هنا ، نصف بروتوكولات الحصول على الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) من قشرة الكلى لتطوير طبقات أحادية وثقافات ثلاثية الأبعاد على مصفوفة خارج الخلية (3D-HRTEC).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطوير الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية في أحادية الطبقات وظروف ثلاثية الأبعاد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم عزل الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) من الكلى التي تمت إزالتها من مرضى الأطفال الذين يخضعون لعمليات استئصال الكلية المشار إليها من قبل وحدة أمراض الكلى للأطفال في المستشفى العام للأطفال بيدرو دي إليزالدي ، بوينس آيرس ، الأرجنتين. من الناحية المجهرية ، يتم تشريح قشرة الكلى الطبيعية من النخاع الكلوي وتقطيعها إلى شظايا. ثم يتم هضم الشظايا القشرية في محلول هانك مع استكمال 0.1٪ من الكولاجيناز من النوع 1 ويتم ترشيحها من خلال شبكة بحجم المسام 70 ميكرومتر لفصل الأنابيب الكلوية عن الكبيبات. تخضع الأنابيب الكلوية لعملية هضم ثانية مع الكولاجيناز لعزل الخلايا الظهارية. أخيرا ، يتم إيقاف هضم الإنزيم ، وتزرع الخلايا الظهارية في قوارير تحتوي على RPMI 1640 مع مكملات أقل من 5٪ ثاني أكسيد الكربون2عند 37 درجة مئوية حتى التقاء. يمكن زراعة خلايا HRTEC كطبقات أحادية على ألواح 96 بئرا ، أو أغطية زجاجية في ألواح 24 بئرا ، أو حاملات زراعة الخلايا المطلية بالكولاجين. أيضا ، يتم الحصول على ثقافات الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية ثلاثية الأبعاد (3D-HRTEC) من خلايا HRTEC المزروعة على مصفوفة الغشاء القاعدي (BM). تتم مراقبة تجميع الخلايا وتشكيل هياكل الشكل الأنبوبي. لقد استخدمنا الثقافات الأولية HRTEC لسنوات عديدة لدراسة التأثير السام للخلايا الناجم عن سم الشيجا في كلية الأطفال ، مما يؤدي إلى تغيرات فيزيولوجية مرضية تؤدي إلى متلازمة انحلال الدم اليوريمي (HUS). يمكن استخدام كل من ثقافات HRTEC و 3D-HRTEC لتقييم تأثيرات السموم المختلفة ، والأدوية الاصطناعية ، والعوامل البيولوجية ، والهرمونات ، وما إلى ذلك ، وتحديدا على ظهارة النبيبات الكلوية القريبة للإنسان.
المقدمة
في مجموعتنا ، تم استخدام الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) التي تم تطويرها في طبقات أحادية وفي ظروف ثلاثية الأبعاد (3D-HRTEC) لدراسة عمل السمية للخلايا لسم شيغا من النوع 2 (Stx2) الناجم بعد عدوى الجهاز الهضمي بالإشريكية القولونية المنتجة لسموم الشيغا (STEC).
Stx1 و Stx2 (Stxs) هما عوامل الفوعة الرئيسية ل STEC القادرة على التسبب في متلازمة انحلال الدم اليوريمية بعد الإسهال (HUS) 1. متلازمة انقطاع النفس الوراثي هي من المضاعفات الجهازية التي تصيب حوالي 5-10٪ من الأطفال المصابين ب STEC وتتكون من فقر الدم الانحلالي وقلة الصفيحات وإصابة الكلى الحا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافقت لجنة الأخلاقيات في المستشفى العام للنينيوس بيدرو دي إليزالدي على استخدام الأنسجة الكلوية البشرية لتطوير مزارع الخلايا الأولية لأغراض البحث. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من أقرب الأقارب أو الأوصياء نيابة عن الأطفال لاستخدام عينات الكلى للبحث.
ملاحظة: الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية البشرية (HRTEC) مشتقة من مرضى الأطفال الذين يخضعون لعمليات استئصال الكلية ، ويشار إليها لتصحيح حالات المسالك البولية أو استئصال الورم ، في المستشفى العام للأطفال بيدرو دي إليزالدي في بوينس آيرس ، الأرجنتين.
1. تطوير الثقافات الأولية للخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أظهرت الثقافات الأولية Confluent HRTEC مورفولوجيا مماثلة لوحظت تحت الفحص المجهري الضوئي (الشكل 1). تميزت الخلايا بالتألق المناعي كما هو موضح في منشوراتنا السابقة باستخدام الأجسام المضادة ضد أكوابورين 1 (AQP1) و PECAM CD319،12،13. أظهرت دراسات التألق المناعي أن أكثر من 90٪ من HRTEC كانت إيجابية ل AQP1 ، مما يدل على أن أصلها في النبيبات الكلوية القريبة البشرية. إلى جانب ذلك ، لم تكن أي من الخلايا إيجا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يجب إجراء الثقافات الأولية في نفس يوم استئصال الكلية. يمكن استخدام الثقافات الأولية HRTEC بين 1-5 مقاطع لضمان الاستقرار المورفوجيني للخلايا. بعد المقطع الخامس ، تبدأ الخلايا في تغيير مورفولوجيتها ، وتظهر مظهرا يشبه الخلايا الليفية أو زيادة في الفجوات ، ويمكن أن تصبح هادئة.
إذا تم استخدام جزء أكبر من الكلى ، فقد يتداخل الحمض النووي المنبعث عن تحلل الخلية بعد الهضم مع عملية الغسيل. في هذه الحالة ، يوصى باستخدام كمية أكبر من محلول الهضم والغسيل. علاوة على ذلك ، ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نحن ممتنون لفريق جراحة المسالك البولية للأطفال في "Sección de Cirugía Pediátrica ، المستشفى العام للأطفال بيدرو دي إليزالدي ، بوينس آيرس ، الأرجنتين ، لتقديم عينات من الكلى. ودعم هذا العمل بمنح مقدمة إلى C. Silberstein من جامعة بوينس آيرس (UBACYT20020190100072BA) وإلى C Ibarra و C Silberstein من المجلس الوطني للبحث العلمي والتقني (CONICET: PUE 0041). وقد دعم هذا العمل جزئيا البرنامج الأيبيري الأمريكي للعلوم والتكنولوجيا (CYTED) (من خلال Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الكولاجيناز من النوع الأول | سيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | 637958 | |
| تكملة نمو الخلايا البطانية | سيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | [إ2759] | |
| مصفوفة غشاء الطابق السفلي Matrigel | BD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية. سيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | 356234 | |
| 70 μ مرشح شبكة المسام M | BD Bioscience ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | CSS010070 | |
| RPMI 1640 متوسط مع L-glutamine | سيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | R8758-500 مل | |
| هانكس محلول ملح متوازن ؛ Ca2+ و Mg2+ مجانا | جيبكو إنفيتروجين ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | 14175046 | |
| حل Trypsin-EDTA | سيجما ميرك ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | تي 4049 |
المراجع
- Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
- Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
