يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس امتصاص الجلوكوز التناظري ، 6- (N- (7-Nitrobenz-2-Oxa-1،3-Diazol-4-yl) Amino) -6-Deoxyglucose ، في شبكية العين العصبية الفئران السليمة

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67921

⸱

مارس 14, 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

أنواع متعددة من الخلايا في شبكية العين ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، تعبر عن ناقلات الجلوكوز (GLUTs) لتمكين امتصاص الجلوكوز في الخلايا. باستخدام شبكية العين العصبية للفأر خارج الجسم الحي والجلوكوز الفلوري التناظري 6-NBDG ، نصف طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لقياس امتصاص الجلوكوز في شبكية الفأر بأكملها.

الملخص

شبكية العين عبارة عن نسيج استقلابي عالي مع أنواع متعددة من الخلايا تتطلب الجلوكوز ومشتقاته لإنتاج الطاقة في شكل ATP. تعبر خلايا الشبكية ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا العصبية والمستقبلات الضوئية والخلايا الدبقية عن ناقلات الجلوكوز (GLUTs ؛ على سبيل المثال ، GLUT1-4) لتمكين امتصاص الجلوكوز لإنتاج الطاقة. GLUT1 هو ناقل الجلوكوز الأكثر تعبيرا بكثرة في شبكية العين. يمكن هذا البروتوكول الباحثين من قياس امتصاص الجلوكوز في شبكية الفئران العصبية في ظروف خارج الجسم الحي باستخدام نظير الجلوكوز الفلوري 6- (N- (7-Nitrobenz-2-oxa-1،3-diazol-4-yl) amino) -6-Deoxyglucose (6-NBDG). بعد تشريح الشبكية ، يمكن تحديد إجمالي مستويات 6-NBDG في شبكية العين بسهولة عن طريق قياس نقطة النهاية الفلورية باستخدام قارئ الألواح. من أجل الاتساق ، نوصي بتطبيع النتائج إلى إجمالي مستويات البروتين. على الرغم من أن 6-NBDG محدد للغاية ل GLUT1 ، إلا أنه تم اكتشاف امتصاص هذا التناظرية في وجود مثبط GLUT1 BAY-876. على هذا النحو ، يوفر هذا الاختبار طريقة سريعة نسبيا وغير مكلفة لقياس امتصاص الجلوكوز خارج الجسم الحي في شبكية العين العصبية للفأر بالكامل ، والتي يتم بوساطة GLUT1 جزئيا.

المقدمة

الجلوكوز هو مستقلب أساسي للشبكية العصبية ، حيث يتم استخدامه لتغذية معدلات عالية من تحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا لإنتاج الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) 1. نظرا لأن الجلوكوز هو ركيزة الطاقة المفضلة ، فإن العديد من خلايا الشبكية تعبر عن ناقلات الجلوكوز (GLUTs) لتسهيل امتصاص الجلوكوز من الأوعية الدموية والأنسجة المحيطة2. تتكون GLUTs من عائلة من البروتينات السكرية الغشائية الجوهرية المسؤولة عن نقل الجلوكوز إلى خلايا الثدييات3. ناقل GLUT-1 (GLUT1) هو ناقل الجلوكوز الأساسي في شبكية العين ، ويتم التعبير عنه في جميع أنحاء طبقات الشبكية4 والخلايا البطانية الشعرية التي تشكل حاجز الدم والشبكية (BRB)5. ومن المثير للاهتمام ، في الأمراض التنكسية العصبية للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك مرض الزهايمر ، فإن انخفاض مستويات بروتين GLUT1 وامتصاص الجلوكوز يسبق ضمور الدماغ والخلل الوظيفي العصبي لدى البشر6،7. في نموذج الفئران لارتفاع ضغط الدم في العين ، لوحظت أيضا مستويات أقل من GLUT1 في الشعيرات الدموية8. ينطوي انخفاض نقل الجلوكوز إلى شبكية العين الخارجية على فقدان المستقبلات الضوئية في النماذج الحيوانية لالتهاب الشبكية الصباغي البشري وقد يلعب أيضا دورا في التنكس العصبي للشبكية ، مثل ذلك الذي لوحظ في الجلوكوما. لذلك ، يلزم فهم نقل الجلوكوز في شبكية العين العصبية لتحديد دوره في التنكس العصبي للشبكية.

هنا ، نصف طريقة كيميائية حيوية جديدة وغير مكلفة ومباشرة لقياس امتصاص 6-NBDG في شبكية العين العصبية الفئران خارج الجسم الحي ، أي باستثناء ظهارة الشبكية المصطبغة والمشيمية. بالمقارنة مع نظائر الفلورسنت الأخرى مثل 2-NBDG ، يتكون 6-NBDG من جزء من الجلوكوز تحل فيه مجموعة النيتروبنزوكسي ديازوأمينو الفلورية محل مجموعة الهيدروكسيل في الكربون 6 ، مما يمنع الفسفرة بواسطة الهيكسوكيناز والمزيد من الانهيار الأيضي9. على الرغم من أن 6-NBDG لديه خصوصية عالية ل GLUT1 ، مع تقارب ارتباط أعلى ب 300 مرة من الجلوكوز9 ، إلا أننا نكتشف امتصاص هذا التناظرية في وجود مثبطات GLUT110. على هذا النحو ، يوفر هذا الاختبار طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لقياس امتصاص الجلوكوز خارج الجسم الحي في شبكية الفأر بأكملها ، والتي يتم بوساطة GLUT1 جزئيا.

يعد قياس امتصاص الجلوكوز في الأنسجة في الوقت الفعلي أمرا صعبا ، وغالبا ما يتطلب وضع العلامات على النظائر المشعة أو طرق تصوير عالية الدقة. هنا ، نستخدم مقايسة كيميائية حيوية فلورية لتحديد امتصاص 6-NBDG بسرعة عبر عينات متعددة من الشبكية في ظروف خارج الجسم الحي . يوفر البروتوكول معلومات حول امتصاص الجلوكوز الكلي في الشبكية. لا يوفر معلومات حول مستويات امتصاص 6-NBDG الخاصة بخلايا الشبكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) التابعة للمركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1. التحضير للفحص

ملاحظة: يجب أن يتم التحضير في يوم الفحص مباشرة قبل إجراء الفحص. هذا ضروري بسبب طبيعة البروتوكول الحساسة للوقت.

  1. التحضير العام قبل التجربة
    ملاحظة: 6-NBDG حساس للضوء ويجب حمايته من الضوء. قم بتغطية جميع حلول 6-NBDG بورق الألمنيوم.
    1. حل مخزون 5 ملي مولار 6-NBDG في 50٪ DMSO / 1x PBS مستقر عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. قم بعمل حل مخزون وقم بتخزين 500 ميكرولتر من الحصص للمقايسات المستقبلية.
    2. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل من الوسائط العصبية القاعدية (بدون جلوكوز) على الثلج.
    3. تأكد من ضبط الحمام المائي على 37 درجة مئوية.
    4. تسمية 4 × 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لكل شبكية العين: 1) تجويع الجلوكوز ، 2) حضانة 6-NBDG ، 3) صوتنة ، و 4) أنبوب تجميع لعينة لفحص بيرس (على سبيل المثال ، إذا كان لديك أربعة شبكية العين في المجموع ، فستحتاج إلى 16 أنبوب طرد مركزي دقيق). انظر الشكل 1 للحصول على ملخص لإعداد الأنبوب.
    5. أضف 200 ميكرولتر من الوسط العصبي القاعدي A من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل على الجليد إلى أنابيب الصوتنة المسماة مسبقا واضبطها على الجليد للخطوة 2.5.4.
    6. قم بتشغيل قارئ اللوحة.
    7. قم بإعداد معلومات اللوحة في برنامج قارئ اللوحة باستخدام ميزة مقايسة نقطة النهاية الفلورية مع المعلمات التالية: الإثارة 483 نانومتر ، والانبعاث 550 نانومتر ، والقطع 530 نانومتر (المعلمات المحددة مسبقا ل 6-NBDG).
  2. تحضير الكاشف قبل التجربة: 6-NBDG
    1. اصنع محلولا عمليا ل 6-NBDG في الوسائط العصبية القاعدية A بتركيز نهائي قدره 500 ميكرومتر عن طريق تخفيف مخزون 5 ملي مولار المصنوع في الخطوة 1.1.1.
      ملاحظة: تذكر تغطية جميع حلول 6-NBDG بورق الألمنيوم. قم بعمل حجم مناسب من 500 ميكرومتر 6-NBDG حل العمل للفحص بأكمله (تحتاج إلى 200 ميكرولتر من محلول 6-NBDG العامل لكل شبكية العين ؛ قم بتضمين حجم إضافي للخطأ والمبالغ اللازمة لإنشاء حلول قياسية في الخطوة 2.4).
    2. ماصة 200 ميكرولتر من محلول العمل 6-NBDG في الأنابيب ذات العلامات المسماة مسبقا المصنوعة في الخطوة 1.1.4 لخطوة حضانة 6-NBDG.

2. تشغيل مقايسة الاستيعاب 6-NBDG

ملاحظة: انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة خطوة بخطوة.

  1. تشريح أنسجة الشبكية
    1. تخدير الفأر باستخدام تخدير الأيزوفلوران المستنشق (2٪ إيزوفلوران في 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ أكسجين).
      ملاحظة: تأكد من تخدير الماوس بشكل كاف عن طريق الضغط على وسادة القدم على كلتا القدمين الخلفيتين. إذا تم تخديره بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تكون هناك حركة اهتزاز (منعكس سحب الدواسة). إذا كانت هناك حركة انعكاسية، فارجع إلى الخطوة 2.1.1.
    2. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم متبوعا بقطع الرأس ثم استئصال العينين بسرعة. ضع العيون المنزوعة النواة في طبق بتري مملوء ب 5-10 مل من الوسائط العصبية القاعدية المثلجة (بدون الجلوكوز) على الثلج.
      ملاحظة: فيما يلي إرشادات أساسية لتشريح الشبكية العصبية (باستثناء ظهارة صبغة الشبكية والمشيمية) ؛ لمزيد من التعليمات والإرشادات المتعمقة ، راجع البروتوكول11 المنشور مسبقا واتبع قسم "تشريح شبكية الفأر".
    3. ضع طبق بتري تحت مجهر تشريح على الثلج.
    4. قم بطي منديل خال من النسالة في مربع صغير وبللها باستخدام وسائط Neurobasal A.
    5. انقل العين إلى منديل مبلل وخالي من النسالة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية مع قطع الطرف.
      ملاحظة: يوفر المنديل الخالي من النسالة احتكاكا متزايدا لمنع العين من الحركة أثناء التشريح.
    6. خذ إبرة 26 جم وثقب جانب القرنية الأمامي للطيف.
    7. استخدم مقص Vannas لقطع طول الطرف من نقطة الثقب لإزالة القرنية.
    8. بمجرد إزالة القرنية ، أمسك الصلبة في منتصف الطريق بين الأطراف ورأس العصب البصري باستخدام زوج من الملقط. باستخدام زوج آخر من الملقط في اليد المعاكسة ، أمسك العدسة وقم بإزالتها بسرعة بحركة واحدة سريعة.
      ملاحظة: إذا تمت إزالة العدسة ببطء ، فستظل شبكية العين ملتصقة بالعدسة ويصبح من الصعب تشريحها.
    9. انقل كوب العين إلى طبق بتري مع Neurobasal A البارد على الثلج.
    10. باستخدام الملقط في كلتا يديك ، خذ كوب العين وامسك الكوب بحذر في أورا سيراتا.
      1. لتحرير كوب الشبكية من الصلبة ، قم بتضييق الغلق على الصلبة باستخدام الملقط ، مع الحرص على عدم تثبيت أنسجة الشبكية.
      2. حرك الملقط بعناية بين الأنسجة الصلبة وأنسجة الشبكية حول الكرة الأرضية بأكملها حتى يتم تحرير شبكية العين بأكملها من الطرف.
    11. باستخدام مقص Vannas ، قم بعمل شق صغير في الصلبة عند الطرف.
    12. خذ ملقطا للاستيلاء على حواف الشق وتقشير الأنسجة الصلبة وصولا إلى منطقة رأس العصب البصري. أمسك الصلبة باستخدام ملقط في اليد غير المهيمنة وقم بتوجيه شبكية العين برفق بعيدا عن الصلبة باستخدام ملقط مغلق في اليد المهيمنة.
    13. قص رأس العصب البصري بالمقص لفصل الشبكية تماما عن الصلبة وأي عصب بصري متبقي.
    14. انقل شبكية العين باستخدام ماصة نقل مشذبة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المحضر مسبقا سعة 1.5 مل لتجويع الجلوكوز من الخطوة 1.1.4 ، والذي يحتوي على 200 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية A (بدون الجلوكوز) -1 شبكية العين لكل أنبوب.
  2. خطوة تجويع الجلوكوز
    1. انقل الأنابيب من الخطوة 2.1.14 إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. حضانة NBDG
    1. انقل كل شبكية إلى أنبوب جديد مسمى مسبقا لحضانة 6-NBDG من الخطوة 1.1.4 ، والذي يحتوي على 200 ميكرولتر من 500 ميكرومتر 6-NBDG في وسط عصبي قاعدي A من الخطوة 1.2.2.
      ملاحظة: يجب نقل شبكية العين باستخدام ماصة نقل تم قطعها لتكبير الطرف لنقل شبكية العين بأقل قدر من الضرر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن القيام بذلك باستخدام ملاقط إذا كنت واثقا من قدرة المرء على نقل شبكية العين دون ضرر.
    2. انقل الأنابيب إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  4. إعداد معايير 6-NBDG (نطاق التركيز 0 ميكرومتر -40 ميكرومتر)
    ملاحظة: إعداد المعايير خلال فترة حضانة 6 دقائق لمجموعة الدفاع الوطني (الخطوة 2.3.2). يمكن إعداد المعايير في درجة حرارة الغرفة. حماية المحاليل من الضوء.
    1. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل # 1-8 للمعايير الثمانية (انظر الشكل 3).
    2. بالنسبة للمعيار #1 (40 ميكرومتر 6-NBDG)، الماصة 32 ميكرولتر من محلول مخزون 500 ميكرومتر 6-NBDG المصنوع في الخطوة 1.2.1.
    3. أضف 368 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية A إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
    4. بالنسبة للمعايير # 2-8 ، قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل على النحو التالي:
      1. ماصة 200 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية في أنابيب # 2-8.
      2. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #1 وقم بوضعه في الأنبوب #2، ثم امزجه جيدا مع الماصة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      3. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي # 2 والماصة في الأنبوب القياسي # 3. تخلط جيدا مع الماصة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      4. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #3 وقم بتثبيته في الأنبوب #4، ثم امزجه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      5. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #4 وقم بتثبيته في الأنبوب #5، ثم اخلطه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      6. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #5 وقم بتثبيته في الأنبوب #6، ثم امزجه جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      7. خذ 200 ميكرولتر من الأنبوب القياسي #6 وقم بتثبيته في الأنبوب #7، ثم امزجه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      8. لا تضاف أي محلول إضافي إلى الأنبوب # 8 (على سبيل المثال ، يجب أن يحتوي على 200 ميكرولتر فقط من الوسائط العصبية القاعدية المضافة في الخطوة 2.4.4.1.).
  5. الغسيل والصوتنة والطرد المركزي لجمع العينات
    1. قم بإزالة جميع الأنابيب من الحمام المائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بمجرد اكتمال حضانة 6-NBDG لمدة 60 دقيقة.
    2. اغسل كل شبكية ب 500 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية المثلجة في أسرع وقت ممكن وبعناية.
      1. للغسيل ، قم بإزالة محلول 6-NBDG بماصة ، مع التأكد من عدم لمس أنسجة الشبكية أو إزعاجها.
        ملاحظة: هناك أيضا خيار لنقل شبكية العين بالملاقط من أنبوب حضانة 6-NBDG إلى أنبوب جديد يحتوي على 500 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية A. بعد ذلك ، ما عليك سوى القيام ب 3 غسلات إضافية. افعل ذلك إذا كنت مرتاحا لقدرتك على عدم إتلاف شبكية العين بالملاقط.
      2. ثم تخلص من المحلول في وعاء نفايات مناسب. ماصة على الفور 500 ميكرولتر من العصبي القاعدي البارد - وسيط في نفس الأنبوب لاستبدال المحلول الذي تمت إزالته. استبدل الأنابيب الموجودة على الثلج بين الغسل.
    3. كرر 3 مرات أخرى ليصبح المجموع 4 غسلات.
    4. باستخدام ماصة نقل ذات حافة أو ملاقط مشذبة ، انقل شبكية العين بعناية إلى أنابيب الصوتنة التي تحتوي على وسط عصبي قاعدي A على الجليد (انظر الخطوة 1.1.4).
    5. قطعي شبكية العين إلى قطع صغيرة باستخدام مقص تشريح صغير.
      ملاحظة: تأكد من غسل الأدوات في الإيثانول بين تقطيع كل شبكية حتى لا تلوث العينات الأخرى.
    6. قم بتقطيع كل شبكية العين لمدة 5-10 ثوان على سعة 10 وضعها على الفور مرة أخرى على الجليد.
      ملاحظة: تأكد من تنظيف مسبار الصوتنة بين العينات مع الإيثانول 100٪ متبوعا ب H2O عالي النقاء. في هذه المرحلة ، إما أن تبرد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية أو استخدم جهاز الطرد المركزي في غرفة باردة 4 درجات مئوية إذا كان ذلك متاحا.
    7. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند السرعة القصوى 21130 × go r إذا كانت أقل من 21130 × جم.
      ملاحظة: أثناء جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في الخطوة 2.5.7، تم إدخال الماصة سعة 100 ميكرولتر من المعايير #1-8 في الخطوة 2.4 في صفيحة سوداء وشفافة ذات 96 بئرا قاعية.
  6. قراءة العينات على قارئ اللوحة
    1. بعد انتهاء جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة، قم بإزالة 100 ميكرولتر من المادة الطافية والماصة في اللوحة المكونة من 96 بئرا.
    2. أدخل اللوحة في قارئ الألواح.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي اللوحة على 100 ميكرولتر من كل عينة و 100 ميكرولتر من كل معيار.
    3. في برنامج قارئ اللوحة، حدد مقايسة نقطة نهاية التألق مع تحديد المعلمات المحددة في الخطوة 1.1.7.
    4. قم بتشغيل الفحص واحفظ النتائج.
    5. عينات من الماصة من صفيحة 96 بئرا في الأنابيب المسماة مسبقا من 1.1.4 لمقايسة بيرس.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن فحص العينات على الفور بحثا عن البروتين (انظر أدناه) أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
  7. اختبار بيرس لتطبيع البروتين
    ملاحظة: يجب تشغيل مقايسة بيرس بشكل مكرر (كل من المعايير والعينات) لزيادة الدقة.
    1. باستخدام معايير فحص البروتين المخفف مسبقا لمقايسة بيرس، قم بتعبئة 10 ميكرولتر من كل منها في صفيحة سفلية شفافة سعة 96 بئرا.
    2. الماصة 10 ميكرولتر من كل عينة مكررة من الخطوة 2.6.5 في الصفيحة المكونة من 96 بئرا.
    3. أضف 150 ميكرولتر من كاشف بيرس إلى جميع الآبار التي تحتوي على معايير أو عينات. غطي الطبق المكون من 96 بئرا واخلطيهم على شاكر طبق بسرعة متوسطة لمدة 1 دقيقة.
    4. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
    5. أدخل اللوحة في قارئ الألواح. حدد مقايسة نقطة نهاية الامتصاص واضبط الطول الموجي على 660 نانومتر.
    6. قياس امتصاص المعايير والعينات وحفظ النتائج. احسب إجمالي بروتين الميكروغرام في كل عينة عن طريق رسم منحنى قياسي.
  8. حساب امتصاص الشبكية 6-NBDG.
    ملاحظة: يجب تطبيع نتائج 6-NBDG إلى محتوى البروتين الكلي بسبب الأحجام غير المتكافئة لشبكية العين.
    1. باستخدام قيم شدة التألق التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.6 ، استخدم قراءات التألق من المعايير المحددة مسبقا لرسم منحنى قياسي مضان 6-NBDG وتحديد تركيز 6-NBDG (ميكرومتر) في كل عينة.
    2. تطبيع نتائج العينة إلى كميات البروتين المقابلة لتحديد [6-NBDG] ميكرومتر / ميكروغرام بروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 4 قياسات مضان الجلوكوز التمثيلية من شبكية الفأر WT المحتضنة ب 6-NBDG لفترات زمنية مختلفة. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، كانت مستويات 6-NBDG في المتوسط 336 ± 27.91 وحدة فلكية ، بينما بعد 60 دقيقة ، زادت مستويات 6-NBDG إلى متوسط 616.3 ± 8.38 AU. أدى الحضانة الأخرى لمدة 30 دقيقة إلى انخفاض مستوى 6-NBDG (506.4 ± 5.3 وحدة فلكية). في 60 دقيقة ، كان التباين في النتائج عند الحد الأدنى وبالتالي تم اختياره كوقت مثالي لحضانة شبكية العين باستخدام 6-NBDG. لاحظ أن الوحدات تعسفية وأن هذه النتائج لم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

باختصار ، تمكن الطريقة الموصوفة باحثي العلوم الأساسية من قياس امتصاص نظير الجلوكوز الفلوري ، 6-NBDG ، في شبكية العين العصبية الفئران خارج الجسم الحي . الجلوكوز هو مستقلب أساسي للشبكية العصبية ، ويدعم امتصاصه المعدلات العالية لتحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا اللازمين لإنتاج الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) 1. نظرا لأن الجلوكوز هو ركيزة الطاقة المفضلة ، فإن العديد من خلايا الشبكية تعبر عن ناقلات الجلوكوز (GLUTs) لتسهيل امتصاص الجلوكوز من الأوعية ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من خلال أموال الإدارات غير المقيدة الممنوحة إلى Lauren K. Wareham.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 5 ملقطKatenaK5-6550تستخدم لتشريح شبكية
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة Thermo Fisher Scientific05-408-129
26 جم × 5/8 بوصة إبرةsol-M112658تستخدم لثقب القرنية أثناء تشريح
أنابيب 5 مل MTCbioc2540
50 ملAvantor بواسطة VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106الفلورسنت gucose التناظرية
96 لوحة بئر سوداء مع قاع واضحThermo Fisher Scientific265301
مخدر فلتر الفحم علبةReFreshEZ-258تستخدم في إعداد التخدير
BAY-876Millipore SigmaSML1774لتثبيط GLUT1.
جهاز طرد مركزي عند 4 درجات ؛ CEppendorfEPP-5424
غاز مضغوط (5٪ ثاني أكسيد الكربون ، 95٪ أكسجين)AirgasUN3156يستخدم في التخدير إعداد
ملقط منحنيRoboz أداة جراحيةRS-5137تستخدم لتشريح شبكية
العين DDH2< / sub>OElga LabWaterElga PureLab Ultraتستخدم بعد الإيثانول لتنظيف جهاز الصوتنة بين العينات
تشريح المجهرأوليمبوسszX12يستخدم لتشريح شبكية
200 دليلعلى مختبرات ديكون2701لاستخدامها لتنظيف جهاز الصوتنة بين العينات
رف أنبوب عائم رغويثيرمو فيشر العلمي36-099-2328للأنابيب أثناء الحضانة في خطوات الحمام المائي
مقص عامأداة جراحية روبوزRS-680تستخدم لشبكية العين تشريح
Isoflurane 250 مل زجاجةPiramal للرعاية الحرجةNDC   6679401725معدات التخدير
IsofluraneVetequip التي تباع بواسطة VWR89012-492تستخدم للتخدير قبل القتل الرحيم
مناديل كيم المبللةVWR82003-820
قارئ الصفيحة الدقيقةالأجهزة الجزيئيةSpectraMax M2 قارئ الصفيحةالدقيقة يستخدم لقراءة عينة
Neurobasal- A mediaGibco12349-015
مخروط الأنف (منخفض قناع التخدير الشخصي)Kent ScientificSOMNO-0801يستخدم لإيصال anethesia
الهدف على تشريح المجهرOlympusDF plapo 1x pfالمستخدم لتشريح شبكية
العين طبق بتريVWR25384-088يستخدم أثناء تشريح شبكية
العين كاشف فحص بيرسThermo Fisher Scientific1861426
أطراف الماصة P20Olympus بلاستيك26-404
أطراف ماصة P200 ، P1000 ، P10 XLVWR76322-150 ، 76322-154 ، 76322-132
ماصات الماصات P200 ، P1000 ، P20 ، P10VWRF144055M ، F144056M ، F144058M ، F144059M
برنامج SoftMax Pro على الكمبيوترالأجهزة الجزيئيةبرنامج SoftMax Pro 7يستخدم لقراءة عينة
مزيل صوتThermo Fisher عينة FB50110 علميةسونيكات (شبكية العين)
ماصات نقلفيشربراند13-711-9AMتستخدم لنقل شبكية العين من أنبوب إلى آخر
مقص زنبركي فاناسكاتيناK4-5000يستخدم لتشريح شبكية
حمام مائي ضبط على 37 درجة ؛ CN / AN / Aتستخدم للحضانة
العين العين من العين

المراجع

  1. Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881(2021).
  2. Daniele, L. L., et al. Glucose uptake by GLUT1 in photoreceptors is essential for outer segment renewal and rod photoreceptor survival. FASEB J. 36 (8), e22428(2022).
  3. Fernandes, R., Hosoya, K. -I., Pereira, P. Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).
  4. Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels. Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).
  5. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15 (4), 261-273 (1999).
  6. Winkler, E. A., et al. GLUT1 reductions exacerbate Alzheimer's disease vasculo-neuronal dysfunction and degeneration. Nat Neurosci. 18 (4), 521-530 (2015).
  7. Mosconi, L., et al. Hypometabolism exceeds atrophy in presymptomatic early-onset familial Alzheimer's disease. J Nucl Med. 47 (11), 1778-1786 (2006).
  8. Moreno, M., et al. Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model. Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).
  9. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. J Neurochem. 109 (s1), 94-100 (2009).
  10. Hamilton, K. E., Bouwer, M. F., Louters, L. L., Looyenga, B. D. Cellular binding and uptake of fluorescent glucose analogs 2-NBDG and 6-NBDG occurs independent of membrane glucose transporters. Biochimie. 190, 1-11 (2021).
  11. Feigenspan, A., Babai, N. Z. Preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies. J Vis Exp. 119, e55173(2017).
  12. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nat Commun. 6 (1), 6807(2015).
  13. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  14. Wareham, L. K., et al. Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments. Mol Neurodegener. 17 (1), 23(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

امتصاص الجلوكوزنظير الجلوكوز الفلوريامتصاص 6-NBDGتشريح الشبكيةمقايسة قارئ الأطباقناقلات الجلوكوزمثبط GLUT1تسوية البروتينشبكية خارج الجسم
قياس امتصاص الجلوكوز التناظري ، 6- (N- (7-Nitrobenz-2-Oxa-1،3-Diazol-4-yl) Amino) -6-Deoxyglucose ، في شبكية العين العصبية الفئران السليمة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.