يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الطريقة التحليلية MEDUSA لتحديد التأثير التنظيمي للوفاة لكل ضربة قاضية جينية. يتضمن إرشادات حول تحديد الظروف التجريبية التي تعمل على تحسين الحساسية وبرنامج تعليمي خطوة بخطوة حول إجراء التحليل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
MEDUSA لتحديد الجينات التنظيمية للوفاة في بيانات التنميط الكيميائي الجيني
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن استخدام الفحص المنهجي للاضطرابات الجينية في اكتساب أو فقدان الوظيفة لتوصيف التبعيات الجينية وآليات التنظيم لأي عملية خلوية ذات أهمية. تتضمن هذه التجارب عادة التنميط من مجموعة من الاضطرابات الجينية المفردة وكيف يؤثر كل اضطراب جيني على لياقة الخلية النسبية. عند تطبيقها في سياق دراسات فعالية الأدوية ، والتي غالبا ما تسمى التنميط الكيميائي الجيني ، يجب أن تكون هذه الأساليب فعالة في تحديد آليات عمل الدواء. لسوء الحظ ، فإن دراسات التنميط الكيميائي الجيني القائمة على اللياقة البدنية غير فعالة في تحديد جميع مكونات الاستجابة للأدوية. على سبيل المثال ، تفشل هذه الدراسات عموما في تحديد الجينات التي تنظم موت الخلايا الناجم عن الأدوية. تساهم العديد من القضايا في حجب تنظيم الوفاة في الشاشات القائمة على اللياقة البدنية ، بما في ذلك الآثار المربكة لتباين معدل الانتشار ، والتباين في التنسيق الناجم عن الأدوية بين النمو والموت ، وفي بعض الحالات ، عدم القدرة على فصل الحمض النووي عن الخلايا الحية والميتة. MEDUSA هي طريقة تحليلية لتحديد الجينات المنظمة للموت في بيانات التنميط الكيميائي الجيني التقليدية. إنه يعمل باستخدام المحاكاة الحسابية لتقدير معدلات النمو والوفيات التي أنشأت ملف تعريف لياقة ملحوظة بدلا من تسجيل اللياقة البدنية نفسها. يعتمد الاستخدام الفعال للطريقة على التحليل الأمثل للظروف التجريبية ، بما في ذلك جرعة الدواء ، وحجم السكان المبتدئين ، وطول الفحص. ستصف هذه المخطوطة كيفية إعداد دراسة التنميط الكيميائي الجيني للتحليل المستند إلى MEDUSA ، وسنوضح كيفية استخدام الطريقة لتحديد معدلات الوفيات في بيانات التنميط الكيميائي والجيني.
المقدمة
في التنميط الكيميائي الجيني ، يتم استخدام الاضطرابات الجينية المنهجية لفهم مساهمة كل جين في استجابة دواء معينة1،2،3. هذه التجارب ذات قيمة ويمكن أن تكشف عن رؤى مهمة حول استجابات الأدوية ، بما في ذلك الهدف الملزم للدواء وآليات تدفق / تدفق الأدوية. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه التجارب يتم إجراؤها عادة بطريقة مجمعة تقيم جميع الجينات في وقت واحد ، فإن توليد رؤى ميكانيكية من بيانات التنميط الكيميائي الجيني قد يكون أمرا صعبا.
تميل آليات التحكم والتبعيات الجينية لموت الخلايا الناجم عن الأدوية إلى أن تكون صعبة في حل بيانات التنمي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحسين جرعة الدواء للحث على موت الخلايا
ملاحظة: البروتوكول أدناه مخصص لتحسين مجموعة واحدة من خط الخلايا والدواء والجرعة باستخدام اختبار FLICK 7,8. تصف بيانات المثال لهذا البروتوكول تحسين وفحص 5 ميكرومولار إيتوبوسيد في خلايا U2OS ، ولكن يمكن تطبيق نفس خطوات التحسين على أي مجموعة أخرى مرغوبة من خط الخلية والمخدرات / الجرعة. لا يتطلب هذا البروتوكول جمع الخلايا الميتة أو تحليلها. يمكن استخدام هذا البروتوكول لثقافات التعليق ، بشرط إزالة الخلايا الميتة. بالنسبة لثقافات التعليق ، يمكن فرز / فصل الخلايا الميتة باستخدام علامة البقاء أو علامة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا البروتوكول ، استكشفنا التبعيات الجينية للموت الناجم عن الإيتوبوسيد في خلايا U2OS. إيتوبوسيد هو علاج كيميائي شائع الاستخدام لإتلاف الحمض النووي15. تم إجراء تجربة التنميط الكيميائي الجيني هذه باستخدام مكتبة GeCKOv216 في Cas9 التي تعبر عن خلايا U2OS5. في هذه الأنواع من التجارب ، عادة ما يتم استنتاج وظيفة الجينات من الوفرة النسبية لاستنساخ بالضربة القاضية عند مقارنة المجموعات المعالجة بالأدوية مقابل المجموعات السكانية غير المعالجة (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول ، نصف استخدام طريقة MEDUSA التحليلية لقياس بيانات التنميط الكيميائي الجيني لتسجيل كيفية تغيير الاضطرابات الجينية لمعدلات النمو والوفيات الناجمة عن الأدوية. نظرا لأن الناتج الأساسي لتجربة التنميط الكيميائي الجيني مرتبط بحجم السكان ، وليس المعدلات ، يتم استنتاج المعدلات الأساسية باستخدام عمليات المحاكاة. وبالتالي ، فإن الخطوات الحاسمة في الطريقة هي المعلمة التجريبية الدقيقة لحركية الاستجابة للأدوية ، والتي تشمل معدل تكاثر الخلايا غير المعالجة ، ووقت ظهور الوفاة الناجم عن .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
نشكر جميع أعضاء مختبر لي ، في الماضي والحاضر ، على مساهماتهم في وجهة نظر مختبرنا حول تقييم استجابات الأدوية. تم دعم هذا العمل من خلال تمويل MJL و MEH من المعاهد الوطنية للصحة (U01CA265709 و R21CA294000 و R35GM152194 إلى MJL ، و F31CA268847 إلى MEH) ، تمويل MJL من مؤسسة Jayne Koskinas Ted Giovanis.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق Fisherbrand TC 100 مم | Fisher Scientific | FB012924 | لزراعة الخلايا وتحسين حجم السكان |
| 150 مم أطباق Fisherbrand TC | Fisher Scientific | FB012925 | لزراعة الخلايا وتحسين حجم السكان |
| حزمة DESeq2 | R | v1.44.0 | لحساب تغيير الطية |
| DMEM | Corning | 10017CV | للبذر والمخدرات الخلايا |
| DMSO | Fisher Scientific | MT-25950CQC | للبذر وتخدير الخلايا |
| Fisherbrand 96-Well ، معالجة بزراعة الخلايا ، على شكل حرف U ، صفيحة | فيشر العلمية | FB012932 | للبذر وتخدير الخلايا (لوحة الدبوس) |
| Greiner Bio-One & nbsp ؛ سيلستار & Clear 96-well ، معالجة بزراعة الخلايا ، مسطحة | Microplate Greiner | 655090 | لخلايا البذر والمخدرات |
| MATLAB | Mathworks ؛ | R2024a | FLICK و GRADE و MEDUSA |
| Tecan | Spark | لقياسات الخلايا الميتة | |
| Sytox Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | لقياسات الخلايا الميتة مكتبة |
| TKOV3 CRISPR | Addgene | 125517 | لأداء شاشة CRISPR |
| Triton-X 100 | Thermo Fisher Scientific | J66624-AP | لاختراق الخلايا |
| تريبان أزرق | كورنينج | لقياس الخلايا الحية / الميتة |
المراجع
- Przybyla, L., Gilbert, L. A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).
- Colic, M., Hart, T. Chemogenetic interactions in human cancer cells. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).
- Colic, M., Hart, T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
