرعية الأربعة الكلاسيكية. في الختام ، فإن الجمع بين علامات التنشيط (anti-CD62P ، anti-CD63 ، anti-Integrin_αIIbβ3 (استنساخ: PAC-1)) ، والعلامات الالتهابية (anti-CXCR4 ، anti-ACKR3) وعلامات موت الخلايا المبرمج (Annexin V ، Zombie NIR) التي تشكل لوحة قياس التدفق الخلوي المكونة من 10 ألوان الموضحة في هذه المخطوطة يفتح إمكانية تحديد المزيد من الأنواع الفرعية للصفائح الدموية التي يمكن ربطها بوظيفة صفائح الدموية المحددة. يمكن تطبيق هذه الطريقة في البحث الأساسي حول وظيفة الصفائح الدموية وعلم وظائف الأعضاء ، وكذلك في تحديد أنواع فرعية جديدة من الصفائح الدموية في نماذج المرض ودراسات المرضى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصفيحات ، وتسمى أيضا الصفائح الدموية ، هي خلايا دم صغيرة خالية من النواة ضرورية للإرقاء وتطور تجلط^{الدم 1}^،². يمكن تنشيطها بواسطة ناهضات الصفائح الدموية المختلفة. ناهضات الصفائح الدموية الفسيولوجية الكلاسيكية هي ثنائي فوسفات الأدينوسين (ADP) ، الذي يرتبط بمستقبلات P2Y12 و P2Y1 ، والثرومبين الذي ينشط الصفائح الدموية من خلال مستقبلات PAR1 و PAR4 ، والكولاجين الذي يتفاعل مع البروتين السكري السادس. يمكن استبدال الكولاجين في التجارب المختبرية بالببتيد المرتبط بالكولاجين (CRP-XL) ³^،⁴. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن الهيمين يحفز تنشيط الصفائح الدموية من خلال تفاعل المستقبلات الشبيهة بالليكتين من النوع C (CLEC-2) والبروتين السكري السادس (GPVI) ، مما يؤسس الهيمين كمنشط / ناهض جديد للصفائح الدموية⁵^،⁶. يمكن أن تؤدي العديد من الحالات المرضية إلى انحلال الدم ، مما يؤدي إلى تحرير الهيمين الحر المحتوي على الحديد. كل ناهضات الصفائح الدموية هذه تغير تعبير المستقبلات السطحية على الصفائح الدموية. يعتمد تغيير المستقبلات السطحية وغشاء البلازما على قوة وتركيز ناهض الصفائح الدموية⁷^،⁸^،⁹. لذلك ، من المهم توصيف الصفائح الدموية ظاهريا لتكون قادرة على تعيين مجموعات سكانية فرعية للصفائح الدموية لوظيفة الصفائح الدموية.

كشفت الطرق عالية الأبعاد مثل قياس التدفق الخلوي أن الصفائح الدموية تشكل مجموعات سكانية فرعية ذات وظائف متميزة. يمكن تصنيف المجموعات السكانية الفرعية من خلال علامات سطحية مختلفة. في الأدبيات ، من المعروف جيدا وجود مجموعتين فرعيتين متميزتين من الصفائح الدموية: التخثر ، الذي يتميز بإخراج الفوسفاتيديل سيرين ، والنمط الظاهري التجميعي الذي ينشط الإنتجرين α_IIIbβ_3.بالإضافة إلى علامات التنشيط الكلاسيكية ، يمكن استخدام الأصباغ الفلورية مثل Glutathione-S-Aryloxide (GSAO) التي تكتشف وظيفة الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي لمزيد من التصنيف ، على سبيل المثال ، الصفائح الدموية المخثرة حسب حالتها الأيضية¹⁰. يسمح ذلك بالتمييز بين النمط الظاهري للصفائح الدموية¹¹ للانتفاخ ونفاذية الميتوكوندريا وانتقال نفاذية الميتوكوندريا (MPTP).

Heemskerk et al. أظهر من خلال تحليل التعرض للفوسفاتيديل سيرين (PS) ونشاط الإنتجرين α_IIbβ₃أن مجموعات الصفائح الدموية المختلفة يمكنها التحكم في خطوات تخثر مميزة وأن المنشطات القوية مثل الثرومبين والكولاجين مطلوبة للتعرض للفوسفاتيديل^{سيرين 12}. علاوة على ذلك ، فإن تنشيط الصفائح الدموية بواسطة GPVI مع الكولاجين أو الاختلاط الناهض GPVI المحدد هو المسؤول بشكل أساسي عن تكوين الصفائح الدموية الملتصقة للتخثر. وبالمثل ، فإن حمض الأراكيدونيك ، الذي يؤدي إلى تنشيط الصفائح الدموية عن طريق إنتاج الثرومبوكسان A2 بواسطة سيكلوأكسيجيناز ، يحفز التعرض ل PS¹³. ومع ذلك ، فإن حمض الأراكيدونيك ، بالمقارنة مع الثرومبين أو الكولاجين ، هو منشط ضعيف للصفائح^{الدموية 14}. قام Van Velzen et al. أيضا بتقييم مستضدات سطح الصفائح الدموية (CD42a / b ، CD36 ، CD41 ، CD61) وعلامات التنشيط (PAC-1 ، CD63 ، CD62P) في قياسين منفصلين¹⁵. بالإضافة إلى ذلك ، تمكن فان فيلزن وآخرون من تحليل الدم من مرضى الوهن الخثاري ومقارنة المجموعات السكانية الفرعية بين المرضى الأصحاء والمرضى. قام Hindle et al. بقياس تأثير البروستاسيكلين على التجمعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية بعد معالجة الثرومبين و CRP-XL بلوحتين فرديتين تتكون من أربع علامات لكل منهما (PAC-1 ، Annexin V ، CD62P ، CD42b ، أو CDCD154 ، CD62P ، CD63 ، CD42b) ¹⁶. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان لتعريف الراحة (CD42b ⁺ ، PAC1^- ، CD62P^- ، Annexin V^-) ، التجميعي (CD42b ⁺ ، PAC1 ⁺ ، CD62P ⁺ ، Annexin ^V-) التخثر (CD42b ⁺ ، PAC1^- ، CD62P ⁺ ، Annexin V ⁺) وموت الخلايا المبرمج (Cd42b^- ، PAC1^- ، CD62P^- ، Annexin ^{V +}) الصفائح الدموية^{الفرعية 7}^،¹⁷. قام Laspa et al. بتوسيع / تحسين نهج قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان عن طريق إضافة أجسام مضادة ضد مستقبلات الكيموكين CXCR4 و ACKR3¹⁸. استنادا إلى الأدبيات المتاحة ، هذه هي أول لوحة مقياس التدفق الخلوي المكونة من 10 ألوان للصفائح الدموية البشرية المعزولة والتي تسمح بالكشف عن 10 مستضدات مختلفة على صفائح دموية فردية (مستوى خلية واحدة) داخل مجموعة من الصفائح الدموية البشرية المعزولة في أنبوب واحد. وبالتالي ، من الممكن قياس التنشيط والالتصاق وإمكانات التجميع ومستقبلات الكيموكين وإمكانات موت الخلايا المبرمج لخلية واحدة لتمييز السكان الفرعيين الحاليين بشكل أكبر. وبالتالي ، فإنه يكمل جونسون وآخرون ، الذين حددوا المجموعات السكانية الفرعية الأربعة الرئيسية بأربع علامات (الراحة ، التخثر ، التجميعي ، موت الخلايا المبرمج) ¹⁷. لذلك ، فإن إنشاء مقايسة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان يمكن من مقارنة ناهضات الصفائح الدموية المختلفة فيما يتعلق بنمط تنشيطها وتشكيل أنواع فرعية من الصفائح الدموية داخل مجموعات الصفائح الدموية الكلاسيكية.

يمكن استخدام هذه الطريقة للبحث الأساسي فيما يتعلق بتحليل وظيفة الصفائح الدموية وعلم وظائف الأعضاء. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء مقايسة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان للصفائح الدموية البشرية باستخدام الصفائح الدموية المكتسبة من خلال دراسات المرضى ، على سبيل المثال ، البحث في أمراض القلب والأوعية الدموية وأحداث التخثر ، لفك تشفير المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية التي تسببها هذه الأمراض وتأثيرات العلاجات على هذه الأنماط الظاهرية المستحثة. على سبيل المثال ، مولر وآخرون أظهر أن المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية يمكن أن تختلف في مرضى تضيق الأبهر¹⁹. قد توفر المعرفة المكتسبة فرصا جديدة للتدخلات الصيدلانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جمع الدم والتعامل معه لأغراض البحث من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الطب بجامعة إبرهارد كارلز ومستشفى جامعة توبنغن (تصويت أخلاقي 238/2018B02) ، وتتوافق منهجيات الدراسة مع المعايير التي حددها إعلان هلسنكي. أعطى المتبرعون الأصحاء موافقة خطية مستنيرة على جمع الدم. وترد الخصائص الأساسية للمتبرعين الأصحاء في الجدول 1. يعطي الشكل 1 نظرة عامة على بروتوكول قياس التدفق الخلوي.

1. عزل الصفائح الدموية البشرية عن الدم الكامل

ملاحظة: تم اتباع إرشادات ISTH من حيث جمع العينات ، والعاصبات ، واختيار مضادات التخثر من أجل ضمان طريقة موحدة لعزل الصفائح^{الدموية 20}.

تحضير العازلة
1. عازلة مضادة للتخثر من حمض السترات وسكر العنب (ACD): قم بإذابة 12.50 جم من Na 3-Citrat (85 ملي مولار C₆H₅Na₃O₇ × 2 H₂O) ، 6.82 جم من حمض السترات (71 مل) و 10.00 جم جلوكوز (111 مل) في 475 مل من أكوا ديستيلاتا. اضبط الرقم الهيدروجيني مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 4.69. املأ ما يصل إلى 500 مل بأكوا ديستيلاتا. بعد ذلك ، قم بتعقيم المخزن المؤقت وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  ملاحظة: يتم تعقيم جميع المحاليل بالترشيح باستخدام نظام ترشيح يعمل بالفراغ ، والذي يستخدم غشاء بولي إيثر سلفون سريع التدفق بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
2. عازلة Tyrode (10x): تزن 80.00 جم كلوريد الصوديوم و 10.15 جم NaHCO_{3 و} 1.95 جم KCl وأضف أكوا ديستيلاتا إلى 1 لتر ، قم بتعقيم المخزن المؤقت وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. عازلة Tyrode's-HEPES (1x ؛ 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.8 ملي كلوريد كلوريد ، 12 ملي NaHCO₃ ، 5 ملي جلوكوز ، 10 ملي هيبس): امزج 10 مل من 10x المخزن المؤقت Tyrode و 90 مل من أكوا ديستيلاتا. قم بإذابة 0.1 جم جلوكوز و 0.1 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA). اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) إلى 7.4. اضبط 10 مل من المخزن المؤقت ل Tyrode على درجة الحموضة 7.4 واضبط الرقم الهيدروجيني المتبقي 90 مل من Tyrode على 7.4 مع 1 N HCl إلى الرقم الهيدروجيني 6.5.
  ملاحظة: يمكن ل BSA البحث عن بعض المواد الكيميائية ، مثل الهيمين. في هذه الحالة ، من المهم إعداد المخزن المؤقت ل 1x Tyrode بدون BSA. يجب السماح لجميع المخازن المؤقتة بالتسخين إلى درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
جمع عينات الدم
1. قم بإعداد حقنة واحدة لكل متبرع سعة 10 مل مع 2 مل من مضادات التخثر ACD واتركها تتكيف مع درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية باستخدام حاضنة. حافظ على عامل التخفيف 1: 5 (ACD: الدم).
  ملاحظة: استخدم محاقن أصغر أو أكبر لسحب عينات الدم. يمكن أن يؤدي المخزن المؤقت البارد ACD إلى تنشيط الصفائح الدموية مسبقا وإضعاف نتائجك.
2. استخدم إبرة فراشة (21 جم) لجمع دم المتبرع ببطء في محاقن ACD المسخنة مسبقا. افتح خرطوم العاصبة قبل ملء المحقنة لتجنب التنشيط المسبق.
  ملاحظة: يمكن للمحاقن ذات الإبرة ذات المقياس الأكبر أن تقلل من تنشيط الصفائح الدموية الناجم عن القص.
3. انقل دم ACD ببطء إلى أنبوب تفاعل سعة 15 مل. استخدم الدم على الفور لتجنب التنشيط المسبق للصفائح الدموية.
عزل الصفائح الدموية
1. جهاز الطرد المركزي لدم ACD لمدة 20 دقيقة عند 209 × جم (درجة حرارة الغرفة ، RT) بدون فرامل. قم بإعداد 25 مل من الرقم الهيدروجيني للعازلة Tyrode's-HEPES 6.5 في أنبوب تفاعل سعة 50 مل.
2. انقل البلازما الغنية بالصفائح الدموية الناتجة برفق (PRP ، الطبقة العليا) إلى أنبوب تفاعل سعة 50 مل يحتوي على المخزن المؤقت Tyrode's-HEPES ، درجة الحموضة 6.5.
3. اترك ما يقرب من 1 مل من البلازما الغنية بالصفائح الدموية فوق الطبقة المصقولة وكريات الدم الحمراء لتجنب التلوث بخلايا الدم الأخرى.
4. الطرد المركزي التعليق عند 430 × جم لمدة 10 دقائق عند RT لتكبيل الصفائح الدموية. أعد تعليق الحبيبات الناتجة بعناية في 200-300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتيرود ، الرقم الهيدروجيني 7.4.
5. استخدم عداد الخلايا لتحديد عدد الصفائح الدموية. اضبط عدد الصفائح الدموية باستخدام درجة الحموضة العازلة Tyrode's-HEPES 7.4 إلى 200 × 10³ الصفائح الدموية / ميكرولتر. انظر الخطوة 3 لمزيد من معالجة تلطيخ الصفائح الدموية.

2. اختيار ومعايرة الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي

اختيار الأجسام المضادة والأصباغ
1. حدد الأجسام المضادة والأصباغ ذات الفلوروفورات المناسبة لمقياس التدفق^{الخلوي 21}. لاحظ تكوين المرشح الموصى به من قبل الشركة المصنعة لمقياس التدفق الخلوي. يتم إعطاء مثال على علامات الصفائح الدموية وتكوين الفلوروفور في الجدول 2 والشكل 2 لمقياس الخلوي التالي: BD LSR Fortessa مع تكوين الليزر: بنفسجي (402 نانومتر) ، أزرق (488 نانومتر) ، أصفر / أخضر (561 نانومتر) ، أحمر (640 نانومتر).
  ملاحظة: استخدم الفلوروكرومات الأكثر إشراقا للمستضدات ذات التعبير المنخفض. على سبيل المثال ، تم استخدام الفلوروكرومات الساطعة BV412 و BV650 لمستقبلات الكيموكين المعبر عنها بشكل ضعيف (ACKR3 و CXCR4) ²²^،²³^،²⁴.
معايرة الأجسام المضادة والأصباغ
1. معايرة الأجسام المضادة للعثور على تركيز العمل المناسب. للمعايرة بالتحليل الحجمي، استخدم الصفائح الدموية البشرية المعزولة من الخطوة 1 وسلسلة تركيز الجسم المضاد.
  ملاحظة: تعد تركيزات العمل التي تقدمها الشركة المصنعة بشكل عام نقطة انطلاق جيدة لسلسلة التركيز.
  1. إذا كنت تعمل مع المستضدات التي يتم التعبير عنها فقط تحت العلاج ، فقم بتنشيط الصفائح الدموية قبل تلطيخها للتأكد من إمكانية اكتشاف الخلايا السالبة والموجبة أيضا. على سبيل المثال ، يرتبط PAC-1 فقط بالإنتجرين المنشط α_IIbβ₃. لذلك ، قم بتنشيط الصفائح الدموية بقوة للحصول على إشارة ساطعة وإيجابية ، على سبيل المثال ، مع 10 ميكروغرام / مل من الببتيد المرتبط بالكولاجين (CRP ؛ انظر الشكل 3).
معايرة العينات
1. اعزل الصفائح الدموية البشرية كما في الخطوة 1 واضبط عدد الصفائح الدموية إلى 1 × 10⁶ صفائح دموية لكل عينة.
  1. بالنسبة للمستقبلات التي لا تحتاج إلى تنشيط قبل تلطيخها: CD61 ، CD42b ، CD41 ، CXCR7 ، CXCR4 استخدم عينة واحدة غير ملوثة وملطخة لكل جسم مضاد. بالنسبة للمستقبلات / العلامات التي تحتاج إلى تنشيطها ، على سبيل المثال ، 10 ميكروغرام / مل من CRP-XL قبل تلطيخها: PAC1 ، CD63 ، CD62P ، Annexin V ، Zombie NIR ، استخدم عينة واحدة نشطة وواحدة غير نشطة¹⁵ ^، ²⁵ ^، ²⁶.
2. قم بتنشيط الصفائح الدموية (1 × 10⁶ صفائح دموية لكل عينة) إذا لزم الأمر لمدة 30 دقيقة باستخدام 10 ميكروغرام / مل CRP-XL. بعد ذلك ، احتضان الصفائح الدموية المعزولة (1 × 10⁶ الصفائح الدموية لكل عينة) لمدة 30 دقيقة بتركيزات مختلفة من الجسم المضاد أو الصبغة المترافقة بالفلوروكروم وإضافة 300 ميكرولتر من 1x Annexin Binding Buffer لتخفيف العينة (ترد أمثلة للتركيزات في الجدول 3).
3. قم بقياس 10,000 حدث لكل عينة.
4. احسب مؤشر البقعة الذي يوضح الفصل الأمثل بين المجموعات الموجبة والسالبة لكل جسم مضاد ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1.
5. ارسم مؤشر البقعة لكل تركيز من تركيزات الجسم المضاد للعثور على التركيز الأمثل.

3. تلطيخ لقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: انظر الجدول 4 للحصول على مثال على تلطيخ أربعة منشطات مختلفة للصفائح الدموية (CRP-XL ، ADP ، ثرومبين ، هيمين).

يجب تحضير هيمين طازجا. قم بإذابة المسحوق في 1.4 M هيدروكسيد الصوديوم إلى محلول 3 أمتار وقم بتسخينه إلى 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق عند 450 دورة في الدقيقة. ثم قم بتخفيفه باستخدام H₂O المقطر إلى محلول مخزون 3 ملم.
بعد تعديل عدد الصفائح الدموية (لكل عينة: 1 × 10⁶ صفائح ضفائح) ، قم بتنشيط الصفائح الدموية في أنبوب مع منشطات الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة عند RT كما هو موضح في الجدول 4.
أضف 43.3 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة إلى العينات واحتضن الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
بعد الحضانة ، قم بتخفيف العينات ب 300 ميكرولتر من 1x Annexin Binding Buffer (10 ملي مولار HEPES / NaOH ، درجة الحموضة 7.4 ، 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي مولار CaCl₂) بحيث يمكن لبروتين Annexin V أن يرتبط بالفوسفاتيديل سيرين على الجانب الخارجي من غشاء الخلية. قم بقياس العينات على الفور.
ملاحظة: قم بقياس العينات مباشرة بعد التحضير. نظرا لأن العينات غير ثابتة ، فإن تأخير إعداد العينة وقياسها يمكن أن يزيد من تباين النتائج. التثبيت يضعف ربط الملحق الخامس.

4. إعداد التعويض والتألق ناقص قياس تحكم واحد (FMO)

ملاحظة: قبل تسجيل البيانات، قم بتشغيل إعداد التعويض. يقوم مقياس التدفق الخلوي تلقائيا بحساب إعدادات التعويض ؛ راجع الكتيبات المعتادة لمقياس التدفق الخلوي لإجراء التعويض المحدد. ومع ذلك ، استخدم عناصر التحكم في التعويض إما بالخلايا أو بالخرز.

إعداد التعويض
1. للتعويض بالخرز ، قم بإعداد 150 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) لكل فلوروفور مع قطرة واحدة من الخرز و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق مع الفلورة.
2. راقب تفاعل الأنواع للخرز. استخدم IgGκ المضاد للفأر والتحكم السلبي في جزيئات البوليسترين الدقيقة. للتعويض عن الملحق الخامس ، قم بتسمية حبات PE / Cy7 بالجسم المضاد PE / Cy7 CD62L المضاد للإنسان الذي يقترن بنفس الفلوروفور مثل الملحق الخامس.
3. استخدم حبات تعويض الأمين التفاعلية للصبغة التفاعلية مع الأمين. استخدم قطرتين من الخرز الموجب وقطرة واحدة من الخرز السالبة في 150 ميكرولتر من PBS مع 1 ميكرولتر من الصبغة. تأكد من أن حبات التعويض المتفاعلة مع الأمين تتفاعل مع الصبغة وتظهر إشارة موجبة. تأكد من أن الخرزات السالبة لا تتفاعل مع الصبغة المتفاعلة مع الأمين وتقدم إشارة سلبية.
  ملاحظة: بالنسبة إلى Zombie NIR APC-Cy7 ، استخدم حبات الأمين التفاعلية السلبية والإيجابية.
4. احتضان عينات التعويض لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
5. قم بتشغيل كل أنبوب تعويض بشكل منفصل وقم بتشغيل البوابة على مجموعة الخرزة المفردة بناء على FSC و SSC. تظهر مجموعة الخرزة كمجموعة صغيرة مركزة. ارسم بوابة حول هؤلاء السكان.
6. اعرض الرسوم البيانية لكل أنبوب تعويض واضبط قيم التعويض حتى لا تتداخل القمم الإيجابية للأجسام المضادة والأصباغ المختلفة. بعد ذلك ، قم بقياس كل أنبوب تعويض والسماح بحساب امتداد الفلوروفورات وفقا لإجراء التشغيل القياسي الخاص بالشركة المصنعة.
7. تابع الحصول على تجربة التلوين الفعلية مع الصفائح الدموية البشرية المعزولة (انظر الخطوة 3 والجدول 4). اضبط جهد SSC / FSC قبل القياس للعثور على عدد الصفائح الدموية. نظرا لأن CD61 يتم التعبير عنه في كل مكان على الصفائح الدموية ، فتحقق من عتبة التألق هذه إذا كان من الممكن اكتشاف كل حجم من الصفائح الدموية.
8. بعد ذلك ، قم بقياس 20,000 حدث لكل عينة.
قياس FMO
1. قم بإعداد عنصر تحكم FMO لكل علامة وفقا للجدول 5. من أجل التمكن من تحديد تداخلات جميع العلامات ، قم بإعداد عينات غير محفزة ومحفزة.

5. تحليل البيانات

التحليل باستخدام برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي (الشكل 4)
1. قم بسحب ملفات FSC وإفلاتها في البرنامج. حدد مع FMO التحكم في السكان الإيجابيين لكل علامة.
  1. حدد FMOs عن طريق رسم كل عنصر تحكم FMO مقابل كل علامة في مخطط نقطي. هذا يجعل الانسكاب إلى قنوات أخرى مرئيا. استخدم بوابة FMO ذات أعلى امتداد مضان كحدود للسكان الإيجابيين للعينات المعالجة المكونة من 10 ألوان.
التحليل باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي المستند إلى السحابة (الشكل 5)
1. افتح البرنامج وأنشئ مجموعة بيانات جديدة. قم بسحب ملفات FCS التي تم الحصول عليها باستخدام مقياس التدفق الخلوي وإفلاتها.
2. ابدأ التحليل عن طريق إنشاء سير عمل. يتم إنشاء مصفوفة التعويض تلقائيا من ملفات البيانات الأولية.
3. قم بإجراء تحليل UMAP بالإعدادات التالية: الجيران: 15 ، الحد الأدنى للمسافة: 0.4 ؛ المكونات: 2 ؛ متري: إقليدي. معدل التعلم: 1 ؛ العصور: 200; تضمين التهيئة: طيفي. حدد جميع الملفات وجميع العلامات ال 10 (الميزات).
4. أضف تحليل Phenopraph كمهمة جديدة وقم بتشغيل التحليل بالإعدادات التالية: K أقرب الجيران: 20; متري المسافة: الإقليدي. لوفان يركض: 1 ؛ عدد النتائج: 1.
5. أضف مهمة بوابة للإشارة إلى المجموعات التي تم إنشاؤها. بعد إجراء التحليل ، من الممكن تقديم البيانات في نقاط مختلفة ، والتي يمكن تصديرها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك خياران لتحليل البيانات الأولية التي تم جمعها بواسطة لوحة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان. أحد الخيارات هو تحليله يدويا باستخدام برنامج التحليل (الشكل 3 والشكل 4). لذلك ، يجب سحب البيانات الأولية وإفلاتها في نافذة البرنامج. أولا ، يجب العثور على الخلايا عن طريق ضبط مقياس SSC / FSC في وضع عرض المخطط المبعثر لإظهار مجموعة الصفائح الدموية كسحابة نقطية مميزة. بعد ذلك ، يمكن تحديد الخلايا الموجبة لكل علامة باستخدام العينات غير المعالجة والمعالجة عن طريق إدخال ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان بتحديد مجموعات / مجموعات فرعية مميزة من الصفائح الدموية مرتبطة بالوظائف^{المنفصلة 12}^،¹⁷^،¹⁸. الحاسم بالنسبة لنتائج المجموعات السكانية الفرعية والتعبير السطحي للمستقبلات هو جودة الصفائح الدموية البشرية المعزولة. لذلك ، فإن إحدى الخطوات الرئيسية في البروتوكول المقدم هي تحضير الصفائح الدموية. يجب عزلها بلطف لتجنب التنشيط قبل علاج العينة بمؤثر مختلف. حتى عند تنفيذ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم المشروع من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) - المشروع رقم 335549539 - GRK 2381.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10x ملزمة المخزن المؤقت	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	Buffer
فوسفات الأدينوسين (ADP)	التحقيق & الذهاب Labordiagnostica GmbH Lemgo, ألمانيا	70212	ناهض الصفائح الدموية
Annexin V PE-Cyanine7	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	dye
المضادة CD41 AF 700	BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	303728	الجسم المضاد ؛
المضادة CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	303727	الأجسام المضادة ؛
مضاد CD42b PerCP / Cyanine5.5 ؛	BioLegend, سان دييغو, كاليفورنيا, الولايات المتحدة الأمريكية	303918	الأجسام المضادة
anti-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	744382	الأجسام المضادة
المضادة ل CD62P PE	بيكمان كولتر ، Brea ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	IM1759U	الجسم المضاد ؛
مضاد CD63 PE / Cy5 ؛	Abcam, Cambrigde, المملكة المتحدة	ab 234251	الأجسام المضادة
المضادة ل CXCR4 BV650	BD Bioscience فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية	740599	الأجسام المضادة ؛
مضاد ل CXCR7 BV421 ؛	BD Bioscience فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛	566234	الأجسام المضادة
المضادة ل PAC-1 FITC	BD Bioscience فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية	340507	الجسم المضاد ؛
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	Applichem, دارمشتات, ألمانيا	A1391-Citrit
acid	كارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا	6490.1-CRP-XL
	CambCol Laboratories ، Ely ، ناهض	CRP-XL	في المملكة المتحدة ؛
D- (+) - Glucose	Sigma Aldrich Co. ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	G7528-Dubecco
' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	شركة Sigma Aldrich Co, سانت لويس, ميسوري, الولايات المتحدة الأمريكية	D8537-Hemin
	Sigma Aldrich Co., سانت لويس, ميسوري, الولايات المتحدة الأمريكية	H9039-10G	ناهض الصفائح الدموية
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	9105.3-Potassium
Chloride	كارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا	6781.3-كلوريد
الصوديوم ؛	كارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا	3957.1-كربونات
هيدروجين الصوديوم ؛	شركة Sigma Aldrich Co, سانت لويس, ميسوري, الولايات المتحدة الأمريكية
401676-Thrombin	Roche	ناهض الصفائح الدموية 10602400001
ثلاثي سترات الصوديوم ثنائي هيدرات	Applichem, دارمشتات, ألمانيا
1416551211-Zombie NIR	BioLegend, سان دييغو, كاليفورنيا, الولايات المتحدة الأمريكية	423105	صبغة أمين تفاعلية

ثنائي الصفائح الدموية شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. Signaling During Platelet Adhesion and Activation. Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).
Oishi, S., et al. Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma. Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).
Bourne, J. H., et al. Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2. Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).
Rohlfing, A. K., et al. cGMP modulates hemin-mediated platelet death. Thromb Res. 234, 63-74 (2024).
Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
Sodergren, A. L., Ramstrom, S. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol. Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).
Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
Agbani, E. O., et al. Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets. Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).
Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
Rukoyatkina, N., et al. Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets. Thromb Res. 171, 22-30 (2018).
Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen. Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).
van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin. J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).
Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
Laspa, Z., et al. Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques. FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).
Mueller, K. A. L., et al. Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).
Jourdi, G., et al. Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).
Flores-Montero, J., et al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Meth. 475, 112618(2019).
Clemetson, K. J., et al. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).
Rohlfing, A. K., et al. ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury. Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).
Rath, D., et al. Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery. Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).
Hashemzadeh, M., et al. A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease. Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).
Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation. Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).
Busuttil-Crellin, X., et al. Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers. Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).
Fink, A., et al. The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI. Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

UMAP

تحليل المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة