مقالة منهجية

الكشف عن شد غشاء الشبكة الإندوبلازمي المرتبط بالميتوكوندريا باستخدام حساسات حيوية FRET المحفزة

DOI:

10.3791/67914

⸱

أغسطس 7, 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف طريقة لقياس قيم FRET لحساسات FRET الحيوية المحفزة التي تستهدف ER (الموسوم ب CFP) أو الميتوكوندريا (موسوم ب YFP) في المختبر لتقييم شد أغشية ER المرتبطة بالميتوكوندريا (MAMs)، والتي تؤثر على توليد Aβ، ويمكن استخدام هذه الطريقة للفحص الأولي للعوامل الصناعية أو الطبيعية التي تعدل MAM كعلاجات محتملة للزهايمر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت العديد من الدراسات أن عدد وطول وعرض الفجوة (السمك) لاتصالات ER-الميتوكوندريا، أو الأغشية المرتبطة بالميتوكوندريا (MAMs)، تؤثر على أدوارها البيولوجية. أظهرت أعمالنا السابقة أن تثبيت MAMs الضيق، الذي يتميز بعرض فجوة حوالي 7 نانومتر، يؤدي إلى زيادة مستويات β الأميلويد (Aβ)، في حين أن وجود MAMs فضفاضة بعرض فجوة حوالي 40 نانومتر يقلل من إنتاج Aβ في نموذج عصبي ثلاثي الأبعاد (3D) لمرض الزهايمر (AD). لدراسة تأثيرات MAMs ذات عرض الفجوات المختلفة، تم تطوير حساسات FRET (نقل طاقة رنين فورستر) المستهدفة للميتوكوندريا - ER-CFP (بروتين فلوري سيان) وMito-YFP (بروتين فلوري أصفر) على التوالي - لقياس حجم MAMs الضيق (<عرض الفجوة 10 نانومتر) مقارنة بالموجات الفضفاضة أو غير الفضفاضة. يحدث FRET عندما يكون فلوروفور المتبرع (CFP) والفلوروفور المستقبل (YFP) على بعد 10 نانومتر من بعضهما البعض، مما يجعل هذا النظام مناسبا لتقييم قرب MAM. يوضح هذا البروتوكول استخدام FRET ذو النسبة الطيفية لقياس مدى تكوين MAM الضيق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلامس الشبكة الإندوبلازمية المرتبطة بالميتوكوندريا (MERCs)، والتي يتم عزلها كيميائيا كأغشية ER المرتبطة بالميتوكوندريا (MAMs)، متورطة في عدة اضطرابات تنكسية عصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)1. تشير فرضية "MAM" المقترحة مؤخرا إلى أن MAMs تلعب دورا مركزيا في توليد β الأميلويد (Aβ)، مما يؤدي إلى بدء السلسلة الممرضة لمرض AD. تشمل هذه السلسلة تكوين التشابك الليفي العصبي (NFTs)، خلل التوازن في الكالسيوم، والالتهاب العصبي2. تتكون MAMs من مجالات دقيقة غنية بالكوليسترول تشبه طوف الدهون في الشبكة الإندوبلازمية وغشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM)، ترتبط ببروتينات ربط محددة تساهم في تنوعها الهيكلي والوظيفي3. يؤثر استقرار اتصالات ER-الميتوكوندريا على عمليات خلوية مختلفة، بما في ذلك إشارات الكالسيوم في ER والموت المبرمج 4,5. يقدر أن 5٪-20٪ من الميتوكوندريا تتواصل فيزيائيا مع الشبكة الطيرانية لتأسيسMAMs 6. أشارت عدة دراسات إلى أن عدد وطول وعرض الفجوة (السماكة) بين ال ER والميتوكوندريا في مواقع MAM هي عوامل مهمة لتحديد أدوارهم الوظيفية. أظهرت المجهر الإلكتروني البارد والتحليلات في الجسم الحي لكبد الفئران أن الحالة الأيضية لخلايا الكبد تعدل كل من سمك (من 14 نانومتر إلى 20 نانومتر) وطول (من 145 نانومتر إلى 270 نانومتر)MAMs 7.

تظهر أيضا MAMs كأهداف علاجية محتملة لمختلف الاضطرابات، بما في ذلك السرطان واضطرابات الأيض. ينظم سمك أو عرض الفجوة في MAM بقاء الخلية. أظهرت المثبتات المكونة ل MAM، MAM 1X و MAM 9X، المصممة لتثبيت التوازن بإحكام (عرض الفجوة 6 نانومتر ± 1 نانومتر) والرخوة (عرض الفجوة 24 نانومتر ± 3 نانومتر)، على التوالي أن تثبيت الميكروفونات الضيقة زاد بشكل كبير من توليد Aβ في نموذج جديد ثلاثي الأبعاد للزراعة العصبية للزهايمر. على النقيض من ذلك، لم يكن لتثبيت المامات الفضفاضة أي تأثير8. لذا، قد يكون تحويل استقرار MAMs المشدود إلى MAMs غير مرتبة مفيدا لتقليل أمراض الأميلويد. تجعل التعقيدات الهيكلية والوظيفية ونقص التحليل الكمي الدقيق لدرجة استقرار ال MAM من الصعب استهداف MAMs لاكتشاف الدواء. أظهر تحليل جديد للتصوير الحي والكيموغرافيا لسرعة المحور المحورية للميتوكوندريا المرتبطة ب ER أن سرعة المحورية للميتوكوندريا يمكن استخدامها كمقياس لقياس استقرار MAM بشكل كمي، لأن التلامس الأقوى مع ER يقلل بشكل كبير من سرعة المحور المحوري للميتوكوندريا مقارنة بالميتوكوندريا الحرة 8,9. باستخدام مثبت محفز لموجات MAM في خلايا Neuro 2A (N2AAPP) المعبرة عن hAPP8، وجدنا أن تضييق عرض فجوة MAM يزيد من توليد Aβ بطريقة تعتمد على الجرعة8. مثبتات MAM القابلة للتحفيز هي بلازميدات تعبيرية ترمز إلى مستشعرات استهداف ER الموسومة بالحبات (CFP) ومستشعرات مستهدفة للميتوكوندريا مع بروتين فلوري أصفر، ومستهدفة للميتوكوندريا بعلامة YFP (بروتين فلورية أصفر) مع نطاقات ارتباط رافاميسين FK506 (FRB) القادرة على تحفيز الراباميسين أو بروتين ارتباط FK506 بقدرة 12 كيلو دالتون (FKBP). تم تمييز المستشعرات الحيوية ب ER-CFP و Mito-YFP على التوالي. CFP هو فلوروفور متبرع ينقل الطاقة إلى الفلوروفور المستقبل YFP عندما يفصل بينهما >10 نانومتر. الخلايا (N2A APP) التي تعبر عن المستشعرات الحيوية المحفزة زادت من توليد Aβ عند علاج الراباميسين8، مما يشير إلى أن زيادة كثافة MAMs تزيد من توليد Aβ. ستكون هذه الطرق مفيدة لفحص معدلات الجزيئات الصغيرة للMAMs وتركيزها الفعال المطلوب لتحقيق استقرار مستوى مثالي من MAMs الضيقة التي ستحول MAMs الممرضة ("Aβ متزايدة") إلى علاجية ("Aβ منخفضة") دون زعزعة استقرار نقاط ER واتصالات الميتوكوندريا بالكامل، وهو أمر مهم لبقاء الخلايا.

النموذج التجريبي
استخدمت هذه الدراسة خلايا Neuro2A(N2A) التي عبرت بشكل مستمر عن APP751 (N2AAPP). تطلق هذه الخلايا مستويات قابلة للكشف من Aβ في الوسط المكيف (CM) مقارنة بخلايا N2A الساذجة. تم الحفاظ على خلاياN2A APP في DMEM مع مكمل 10٪ FBS، و100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، و2 ملي مول L-جلوتامات مع 200 ميكروغرام/مل G418، كما تم وصفهسابقا 10.

بلازميد التعبير
تم توليد بلازميد تعبيري عن طريق دمج تسلسل استهداف الميتوكوندريا الموسوم ببروتين A-kinase الثديي 1 [AKAP1(34-63)] وتسلسل استهداف ER الموسوم ببروتين الفلورية السماوية CFP لفوسفاتيديلينوسيتول-3-فوسفاتاز Sac1 [Sac1(521-587)] مع تسلسل Tav2A ذاتي الشق يرمز لتسلسل الببتيد EGRGSLLTCGDVEENPGPP، ويرمز له ب pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8 . البلازميد المدمج مع Tav2A محاط أيضا بتسلسلات نوكليوتيدية تشفر مجال ارتباط الراباميسين FK506 (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] أو مجال بروتين ارتباط FK506 (FKBP) بقوة 12 كيلو دالتون (MGVEKQVIRPNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). تم توليد بلازميد الاندماج FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP، المشار إليه هنا باسم MAM-Tav2A، للحصول على مستويات تعبير متساوية الأضرار ل FRB-YFP-AKAP1(34-63) و Sac1(521-587)-CFP-FKBP لتحليل FRET النسبي. Sac1(521-587)-CFP-FKBP، ويرمز له ب ER-CFP، هو فلوروفور المتبرع، بينما ميتو-YFP-FRB، المرمز إليه ب Mito-YFP، هو الفلوروفور المستقبل الذي يولد FRET عند الفصل بينهما ~10 نانومتر8. لذا، تكتشف حساسات المحركات الحيوية المبنية على FRET الميكروبات الضيقة (6-10 نانومتر، عرض الفجوة). تم إدخال FRB وFKBP لتحفيز تضييق عرض فجوات MAM عند إضافة الراباميسين بطريقة تعتمد على الجرعة، ويمكن قياسها بقياس إشارة FRET المتزايدة8.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. النقل الداخلي

  1. نقل خلاياN2A APP باستخدام بلازميد تعبير MAM-Tav2A (14-18 ساعة).
    1. قبل البدء، × اللوحة 1 106 خلايا N2A APPلكل بئر من صفائح ذات 6 آبار تحتوي على أغطية زجاجية وتحافظ على الخلايا في وسط النمو لمدة 12-16 ساعة.
    2. نقل بلازميد MAM-Tav2A بسعة 1-3 ميكروغرام (ملف تكميلي 1) باستخدام كاشف الترانسفيكشن ليبوفكتامين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. بعد 12-16 ساعة من النقل الدوائي، قم بإجراء العلاج الدوائي.
      ملاحظة: دائما يجب نقل الخلايا باستخدام بلازميد تعبير يرمز فقط للمتبرع (ER-CFP) أو المستقبل (Mito-YFP) ليستخدم كخلفية FRET.

2. علاج المخدرات

  1. عالج خلاياNP التي تعبر عن MAM-Tav2A باستخدام راباميسين (Rapa) أو Rapalog (Log) (3-6 ساعات).
    1. قبل العلاج، حضر محاليل المخزون (10 ملم) من رابا وجذوع.
    2. غير الوسائط باستخدام وسائط جديدة تحتوي على 0 نانومتر، 100 نانومتر، أو 250 نانومال، رابا أو لوج.
    3. بعد 3 ساعات من العلاج، أضف 3.3٪ بارافورمالديهايد (PFA) لتثبيت الخلايا.
    4. جهز الشرائح للمجهر الكونفوكالي الفلوري عن طريق وضع قطرة واحدة من مادة مضاد التلاشي.
    5. ثبت الغطاء فوق القطرة واضغط بلطف بالملاقط.
      ملاحظة: أغطية الزجاج هشة وتتطلب الحذر. كبديل لألواح الغطاء الزجاجي، استخدم صفائح قاعية زجاجية. العيب الرئيسي في استخدام الألواح ذات القاع الزجاجي هو عدم إمكانية استخدام كاشف مكافحة التلاشي، مما يجعل التصوير صعبا بسبب تبييض الفلوروفورات. لا تستخدم كاشف مضاد التصبغ الذي يحتوي على DAPI (4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول) لأن فلورته الزرقاء ستؤثر على FRET بين CFP وYFP.

3. المجهر الكونفوكلي لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)

  1. ضع الشرائح تحت المجهر المقلوب وضبط تركيز المجهر حتى تصبح الخلايا مرئية.
  2. تحفيز الفلوروفور باستخدام ليزر 440 نانومتر والتقاط صور باستخدام انبعاث 468-503 نانومتر للمانح CFP (FKBP-CFP-ER) أو 525-565 نانومتر للمستقبل YFP (FRB-YFP-MITO).
  3. قم بضبط شدة الإشارة باستخدام فلتر الفلورسنت المدمج حتى تتلاشى الإشارة الخلفية (يجب أن تكون تقريبا سوداء تماما).
    ملاحظة: تم استخدام مجهر كونفوكال لالتقاط الصور الفلورية باستخدام برنامج NIS Element AR. تم استخدام تكبير 60x بدقة 512 بكسل.
  4. احفظ الصور كملفات .nds.
  5. قم بإجراء تحليل FRET النسبي الطيفي.

4. تحليل FRET بنسبة (6 - 12 ساعة)

ملاحظة: تم اكتشاف انبعاث فلوري من المتبرع ER-CFP (468-503 نانومتر) والمستقبل ميتو-YFP (525-565 نانومتر) باستخدام مجهر كونفوكلي. تم استخدام برنامج ImageJ لقياس متوسط شدة فلورة البكسل بعد طرح الخلفية. تم حساب نسبة YFP إلى شدة انبعاث CFP واستخدامها كقراءة لتحليل FRET الطيفي.

  1. صورة مفتوحة J (فيجي).
  2. إما سحب ملف .nds إلى الصورة J، أو اضغط ملف -> فتح واختر الصورة.
  3. في الشاشة التالية، اختر مربع تقسيم القنوات .
  4. انقر على لوحة C = 0 .
  5. انقر على تحليل -> القياس.
    ملاحظة: اكتب القيمة المتوسطة لحسابها لاحقا.
  6. انقر على العملية -> الرياضيات -> الطرح.
  7. هنا يأتي المتوسط للقيمة.
  8. كرر الخطوة 4 للوحة C = 1.
  9. انقر على أداة الاختيار الحرة .
  10. قم بتدوير خلية محل اهتمام، ثم اضغط Ctrl+T لتسجيلها إلى العائد على الاستثمار.
  11. انقر على عرض الجميع في أسفل العائد على الاستثمار لعرض ما اخترته بالفعل.
  12. اختر جميع الخلايا المحددة وانقر على القياس، وسجل هذه القيم في إكسل.
  13. انقر على لوحة C = 1 ثم اضغط على عرض الكل.
  14. اختر جميع الخلايا وانقر على القياس مرة أخرى، وسجل هذه القيم في عمود منفصل في Excel.
  15. في Excel، أنشئ دالة لوضع قيم إشارة المتبرع فوق المستلم (C0/C1). هذه هي نسبة FRET.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهر تحليل FRET النسبي لخلاياN2A APP الغنية ب FACS والتي تعبر عن MAM-Tav2A زيادة تعتمد على الجرعة في مستويات Aβ40 بعد علاج الراباميسين8. يعمل الراباميسين عن طريق تثبيط مسار الإشارة المستهدف للثدييات من راباميسين (mTOR)، مما يقلل بدوره من تعبير TREM2 (المستقبل المحفز المعبر عن خلايا الميلويد 2) في الخلايا الدبقية الدقيقة، مما يؤدي إلى تقليل تطهير اللويحات Aβ في نماذج الفئران 5XFAD لمرض الزهايمر11. AP21967 النظير للراباميسين، المعروف عادة باسم الرابالوج (Log)، يظهر تقاربا منخفضا ل mTOR وبالتالي فهو غير سام نسبيا للخلايا. ومع ذلك، يحتفظ بالقدرة على ربط مجال FRB بنفس الألفة التي تميز الراباميسين، بسبب طفرة تعويضية مكونة التجويف (K2095P) أدخلت إلى مجال FRB12.

زاد علاج رابا ولوغ من نسبة FRET (الشكل 1). أظهر العلاج تأثيرا ضئيلا أو معدوما على مستويات APP أو بروتينات MAM الأخرى، مثل IP3R3 أو VDAC1. وبالتالي، فإن زيادة الكثافة الكثيفة (<10 نانومتر) من توليد Aβ في المختبر8. ومن الجدير بالذكر أن اختبارات FRET التي أجريت في خلايا N2A الساذجة أيضا أنتجت نتائج مماثلة.

figure-results-1
الشكل 1: زيادة عرض الفجوات بين MAM زادت من توليد Aβ في المختبر. (أ) مخطط مثبت MAM المحفز CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-Tav2A) الذي يخضع للانقسام الذاتي، مولدا مستويات متساوية الشكل للمانح (CFP-FRB-ER أو ER-CFP) والمستقبل (Mito-FKBP-YFP أو Mito-YFP)، ويعزز FRET/FLIM عند الربط بالصوتات المغلقة الداخلية أو عند تعزيز تكوين MAM المشدود عن طريق تحفيز تفاعل FRB وFKBP مع الراباميسين (Rapa) أو نظيره Rapalog (Log). (B) IB للخلايا التي تعبر عن MAM-Tav2A (Tav2A) تظهر تعبيرا متساويا للضمير CFP-ER (الصندوق الأزرق) وMito-YFP (الصندوق الأصفر) بعد الانقسام الذاتي ل Tav2A. (ج) صور كونفوكال لخلايا معالجة DMSO (Veh) أو Rapa (250 نانومتر) التي تفرط في التعبير عن MAM-Tav2A. (د، ه). تحليل FRET بنسبة نسبية للخلايا المعالجة بدون (Veh) أو ب 100 نانومال راباميسين (Rapa) (D) أو رابالوج (Log) (E). تعرض قيم FRET كنسب شدة بين القناة 2 (465-500 نانومتر) والقناة 1 (525-555 نانومتر). لكل تحليل FRET، تم اختيار 40-50 خلية عشوائيا لتوليد عائد على المؤشرات على أساس خلية تلو الأخرى. تحليل أنوفاجي أحادي الاتجاه. ص < 0.0001. (و) صورة البقعة الغربية التمثيلية لخلاياNP2A التي تعبر عن MAM-Tav2A بعد علاج لمدة 24 ساعة بريفاستيغمين (Riv: 0 أو 50 ميكرومول). مولد MAM-Tav2A مستويات متساوية الأضرار للمتبرع (CFP-ER) والمستقبل (Mito-YFP). (G) قياس نسبة FRET بين المتبرع والمستقبل للمعالج بالمركبة (0 ميكرومولار) أو معالج ب Riv (50 ميكرومولار). (H) أظهر Aβ ELISA (Wako) للوسط المكيف (CM) لخلايا المعالجة بالمركبات (0 ميكرومول) أو المعالج ب Riv (50 ميكرومولار) انخفاضا كبيرا في مستويات Aβ40 (بيسيول) بعد معالجة 50 ميكرومولار ب Riv. n = 6، p < 0.001. (I) قيم FRET (النسبة) وAβ (pM) تجمع. تم تعديل الشكل من زيلمر وآخرون8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف الإضافي 1: ملف تسلسل البلازميدات MAM-Tav2A. تسلسل الحمض النووي للبلازميد المعبر الذي يشفر تسلسل Sac1 المستهدف ER (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQ KEKID587) مرتبط بتسلسل FKBP وCFP وتسلسل AKAP1 المستهدف للميتوكوندريا (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63) المرتبط بتسلسل FRB وYFP المرتبط بتسلسل Tav2A الشقي ذاتيا (EGRGSLLTCGD VEENPGP). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعديل MAMs هو مجال بحثي ناشئ له تداعيات محتملة على اضطرابات مختلفة، بما في ذلك السرطان، والاضطرابات الأيضية، والأمراض التنكسية العصبية13. العديد من العوامل الدوائية، بما في ذلك مضاد الداينين LDC-3/دينرايستين، ودواء مضاد السكري الميتفورمين، والعامل المضاد للسرطان سولفورافان، تعطل MAMs وتخضع حاليا لتجارب ما قبل السريرية والسريرية للسرطان والاضطرابات الأيضية. تقوم هذه العوامل الدوائية بتعديل نقاط اتصال ER-الميتوكوندريا أو عرض تلامس MAM من خلال تنظيم التفاعلات بين بروتينات ربط MAM مثل PTPIP51، VAPB، VDAC1، PACS2، MFN2، VDAC1، وIP3R314، 15، 16، 17، 18، 19، 20. قام مضاد مستقبلات سيغما-1 (S1R) (NE-100) بخفض ضبط العضلات المغناطيسية (MAMs) وخفض بشكل كبير مستويات Aβ المحوري في نموذج عصبي ثلاثي الأبعاد لAD 21. أظهر تقرير حديث أن فقدان S1R زاد من الميكانيكات الفضفاضة وتقليل الميكانيكيات المشدودة، مما يشير إلى أن S1R هدف علاجي لتعديل شد MAM 8,9.

أظهر التصوير الحي بتقنية FRET (نقل طاقة الرنين الفلوري) للخلايا العصبية المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا في مرض الزهايمر (AD) عن اضطراب كبير في الجرذان الموحدة الضيقة (<10 نانومتر)، دون أي تغيير ملحوظ في الميكروفونات الفضفاضة (~20 نانومتر)، مقارنة بتلك في العينات الضابطة البرية1. مثبتات MAM المعتمدة على FRET/FLIM المحفزة والتي تتضمن مجالات تثبيط FRB وFKBP المحفزة لللوغاريتم/الرابالوج، المعبر عنها في خلاياN2A APP، أظهرت أن علاج Rapa/Log عزز شد MAM وزاد إنتاج Aβ40 بطريقة تعتمد على الجرعة 8,9. وقد قدم هذا أول دليل على أن تضييق عرض فجوة MAM يعزز المعالجة الأميلويدوجينية. الدواء المعتمد من إدارة الغذاء والدواء المضاد للذاكرة ريفاستيجمين، الذي يخضع حاليا للدراسة قبل السريرية لمرض AD22,23 الخفيف إلى المتوسط، خفض بشكل كبير مستويات Aβ40 (p < 0.001) دون تغيير تعبير VDAC1 أو BACE1، أو التأثير على تكرار التواجد المشترك بين CFP-ER وMito-YFP 8,9. يبدو أن ريفاستيغمين يؤثر على استقرار MAM من خلال تعديل مستويات بروتين ميتوفوزين-2 المرتبط ب MAM (MFN2)24. يتماشى هذا الاكتشاف مع دراسات أخرى تشير إلى أن ريفاستيغمين يقلل من مستويات Aβ في الخلايا العصبية المزروعة ونماذج فئران AD (3xTg)25,26. نظرا لأن عرض فجوة MAM ينظم العمليات الخلوية المختلفة الضرورية لبقاء الخلية27، فقد يقدم التعديل المستهدف لاستقرار MAM استراتيجية علاجية أكثر فعالية ضد تراكم Aβ من الزعزعة الكاملة للMAMs، مما قد يؤدي إلى آثار جانبية غير مقصودة.

من القيود الرئيسية للطريقة أن تقنية FRET بنسبة القياس تعتمد على التعبير المتساوي للمانح والمقبل. التعبير المشترك للبلازميدات المشفرة التي تشفر المتبرع أو المستقبل سينتج نتائج غير متسقة. استخدام جهاز Tav2A ذاتي القطع الذي يربط المتبرع بالمستشعرات الحيوية المستقبلة يضمن التعبير المتساوي للمستشعرات الحيوية. ومع ذلك، تم فحص مستويات تعبير الحساسات الحيوية باستخدام تحليل ويسترن بلوت قبل تحليل FRET.

قد لا يكون راباميسين (Rapa) مثاليا لتقييم تأثيرات شد MAM على إنتاج Aβ، لأنه يثبط مسار الإشارة المستهدف لدى الثدييات من الراباميسين (mTOR)، مما يؤدي إلى انخفاض تنظيم TREM2 (المستقبل المحفز المعبر عنه في الخلايا النخاعية 2) في الخلايا الدبقية الدقيقة وبالتالي يقلل من تطهير بلاك Aβ في نماذج فئران مرض الزهايمر (5XFAD)11. كبديل، يمكن استخدام AP21967 النظير للراباميسين، المعروف عادة باسم الرابالوج (لوغار). يظهر Log قدرة ارتباط منخفضة على mTOR، مما يجعله غير سام نسبيا للخلايا. ومع ذلك، يحتفظ بالقدرة على ربط مجال FRB بألفة مشابهة للراباميسين، بسبب إدخال طفرة تعويضية لتكوين التجويف (K2095P) في مجال FRB12.

الطريقة الموصوفة لها أهمية عالية. على الرغم من الأدلة من عدة دراسات ما قبل سريرية أظهرت تأثيرات علاجية واعدة للمعدلات الاصطناعية أو الطبيعية ذات الجزيئات الصغيرة لMAMs في السرطان والاضطرابات الأيضية، لم تجرى أي تجارب سريرية حتى الآن. أحد الأسباب الرئيسية لذلك هو غياب طريقة موثوقة يمكنها قياس استقرار ال MAM بشكل كمي، وهو شرط أساسي لتطوير علاجات فعالة. يتطلب قياس علاقة البنية والوظيفة بين MAM رؤية كاملة للخلية، وهو ما لا يمكن تحقيقه للخلايا العصبية الناضجة بواسطة المجهر التقليدي TEM أو المجاهر عالية الدقة الأخرى، ولكن يمكن الحصول عليه بتكبير منخفض28. لذا، قد تكتشف التقنيات التقليدية مثل TEM، أو التجميد التام، أو المجاهر الإلكترونية الماسحة (SEM) البنى الخلوية على المستوى النانوي لكنها تعاني من قيود في قياس درجة استقرار MAM لأن الطبيعة الديناميكية العالية للميتوكوندريا29 وER30,31 تجعل هياكل MAM عابرة 32,33,34. للتحقيق في علاقة دالة البنية بين MAM، تم اقتراح قياس سرعة المحور المحوري للميتوكوندريا المتصلة ب ER عبر MAMs ضيقة أو فضفاضة باستخدام تصوير الخلايا الحية وتحليل الكيموغرافيا 8,9. وهذا يتوافق مع تقارير أظهرت انخفاضا في نقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية القشرية من أدمغة الزهايمر35 وخلايا سايبريد AD المتمايزة36. على الرغم من الدقة الكمية العالية، قد لا تكون تقنية التصوير بالخلايا الحية مفيدة لفحص الأدوية عالي الإنتاجية. على النقيض من ذلك، يمكن تطبيق تحليل FRET/FLIM كتقنية كمية أسرع من المجهر الحالي للخلايا الحية أو المجهر عالي الدقة في المستقبل لتحديد العلاجات الصغيرة للزهايمر.

لقد ثبت أن بروتوكول FRET الموضح هنا قابل للتطبيق تحديدا في سياق الارتباط الصناعي بين ER والميتوكوندريا. تمكن بساطته من تقييم فعال لاستقرار اتصال الميتوكوندريا بين ER والميتوكوندريا والتحقيق في التأثيرات الناتجة على أمراض الأميلويد، وهو الهدف الأساسي لهذا النهج. نهدف إلى الاستفادة الأكبر من هذه الطريقة لفحص مكتبة من الجزيئات الصغيرة المحتملة التي تعدل MAM ضمن منصة فحص أدوية AD ثلاثية الأبعاد (3D) تم تطويرها حديثا37. ستكون النتائج مفيدة للغاية في اختيار معدلات MAM المضادة للجزيئات الصغيرةالمضادة ل Aβ 13 في المختبر ، والتي يمكن توسيعها إلى الدراسات الحية أو السريرية في المستقبل.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بصدق الدكتور رودولف إي. تانزي، أستاذ في مستشفى ماساتشوستس العام (MGH)، على تعليقاته العميقة حول المخطوطة. نشكر الدكتور ماساتو مايساكو، أستاذ مساعد في MGH، على مشاركته خبرته في اختبارات FLIM. نشكر الدكتور جيورجي هاجنوتشكي، أستاذ جامعة توماس جيفرسون في فيلادلفيا، على تزويدنا بسخاء بلازميدات التعبير التي ترمز إلى ER-CFP أو Mito-YFP. وقد دعمت هذه الدراسة صندوق علاج الزهايمر ل RB.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BSAFisher Scientific501781532
Confocal microscope Olympus FV3000RS (Tokyo, Japan)N/A
DMEM with GlutaMAX supplementGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
GAPDH Polyclonal AntibodyThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatin VWR International9000-70-8
Geneticin (G418 Sulfate)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP monoclonal AntibodyInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, version 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich H0200000
ImageJ Software ImageJ 1.53aN/A
Inverted confocal microscope Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, version 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

234 234 JoVE
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة