يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطوير الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية في أحادية الطبقات وظروف ثلاثية الأبعاد

905 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67920

⸱

يونيو 13, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Fisiología Renal, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Buenos Aires (UBA), 2Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay (IFIBIO Houssay), Universidad de Buenos Aires – Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET), 3Servicio de Nefrología, Hospital General de Niños Pedro de Elizalde, 4Laboratorio de Fisiopatogenia, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف بروتوكولات الحصول على الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) من قشرة الكلى لتطوير طبقات أحادية وثقافات ثلاثية الأبعاد على مصفوفة خارج الخلية (3D-HRTEC).

الملخص

يتم عزل الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) من الكلى التي تمت إزالتها من مرضى الأطفال الذين يخضعون لعمليات استئصال الكلية المشار إليها من قبل وحدة أمراض الكلى للأطفال في المستشفى العام للأطفال بيدرو دي إليزالدي ، بوينس آيرس ، الأرجنتين. من الناحية المجهرية ، يتم تشريح قشرة الكلى الطبيعية من النخاع الكلوي وتقطيعها إلى شظايا. ثم يتم هضم الشظايا القشرية في محلول هانك مع استكمال 0.1٪ من الكولاجيناز من النوع 1 ويتم ترشيحها من خلال شبكة بحجم المسام 70 ميكرومتر لفصل الأنابيب الكلوية عن الكبيبات. تخضع الأنابيب الكلوية لعملية هضم ثانية مع الكولاجيناز لعزل الخلايا الظهارية. أخيرا ، يتم إيقاف هضم الإنزيم ، وتزرع الخلايا الظهارية في قوارير تحتوي على RPMI 1640 مع مكملات أقل من 5٪ ثاني أكسيد الكربون2عند 37 درجة مئوية حتى التقاء. يمكن زراعة خلايا HRTEC كطبقات أحادية على ألواح 96 بئرا ، أو أغطية زجاجية في ألواح 24 بئرا ، أو حاملات زراعة الخلايا المطلية بالكولاجين. أيضا ، يتم الحصول على ثقافات الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية ثلاثية الأبعاد (3D-HRTEC) من خلايا HRTEC المزروعة على مصفوفة الغشاء القاعدي (BM). تتم مراقبة تجميع الخلايا وتشكيل هياكل الشكل الأنبوبي. لقد استخدمنا الثقافات الأولية HRTEC لسنوات عديدة لدراسة التأثير السام للخلايا الناجم عن سم الشيجا في كلية الأطفال ، مما يؤدي إلى تغيرات فيزيولوجية مرضية تؤدي إلى متلازمة انحلال الدم اليوريمي (HUS). يمكن استخدام كل من ثقافات HRTEC و 3D-HRTEC لتقييم تأثيرات السموم المختلفة ، والأدوية الاصطناعية ، والعوامل البيولوجية ، والهرمونات ، وما إلى ذلك ، وتحديدا على ظهارة النبيبات الكلوية القريبة للإنسان.

المقدمة

في مجموعتنا ، تم استخدام الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) التي تم تطويرها في طبقات أحادية وفي ظروف ثلاثية الأبعاد (3D-HRTEC) لدراسة عمل السمية للخلايا لسم شيغا من النوع 2 (Stx2) الناجم بعد عدوى الجهاز الهضمي بالإشريكية القولونية المنتجة لسموم الشيغا (STEC).

Stx1 و Stx2 (Stxs) هما عوامل الفوعة الرئيسية ل STEC القادرة على التسبب في متلازمة انحلال الدم اليوريمية بعد الإسهال (HUS) 1. متلازمة انقطاع النفس الوراثي هي من المضاعفات الجهازية التي تصيب حوالي 5-10٪ من الأطفال المصابين ب STEC وتتكون من فقر الدم الانحلالي وقلة الصفيحات وإصابة الكلى الحادة لدى الأطفال (AKI) ، مما يتطلب علاجا داعما2. في الأرجنتين ، STEC-HUS هو مرض مستوطن يبلغ معدل الإصابة السنوي 6.52 حالة لكل 100,000 طفل دون سن 5 سنوات (أعلى مستوى في جميع أنحاء العالم) ، وهو ما يمثل أحد الأسباب الرئيسية لإصابة الكلىالحادة 3. على الرغم من أن معدل الوفيات أقل من 4٪ 3 ، إلا أن ما يقرب من 50٪ من المرضى يصابون بعواقب الكلى ، مما يشكل ثاني أكثر أسباب زراعة الكلى شيوعا في بلدنا 4,5.

قبل الاستيعاب وممارسة عمله السام للخلايا ، يرتبط Stx2 على وجه التحديد بمستقبلات الجليكوليبيد globotriaosylceramide (Gb3) المعبر عنها على سطح الخلية للأعضاءالمستهدفة 6. الكلى هي العضو الرئيسي الذي تضرر من Stxs بسبب وجود خلايا حساسة ل Stx ، والتي تعبر عن كميات كبيرة من مستقبلات Gb3 النشطة بيولوجيا في الخلايا الظهارية والبطانية الكلوية7،8.

أظهرت الأعمال السابقة التي تم إجراؤها في HRTEC المزروعة كطبقات أحادية أن Stx2 يثبط تخليق البروتين ، ويقلل من بقاء الخلايا وتكاثر الخلايا ، ويتسبب في موت الخلايا المبرمج والنخر9،10،11،12. علاوة على ذلك ، فإن تعرض 3D-HRTEC ل Stx2 منع هجرة الخلايا وتطوير الهياكل الأنبوبية بخصائص الأنابيب الكلوية القريبة12،13.

كما تم استخدام الثقافات الأولية لثقافات HRTEC و 3D-HRTEC لتقييم تأثير الاستراديول على تكاثر الخلايا عن طريق قياس دمج 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) في الحمض النووي للخلايا في المرحلة S من دورة الخلية14.

لعزل الخلايا الظهارية ، نبدأ من شظايا الكلى التي تم الحصول عليها من استئصال كلية الأطفال المشار إليها لتصحيح حالات المسالك البولية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافقت لجنة الأخلاقيات في المستشفى العام للنينيوس بيدرو دي إليزالدي على استخدام الأنسجة الكلوية البشرية لتطوير مزارع الخلايا الأولية لأغراض البحث. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من أقرب الأقارب أو الأوصياء نيابة عن الأطفال لاستخدام عينات الكلى للبحث.

ملاحظة: الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) مشتقة من مرضى الأطفال الذين يخضعون لعمليات استئصال الكلية ، ويشار إليها لتصحيح حالات المسالك البولية أو استئصال الورم ، في المستشفى العام للأطفال بيدرو دي إليزالدي في بوينس آيرس ، الأرجنتين.

1. تطوير الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC)

ملاحظة: يتم تشريح شظايا الكلى القشرية من الكلى التي يتم إزالتها من مرضى الأطفال الذين يخضعون لعمليات استئصال الكلية في المستشفى. يتم إجراء الثقافة الأولية ل HRTEC وفقا للطريقة الموضحة سابقا11.

يتم وصف البروتوكول في الخطوات التالية:

  1. احتفظ بجزء الكلى في الثلاجة في محلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) أو محلول هانكس المتوازن (هانكس) حتى تتم معالجته في المختبر.
  2. تشريح الكبسولة الكلوية بالملقط. افصل القشرة الكلوية عن النخاع وقطعها إلى أجزاء صغيرة يبلغ طولها حوالي 1 مم.
  3. لإجراء عملية الهضم ، ضع شظايا الكلى في محلول هانكس معقم بدون Ca2+ و Mg2+ ، مع استكمال 0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول.
    1. احتضان شظايا الكلى لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الرج.
  4. لوقف الهضم ، أضف حجما واحدا من PBS يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وغسل العينة ثلاث مرات بالطرد المركزي عند 160 × جم لمدة 10 دقائق لكل منها ، في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجات مئوية. في كل طرد مركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في نفس المحلول.
  5. مرر ناتج الهضم من خلال شبكة مسام 70 ميكرومتر لتصفية الأنابيب والتخلص من الكبيبات التي تبقى محتفظ بها في الفلتر.
  6. قم بالطرد المركزي للأنابيب المفلترة عند 160 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في محلول هانكس المعقم ، بدون Ca2+ و Mg2+ ، مع استكمال 0.2٪ كولاجيناز من النوع الأول.
    1. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الرج.
  7. لوقف الهضم ، أضف حجما واحدا من PBS يحتوي على 10٪ مصل بقري الجنين (FBS).
    1. اغسل العينة ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عند 160 × جم ، 10 دقائق لكل منها ، في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجات مئوية. في كل طرد مركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في نفس المحلول.
  8. بعد الطرد المركزي الأخير ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط الاستزراع الكامل (RPMI 1640 مكمل بنسبة 5٪ FBS ، L-glutamine [2 مليمول / لتر] ، البنسلين [100 وحدة / مل] ، ستربتومايسين [100 ميكروغرام / مل] ، ومكملات نمو الخلايا البطانية [ECGS ، 1٪]).
    1. قم بزرع معلق الخلية في قارورة ثقافة مقاس 25 سم2 بغطاء مفتح.
    2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  9. في اليوم التالي ، اغسل مزرعة الخلية 3 مرات ، وتخلص من السائل من القارورة ، وأضف 5 مل من PBS لكل منهما ، وأضف 5 مل من وسط الثقافة الكامل إلى القارورة. تقضي هذه الغسالات على خلايا الدم الحمراء والشظايا الأنبوبية التي لم يتم هضمها بالكامل ولم يتم ربطها بقارورة الزراعة.
  10. احتضان الخلايا الظهارية في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، مما يسمح لها بالنمو في طبقة أحادية التقاء.
  11. قم بتغيير الوسط بوسط ثقافة كامل طازج كل 3 أيام وراقب زراعة الخلية يوميا تحت المجهر المقلوب.

2. تطوير ثقافات HRTEC ثلاثية الأبعاد (3D-HRTEC)

ملاحظة: يوفر هذا القسم خطوات تطوير الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D-HRTEC). يتم تنفيذ ثقافات 3D-HRTEC وفقا للطريقة الموضحةسابقا 12.

  1. استخدم مصفوفة BM من ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm. يتم تسليم مصفوفة BM هذه مجمدة ، وفي هذه الحالة ، تظل صلبة. قم بإذابة محلول مصفوفة BM طوال الليل في حمام جليدي في الثلاجة عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
  2. قم بتبريد الأطراف في الفريزر قبل وضع مصفوفة BM واترك اللوحة متعددة الآبار على الجليد لمنع تصلب المصفوفة أثناء العملية.
  3. خذ كمية من مصفوفة BM السائلة (150 مل / سم2) وضعها في كل بئر من اللوحة لتغطية قاع البئر. احتضان اللوحة في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتحويل مصفوفة BM إلى حالة هلامية.
  4. وفي الوقت نفسه ، لفصل المزارع الأولية المتقاربة HRTEC ، تخلص من وسط الاستزراع من القارورة وأضف 1 مل من محلول 0.25٪ تريبسين و 0.02٪ محلول EDTA.
    1. انشر السائل على كامل سطح القارورة واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا.
    2. لاحظ تحت المجهر المقلوب ما إذا كانت جميع الخلايا قد انفصلت.
  5. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط الثقافة أو PBS ، وقم بتمريرها إلى أنبوب سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 160 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    1. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط مزرعة كامل يحتوي على نفس المكملات المستخدمة في الثقافات الأولية ل HRTEC.
    2. احسب عدد الخلايا في غرفة نيوباور.
  6. البذور 4 × 104 خلايا / 150 ميكرولتر لكل بئر على مصفوفة BM. احتضان مزرعة الخلايا لعدة أيام في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، في جو رطب و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  7. قم بتغيير الوسط كل يومين بوسط طازج.
  8. مراقبة تجميع الخلايا وتشكيل هياكل الشكل الأنبوبي تحت مجهر بصري مقلوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهرت الثقافات الأولية Confluent HRTEC مورفولوجيا مماثلة لوحظت تحت الفحص المجهري الضوئي (الشكل 1). تميزت الخلايا بالتألق المناعي كما هو موضح في منشوراتنا السابقة باستخدام الأجسام المضادة ضد أكوابورين 1 (AQP1) و PECAM CD319،12،13. أظهرت دراسات التألق المناعي أن أكثر من 90٪ من HRTEC كانت إيجابية ل AQP1 ، مما يدل على أن أصلها في النبيبات الكلوية القريبة البشرية. إلى جانب ذلك ، لم تكن أي من الخلايا إيجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يجب إجراء الثقافات الأولية في نفس يوم استئصال الكلية. يمكن استخدام الثقافات الأولية HRTEC بين 1-5 مقاطع لضمان الاستقرار المورفوجيني للخلايا. بعد المقطع الخامس ، تبدأ الخلايا في تغيير مورفولوجيتها ، وتظهر مظهرا يشبه الخلايا الليفية أو زيادة في الفجوات ، ويمكن أن تصبح هادئة.

إذا تم استخدام جزء أكبر من الكلى ، فقد يتداخل الحمض النووي المنبعث عن تحلل الخلية بعد الهضم مع عملية الغسيل. في هذه الحالة ، يوصى باستخدام كمية أكبر من محلول الهضم والغسيل. علاوة على ذلك ، ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لفريق جراحة المسالك البولية للأطفال في "Sección de Cirugía Pediátrica ، المستشفى العام للأطفال بيدرو دي إليزالدي ، بوينس آيرس ، الأرجنتين ، لتقديم عينات من الكلى. ودعم هذا العمل بمنح مقدمة إلى C. Silberstein من جامعة بوينس آيرس (UBACYT20020190100072BA) وإلى C Ibarra و C Silberstein من المجلس الوطني للبحث العلمي والتقني (CONICET: PUE 0041). وقد دعم هذا العمل جزئيا البرنامج الأيبيري الأمريكي للعلوم والتكنولوجيا (CYTED) (من خلال Red STEC/SUH Nº 224RT0152).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكولاجيناز من النوع الأولسيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية637958
تكملة نمو الخلايا البطانيةسيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية[إ2759]
مصفوفة غشاء الطابق السفلي MatrigelBD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية. سيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية356234
70 μ مرشح شبكة المسام MBD Bioscience ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةCSS010070
RPMI 1640 متوسط مع L-glutamine سيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةR8758-500 مل
هانكس محلول ملح متوازن   ؛ Ca2+ و Mg2+ مجاناجيبكو إنفيتروجين ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية14175046
حل Trypsin-EDTAسيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةتي 4049

المراجع

  1. Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
  2. Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11 (2), 174-192 (1973).
  3. Alconcher, L. F., et al. Hemolytic uremic syndrome associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli infection in Argentina: update of serotypes and genotypes and their relationship with severity of the disease. Pediatr Nephrol. 36 (9), 2811-2817 (2021).
  4. Alconcher, L. F., Lucarelli, L. I., Bronfen, S., Meni Battaglia, L., Balestracci, A. Dynamic evolution of kidney function in patients with STEC-hemolytic uremic syndrome followed for more than 15 years: unexpected changes. Pediatr Nephrol. 40 (1), 143-150 (2025).
  5. Monteverde, M. L., et al. A decrease in the incidence of Shiga toxin-related hemolytic uremic syndrome as a cause of kidney transplantation at an Argentine Referral Center. Pediatr Transplant. 27 (4), e14489(2023).
  6. Sandvig, K., van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J. 19 (22), 5943-5950 (2000).
  7. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga toxin mechanisms of action in renal disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  8. Karpman, D., et al. Apoptosis of renal cortical cells in the hemolytic-uremic syndrome: in vivo and in vitro studies. Infect Immun. 66 (2), 636-644 (1998).
  9. Pistone Creydt, v, Silberstein, C., Zotta, E., Ibarra, C. Cytotoxic effect of Shiga toxin-2 holotoxin and its B subunit on human renal tubular epithelial cells. Microbes Infect. 8, 410-419 (2006).
  10. Silberstein, C., Pistone Creydt, V., Gerhardt, E., Nuñez, P., Ibarra, C. Inhibition of water absorption in human proximal tubular epithelial cells in response to Shiga toxin-2. Pediatr Nephrol. 23, 1981-1990 (2008).
  11. Márquez, L. B., et al. Effects of Escherichia coli subtilase cytotoxin and Shiga toxin 2 on primary cultures of human renal tubular epithelial cells. PLoS One. 9, e87022(2014).
  12. Márquez, L. B., Araoz, A., Repetto, H. A., Ibarra, F. R., Silberstein, C. Effects of Shiga toxin 2 on cellular regeneration mechanisms in primary and three-dimensional cultures of human renal tubular epithelial cells. Microb Pathog. 99, 87-94 (2016).
  13. Sánchez, D. S., et al. Eliglustat prevents Shiga toxin 2 cytotoxic effects in human renal tubular epithelial cells. Pediatr Res. 91 (5), 1121-1129 (2022).
  14. Sánchez, D. S., et al. Estradiol stimulates cell proliferation through classic estrogen receptors and GPER-1 in human renal tubular epithelial cell primary cultures. Biochem Biophys Res Commun. 512, 170-175 (2019).
  15. Fernandez Miyakawa, M., Zabal, O., Silberstein, C. Clostridium perfringens epsilon toxin is cytotoxic for human renal tubular epithelial cells. Hum Exp Toxicol. 30, 275-282 (2011).
  16. Chen, J., et al. Cooperative application of transcriptomics and ceRNA hypothesis: ln cRNA-00742/miR-116 targets CD74 to mediate vanadium-induced mitochondrial apoptosis in duck liver. J Hazard Mater. 480, 135904(2024).
  17. Chen, J., et al. Copper toxicity in the liver of broiler chicken: insights from metabolomics and AMPK-mTOR mediated autophagy perspective. Poult Sci. 103 (9), 104011(2024).
  18. Zhang, T., et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep. Environ Pollut. 334, 122207(2023).
  19. Fujiki, K., et al. Blockage of Akt activation suppresses cadmium-induced renal tubular cellular damages through aggrephagy in HK-2 cells. Sci Rep. 14, 14552(2024).
  20. Joun, J. I. H., et al. Antioxidative effects of molybdenum and its association with reduced prevalence of hyperuricemia in the adult population. PLoS One. 19 (8), e0306025(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تطوير الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية في أحادية الطبقات وظروف ثلاثية الأبعاد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.