يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول قوي وقابل للتكرار لتوليد عضويات الأنابيب العصبية من خلايا جذعية جنينية فردية في الفأر

463 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67883

⸱

ديسمبر 19, 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

في هذه المقالة

ملخص

تعد عضويات الأنابيب العصبية ثلاثية الأبعاد (NTOs) المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر أدوات قيمة لدراسة الجهاز العصبي المركزي خلال التطور المبكر. هنا، يتم عرض خطوة بخطوة لبروتوكول محسن لزراعة NTO في المختبر، يوفر ظروف زراعة مستقرة واستراتيجيات استكشاف أعطال لتوليد NTO موثوق وقابل للتكرار.

الملخص

تطور الثدييات هو عملية معقدة للغاية، تتميز بضرورة الإشارات الدقيقة المعتمدة على التركيز والوقت لتكوين الأنماط الصحيحة والتشكل الشكلي. على الرغم من التقدم التكنولوجي الكبير والمعرفة التي تم جمعها، لا تزال العديد من جوانب تطور الثدييات بعيدة المنال. عند فحص الكائن الحي بأكمله، يصبح من الصعب فك تأثير المسارات الفردية أو الآلية التي توجه بها المنبهات الخارجية تداخل الأنسجة والعوامل المحيطة. في معالجة هذا التعقيد، ظهرت نماذج ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) في المختبر مثل العضويات كأدوات قيمة. تظهر العضويات، المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs)، خصائص شبيهة بالأنسجة تشبه إلى حد كبير نظيراتها في الجسم الحي من حيث أنماط التعبير والوظائف. والأهم من ذلك، أنها توفر إمكانية الوصول للتلاعب والدراسات البيولوجية الواسعة ضمن بيئة تجريبية مضبوطة. على الرغم من نشأتها من ثقافات متعددة القدرات، غالبا ما تظهر الأنظمة العضوية تباينا وتنوعا كبيرا، مما يحد من فائدتها عند دراسة الأسئلة البيولوجية المعقدة والمعقدة. لذلك، هناك حاجة ملحة لبروتوكولات مفصلة تهدف إلى توحيد الإجراءات التي تؤدي إلى بيانات عالية الجودة قابلة للتكرار، وتقليل المواد المستخدمة، والتي تسمح بشكل مهم بدراسة الظواهر المعقدة. في هذا السياق، يتم تقديم بروتوكول محسن لزراعة عضويات الأنابيب العصبية (NTOs) في المختبر . من خلال إنتاج ظروف زراعة مستقرة وتقديم استراتيجيات شاملة لحل المشكلات، يمكن هذا البروتوكول من توليد NTOs الموثوق والقابل للتكرار، والتي تعد نموذجا مناسبا لدراسة الأسئلة العلمية ذات الصلة، بما في ذلك آليات التحفيز العصبي، والنمط، والتطور المبكر للجهاز العصبي المركزي.

المقدمة

تطور الثدييات، الذي يبدأ من خلية جذعية واحدة توتيبوتنت، هو عملية معقدة تتضمن تحفيز تكوين النمط والتشكل 1,2. يتطلب هذا التطور برامج خلوية منظمة بدقة لإدارة التفاعلات الديناميكية بين الخلايا وبيئاتها. تمتلك الخلايا الجذعية القدرة الجوهرية على الإحساس والتكامل والاستجابة للإشارات الجهازية والمحلية بما في ذلك تدرجات المورفوجين3، والحدود الميكانيكية4، وتكاثر الخلايا، وإعادة تشكيل البيئة5. كما أن الإشارات المكانية الزمنية الخارجية تدفع الاستجابات متعددة الخلايا، في البداية في الأنسجة المتجانسة، لضمان تكوين دقيق للهياكل المعقدة. تلعب الخلايا الجذعية، التي تتميز بقدرتها على التجدد الذاتي 6,7 وقدرتها على التمايز، دورا حيويا في التطور الجنيني وإصلاح الأنسجة البالغة، مع الأنواع الرئيسية تشمل الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، والخلايا الجذعية البالغة (ASCs)، والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثثة (iPSCs).

يتم استخراج الخلايا الكيميائية من الكتلة الداخلية للخلايا (ICM) في الكيسة الأريمية، وعادة ما تزرع في بيئة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) على خلايا تغذية أو مصفوفة خارج الخلية باستخدام وسائط زراعة محددة للحفاظ على تعددية قدراتها8. في السنوات الأخيرة، زادت الحاجة إلى ظروف وتقنيات زراعة الخلايا الأكثر واقعية بشكل كبير، لذا تم إنشاء نماذج خلايا وأنسجة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لدراسة العمليات الطبية الحيوية الأساسية9. خاصة في علم الأحياء التطوري، تقدم هذه النماذج ثلاثية الأبعاد مثل العضوية طريقة قوية لنمذجة تشكل الأنسجة وتكوين الأعضاء خارج الجسم الحي9. تتكون العضوية من خلال التنظيم الذاتي للخلايا الجذعية المتكاثرة التي تتطور تلقائيا إلى هياكل ثلاثية الأبعاد معقدة من خلال كسر التناظر وتكوين الأنماط. هذه العملية مشابهة، لكنها ليست مطابقة لما يلاحظ في الجسم الحي، وتحدث غالبا بدون توجيه خارجي بل مدفوعة بديناميكياتوتفاعلات داخلية. نظرا لأن الأعضاء تحاكي عن كثب بنية ووظيفة الأعضاء الفعلية، يمكنها تقديم تمثيل أكثر دقة لبيولوجيا الثدييات مقارنة بزراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية11. بالإضافة إلى ذلك، من الفوائد الرئيسية الميزة الأخلاقية، حيث تقلل العضويات الحاجة إلى نماذج حيوانية، مما يعالج المخاوف المتعلقة بتجارب12،13. علاوة على ذلك، توفر العضوية منصة لفحص الأدوية عالي الإنتاجية، مما يحسن التنبؤ بفعالية الدواء وسميته. ومع ذلك، هناك أيضا عدة تحديات مرتبطة باستخدام العضويات. ورغم أنها أكثر واقعية من الثقافات ثنائية الأبعاد، إلا أنها لا تعكس تماما تعقيد وتفاعلات الأعضاء الكاملة داخل كائنحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة تباين كبير بين الأعضاء العضوية، حتى عند اشتقاقها من نفس نوع الخلايا، مما يؤدي إلى تناقضات في نتائج التجارب15. لذا، فإن زراعة الأعضاء بشكل قوي وقابل للتكرار أمر ضروري ويتطلب مهارات تقنية متقدمة، ومعدات متخصصة، وبروتوكولات مفصلة.

الجهاز العصبي هو شبكة معقدة مسؤولة عن تنسيق الأفعال ومعالجة المعلومات الحسية من خلال إرسال واستقبال الإشارات في جميع أنحاء الجسم، وبالتالي التحكم والتنسيق في جميع الوظائف المطلوبة، بما في ذلك الحركة، والإحساس، والتفكير، والوظائف الذاتية مثل نبض القلب والهضم. السلف للجهاز العصبي المركزي، الذي يتكون من الدماغ والحبل الشوكي، هو الأنبوب العصبي. من الضروري فهم كيفية تشكل وعمل البنى العصبية في تطور الأنابيب العصبية المبكر للحصول على رؤى حول مختلف الاضطرابات العصبية والاضطرابات النمائية. تعد اضطرابات النمو العصبي صعبة في الدراسة داخل الجسم الحي، خاصة عندما تنشأ من أشخاص بسبب مخاوف أخلاقية. لقد عززت الأعضاء العصبية، مثل الأعضاء الدماغية 16,17، بشكل كبير فهم تطور الجهاز العصبي والأمراض من خلال توفير نماذج متعددة الاستخدامات وسهلة الوصول تحاكي أنسجة الدماغ البشري بشكل وثيق. هذه البنى ثلاثية الأبعاد، المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs)، تكرر جوانب مختلفة من تطور الدماغ، بما في ذلك تكوين مناطق دماغية مميزة، وتنوع خلوي، وشبكات عصبية معقدة 16,18,19. من خلال السماح للباحثين بمراقبة مراحل النمو في الوقت الحقيقي ودراسة الآليات التنظيمية الرئيسية، تقدم هذه العضويات رؤى عميقة حول تطور الدماغ الطبيعي. تمكن الأعضاء الدماغية أيضا من نمذجة أمراض النمو العصبي19 والأمراض التنكسيةالعصبية 20، مثل صغر الرأس16، 21، عدوى فيروس زيكا22، اضطرابات طيف التوحد23، وغيرها، موضحة آليات المرض وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة. بالإضافة إلى ذلك، تعد الأعضاء الدماغية منصات قيمة لاختبار وتطوير المخدرات، مما يسهل تقييم فعالية الأدوية وسميتها في بيئة تشبه الدماغ البشري وتسرع من أساليب الطب الشخصي. علاوة على ذلك، توفر بيئة محكمة لدراسة التفاعلات بين الجينات والبيئة، مما يعزز فهم الأمراض المعقدة الناتجة عن تفاعل العوامل الجينية والبيئية. ومع ذلك، نظرا لأن الأعضاء العصبية، مثل عضويات الدماغ، تتكون عادة من تجمعات الخلايا، فإنها غالبا ما تظهر تباينا خلويا كبيرا وتغيرات في نتائج التجارب، مما يؤثر بدوره على قابلية تفسير البيانات المولدة، مما يشكل تحديا كبيرا للباحثين17. لهذا السبب، يعد تحسين البروتوكول ومعايير التحكم الدقيقة في الجودة أمرا بالغ الأهمية لتخفيف البيانات القيمة التي تمثل الحالة الحية بشكل كاف.

أحدث مينهارت وزملاؤه24 تأثيرا حاسما عندما أبلغوا أولا عن بروتوكول عضوي عصبي مستنسخ يحاكي تطور الأنابيب العصبية المبكر، يتكون من خلايا جذعية جنينية واحدة (ESCs) يقلل بشكل كبير من التباين بين الأعضاء العضوية. يتيح هذا الابتكار للباحثين دراسة العمليات والآليات التطورية، بالإضافة إلى الأنماط العصبية، في بيئة دقيقة ومحددة بدقة استثنائية. حتى الآن، طورت العديد من المختبرات عضويات عصبية، معظمها من أصل فأر أو بشر، تحاكي أجزاء مختلفة من الأنبوب العصبي وتطوره، كما هو ملخص في25. ومع ذلك، وبناء على المعلومات المتاحة، فإن البروتوكول الذي وضعه مينهارت وآخرون هو الطريقة الوحيدة التي تتشكل فيها NTOs بشكل موثوق من خلية واحدة، وتنظم ذاتيا، وتتنقل بكفاءة إلى مصائر ظهرية بطنية متبعة نبضة عالمية واحدة من حمض الريتينويك (RA) دون إضافة عوامل بطنية أخرى مثل منشط القنفذ الصوتي (SAG)26، أو استخدام غرف ميكروفلويدية توفر معلومات مكانية بسبب تكوين التدرج. تم تكييف البروتوكول المقدم هنا من Meinhardt وآخرون 24 كما هو موضح في Krammer وآخرين. في هذا البروتوكول، يتم زرع الخلايا العصبية المنفصلة في مصفوفة زراعة الخلايا وتتعرض لظروف تمايز عصبي محددة. خلال يومين، تتوسع هذه الخلايا بشكل استنساخي وتتحول إلى ظهارة، مكونة بنية ثلاثية الأبعاد من الدائرة إلى القطع الناقص مع تجويف واحد وخلايا طبقية ذات قاعدة قمة. في اليوم الثاني، يعزز نبضة الجزيء الإشارة RA التي تطبق على مستوى 18 ساعة على مستوى التمايز العصبي، ويجعل NTOs من منتصف الدماغ إلى مستويات الحبل الشوكي الخلفي/العنقي خلفيا، ويحفز تكوين صفيحة أرضية واحدة وظيفية بحلول اليوم السادس، والتي تشكل NTO من البطن إلى الظهري.

يقدم البروتوكول المحسن عدة مزايا رئيسية. يتيح ذلك الظهارة القوية خلال الأيام الثلاثة الأولى ويولد أسجة كروية صغيرة نسبيا بقطر حوالي 200 ميكرومتر، كل منها يحتوي على لومن واحد. تنشأ العضويات بشكل استنساخي من خلايا منفردة وتحافظ عليها في وسط زراعة خالي من المصل ومعرف كيميائيا. خلال ستة أيام، يتم تحقيق تمايز تدريجي عصبي عن الثقافات متعددة القدرات، مما ينتج عنه عضويات تظهر هوية أمامية في منتصف الدماغ بحلول اليوم السادس وهياكل شبيهة بالدماغ الخلفي أو العنقي بعد نبضة RA العالمية26.

تم تعديل عدة جوانب تختلف عن البروتوكولالأصلي 22,25 لتعزيز قابلية التكرار وسرعة الإنتاج. تشمل هذه الشروط المعدلة في ظروف زراعة ESC، تقليل عدد الخلايا المدخلة، وسط تمايز محسن، وبروتوكول تمايز معدل يستبعد مكملات نوجين خلال الأيام 0-2 (المستخدمة بالفعل في26). علاوة على ذلك، تم تحسين كثافة البذر للاستخدام في صفائح 96 بئرا، مما يسمح بتحليل عالي الإنتاجية. معا، أدت هذه التحسينات إلى زيادة بنسبة 40٪ في كفاءة تكوين وأنماط NTO، من ~40٪ 24 إلى الآن ~80٪ 26 في النسخة المحدثة.

هنا (الشكل 1)، تم تقديم وصف مفصل لبروتوكول محسن يسمح بتوليد قوي وقابل للتكرار من NTO في مصفوفة زراعة الخلايا. يشمل البروتوكول جميع مراحل معالجة NTO، بدءا من البذر الأولي لوحدات ESC لاختبارات التمايز إلى الصيانة والتثبيت والتحليل اللاحق. كما يتضمن إرشادات لمراقبة الجودة من خلال التقييم البصري اليومي لمورفولوجيا NTO، بالإضافة إلى توصيف حرج لهوية العضوية باستخدام صبغة الأجسام المضادة للتحقق من النمط الصحيح والتمايز العصبي. بالإضافة إلى ذلك، تقدم طرق شاملة لاستكشاف المشاكل، مما يسمح بتقييم نقدي في كل خطوة من خطوات البروتوكول، وهو أمر ضروري لضمان قابلية تكرار وموثوقية البروتوكولات التجريبية. تساعد هذه التعليمات التفصيلية في تحديد وحل المشكلات المحتملة، وتقليل الأخطاء، وتحسين النتائج. وهذا أمر بالغ الأهمية للحفاظ على نزاهة التجارب العلمية وتمكين العلماء الآخرين من تكرار العمل بنجاح واستخلاص استنتاجات شاملة من البيانات المولدة، مما يؤدي إلى تقدم المجال.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. (أ) ناقلات ESC التمريرية (انظر الخطوة 1.1). (ب) تحليل مصفوفة زراعة الخلايا وزرع خلايا ESC منفردة للتمايز إلى NTO (انظر الخطوة 1.2). (ج) اقتباس التحليل الروماتويدي وعلاج الروماتويديا (انظر الخطوة 2). (د) إزالة التهاب المفاصل الروماتويدي وروتين استبدال الوسط اليومي (انظر الخطوة 3). تم إنشاء هذه الشخصية باستخدام BioRender.com. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: افحص الخلايا وNTO يوميا لتقييم الجودة قبل أي إجراء إضافي (استبدال الوسط، العلاج، التثبيت، إلخ). يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تتطلب تعرضا مباشرا للخلايا للهواء داخل خزانة أمان حيوي لضمان التعقيم ومنع تلوث الزرعة.

1. صيانة، مرور، وزرع عناصر ESC للفئران من أجل تمييز NTO

  1. العبور
    1. حافظ على أقراص ESC على أطباق زراعة الخلايا أو آبار في طبق مكون من 6 آبار مطلية مسبقا ب 0.15٪ جيلاتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. أدخل ال ESC كل يومين إلى ثلاثة أيام، مع استبدال يومي من اليوم الثاني فصاعدا.
    3. قم بتسخين جميع المواد (المتوسط، PBS، محلول الإنزيم) على الأقل 21 درجة مئوية و37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    4. فحص الخلايا تحت مجهر التباين الطوري (انظر الصور الممثلة، الشكل 2). تأكد من أن المستعمرات لها حجم مناسب وشكل مناسب (الشكل 2A)، مع التأكد أيضا من التصاقها بقاع الطبق.
      ملاحظة: تخلص من الثقافة إذا تم تمييز أكثر من 10٪ من أسماك ESC الفأرية (الشكل 2B)، وحضر ثقافة مذابة حديثا، يجب أن تمر مرتين على الأقل قبل زرع ESCs لاختبار التمايز. يمكن للباحثين ذوي الخبرة الحكم من خلال التقييم البصري (انظر أيضا مولاس وآخرون 28) أو من خلال تلوين الأجسام المضادة للتعبير عن العلامات (مثل OCT4، انظر أيضا Ying وآخرون 29).
    5. افتح غطاء طبق/طبق/الزراعة الصغيرة، وقم بإمالته قليلا واستنشق الوسط بحذر. أبق الخلايا خارج الحاضنة لأقصر وقت ممكن. احتفظ بالخلايا بدون وسط لفترة وجيزة قدر الإمكان لتجنب جفاف الززرعة.
    6. اغسل المستعمرات ب 500 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا (أضف إلى الخلايا في بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار)، ثم استنشق مرة أخرى فورا.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لأن: 1) يجب تجنب انتقال وسط ESC (2iLIF) قبل اختبار التمايز (وإلا سيتعيق تكوين NTO)، 2) يمكن أن توقف FBS أو BSA في وسط الزراعة الانفصال. ينطبق هذا على الخلايا الكيميائية المستزرعة في وسط ESC مختلف، وتحتوي على FBS أو BSA.
    7. أضف 500 ميكرولتر من محلول الإنزيم المسخن مسبقا وانقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة.
    8. حضن الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق باستخدام مؤقت.
    9. بعد فترة الحضانة، أخرج اللوحة وفحص الخلايا تحت مجهر تباين الطور.
      ملاحظة: يجب أن تكون الناقلات الثانوية الخارجية قد انفصلت عن صفيحة الزرعة؛ إذا لم يكن كذلك، اضغط على الطبق/الطبق بقوة ولكن بحذر (الشكل 2C).
    10. أضف 1 مل من وسط N2B27 (الجدول 1) عن طريق صب الماصات مباشرة على الخلايا.
      ملاحظة: عند تحضير الوسط (N2B27)، يحفظ الجلوتامين لمدة أقصاها 5-10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ويفضل أن يكون في درجة حرارة الغرفة. يجب غسل الطبقات الخالية من الطبق، مع ترك مناطق 'فارغة' في طبق الزرعة.
    11. استخدم ماصة P1000 وميل الطبق قليلا حتى يمكن غسل جميع المستعمرات الملتصقة بطبق الزرعة.
    12. لفصل كتل الخلايا، قم بإمالة اللوحة قليلا، وضع رأس الماصة (P1000) في مركز الطبق، اضغط الطرف على قاع الطبق ولكن قليلا بعيدا عن المحور العمودي، وقم بإخراج الخلايا. كرر ذلك من خمس إلى عشر مرات لكسر تجمعات الخلايا.
    13. تحقق من أن الخلايا متفتخة بشكل صحيح إلى خلايا فردية تحت مجهر التباين الطوري (الشكل 2D) وكرر العملية إذا كانت هناك تكتلات.
    14. بعد التفكك الكامل، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي نظيف ومعقم بسعة 15 مل، وغسل البئر الفارغ حيث زرعت الخلايا ب 1 مل من وسط N2B27، ثم انقله إلى نفس أنبوب الطرد المركزي المخروطي مع تعليق الخلية.
    15. قم بتدوير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 453 × g في جهاز الطرد المركزي فوق الفائق.
    16. استنشق السوبرناتانت بحذر.
    17. أعد تعليق الخلايا في كمية مناسبة من وسط N2B27 (مثل 1 مل) وعد الخلايا (انظر الجدول 2 لأرقام الخلايا الموصى بها لاختبار التمايز إلى NTOs).
  2. تمايز الخلايا العصبية إلى عضويات الأنبوب العصبي (NTOs)
    1. مصفوفة التوزيع الخلوي
      1. قم بإذابة زجاجة مصفوفة زراعة الخلايا طوال الليل على الثلج عند 4 درجات مئوية (ليس في درجة حرارة الغرفة ولا بإذابة اليد). لا تترك مصفوفة زراعة الخلايا عند 4 درجات مئوية لفترة أطول من اللازم؛ aliquot وFreeze بأسرع وقت ممكن للحفاظ على وظائفه.
      2. في خزانة السلامة البيولوجية، ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5-2 مل على الثلج لتبريدها مسبقا مع إبقاء زجاجة مصفوفة زراعة الخلايا على الثلج الطازج.
      3. اخلط مصفوفة زراعة الخلايا المذابة بعناية لتجنب تكون الفقاعات، لأن الفقاعات قد تسبب انفصالا عن البئر/الطبق بعد التجليل.
      4. مصفوفة زراعة الخلايا ب Aliquot عند الحجم المطلوب (يوصى ب 0.5-1 مل) وتجمد عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي. تجنب استبدال الطرف بين الأليكوات، لأن رؤوس درجة حرارة الغرفة قد تسبب تصلب مصفوفة زراعة الخلايا داخلها، مما يؤدي إلى فقدان كبير. بدلا من ذلك، قم بتبريد رؤوس الماصة إلى 4 درجات مئوية عن طريق تخزينها في الثلاجة قبل الاستخدام.
    2. زرع خلايا منفردة في مصفوفة زراعة الخلايا
      1. قم بقياس عدد الخلايا المطلوبة (مصفوفة زراعة الخلايا بحجم 100 خلية/ميكرولتر، انظر الجدول 2).
      2. انقل رقم الخلايا المناسب (تعليق الخلية) إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي نظيف بسعة 15 مل واملئه ب 1 مل من N2B27.
      3. قم بتدوير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 453 × جرام في جهاز الطرد المركزي.
      4. استنشق السائل العلوي وضع أنبوب الطرد المركزي المخروطي على الثلج.
      5. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية على الجليد في كمية مناسبة من مصفوفة زراعة الخلايا المذابة والسائلة مع تجنب تكون الفقاعات.
      6. انشر الكمية المناسبة من تعليق خلايا مصفوفة زراعة الخلية، في طبقة رقيقة، على طبق قاع زجاجي أو بلاستيكي يكون مثاليا للتصوير (انظر الجدول 2، الشكل 3A-C)، دون لمس جدران ألواح الحفر المتعددة. بسبب التوتر السطحي العالي، يمكن لقطرة مصفوفة زراعة الخلايا أن تتحرك من مركز البئر إلى الجدران إذا تم لمسها مسبقا، مما يؤدي إلى توزيع غير كاف للخلايا/NTOs.
        ملاحظة: إذا كنت تستخدم صفائح متعددة الآبار: ارسم أولا دائرة لمصفوفة زراعة الخلايا باستخدام رأس ماصة P20 (صفيحة 96 بئر) أو P200 قبل 'ملئها' بتعليق مصفوفة زراعة الخلايا (الشكل 3B).
      7. ضع اللوحة/الطبق متعدد الآبار في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية للسماح لمصفوفة زراعة الخلايا بالتصلب. تقدير دقيقة واحدة لكل مصفوفة زراعة الخلايا لكميات أقل وأقصى 15 دقيقة ل 40 ميكرولتر أو أكثر.
      8. بعد فترة الحضانة، أخرج الطبق وأضف حجما مناسبا من الوسط (انظر الجدول 2). يجب ألا تجف الخلايا التوسعة في مصفوفة زراعة الخلايا أثناء التلقيح لاختبار التمايز إلى NTO أو عند استبدال الوسط. بعد التجلية، يجب تطبيق الوسيط في أسرع وقت ممكن. عادة ما تكتمل عملية التفريغ في دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية لكل مصفوفة زراعة خلايا بمقدار 1 ميكرولتر، وأقصى 15 دقيقة لمصفوفة زراعة الخلايا بسعة 40-100 ميكرولتر عند التوزيع كطبقة رقيقة.
        ملاحظة: لتجنب جفاف ال ESCs في مصفوفة زراعة الخلايا، تعامل مع حد أقصى 8 آبار من صفيحة بسعة 96 بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات أو طبق أو بئر زجاجي بقطر 35 مم من أي لوحة متعددة الآبار أخرى. أبق الخلايا خارج الحاضنة لأقصر وقت ممكن.
      9. تحقق من كثافة البذر وتوزيع الخلايا داخل مصفوفة زراعة الخلايا تحت مجهر تباين الطور (الشكل 3C,D). يوصى بكثافة البذور المثلى (الجدول 2 والشكل 3). ومع ذلك، لبعض التطبيقات، مثل التحليل المبكر، قد يكون من المفيد زيادة كثافة البذر حتى 10 أضعاف.
        ملاحظة: قم بخلط معلق خلايا مصفوفة زراعة الخلايا بعناية عن طريق إعادة تعليقه برأس ماصة P300 أو P1000 قبل الزرع لاختبار التمايز لمواجهة تباين عدد الخلايا بين الآبار/الأطباق. لا ينصح بهذه الخطوة قبل زرع كل بئر للحماية من فقدان مصفوفة زراعة الخلايا، لأنها قد تتصلب وتلتصق بطرف الماصة.

الجدول 1: المكونات المتوسطة (قاعدة N2B27، 2iLIF، N2B27diff). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: معلومات عن عدد الخلايا لكل طبق، كمية مصفوفة زراعة الخلية، حجم الوسط، ووقت التحليق. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

2. علاج التهاب المفاصل الروماتويدي لعضلات النوم العصبية لتعزيز التمايز العصبي وتحفيز التماسك الخلفي والبطني

  1. حمض الريتينويك السريع (RA)
    1. أحضر مسحوق الروماتويين الروماتويدي بالكامل إلى درجة حرارة الغرفة (مخزن عند -20 درجة مئوية).
    2. إعادة تكوين المسحوق بحجم مناسب من DMSO للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ملم متر.
    3. أليكوت 1 ميكرولتر من 100 مللي مولار RA في قارورة واحدة بحجم 1.5 مل من اللولب لكل واحدة.
    4. أضف غاز الأرجون حتى يصبح الأنبوب 'ممتلئا'.
      ملاحظة: بما أن غاز الأرجون أثقل من الأكسجين، فإنه يغوص إلى قاع الأنبوب ليغطي ويحافظ على الحمض النووي الروماتويدي من الهواء. يمكن الشعور بذلك على اليدين عندما يتسرب الأنبوب عندما يكون الأنبوب ممتلئا.
    5. أغلق القارورة بإحكام. التهاب المفاصل الروماتويدي حساس جدا للضوء والهواء.
    6. تخزين الأليكوات في الظلام عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي. بدلا من ذلك، يمكن تخزين الحمض النووي الرويتويد المعاد تشكيله في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل في سائلN2.
      ملاحظة: يمكن تخزين الروماتويديوم المعاد تشكيله ومخففه في الثلاجة عند تغطيته بورق الألمنيوم لمدة لا تتجاوز يومين.
  2. علاج التهاب المفاصل الروماتويدي لمتلازمات النوم الروماتويدي لمدة 18 ساعة (الشكل 4A)
    1. أخرج 1 ميكرولتر من الأليكوت بتركيز 100 ملليمتر من -80 درجة مئوية واحتفظ به في الظلام حتى يذوب عند درجة حرارة الغرفة (مثلا، في راحة اليد أو في رف أنابيب في خزانة أمان حيوي بدون إضاءة مضاءة).
      ملاحظة: إذا تم تخزين أليكوتات RA في سائل N2، افتح غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق فورا لتجنب انفجار الأنبوب، ثم أغلق مرة أخرى وتابع الخطوة 2.2.2.
    2. بعد إذابة الجهاز، أضف 400 ميكرولتر من وسط N2B27diff المسخن مسبقا لتركيز 250 ميكرومولار باستخدام ماصة P1000. اخلط جيدا لتحقيق التجانس.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إعادة تكوين الروماتويديوم وتخفيفه في وسط DMSO نقي بدلا من وسط N2B27diff، رغم أن ذلك يزيد من تركيز DMSO في الزرعة. عند تحضير الوسط (N2B27diff)، يحفظ الجلوتامين لمدة أقصاها 5-10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ويفضل أن يكون في درجة حرارة الغرفة.
    3. أخرج الصحون/الصحون التي تنمو NTO من الحاضنة وضعها في خزانة أمان بيولوجي معقمة.
    4. افحص ال NTO المتزايدة تحت مجهر تباين الطور. تشكل شكل العينات غير القابلة للزراعة (NTOs) أمر بالغ الأهمية في توفير معلومات حول جدوى الزراعة وفعالية التجربة (الشكل 4B-D).
    5. أزل غطاء الطبق/الطبق وميل الطبق قليلا إلى الجانب. استنشق الوسط بحذر، سواء باستخدام ماصة P200 أو شفاط، دون الإخلال بمصفوفة زراعة الخلايا. احتفظ ب NTOs بدون وسط لفترة وجيزة قدر الإمكان لتجنب جفاف الزراعة و/أو خليط زراعة الخلايا.
    6. أضف حجما مناسبا من N2B27diff مع محلول RA بسعة 250 نانومالتر (انظر الجدول 2)، غطه بالغطاء، وانقل NTOs مرة أخرى إلى الحاضنة.
      ملاحظة: أحيانا، خاصة إذا لم يختلط الروماتويديوم بالكامل، يمكن أن تتكون ترسبات يصعب إذابتها في N2B27diff العادي. في هذه الحالة، تخلص من الأليكوت وصنع أليكوات RA جديدة لأن هذه الرواسب تحتوي على تركيز غير معروف وغير متحكم فيه من RA.

3. إزالة الروماتويدات الروماتويدية وروتين استبدال وسط NTOs يوميا

  1. انقل لوحة الزراعة من الحاضنة إلى خزانة السلامة البيولوجية المعقمة.
  2. أزل الغطاء وميل اللوحة قليلا إلى الجانب.
  3. استنشق N2B27diff المحتوي على حمض الروماتويوم بعناية، إما باستخدام ماصة P200 أو شفاط، دون لمس مصفوفة زراعة الخلية.
  4. أضف PBS المسخن مسبقا (استخدم حجما كافيا لتغطية قطرة مصفوفة زراعة الخلايا أو كما هو مذكور في الجدول 2)، ثم قم بإمالة اللوحة مرة أخرى وأزلها بعناية لغسل بقايا الروماتويد.
  5. أضف حجما مناسبا من N2B27diff (كما هو مذكور في الجدول 2)، عن طريق توصيل الوسط على طول جدار البئر/الطبق لتجنب إتلاف قطرة مصفوفة زراعة الخلية.
  6. استبدل الوسيط يوميا باتباع الخطوات 3.1-3.3، ثم أضف N2B27diff الطازج المسخن مسبقا بلطف عن طريق وضع الوسط على جدار البئر/الطبق قبل إعادة NTO إلى الحاضنة. الرش المباشر والقوي أو إضافة وسط بارد/PBS على قطرة مصفوفة زراعة الخلايا يمكن أن يسبب كسرها وانفصالها عن الطبق/الطبق.
    ملاحظة: عند تعديل المسارات باستخدام جزيئات صغيرة أو بروتينات مؤتلفة، من المهم استبدال الوسط يوميا. إذا كان من المقرر استخدام الأدوية لأكثر من يوم واحد، يجب تحضير الحلول الدوائية حديثا يوميا أو على الأقل كل يومين لضمان استقرار البروتين/الدواء واستمرار وجود التركيزات الصحيحة.

4. تثبيت ال NTO

ملاحظة: ال NTO ثابتة كما وصفها كرامر وآخرون. اعتمادا على الجسم المضاد الذي سيتم استخدامه لاحقا، قد يكون من الضروري استخدام PFA من مصادر مختلفة (من المتجر، من المتجر الداخلي، إلخ).

  1. إذابة PFA عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  2. ارفع PFA إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. إذا استخدمت تركيزا أعلى من PFA، قم بتخفيف PFA إلى 4٪ في وسط N2B27diff أو PBS في غطاء كيميائي.
  4. أخرج NTO من الحاضنة وانقلها إلى غطاء كيميائي.
  5. افتح الغطاء وأضف 4٪ من PFA بنسبة 1:1 مباشرة إلى NTOs لتحقيق تركيز نهائي 2٪ (مثلا، 100 ميكرولتر من 4٪ PFA مضاف إلى 100 ميكرولتر N2B27diff في صفيحة 96 بئرا).
  6. أعد الغطاء واحتضن NTO لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اضبط مؤقتا، لأن التثبيت الأطول قد يؤثر على أداء بعض علاجات الأجسام المضادة.
    ملاحظة: PFA سام ولا يجب استنشاقه. اعمل بحذر وحذر تحت غطاء المواد الكيميائية. بعض الأجسام المضادة تتطلب استخدام PFA محدد أو وقت تثبيت أقصر/محسن.
  7. بعد 30 دقيقة، أزل الغطاء وميل اللوحة قليلا إلى الجانب، ثم اتبع الخطوات 3.3-3.4.
  8. أضف PBS المسخن مسبقا بعناية (استخدم حجما كافيا لتغطية قطرة مصفوفة زراعة الخلايا أو كما هو مذكور في الجدول 2)، وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة 3 مرات لإزالة كل ما تبقى من PFA.
  9. بعد الغسل النهائي، أضف كمية مناسبة من PBS (انظر الجدول 2)، وأغلق اللوح باستخدام بارافيلم، واحتفظ بالحرارة 4 °م حتى الاستخدام مرة أخرى.

5. صبغة الأجسام المضادة لجرعات NTO

  1. صبغة الأجسام المضادة أداة قيمة في تقييم الهوية الصحيحة لمضادات الأجسام وكذلك نجاح الاختبار/التجربة. يمكن إجراء تلوين الأجسام المضادة كما هو موضح في مينهارت وآخرون 24 وكرامر وآخرون 26.
    ملاحظة: إذا بدت NTO غير مثالية (الشكل 4E-G) أو لم تظهر تعبيرا صحيحا للعلامة المكانية والزمانية (من الشكل 5 إلى الشكل 7)، يرجى التخلص من المادة لأنها لا تستوفي معايير الجودة.
  2. حافظ على محلول البلوك/النفاذية (1x PBS مع 1٪ BSA و0.5٪ Triton-X) عند 4 درجات مئوية وتكيف مع درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. لإعادة التكوين والتحليل ثلاثي الأبعاد كامل، حافظ على الأجسام المضادة (الأولى والثانية من الثانية) عند 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن ليلة واحدة، ويفضل أن تكون 2-3 ليال، لضمان اختراق جيد للأجسام المضادة.
    ملاحظة: قد يعطي الجسم المضاد أليكسا فلور مضاد 5612nd إشارة خلفية أقوى في مصفوفة زراعة الخلايا خلال الأيام الثلاثة الأولى من اختبار التمايز.

6. تصفية المنظمات غير المكتبية

  1. استعد لتنظيف26
    1. أكمل عملية صبغ الأجسام المضادة قبل بدء عملية التنظيف (تأكد من حضانة الأجسامالمضادة الأولى والثانية وغسلها تماما).
    2. أضف بروبيلغالات إلى محلول التنظيف (2 ملغ بروبيلغالات لكل مل محلول تنظيف) لتقليل التبييض الضوئي لمواد NTO.
      ملاحظة: قم بعملية التنظيف قبل التصوير بساعة إلى ساعتين لمنع الأكسدة (السائل يتحول من الأصفر الفاتح/الكريمي إلى الأصفر الداكن الساطع أو حتى البني) أو تبلور محلول التطهير. إذا حدث التبلور، قم بإذابة الألياف الزائدة إلى البئر.
  2. الرقم الهيدروجيني للمحلول واحتياطات الخلط
    1. حافظ على الرقم الهيدروجيني الصحيح لمحلول التنظيف لتجنب الأكسدة السريعة أو إذابة مصفوفة زراعة الخلايا.
    2. تجنب الهز القوي أو الخلط القوي للمحلول لمنع تكون فقاعات الهواء.

7. تحليل الوحدات غير المكتبية

  1. تحضير المجهر
    1. بعد الانتهاء من صبغ الأجسام المضادة وتنظيف الأنسجة بالكامل، استخدم مجهر كونفوكال بأهداف 10-40x للتصوير.
  2. التقييم البصري
    1. استخدم التقييم البصري والقياس اليدوي لتحديد ما إذا كانت NTOs تظهر تعبيرا مناسبا من العلامات العصبية وتنظيما ظهريا بطنيا.
  3. برامج التحليل ثلاثي الأبعاد
    1. للتحليل ثلاثي الأبعاد، استخدم برامج مثل CellProfiler28، 29، Imaris (محول وعارض الملفات) أو أداة مشابهة لتقييم العلامات المكانية والتفاصيل الهيكلية.
  4. التحقق من هوية NTO
    1. تأكيد الهوية الصحيحة لمؤشرات NTO من خلال تقييم التعبير الزمني للعلامات العصبية والتعبير الزماني المكاني لعلامات النمط الظهري البطني المحددة. هذه الخطوة ضرورية لضمان نجاح اختبار التمايز قبل المزيد من البحث.
  5. جوانب التوصيف: يرجى الرجوع إلى الشكل 4، وكذلك الشكل 6 والشكل 7 للتحقق من الجوانب الحاسمة التالية لنجاح الثقافة:
    1. راجع الشكل 4 وصبغة ZO-1 المعروضة في Meinhardt وآخرون 24 للتحقق من نجاح الظهارة وتكوين التلوين.
    2. يتميز التمايز العصبي الناجح بانخفاض OCT4 وزيادة SOX1، يليه تعبير β3TUBULIN (مفصلة في24). راجع الشكل 6 والشكل 7 للتحقق من نجاح التمايز العصبي.
    3. يتم تأكيد النمط الظهري البطني بوجود صفيحة أرضية بطنية FOXA2+/SHH+ وتعبير PAX3+ عند القطب الظهري المقابل (النمط البطني المفصل في26). راجع الشكل 6 والشكل 7 للتحقق من نجاح النمط الظهري البطني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام مكاتب ESC لفأر R1 لجميع الأمثلة الممثلة في الأشكال المعروضة في هذه المخطوطة. يمكن أن تظهر الفروقات الدماغية المبكرة الأخرى للفئران المذكورة اختلافات طفيفة في توقيت الظهارة، أو التمايز العصبي، أو كفاءة النمط عند الزرع لبذبات NTO، ومع ذلك، لا ينبغي أن تختلف النتائج بشكل ملحوظ عن البيانات المعروضة هنا.

فقط الخلايا الجيدة (الشكل 2A) التي تم زرعها بكثافة خلاية مناسبة (الشكل 3) تشكل NTOs ذات جودة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، تعرض عدة تعديلات وتحسينات لتحسين البروتوكول الأصلي لتوليد NTO عالية الجودة لتسهيل التوحيد القياسي عبر المختبرات. تشمل التعديلات الرئيسية ظروف زراعة ESC المختلفة، تقليل أعداد خلايا المدخلات، تحسين وسط التمايز، بروتوكول تمايز معدل، وتعديلات كثافة البذور لتحليل عالي الإنتاجية باستخدام صفائح متعددة الآبار. تعد عدة جوانب من البروتوكول حاسمة بشكل خاص لتحقيق نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. أولا، يجب استخدام مصفوفة زراعة الخلايا الصحيحة بتركيز بروتين مناسب، لأن التركيزات غير المناسبة قد تؤثر س...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تاناكا على دعمهم ومناقشاتهم في تطوير هذا البروتوكول. نشكر بشكل خاص أ. بيلزل على قراءته النقدية للمخططة، وتقديم المدخلات، والمساعدة في المخططات، ولإي. تشاتزيداكي على قراءته النقدية للمخطوطة، وتحريره، ودعمه للمخططات، بالإضافة إلى حصوله على تمويل PUD 25 بالتعاون مع يورغن أ. كنوبليش. تم تمويل هذا المنشور من قبل صندوق العلوم النمساوي (FWF): "مشروع نشر مستقل رقم PUD 25". بالإضافة إلى ذلك، حصل هذا المشروع على تمويل من المجلس الأوروبي للأبحاث (ERC) ضمن برنامج الاتحاد الأوروبي Horizon 2020 للبحث والابتكار (اتفاقية منحة ERC AdG 742046)، ومن صندوق العلوم النمساوي (FWF) [10.55776/ F7803-B] (تعديل الخلايا الجذعية). لغرض الوصول المفتوح، قام المؤلفون بتطبيق ترخيص حقوق نشر عام CC BY على أي نسخة من المخطوطة المقبولة من قبل المؤلف (AAM) تنشأ من هذا التقديم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق 35 مم | رقم 1.5 كوفر سليب | قطر زجاج 14 مم | غير مطليةشركة ماتيكCat# P35G-1.5-14-C
أكوتازإنفيتروجينالقط# 00-4555-56
ألبومين (BSA) فركشن V (pH 7.0)بانريك تطبيقيCat# A1391
حمض الريتينويك العابر بالكاملميركCat# R2625
مكمل B-27 (50X)، خالي من المصلجيبكوكات# 17504044
مصفوفة الغشاء القاعدي (ماتريجيل)كورنينغكات# BDL354234تركيز البروتين 10 ملغ/ملم 
ألواح CellCarrier-96 ألترا ميكروبليتبيركينإلمركات# 6055302
CellProfiler 4ستيرلينغ وآخرون 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021توكريسCat# 4423
CUBIC-R+(N)ماتسوموتو وآخرون، 2019لا يوجد
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيغما ألدريتشCat# D2650
DMEM/F-12، بدون جلوتامينجيبكوكات# 21331020
دولبيكو' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS، 1X)جيبكوكات# 14190144
جهاز الطرد المركزي إبندورف 5810 Rإبندورفكات# 5811000015
إيبندورف مايكروتيوب 3810Xميرككات# EP0030125150
أنابيب الطرد المركزي المخروطية الصقريةكورنينغكات# 352095
الجيلاتينميركCat# G2500
إل-جلوتامين (200 ملليمتر)جيبكوكات# A2916801
حاضنة هيراسيل فيوس 160i ثاني أكسيد الكربون، 165 لترثيرموفيشر ساينتيفيككات# 51033557
إيماريسأوكسفورد إنسترومنتسhttps://imaris.oxinst.com
مجهر التباين الطور المقلوب LED (CKX53)أوليمبوس
2-ميركابتوإيثانول (50 ملم تر)جيبكوكات# 31350010
فأر أحادي النسيلة مضاد OCT-3/4سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةCat# sc-5279; RRID:AB_628051استخدم 1:200
فأر أحادي النسيلة مضاد PAX3DSHBالقط# PAX3-C; RRID:AB_528426استخدم 1:100
الأرنب أحادي النسيلة المضاد ل SHHتقنيات الإشارة الخلويةCat# 2207; RRID:AB_2188191استخدم 1:300
الأرنب أحادي النسيلة مضاد وبيتا؛ 3-توبولينتقنيات الإشارة الخلويةCat#5568; RRID:AB_10694505استخدم 1:500
فأر أحادي النسيلة مضاد ZO-1إنفيتروجينالقط# 33-9100; RRID:AB_2533147استخدم 1:200
ماوس لايفQkineكات# Qk018-1000
مكمل N-2 (100X)جيبكوكات# 17502048
الوسط العصبي القاعديجيبكوكات# 21103049
بارافورمالدهيد، درجة كاشف، بلوريميركCat# P6148
0325901 المرضتوكريسكات# 4192
محلول البنسلين-ستريبتوميسينجيبكوكات# 15140130
مجهر التباين الطور
الماعز متعدد النسيلات مضاد لFOXA2R& DCat# AF2400; RRID:AB_2294104استخدم 1:400
الماعز متعدد النسيالات مضاد SOX1R& دي سيستمزCat# AF3369; RRID:AB_2239879استخدم 1:200
بيانات RNA-Seq المتعلقة بالشكل 6إيشيهارا وآخرون، 2022جيو: GSE214368
خزانة السلامة الميكروبيولوجية المميزة SafeFASTمجموعة داسيت أسرعكات# F00025200000
بيروفيات الصوديوم (100 ملم متر)جيبكوكات# 11360070
المجهر المقلوب الكونفوكلي المقلوب للقرص الدوار (IX3)أوليمبوس
ترايتون X-100سيغما ألدريتشCat# 9036-19-5

المراجع

  1. Hiiragi, T., Solter, D. First cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but defined by the topology of the two apposing pronuclei. Nature. 430 (6997), 360-364 (2004).
  2. Louvet-Vallée, S., Vinot, S., Maro, B. Mitotic spindles and cleavage planes are oriented randomly in the two-cell mouse embryo. Curr Biol. 15 (5), 464-469 (2005).
  3. Sagner, A., Briscoe, J. Morphogen interpretation: concentration, time, competence, and signaling dynamics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 6 (4), e271(2017).
  4. Anlaş, A. A., Nelson, C. M. Tissue mechanics regulates form, function, and dysfunction. Curr Opin Cell Biol. 54, 98-105 (2018).
  5. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape: mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. J Cell Sci. 131 (6), jcs214015(2018).
  6. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation. 14 (1-3), 23-33 (1979).
  7. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  8. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  9. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: modeling development and the stem cell niche in a dish. Dev Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  10. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  11. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Park, G., Rim, Y. A., Sohn, Y., Nam, Y., Ju, J. H. Replacing animal testing with stem cell-organoids: advantages and limitations. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1375-1386 (2024).
  14. Xu, Z., et al. Merits and challenges of iPSC-derived organoids for clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1188905(2023).
  15. Phipson, B., et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 16 (1), 79-87 (2019).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  18. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  19. Eichmüller, O. L., et al. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science. 375 (6579), eabf5546(2022).
  20. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  21. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  22. Krenn, V., et al. Organoid modeling of Zika and herpes simplex virus 1 infections reveals virus-specific responses leading to microcephaly. Cell Stem Cell. 28 (8), 1362-1379.e7 (2021).
  23. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  24. Meinhardt, A., et al. 3D reconstitution of the patterned neural tube from embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 987-999 (2014).
  25. Wu, Y., Peng, S., Finnell, R. H., Zheng, Y. Organoids as a new model system to study neural tube defects. FASEB J. 35 (4), e21545(2021).
  26. Krammer, T., et al. Mouse neural tube organoids self-organize floorplate through BMP-mediated cluster competition. Dev Cell. 59 (15), 1940-1953.e10 (2024).
  27. Ishihara, K., Ranga, A., Lutolf, M. P., Tanaka, E. M., Meinhardt, A. Reconstitution of a patterned neural tube from single mouse embryonic stem cells. Organ Regen. 1597, 43-55 (2017).
  28. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), dev173146(2019).
  29. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  30. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  31. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  32. Ishihara, K., et al. Topological morphogenesis of neuroepithelial organoids. Nat Phys. 19, 177-183 (2023).
  33. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  34. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  35. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  36. Robanus-Maandag, E., et al. p107 is a suppressor of retinoblastoma development in pRb-deficient mice. Genes Dev. 12 (11), 1599-1609 (1998).
  37. Smith, A. G., Hooper, M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121 (1), 1-9 (1987).
  38. Kuehn, M. R., Bradley, A., Robertson, E. J., Evans, M. J. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 326 (6110), 295-298 (1987).
  39. Doetschman, T., et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature. 330 (6148), 576-578 (1987).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Ranga, A., et al. Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.