يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص الأغشية الحيوية للمطثية العسيرة مع تطبيقات اكتشاف الأدوية

981 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

يوليو 8, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الأغشية الحيوية لمسببات الأمراض البكتيرية Clostridioides difficile وأهميتها في المرض ليست مفهومة جيدا. وتشير النتائج الحديثة إلى دور في تكرار المرض مما يؤكد أهميتها. هنا ، نصف تكييف مقايسة الأغشية الحيوية إلى جانب قراءة التمثيل الغذائي مع تطبيقات اكتشاف الأدوية ضد الأغشية الحيوية.

الملخص

المطثية العسيرة هي مسببات الأمراض البكتيرية المعدية المعوية قادرة على الاستفادة من بيئة الجراثيم المخللة للتكاثر وإفراز السموم وإتلاف ظهارة الأمعاء. ستعاني مجموعة فرعية من مرضى عدوى المطثية العسيرة (CDI) من فشل العلاج بالمضادات الحيوية (15٪ -30٪) أو زرع الجراثيم البرازية (FMT) (<10٪). لذلك ، فإن تطوير تدخلات علاجية إضافية له أهمية حاسمة. دور المطثية العسيرة الأغشية الحيوية في التكرار غير واضح. ومع ذلك ، فإن الأغشية الحيوية في الكائنات الحية الأخرى مسؤولة عن الأمراض المزمنة والانتكاسية ، مما يشير إلى أن هذا قد يكون هو الحال أيضا في CDI المتكرر. نفترض أن الأغشية الحيوية ل C. difficile تمثل هدفا علاجيا قيما. الهدف من البروتوكول المقدم هنا هو تكييف مقايسة تكوين الأغشية الحيوية لتحديد المركبات القابلة لإعادة الوضع ذات النشاط ضد الأغشية الحيوية المطثية العسيرة . يعمل البروتوكول على تحسين اختبار قوي وقابل للتكرار لتشكيل الأغشية الحيوية ، ويقترن به باختبار التمثيل الغذائي ، ويطبقه على اكتشاف الأدوية. يحدد هذا البروتوكول مقايسة تكوين الأغشية الحيوية ، وقراءات الكتلة الحيوية ونشاط التمثيل الغذائي ، واختبار الحساسية للأدوية ، وفحص الأدوية لمكتبة إعادة التموضع ، والنتائج التمثيلية.

المقدمة

المطثية العسيرة هي مسببات الأمراض البكتيرية اللاهوائية المكونة للأبواغ وقادرة على إلحاق أضرار جسيمة بالجهاز الهضمي البشري (GI) عن طريق إنتاج السموم. المطثية العسيرة مسؤولة عن ما يقرب من نصف مليون حالة سنويا ، مع ~ 30,000 حالة وفاة (CDC ، 2015). يضيف علاج عدوى المطثية العسيرة (CDI) تكلفة كبيرة لنظام الرعاية الصحية المتوتر بالفعل (~ 4.8 مليار دولار) 1،2،3. الأفراد الأكثر عرضة للخطر هم أولئك الذين يعانون من تثبيط المناعة ، والتعرض للمضادات الحيوية ، و / أو كبار السن ، وجميع السكان الذين يستمرون في التوسع بشكل كبير في كل من الولايات المتحدة وحول العالم 4،5،6،7.

تعتمد المطثية العسيرة اعتمادا كبيرا على حالة الجراثيم الدهشية المضيفة ، وعلى هذا النحو ، فإن العلاج بالمضادات الحيوية هو عامل رئيسي مؤهب ل CDI. يؤدي تحديد العزلات السريرية المقاومة للمضادات الحيوية للمطثية العسيرة إلى تعقيد العلاج8،9،10. علاوة على ذلك ، فإن ما بين 15٪ و 30٪ من المرضى الذين عولجوا بالمضادات الحيوية ل CDI سيفشلون في العلاج الأولي5،11،12،13،14،15،16. بمجرد أن يعاني المريض من نوبة تكرار ، تزداد احتمالية نوبات التكرار إلى 45٪ -64٪ (سلم متحرك متكرر) ويصاحبها خطر متزايد لمزيد من فشل العلاج16،17. الأهم من ذلك ، أن معظم حالات الانتكاس من CDI ناتجة عن السلالة الأصلية التي أنشأت الحلقة الأولى من العدوى في المضيف18،19 ، مما يشير إلى استمرار الاستعمار بواسطة المطثية العسيرة حتى بعد العلاج الناجح. بينما ثبت أن الجراثيم تستمر في الجهاز الهضمي وتؤدي إلى الانتكاس في نماذج خارج الجسم الحي والفئران20 ، فإن المطثية العسيرة الأغشية الحيوية ودورها في المرض والانتكاس لم يتم استكشافها بشكل كاف. الأغشية الحيوية هي مجتمعات ميكروبية محمية بواسطة مصفوفة خارج الخلية منتجة ذاتيا ، وهي خاصية تجعلها شديدة العنيدة للإهانات البيئية مثل العلاج بالمضادات الحيوية والاستجابات المناعية21. علاوة على ذلك ، يعد تكوين الأغشية الحيوية عاملا مهما فيالفوعة 22،23،24،25 وفي الالتهابات البكتيرية ، مثل تلك التي تسببها المكورات العنقودية الذهبية والزائفة الزنجارية ، تعتبر الأغشية الحيوية أساسية في التكرار والمظاهر المزمنة26،27. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح الأغشية الحيوية المطثية العسيرة كخزان للعدوى المتكررة28،29،30 وبالتالي تمثل هدفا عالي القيمة لعلاج و / أو الوقاية من تكرار CDI.

تشمل النماذج الحالية لدراسة المطثية العسيرة نماذج الأغشية الحيوية للمستعمرة31،32 ، ونماذج microfermentors33 ، ونماذج الأمعاء الكيميائية34،35 ، وأنظمة الاستزراع السائل باستخدام قوارير أو ألواح الآبار36،37. أسفرت كل هذه النماذج عن معلومات أساسية عن الأغشية الحيوية المطثية العسيرة في مراحل مختلفة من التطور وفي بيئات متميزة. ومع ذلك ، فإن بعض هذه النماذج (مثل microfermentors ، ونماذج الأمعاء الكيميائية ، والأغشية الحيوية للمستعمرة) ليست مناسبة لجهود اكتشاف الأدوية. حتى الآن ، ركزت معظم الدراسات التي تنطوي على جهود اكتشاف الأدوية على نمط حياة العوالق ل C. difficile38،39،40،41. لذلك ، يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى تكييف وتوحيد والتحقق من صحة نموذج الأغشية الحيوية الحالي المكون من 96 بئرا بهدف تطوير منصة لمكتبات الفحص لتحديد الجزيئات القابلة لإعادة الموضع مع القدرة على قتل الأغشية الحيوية المطثية العسيرة الراسخة (24 ساعة). تم إجراء التحقق من صحة البروتوكول من خلال مقارنة قدرات تكوين الأغشية الحيوية بين سلالة متكيفة مختبريا (630 ميكرومترم) وعزل سريري وبائي (سلالة UK1 معزولة خلال تفشي عام 2006 في مستشفى ستوك ماندفيل في المملكة المتحدة42). تم قياس تكوين الأغشية الحيوية باستخدام مقايسة البنفسج الكريستالي الكلاسيكي لقياس الكتلة الحيوية ومقايسة التمثيل الغذائي لقياس جدوى الأغشية الحيوية. تم تحديد اختلافات كبيرة في قدرات تكوين الأغشية الحيوية بين السلالات ، مما يشير إلى الآثار السريرية المحتملة. علاوة على ذلك ، تم استخدام الفحص لتحديد ملامح الحساسية للمضادات الحيوية للأغشية الحيوية القائمة. وأخيرا، وكدليل على المفهوم، تم فحص مربع أولويات الصحة العالمية من مشروع الأدوية من أجل الملاريا، وهي منظمة غير ربحية تركز على اكتشاف علاجات جديدة ضد الأمراض المهملة مثل الملاريا، لتحديد المركبات التي لها نشاط ضد الأغشية الحيوية الراسخة للمطثية العسيرة. يتكيف البروتوكول الموصوف هنا ويتحقق من صحة مقايسة الأغشية الحيوية الكلاسيكية لاستخدامها كمنصة لفحص الأدوية تستهدف الأغشية الحيوية الناضجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير الخلايا لمقايسة الأغشية الحيوية

تنبيه: المطثية العسيرة هي مسببات الأمراض البشرية وتتطلب احتواء BSL-2.

ملاحظة: تم الحصول على الجراثيم المستخدمة في هذه الدراسة من الدكتورة كارول كوماموتو في كلية الطب بجامعة تافتس. وأعدت مخزونات الأبواغ المطثية العسيرة على النحو الموصوفسابقا 45 43 و44 و45. ثم يتم تقسيم الجراثيم على شكل أحجام 10 ميكرولتر في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل لخطوط الألواح. يجب تقليل جميع الوسائط ومحلول ملحي عازل الفوسفات (PBS) المطلوب للتجربة مسبقا في الغرفة اللاهوائية قبل 24 ساعة من الاستخدام. يتم تحقيق ذلك عن طريق فك غطاء الزجاجة التي تحتوي على الوسائط أو PBS داخل الغرفة.

  1. قبل تقليل لوحة أجار تسريب القلب في الدماغ مع 0.1٪ (وزن / حجم) taurocholate و 0.1٪ (وزن / حجم) L-cysteine (BHIS) في الغرفة اللاهوائية ، ويفضل بين عشية وضحاها أو لمدة 3 ساعات على الأقل للسماح بالتخفيض الكامل. اضبط درجة حرارة الغرفة اللاهوائية على 37 درجة مئوية.
  2. قم بتسخين أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من الجراثيم لمدة 20 دقيقة عند 70 درجة مئوية. يمكن القيام بذلك في حمام مائي أو دراجة حرارية.
  3. أحضر الجراثيم إلى الغرفة اللاهوائية، واخلطها عن طريق سحب 5x-6x برفق، وقم بسحب 10 ميكرولتر على لوحة BHIS المخفضة مسبقا. قم بإجراء خط من أربعة أرباع كما هو موضح سابقا46 ، واحتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة اللاهوائية).
  4. بعد 24 ساعة من النمو ، يجب أن تكون المستعمرات المعزولة مرئية. حدد مستعمرة واحدة ، وباستخدام حلقة يمكن التخلص منها ، انقلها إلى أنبوب يحتوي على 10 مل من سائل BHIS. احتضان بين عشية وضحاها (14-18 ساعة).
  5. حدد كثافة الخلايا عن طريق تخفيف الثقافة الليلية في الغرفة بشكل مسلسل.
    1. قم بإجراء تخفيفات 10 أضعاف للثقافة الليلية. ينتج عن التخفيف 103 عينة قابلة للعد لكل سلالة من السلالات المستخدمة في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، قد يكون توحيد هذه الخطوة مطلوبا للعزلات السريرية ذات الاختلافات في النمو.
    2. أخرج الأنابيب من الغرفة اللاهوائية ، ضع 10 ميكرولتر من كل عينة في مقياس كثافة الدم ، وعد باستخدام مجهر المجال الساطع كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة لمقياس الدم.
    3. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحديد تركيز الخلية بعد العد.

2. تشكيل الأغشية الحيوية

ملاحظة: في حين أن هذا البروتوكول قابل للتكيف مع أحجام الآبار المميزة ، فقد تم تحسينه لمنصة 96 بئرا. إذا تم تعديل حجم البئر ، فستحتاج إلى تعديل تركيز الخلية بناء على مساحة سطح البئر.

  1. بعد تحديد تركيز الخلية من المزرعة الليلية ، اضبط تركيز الخلية على 1 × 107 خلايا / مل في BHIS (مكملة بنسبة 10٪ (وزن / حجم) L-cysteine و 0.1M جلوكوز).
    ملاحظة: لقد ثبت سابقا أن مكملات الجلوكوز 0.1M تزيد من تكوين الأغشية الحيوية بواسطة C. difficile 630 Δerm سلالة47. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم اختيار تركيز 1 × 107 خلايا / مل بعد اختبار تركيزات البداية المميزة (الشكل 1). لا يزال من الممكن تحقيق تكوين غشاء حيوي قوي بدون مكملات الجلوكوز.
  2. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الخلايا في آبار صفيحة ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا (قاع مسطح ومعالجة زراعة الأنسجة) ، مع ترك أعمدة التحكم (الخلايا فقط) وأعمدة فارغة (الوسائط فقط). احتضن لمدة 24 ساعة في الغرفة اللاهوائية (37 درجة مئوية).
    1. إذا أصبح تبخر الوسائط مشكلة ، فضع ألواح الأغشية الحيوية بعيدا عن أي وحدة تسخين. بدلا من ذلك ، ضع الأغشية الحيوية داخل حاوية إضافية أو قم بتغطيتها بأغشية صفيحة قابلة للاختراق مكونة من 96 بئرا.
  3. قم بإزالة الوسائط برفق من جميع الآبار ، بدءا من الفراغ. سيؤدي ذلك إلى إزالة الخلايا غير الملتصقة وترك غشاء حيوي. هذه الخطوة حاسمة لأن الخلايا داخل الأغشية الحيوية فقط هي ذات الأهمية.
  4. اغسل الأغشية الحيوية برفق 2x باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المختزل مسبقا. لإجراء هذا الغسيل برفق ، قم بإمالة الصفيحة المكونة من 96 بئرا قليلا ، وأدخل أطراف الماصة على جدار البئر ، وحرك الأطراف بالقرب من قاع البئر دون كشط القاع ، واستنشق ببطء. إذا تم ترك PBS في الأسفل ، كرر العملية مرة أخرى. في هذه المرحلة ، يمكن إزالة الخلايا غير الملتصقة ، وهذا أمر طبيعي. قم بإزالة PBS قبل إخراج اللوحة من الغرفة اللاهوائية.
  5. في هذه المرحلة ، استخدم الأغشية الحيوية من أجل: قياسات الكتلة الحيوية (انظر الخطوة 3) ؛ قياسات النشاط الأيضي (انظر الخطوة 4) ؛ قابلية الحساسية للأدوية وفحوصات فحص الأدوية (انظر الخطوة 5).
    ملاحظة: تم التحقق من صحة هذا البروتوكول لسلالة 630 Δerm المكيفة في المختبر وسلالة UK1 الوبائية. قد تظهر العزلات والسلالات السريرية المتميزة قدرات ضعيفة في تكوين الأغشية الحيوية. لتقليل اضطراب الأغشية الحيوية ، اغسل باستخدام PBS 1x بدلا من 2x وقلل حجم الغسيل إلى 100 ميكرولتر.

3. قياس الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية باستخدام مقايسة البنفسج الكريستالي

ملاحظة: استند تلطيخ البنفسجي الكريستالي إلى بروتوكول48 الموصوف سابقا.

  1. بعد غسل الأغشية الحيوية في الغرفة اللاهوائية (انظر الخطوة 2.4) ، قم بإزالة اللوحة ونقلها إلى غطاء الدخان الكيميائي.
  2. لإصلاح الأغشية الحيوية ، أضف برفق 150 ميكرولتر من الميثانول إلى كل بئر. غطي الطبق بالغطاء لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإزالة الميثانول واترك الآبار تجف تماما مع إزالة الغطاء. يجب أن يستغرق هذا ما بين 30 دقيقة و 45 دقيقة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من البنفسج الكريستالي 0.3٪ إلى جميع الآبار وصمة عار لمدة 10 دقائق. قم بإزالة البنفسج الكريستالي بعناية لمنع تلطيخ حافة البئر والجدران ، حيث يمكن أن يؤثر ذلك على القراءة.
  5. اترك الطبق يجف مع إزالة الغطاء. يجب أن يستغرق هذا ما بين 30 دقيقة إلى 45 دقيقة.
  6. اغسل الآبار 3 مرات ب 200 ميكرولتر من الماء المقطر واترك اللوحة تجف تماما. يجب أن يستغرق هذا من 30 إلى 45 دقيقة.
  7. بمجرد أن يجف ، استخدم مجهر المجال الساطع لتصوير الأغشية الحيوية (الشكل 2 أ). في حين أن هذه الخطوة اختيارية ، إلا أنها تسمح بمراقبة أكثر شمولا للخلايا الموجودة في الأغشية الحيوية.
    1. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا على مجهر المجال الساطع المقلوب باستخدام محول لوحة. تحديد الآبار التمثيلية لكل سلالة تم اختبارها.
    2. التقط صورا لكل بئر بالتكبير المطلوب. تم التقاط الصور المعروضة في هذا البروتوكول بتكبير 40x.
  8. بمجرد الحصول على الصور المرغوبة ، انقل اللوحة مرة أخرى إلى غطاء الدخان الكيميائي لإزالة التلطيخ.
  9. لإزالة بقع الأغشية الحيوية ، أضف 150 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 33٪ وضعها على شاكر بسرعة متوسطة لمدة 10 دقائق.
  10. قم بإزالة 90 ميكرولتر من كل بئر وانقلها إلى طبق جديد مسطح القاع مكون من 96 بئرا. اقرأ الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام قارئ الألواح (الشكل 2 ب).

4. قياس صلاحية الأغشية الحيوية باستخدام صبغة التمثيل الغذائي PrestoBlue

  1. إجراء قياس نشاط التمثيل الغذائي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للفحص مع التعديلات الرئيسية. قم بتسخين قارئ اللوحة إلى 37 درجة مئوية قبل تحضير الأغشية الحيوية للفحص. يوصى باستخدام قارئ لوحة قادر على قياس التألق.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن قراءة نشاط التمثيل الغذائي في OD600. ومع ذلك ، لم نجد أن هذا النهج حساس بما فيه الكفاية لهذه الفحوصات. يوصى بأن يقوم المستخدمون بمراجعة بروتوكول الشركة المصنعة وتوحيده إذا لزم الأمر.
  2. بعد غسل الأغشية الحيوية باستخدام PBS في الغرفة اللاهوائية كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.4) ، قم بإزالة اللوحة من الغرفة.
  3. جنبا إلى جنب مع اللوحة ، قم بإزالة 9 مل من BHIS المخفضة مسبقا (مكملة بنسبة 10٪ (وزن / حجم) L-cysteine و 0.1 M جلوكوز).
  4. أضف بسرعة 1 مل من كاشف PrestoBlue إلى 9 مل من BHIS والدوامة المخفضة مسبقا. لا تقم بتقليل الكاشف مسبقا لأن هذا يمكن أن يؤثر على تلوين الكاشف (انظر المناقشة).
  5. أضف 100 ميكرولتر من خليط BHIS-PrestoBlue إلى كل بئر. ضع اللوحة في قارئ لوحة بالإعدادات التالية: درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ، نوع الفحص كحركي ؛ وقت القراءة 30 دقيقة ؛ قراءة التردد في كل 2 دقيقة ؛ شدة التألق حسب نوع قارئ اللوحة المتاح. تم إجراء القياسات الموضحة في هذا البروتوكول باستخدام أطوال موجية للإثارة / الانبعاث تبلغ 560 نانومتر / 590 نانومتر ، على التوالي.
  6. بعد القراءة ، تخلص من اللوحات.
  7. بمجرد الحصول على قيم التألق من قراءات الألواح ، استخدم الآبار الفارغة (الوسائط فقط) لطرح الضوضاء من جميع آبار العينات. بعد ذلك ، قسم آبار الأغشية الحيوية المعالجة بكل مركب بواسطة بئر التحكم الذي يحتوي على غشاء حيوي غير معالج (100٪) للحصول على نشاط التمثيل الغذائي.

5. إضافة الأدوية إلى الأغشية الحيوية

ملاحظة: يمكن تعديل الإعداد الموضح أدناه لمقايسات الحساسية للأدوية وفحص الأدوية ذات التركيز الثابت. بالنسبة لكلتا الطريقتين الموضحة أدناه ، يوصى باستخدام اختبار PrestoBlue.

  1. تحديد الحد الأدنى من التركيزات المثبطة (MIC) للمضادات الحيوية المتميزة
    ملاحظة: يتم التعامل مع الأغشية الحيوية على مدى 48 ساعة ، مما يزيد من احتمالية التلوث. من الأهمية بمكان معالجة الآبار الفارغة أولا واتباع الإجراءات المعقمة. تم استخدام قيم MIC المبلغ عنها في الأدبيات الخاصة بسلالات المطثية العسيرة الأخرى ومقايسات استجابة جرعة الاختبار لإبلاغ تركيزات المضادات الحيوية البدائية لمقايسات MIC المقدمة في هذا البروتوكول. سيكون هذا النهج مفيدا لتحديد تركيزات المضادات الحيوية الابتدائية عند العمل مع العزلات السريرية.
    1. اغسل الأغشية الحيوية الناضجة (24 ساعة) باستخدام PBS في الغرفة اللاهوائية كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.4).
    2. أضف 200 ميكرولتر من BHIS المختزلة مسبقا (مكملة بنسبة 10٪ (وزن / حجم) L-cysteine و 0.1M جلوكوز) تحتوي على تخفيفات مزدوجة من المضاد الحيوي للاختبار لكل بئر باستثناء أعمدة التحكم (الخلايا فقط) والفارغة (الوسائط فقط) في اللوحة.
    3. احتضن لمدة 24 ساعة إضافية. في هذه الدراسة ، تم استخدام فانكومايسين (تركيز يبدأ من 200 ميكروغرام / مل) ، وميترونيدازول (تركيز يبدأ من 16 ميكروغرام / مل) ، وفيداكسوميسين (تركيز يبدأ من 4 ميكروغرام / مل) للتحقق من صحة الفحص. وترد قيم الميكروفون في الجدول 1.
    4. لمنع جفاف الألواح ، ابتعد عن وحدة التسخين في غرفة لاسروبية أو استخدم غشاء نفاذية للغاز.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام PBS أو خندق وسائط مخفض مسبقا (300 ميكرولتر) على الآبار الخارجية للوحة.
    5. بعد 24 ساعة من الحضانة مع الأدوية ، قم بإزالة الوسائط وغسل الأغشية الحيوية برفق 1x باستخدام PBS. معالجة الأغشية الحيوية باستخدام مقايسة البنفسجي الكريستالي أو اختبار PrestoBlue.
  2. فحص مكتبات الأدوية
    1. اغسل الأغشية الحيوية الناضجة (24 ساعة) باستخدام PBS في الغرفة اللاهوائية كما هو موضح أعلاه (انظر الخطوة 2.4).
    2. أضف 200 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على تركيز ثابت من مركبات مكتبة الأدوية إلى كل بئر باستثناء الأعمدة الضابطة (الخلايا في الوسائط الخالية من المضادات الحيوية) والأعمدة الفارغة (الوسائط بدون مضادات حيوية) في اللوحة. احتضن لمدة 24 ساعة إضافية. لمنع جفاف الألواح ، ابتعد عن وحدة التسخين في غرفة لاذي.
    3. بعد 24 ساعة من الحضانة مع الأدوية ، قم بإزالة الوسائط وغسل الأغشية الحيوية برفق 1x باستخدام PBS. معالجة الأغشية الحيوية باستخدام مقايسة البنفسج البلوري أو مقايسة التمثيل الغذائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الهدف من البروتوكول الموصوف أعلاه هو تكييف نموذج تكوين الأغشية الحيوية ذات 96 بئرا والتحقق من صحته كمنصة لفحص الأدوية لتحديد المركبات القابلة لإعادة الموضع ذات النشاط ضد الأغشية الحيوية الراسخة من المطثية العسيرة. تم تحديد تأثير كثافات الخلايا المميزة (10 و4 و 10و 5 و 10و 6 و 107 خلايا / مل) على تكوين الأغشية الحيوية ، وتم تحديد تكوين الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخ البنفسج البلوري كما هو موضحسابقا 48. تشير نتائج ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

C. العسيرة تكوين الأغشية الحيوية والدور الذي يلعبه في المرض غير مفهومة جيدا. تشير النتائج الحديثة إلى دور الأغشية الحيوية في انتكاسةالمرض 28،34. تكوين الأغشية الحيوية هو عامل ضراوة كبير22،23،24،25 وفي الالتهابات البكتيرية ، مثل تلك التي تسببها المكورات العنقودية الذهبية والزائفة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تعارض للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

صمم JAR الدراسة والبروتوكول وكتب المخطوطة. أجرى A.S. و P.Z. التجارب وساعدوا في تحسين البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال أموال بدء التشغيل من جامعة تكساس في سان أنطونيو (UTSA) إلى JAR ، وتم دعم A.S. من قبل برنامج UTSA MARC (T34GM145507). يود المؤلفون أن يشكروا مشروع أدوية الملاريا (MMV، سويسرا) لتقديمه مكتبة صندوق أولويات الصحة العالمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسيتيك SAF-CT ACS 500 ملفيشر ساينتفيكA38S500
أجار البكتريولوجيك GR 1 كجمقارئ لوحة فيشر ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1Fisher ScientificBTH1MG
زجاجة مستخلص الخميرة 500 جرامفيشر DF0127179
الدماغ مرق ضخ القلبفيشر ScientificCM1135R
Crystal Violet USP grade 100GVWR97061-850لتلوين الأغشية الحيوية لمقايسات الكتلة الحيوية
CytoOne 96-well TC ، قاع مسطح ، شفاف ، مغلف ، 50 / حالةالولايات المتحدة الأمريكية ScientificCC7682-7596
D- (+) - الجلوكوز ، 50712744فيشر العلمي
ثنائي ميثيل سلفوكسيد للبيولوجيا الجزيئية (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICIN 250MGفيشر ScientificAC468312500
L-CYSTEINE 98 +٪ 1KGفيشر AAA104350B العلميلوسائط المطثية العسيرة
ميثانول 99.8 أكروزال 1LTفيشر AC364390010
ميترونيدازول ، 99٪ 5GRفيشر ScientificAC210340050
ملحي عازل للفوسفات (PBS) 10Xفيشر ScientificBP3991
كاشف جدوى الخلية المبسطة الأزرقفيشر ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100 / CSFisher Scientific7000379تستخدم لإغلاق ألواح المخدرات للأم وابنتها قبل التخزين
SODIUM TAUROCHOLATE 100MG & nbsp ؛VWR100291-598
فانكومايسينفيشرBP29581
اللامائيالعلمي محلول العلمي

المراجع

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تكوين الغشاء الحيويالمقايسة الأيضيةالقابلية للتأثر بالأدويةقراءة الكتلة الحيويةفحص الأدويةالعدوى المتكررةالهدف العلاجي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.