تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا ل PmbExM ، وهي تقنية مجهرية تمدعية مصممة خصيصا للأغشية الحيوية Proteus mirabilis . يستخدم PmbExM معالجة إنزيمية تدريجية لعينات الأغشية الحيوية لتحقيق توسع متناحي بمقدار 4.3 أضعاف ، مما يتيح تحليلا فائق الدقة للتنظيم المكاني للهياكل الخلوية وتحت الخلوية داخل هذه المجتمعات الميكروبية اللاطئة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير فائق الدقة للفيلم الحيوي Proteus mirabilis بواسطة الفحص المجهري التوسعي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الوصول إلى المعلومات المرئية التفصيلية والبيانات الكمية من العينات الميكروبيولوجية باستخدام الفحص المجهري البصري التقليدي محدود بحاجز الانعراج. أحد الحلول لتحسين الدقة هو الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، وهي تقنية مبتكرة وفعالة من حيث التكلفة فائقة الدقة تعمل على تكبير العينات فعليا بحوالي أربعة أضعاف حجمها الأصلي. من أجل التوسع الناجح ، من الضروري تجانس الخواص الميكانيكية للمادة البيولوجية. الأغشية الحيوية هي مجتمعات بكتيرية ، تلتصق بسطح ومدمجة في مصفوفة خارج الخلية تنتجها. إنها تتطلب تكييف بروتوكولات ExM لاستيعاب مكوناتها الهيكلية الفريدة. تقدم هذه المقالة Proteus mirabilis biofilm ExM (PmbExM) ، وهو نوع متخصص من ExM يتيح التصور فائق الدقة ل P. mirabilis الأغشية الحيوية المزروعة لمدة 48 ساعة. يركز البروتوكول على التحلل المستهدف للمكونات الهيكلية الرئيسية للعينات من خلال عمليات الهضم الأنزيمية التسلسلية ، المحسنة بالقرب من ظروفها النظرية. يستخدم PmbExM مزيجا من الإنزيمات ، بما في ذلك α-الأميليز ، والسيلولاز ، والليتيكاز جليكوزيد-هيدرولاز للتحلل المائي للسكاريد. ميتانوليسين للتحلل المائي الببتيدوغليكان. والبروتيناز K للتحلل المائي للبروتين. إجراءات الهضم هذه مستقلة عن عملية الهلام ، مما يسمح للتعديلات بتلبية متطلبات التجانس المحددة في نماذج الأغشية الحيوية المختلفة. توفر هذه القدرة على التكيف إمكانات كبيرة للتطبيق عبر مختلف الأنواع البكتيرية وظروف النمو. تم تطبيق ExM على أنواع مختلفة من الأغشية الحيوية مع عوامل تمدد عامة دون المستوى الأمثل. في المقابل ، يحقق PmbExM الحد الأقصى لعامل التمدد النظري لهيدروجيل الأكريلاميد الأكريليت القياسي ExM ، دون تشويه كبير في التشكل أو الطوبولوجيا. الهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول فائق الدقة يمكن الوصول إليه لتصور البنية والتجميع والميزات الخلوية وداخل الخلايا ل P. mirabilis الأغشية الحيوية.
المقدمة
الفحص المجهري الفلوري هو أداة مستخدمة على نطاق واسع لدراسة بنية الأغشية الحيوية وتكوينها ووظيفتها1. ومع ذلك ، فإن قدرة الفحص المجهري البصري على حل السمات الهيكلية والخلوية وتحت الخلوية للأغشية الحيوية محدودة بحاجز الحيود. الفحص المجهري التوسعي (ExM) هو تقنية مبتكرة ويمكن الوصول إليها وسهلة الاستخدام فائقة الدقة ولديها إمكانات كبيرة للكشف عن بنية الأغشية الحيوية بما يتجاوز حد الحيود2،3. يعزز ExM الدقة عن طريق توسيع العينات البيولوجية بشكل متناحي الخواص تقريبا أربعة أضعاف حجمها الأصلي. تتضمن الطريقة البلمرة في الموقع لهيدروجيل أيوني منتفخ في جميع أنحاء العينة والحفاظ على الترتيب المكاني النسبي للأهداف الجزيئية عند تطبيقها بعناية4،5.
لكي يعمل ExM بشكل صحيح ، يعد تجانس الخواص الميكانيكية للمادة البيولوجية خطوةحاسمة 6. تم تطوير متغيرات ExM القياسية على مزارع وأنسجة خلايا الثدييات ، حيث حققت التجانس بكفاءة فقط من خلال الهضم المحلل للبروتين K4،5 أو تمسخ البروتين الناعم مع المنظفات والتعقيم7 ، مما أدى إلى توسع متناحي 4 أضعاف. ومع ذلك ، في حالة البكتيريا والأغشية الحيوية البكتيرية ، فإن جدار الخلية الببتيدوغليكان وعناصر مصفوفة EPS ، مثل السكريات الهيكلية ، هي عقبات أمام التمدد 2،3،8،9.
توضح هذه المقالة إجراءات الفحص المجهري لتوسيع الأغشية الحيوية Proteus mirabilis (PmbExM) ، وهو متغير ExM مصمم خصيصا لتوسيع الأغشية الحيوية ل P. mirabilis، وهي عصية سالبة الجرام ذات صلة سريريا مرتبطة بمقاومة عالية للمضادات الحيوية والتهابات المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة10. يستخدم PmbExM مزيجا من العلاجات الأنزيمية mutanolysin و α-amylas و cellulase و lyticase و proteinase K لتحلل جدار الخلية الببتيدوغليكان والسكريات والبروتينات ، على التوالي. توضح النتائج أن هذه الطريقة تحقق تمدد متناحي بمقدار 4.3 أضعاف من P. mirabilis البالغ عمرها 48 ساعة. تتيح هذه التقنية التصور فائق الدقة ل P. mirabilis هندسة الأغشية الحيوية والتجميع والميزات داخل الخلايا من خلال تلطيخ مزدوج3. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف PmbExM مع نماذج الأغشية الحيوية الأخرى عن طريق ضبط علاجات الإنزيم لاستهداف مكونات الأغشية الحيوية الخاصة بالأنواع.
الهدف من هذه المقالة هو تقديم وصف تفصيلي للإجراءات المتبعة في الهلام والهضم والتوسع وتركيب عينات الأغشية الحيوية ل PmbExM. بالإضافة إلى ذلك ، يحدد هذا العمل ظروف نمو البكتيريا وتنسيقات العينات وتقنيات تلوين الفلورسنت التي يستخدمها المؤلفون ، جنبا إلى جنب مع روتين معالجة البيانات وتحليلها الذي يمكن تطبيقه بسهولة من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة في معالجة الصور. للحصول على دليل أكثر شمولا وتعمقا حول معالجة الصور وتحليلها ، يرجى الرجوع إلى Castagnini، D. et al.3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم تلخيص العملية الشاملة ل PmbExM في الشكل 1. يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 1 للعثور على تكوين جميع المحاليل المسماة (مثل محلول المونومر ، محلول هضم البروتيناز K ، إلخ) المستخدمة في هذا العمل. وبالمثل ، ارجع إلى الملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 والملف التكميلي 4 للحصول على روتين مبسط لمعالجة البيانات وتحليلها يمكن استخدامه من قبل الباحثين الذين ليس لديهم خبرة واسعة في معالجة الصور. يمكن تنفيذ البروتوكول بشكل مريح على مدى 2.5-3 أسابيع: الأسبوع الأول المخصص لتنظيف الغطاء وتعقيمه ، ونمو الأغشية الحيوية ، وتثبيت العينة. الأسبوع الثاني لأخذ عينات من التلوين وبروتوكول PmbExM نفسه ، والثالث لتركيب العينة والحصول على الصور. بالإضافة إلى ذلك ، ضع في اعتبارك أسبوعا واحدا من الاستعدادات المسبقة للمواد والحلول المطلوبة. يتم سرد تفاصيل حول الكواشف والمواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.
الشكل 1: التثبيت والبلمرة والهضم وغسيل الكلى لبروتوكول PmbExM من أجل التوسع والمراقبة والتحليل الناجح ل P. mirabilis الأغشية الحيوية. يحدد العمود الأيسر ست حالات من العينة في خطوات محددة أثناء بروتوكول التوسيع. يبدأ من عينة الأغشية الحيوية الثابتة والمنفذة والملطخة ، بعد أربع حالات وسيطة حتى الحالة الهلامية والموسعة النهائية ، وجاهزة للفحص المجهري وتحليل الصور بدقة فائقة. تظهر مصفوفة EPS للأغشية الحيوية باللون الأخضر ، ويتم تمثيل جدار الخلية البكتيرية بخطوط أرجوانية ، ويظهر الهيكل العام لخلية البروتين باللون الرمادي ، ويتم عرض بوليمر الأكريلاميد الأكريليت ExM كخطوط زرقاء متموجة. يتم تمثيل جميع الإنزيمات المشاركة في العملية برموز Pac-Man: 3 جليكوسيد هيدرولاز (أخضر) للتحلل المائي لعديد السكاريد الخارجي: α-الأميليز ، السليلاز ، والليتيكاز. mutanolysin (أرجواني) لتدهور جدار الخلية الببتيدوغليكان. والبروتيناز K (الرمادي) لهضم البروتين العام. تتطابق ألوان رموز Pac-Man مع الهياكل المستهدفة المعنية. تمثل جميع الكائنات المعروضة بالتعتيم المنخفض أو الحدود المتقطعة حالة من التدهور الأنزيمي. تم تعديل هذا الشكل من Castagnini، D. et al.3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. تنظيف وتعقيم الأغطية الزجاجية لتشكيل الأغشية الحيوية
- ينزلق غطاء زجاجي بالموجات فوق الصوتية مقاس 12 مم في هيدروكسيد الصوديوم 1 متر لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم يشطف بالماء المنزوع الأيونات بكثرة.
- الموجات فوق الصوتية الغطاءات في 70 ٪ (الخامس / الحجم) الإيثانول لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اشطفها بنسبة 95 ٪ (الخامس / الحجم) الإيثانول.
- اترك الغطاء يجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
- تعقيم عن طريق التعقيم.
2. نمو الأغشية الحيوية Proteus mirabilis
- ازرع P. mirabilis في 10 مل من مرق Luria Bertani (LB) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية دون رج.
ملاحظة: تم الحصول على سلالة من النوع P . mirabilis المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) واستخدامها في هذه الدراسة ، ولكن يتم تشجيع استخدام أي سلالة P. mirabilis متاحة بسهولة. - خذ 1 مل من المزرعة وأضفه إلى 9 مل من مرق LB الطازج والمعقم لتوليد تعليق بكتيري من 1:10 مخفف.
- تحقق من الكثافة البصرية (OD) عند 600 نانومتر من التعليق البكتيري 1:10 ليكون 0.1. اضبط إذا لزم الأمر عن طريق إضافة كميات صغيرة من LB الطازج أو P. mirabilis مزرعة حتى تصل إلى OD600 = 0.1.
- أدخل أغطية زجاجية مقاس 12 مم (تم تنظيفها وتعقيمها مسبقا) في صفيحة بئر بوليسترين 24 معقمة (غطاء واحد لكل بئر).
ملاحظة: تأكد من أن سطح الغطاء بالكامل يلامس قاع البئر. سوف يتشكل الأغشية الحيوية على جانب الغطاء الذي يواجه لأعلى. - بذر آبار الصفيحة ب 350 ميكرولتر من OD600 = 0.1 تعليق بكتيري.
ملاحظة: يوصى بزرع الآبار الداخلية للصفيحة فقط ، مع ملء الآبار الخارجية (أي الآبار في الصفين A و D وفي العمودين 1 و 6) بالماء المعقم أو مرق LB. وذلك لأن الآبار الخارجية عرضة لمعدلات تبخر سائل أعلى من الآبار الداخلية ، مما يؤثر على نمو الأغشية الحيوية. - ضع الصفيحة المصنفة داخل حاضنة وضعها بزاوية 45 درجة.
ملاحظة: استخدم مواد مختبرية شائعة مثل أنابيب أجهزة الطرد المركزي سعة 50 مل أو صناديق أطراف الماصات الدقيقة. سيسمح الوضع المائل بتكوين واجهة هواء سائلة على سطح الغطاء الذي ينشئ فيه P . mirabilis الأغشية الحيوية منطقته السميكة. - اسمح للأغشية الحيوية بالتشكل لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، دون اهتزاز.
ملاحظة: إعداد نمو الأغشية الحيوية هذا غير مناسب لأوقات الحضانة التي تزيد عن 48 ساعة بسبب جفاف الأغشية الحيوية بسبب تبخر الوسط.
3. تثبيت عينة الأغشية الحيوية وتخزينها
- قم بإزالة وسط الاستزراع بعناية من الآبار واغسل الغطاء الحامل للأغشية الحيوية برفق مرتين باستخدام محلول ملحي معقم من الفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تحريك خفيف جدا.
ملاحظة: تجنب تدمير الأغشية الحيوية مع تبادل السوائل المتكرر باستخدام كميات صغيرة للحضانات أو الغسيل. 300-400 ميكرولتر من السائل يكفي لغمر الأغشية الحيوية في صفيحة 24 بئرا. يقترح بشدة سحب العينات البطيء والمنهجي ، بالإضافة إلى تجنب ضرب الأغشية الحيوية مباشرة مع المحاليل المتبادلة. - قم بإزالة PBS بعناية واستبدله ب 400 ميكرولتر من 4٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد (PFA) في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الأغشية الحيوية.
- قم بإزالة PFA واستبدله ب 300 ميكرولتر من 1٪ PBST (1٪ v / v Triton X-100 في PBS) لنفاذية الخلية. احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- استبدل محلول PBST بنسبة 1٪ ب 300 ميكرولتر من ٪0.3 PBST (3٪ حجم/حجم Triton X-100 في PBS). احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة 0.3٪ PBST واستبدله ب 300 ميكرولتر من خليط 50:50 من الميثانول و 0.3٪ PBST لتجفيف العينة. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم استبدل الخليط ب 1 مل من الميثانول المطلق.
ملاحظة: أضف 1 مل من الميثانول ببطء ، ووجهه إلى جدران البئر. يتم استخدام هذا الحجم الأكبر من الميثانول لمنع تبخره الكامل أثناء تخزين العينة. - قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية لمدة يوم واحد على الأقل وحتى شهر.
ملاحظة: يوصى بإغلاق الألواح باستخدام غشاء شمع مرن لتأخير تبخر الميثانول وجفاف العينات. - عند الاستخدام ، أعد ترطيب العينات بالتتابع عن طريق استبدال الميثانول ب 300 ميكرولتر من خليط 50:50 من الميثانول و 0.3٪ PBST ، ثم ب 300 ميكرولتر 0.3٪ PBST ، في درجة حرارة الغرفة.
4. تلطيخ الفلورسنت Biofilm
- احتضان عينات الأغشية الحيوية المعاد ترطيبها ب 300 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل من تراص الليكتين الفلوري لجنين القمح وجنين القمح (يشار إليه فيما يلي باسم WGA المترافق ؛ انظر جدول المواد) في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلوين جدار الخلية / الكبسولة / عديدات السكاريد الخارجية.
ملاحظة: يرجى الاطلاع على الموضوعات ذات الصلة المتعلقة بتلطيخ الفلورسنت في قسم المناقشة. من الآن فصاعدا ، قم بحماية العينات من الضوء. - قم بإزالة محلول WGA المترافق واغسله برفق مرتين باستخدام 300 ميكرولتر من PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. خطوات PmbExM
- MA-NHS التثبيت وبلمرة الأكريلاميد الأكريليت
- احتضان عينات الأغشية الحيوية الملطخة ب 400 ميكرولتر من 1 ملي مولار من حمض الميثاكريليك N-hydroxysuccinimidyl ester (MA-NHS) في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض خفيف.
ملاحظة: MA-NHS هو إستر منشط عرضة للتحلل المائي في وسط مائي ، لذا قم بمعالجة العينات مباشرة بعد تحضير محلول 1 ملي مولار في PBS. - قم بإجراء ثلاث غسلات لطيفة لمدة 10 دقائق مع 300 ميكرولتر من PBS في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة PBS واستبدله ب 300 ميكرولتر من محلول المونومر. احتضان بين عشية وضحاها (O.N.) عند 4 درجات مئوية.
- قم ببناء الغرف المسبقة للهلام. استخدم شريحة زجاجية كقاعدة وضع عليها قطعتين من الشريط المطوي على الوجهين لتكون بمثابة فواصل 400 ميكرومتر. رتب الفواصل 8-10 مم من بعضها البعض.
ملاحظة: انظر الشكل 2 أ لمزيد من الوضوح حول كيفية بناء غرفة التبلور المسبقة. كان سمك الشريط على الوجهين المستخدم هنا حوالي 100 ميكرومتر ، لذلك تم قصه وطيه على نفسه لإنشاء فواصل 3 مم × 5 مم × 0.4 مم. قم بقياس سمك الشريط المتاح على الوجهين وترتيبه وفقا لذلك. امتصاص محلول التبلور بواسطة فواصل الشريط لا يكاد يذكر. كبديل للشريط على الوجهين ، يمكن لصق أغطية زجاجية مستديرة مقاس 12 مم مع قطرات من الماء وتكديسها حتى الارتفاع المطلوب. - رتب غرف مبللة لحماية العينات أثناء البلمرة من الجفاف.
ملاحظة: يمكن تحويل صندوق مشترك من أطراف الماصات الدقيقة بسهولة إلى حجرة مبللة عن طريق إزالة السقالة البلاستيكية للأطراف واستبدالها بمناشف ورقية مبللة. - قم بإعداد حجم مخزون جديد من محلول التبلور عن طريق خلط كميات محلول المونومر جيدا ، 10٪ (وزن / حجم) N ، N ، N '، N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) ، 0.5٪ (وزن / حجم) 4-هيدروكسي تيمبو (4-HT) و 10٪ (وزن / حجم) بيرسلفات الأمونيوم (APS) بنسبة 47: 1: 1: 1 ، على التوالي. امزج APS مع بقية كواشف محلول التبلور فقط عند الانتهاء من الخطوات حتى 5.1.5.
ملاحظة: يعتمد الحجم الإجمالي لمحلول تبلور المخزون المراد تحضيره على كمية عينات الأغشية الحيوية التي تتم معالجتها. على سبيل المثال ، لمعالجة ثلاث عينات من الأغشية الحيوية ، قم بإعداد 900 ميكرولتر من محلول التبلور عن طريق خلط 846 ميكرولتر من محلول المونومر مع 18 ميكرولتر من 10٪ (وزن / وزن) TEMED ، و 18 ميكرولتر من 0.5٪ (وزن / وزن) 4-HT و 18 ميكرولتر من 10٪ (وزن / وزن) APS. لمنع البلمرة المبكرة ، APS يجب أن تضاف أخيرا إلى المزيج وفقط عندما تكون العينات والغرف المسبقة للهلام والغرف الرطبة جاهزة للاستخدام. حافظ على جميع الكواشف المذكورة ومحلول التبلور المعد مؤخرا المبرد خلال هذه الخطوة. - مباشرة بعد تحضير محلول التبلور ، قم بإزالة محلول المونومر برفق واستبدله ب 300 ميكرولتر من السابق. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- أثناء استمرار الخطوة 5.1.7 ، قم بإزالة الغطاء الواقي المتبقي لخطوط الشريط على الوجهين المرتبة على الشرائح الزجاجية ، وفي الفراغ بينهما ، ضع 40 ميكرولتر من محلول التبلور.
- بعد انتهاء الخطوة 5.1.7 ، قم بإزالة كل غطاء يحمل الأغشية الحيوية من بئره وضعه فوق قطرة 40 ميكرولتر من محلول التبلور الذي تم وضعه مسبقا على شريحة زجاجية. قم بتوجيه الغطاء بحيث يلامس الأغشية الحيوية الموجودة على سطحه محلول التبلور.
- قم بإنهاء بناء حجرة التبلور عن طريق الضغط برفق على الغطاء الحامل للأغشية الحيوية باستخدام ملاقط لتأمين التصاقها بفواصل الشريط على الوجهين.
ملاحظة: يتكون هذا الإعداد الشبيه بالساندويتش مما يسمى بغرفة التبلور (الشكل 2 ب). - دع العينات تتبلمر داخل غرفة مبللة وتحتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية دون تحريض.
- تصور العينات تحت الفحص المجهري الفلوري (انظر الخطوة 6.2.1) دون تفكيك غرف التبلور لالتقاط صورة ما قبل التمدد.
ملاحظة: لا تترك العينات المتبلور خارج الغرفة المبللة لأكثر من ساعة ، لأن المواد الهلامية الموسعة مسبقا عرضة للجفاف ، مما يجعل العينة غير صالحة للاستخدام. يرجى الاطلاع على الخطوة SF2.3 (الملف التكميلي 2) للاطلاع على إجراءات الاستحواذ قبل التوسع ذات الصلة. - قم بتفكيك غرف التبلور وتقليم الجل الزائد حول المنطقة ذات الأهمية في عينة الأغشية الحيوية باستخدام شفرة جراحية.
ملاحظة: يوصى بشدة بتقليم المواد الهلامية لتسهيل التعامل مع العينات الموسعة وتركيبها. بالإضافة إلى ذلك ، لتتبع الاتجاه المكاني لمنطقة الاهتمام داخل العينات ، قم بقص المواد الهلامية إلى شكل غير متماثل أو اترك قطعا مميزا في الجل لسهولة التعرف على الاتجاه الصحيح. - ضع الغطاء الذي يحمل المواد الهلامية المشذبة داخل طبق جديد مكون من 24 بئرا ، بحيث يكون الجل متجها لأعلى.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تظل العينات المتبلور ملتصقة بغطاء الزجاج الأصلي.
- احتضان عينات الأغشية الحيوية الملطخة ب 400 ميكرولتر من 1 ملي مولار من حمض الميثاكريليك N-hydroxysuccinimidyl ester (MA-NHS) في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض خفيف.
- الهضم الأنزيمي I-III وتلوين الحمض النووي
ملاحظة: تجانس الخواص الميكانيكية ل P. mirabilis عينات الأغشية الحيوية يتبع سلسلة من عمليات الهضم الأنزيمية التي صنفها المؤلفون في 3 خطوات ، بناء على التركيب البيولوجي المستهدف للتحلل: التحلل المائي للسكاريد (الهضم الأول) ، التحلل المائي الببتيدوغليكان (الهضم الثاني) والتحلل المائي للبروتين (الهضم الثالث).- الهضم I
- اغمر العينات في 1 مل من محلول هضم α-الأميليز. احتضان O.N. عند 50 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم استخدام كميات كبيرة (أي 0.5-1 مل) من المحلول الأنزيمي لمنع جفاف العينة بسبب ارتفاع درجة حرارة الحضانة. - قم بإزالة محلول α-الأميليز واغسل المواد الهلامية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام 300 ميكرولتر من محلول هضم السليولاز.
- قم بإزالة المخزن المؤقت لهضم السليولاز واستبدله ب 500 ميكرولتر من محلول هضم السليولاز. احتضان لمدة ساعتين عند 45 درجة مئوية.
- قم بإزالة محلول هضم السليولاز واغسل المواد الهلامية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام 300 ميكرولتر من محلول هضم الليتيكاز.
- قم بإزالة المخزن المؤقت لعملية الهضم ليتيكاز واستبدله ب 500 ميكرولتر من محلول هضم الليتيكاز. احتضان لمدة 2 ساعة عند 30 درجة مئوية.
- اغمر العينات في 1 مل من محلول هضم α-الأميليز. احتضان O.N. عند 50 درجة مئوية.
- الهضم الثاني
- قم بإزالة محلول الهضم الليتيكاز واغسل المواد الهلامية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام 300 ميكرولتر من محلول هضم الموتانوليسين.
- قم بإزالة المخزن المؤقت للهضم الميتانوليسين واستبدله ب 1 مل من محلول هضم الموتانوليسين. احتضان O.N. عند 55 درجة مئوية.
- الهضم الثالث
- قم بإزالة محلول هضم mutanolysin واغسل المواد الهلامية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام 300 ميكرولتر من محلول الهضم البروتيناز K. قم بإزالة محلول هضم البروتيناز K واستبدله ب 500 ميكرولتر من محلول هضم البروتيناز K. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
- (اختياري) تلطيخ الحمض النووي
- قم بإزالة محلول البروتيناز K واغسل المواد الهلامية ب 300 ميكرولتر من 10x PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة 10x PBS واستبدله ب 300 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي الفلوري الأحمر 5 ميكرومتر في 10x PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: راجع قسم المناقشة للحصول على تعليقات حول تلطيخ الحمض النووي لإجراءات ExM.
- الهضم I
- توسع
- قم بإزالة محلول البروتيناز K (أو محلول تلطيخ الحمض النووي إذا تم تنفيذ الخطوة الاختيارية 5.2.4) ونقل المواد الهلامية إلى طبق بتري 60 مم. ضع هلام واحد لكل طبق بتري.
ملاحظة: استخدم فرشاة رسم مسطحة صغيرة لدفع الجل على الغطاء الزجاجي. باستخدام ملاقط المختبر ، أمسك الغطاء الزجاجي واستخدمه كمنصة للجل. امنع الجل من السقوط من الغطاء بمساعدة الفرشاة عند رفعه من بئر اللوحة. تجنب المواد الهلامية من الطي على نفسها. - املأ طبق بتري بالماء الزائد منزوع الأيونات ، واغمر الجل بالكامل ، واحتضنه تحت تحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. استبدل الماء 4-5 مرات.
ملاحظة: لاحظ أن الجل الموسع يصبح غير مرئي تقريبا عند غمره في الماء. ضع طبق بتري مقابل الضوء لتسهيل تحديد موقع الجل لتجنب إتلافه بالشفط من ماصة باستور أو الماصة الدقيقة أثناء تبادل المياه.
- قم بإزالة محلول البروتيناز K (أو محلول تلطيخ الحمض النووي إذا تم تنفيذ الخطوة الاختيارية 5.2.4) ونقل المواد الهلامية إلى طبق بتري 60 مم. ضع هلام واحد لكل طبق بتري.
الشكل 2: غرفة الهلام وتركيب العينة. (أ) غرفة ما قبل الهلام. على شريحة، ضع 2 فواصل شريط على الوجهين (أصفر). غطاء زجاجي (
= 12 مم) يجلس فوق مرجع المسافة. (ب) غرفة التبلور. يتكون الأغشية الحيوية البكتيرية (الخضراء) على سطح الغطاء السفلي. فواصل بسمك 400 ميكرومتر (برتقالي) مصنوعة من قواطع شريطية على الوجهين بسمك 100 ميكرومتر. تسمح الفواصل للهلام بتضمين العينة بأكملها وتجنب فيضان محلول التبلور من حواف الغرفة ، مما يمنع العينة من التعرض للسحق بين الشريحة والغطاء. (ج) غرف التصوير المطبوعة ثلاثية الأبعاد (قم بزيارة الرابط التالي للوصول إلى ملفات .stl https://github.com/scianlab/ExM). عينة هلامية موسعة (يسار) وعينة هلامية موسعة مغمورة في ماء منزوع الأيونات (يمين). تصبح المواد الهلامية الموسعة غير مرئية تقريبا عند غمرها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. الملاحظة والتحليل
- تركيب العينات الموسعة
- قم بإعداد غرف التصوير بطلاء بولي ليسين لتثبيت العينة أثناء التصوير11: انقع السطح الزجاجي لغرفة التصوير (انظر جدول المواد) باستخدام 0.1٪ (وزن / حجم) بولي إل ليسين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة محلول بولي إل ليسين وقم بغسلتين بالماء الزائد منزوع الأيونات. اتركيه ليجف في الهواء لمدة ساعة واحدة أو ضعه داخل حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لتسريع عملية التجفيف.
- بعد دورة غسيل الكلى الخامسة من الخطوة 5.3.2 ، قم بإزالة الماء الذي يغطي المواد الهلامية واستخدم فرشاة مسطحة صغيرة لدفع العينة إلى غطاء زجاجي مقاس 24 مم × 50 مم. استخدم الغطاء المستطيل كمنصة للهلام وارفعه من طبق بتري.
- قم بإزالة الماء الزائد من الجل باستخدام المناديل الورقية لمنع الماء من منع التلامس المباشر بين سطح الجل وطلاء بولي ليسين على السطح الزجاجي لغرفة التصوير.
- ضع الجل بحذر على السطح الزجاجي لغرفة التصوير ، وتجنب احتباس فقاعات الهواء بين الجل والزجاج.
ملاحظة: يجب أن يكون السطح الزجاجي لغرفة التصوير جافا تماما. إذا تم التقاط صور ما قبل التوسيع ، ففكر في الاتجاه الصحيح للهلام الموسع لتسهيل العثور على مجالات الرؤية التي تم التقاطها مسبقا في العينة الموسعة مسبقا. - أضف الماء منزوع الأيونات حتى يغمر الجل تماما (انظر الشكل 2 ج).
ملاحظة: يجب أن تظل المواد الهلامية الموسعة رطبة أثناء عملية التصوير بأكملها لتجنب الانكماش أثناء الالتقاط.
- الحصول على الصور
- تصور والتقاط صور للعينات على مجهر فلورسنت محدود الحيود.
ملاحظة: استخدم المؤلفون مجهرا متحد البؤر للقرص الدوار ، مع هدف غمر في الماء 63x بفتحة عددية 1.2 (NA). لإثارة الفلوروفور ، تم استخدام خط ليزر الحالة الصلبة عند 488 و 647 نانومتر. تم إجراء اللقطات باستخدام كاميرا CMOS رقمية 16 بت يتم التحكم فيها بواسطة برنامج احتكاري (انظر جدول المواد). تم ضبط حجم Voxel على 64.4 مم × 64.4 مم × 200 نانومتر (محاور XYZ ).
- تصور والتقاط صور للعينات على مجهر فلورسنت محدود الحيود.
- معالجة الصور
- يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 2 للعثور على روتين معالجة الصور الرقمية لتجزئة البكتيريا (القسم SF2.1) ، وقياس عرض الخلية (القسم SF2.2) ، وتحديد EF (القسم SF2.3) ، ومطابقة الصور للظروف الموسعة والموسعة مسبقا (القسم SF2.4).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قام PmbExM بتوسيع الأغشية الحيوية P. mirabilis 4.3 أضعاف والحفاظ على التشكل والطوبولوجيا
يوضح الشكل 3A-D التكبير المادي ل P. mirabilis خلايا الأغشية الحيوية والدقة المتزايدة التي أثارتها هذه التقنية. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ هذا فقط في مناطق الأغشية الحيوية الرقيقة حيث تنظم الخلايا في تخطيط يشبه الطبقة الأحادية ، ولكن أيضا في المناطق السميكة من الترتيبات المكتظة بالسكان لطبقات البكتيري...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة ل PmbExM
كما هو الحال مع أي متغير ExM ، فإن إحدى أهم خطوات البروتوكول هي تجانس الخواص الميكانيكية للعينة. في حالة PmbExM ، يتم تحقيق ذلك من خلال سلسلة من العلاجات الأنزيمية. يمكن أن يؤدي الهضم غير الكافي إلى انخفاض EFs وتلف محتمل لمورفولوجيا الأغشية الحيوية و / أو الطوبولوجيا ، مما يؤدي إلى دقة دون المستوى الأمثل ونتائج غير موثوقة. على العكس من ذلك ، يمكن أن يتسبب الهضم المفرط في العدوانية ، وخاصة العلاجات المحللة للبروتين ، في فقدان كبير في التألق ويع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح المالية أو الشخصية المتعلقة بهذا العمل.
شكر وتقدير
يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور خوان إدواردو رودريغيز والبروفيسور الدكتور أولريش كوبيتشيك (يو بون) لمساهمتهما في تنفيذ تقنيات التوسع في SCIAN-Lab. تم تمويل هذا العمل من قبل مشاريع ANID ICM P09-015-F (SH ، DC ، KP ، JJW) ، FONDECYT 1211988 (SH ، DC ، KP) ، FONDECYT 3220832 (JJW) ، FONDEQUIP EQM210020 (DC ، KP ، JJW ، JT ، NCH ، PS ، SH) ؛ Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH ، KP ، JJW) ، CORFO 16CTTS- 66،390 ، MINEDUC GRANT RED 21994 (SH) ، BASAL FB210005 (SH) ، DAAD 57519605 (SH ، NC) ، Centro CTI230006 (SH) ، معرف FONDEF 23I10337 (SH) ، والمشروع الإقليمي ثنائي القومية Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH ، NCH ، PS ، MJG).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| α-Amylase من Bacillus sp. | Sigma-Aldrich | 10070 | هضم عديد السكاريد |
| 0.1٪ (وزن / حجم) محلول ماء بولي إل ليسين | Sigma-Aldrich | P8920 | عينة تثبيت للتصوير |
| 12 مم أغطية زجاجية | Chemglass Life Sciences | CLS-1760 | مكون غرفة التبلور |
| 16 بت C13440-20CU | Hamamatsu الضوئيات | غير متوفرة | كاميرا CMOS الرقمية للحصول على الصور |
| 24 مم × 50 مم أغطية زجاجية | Chemglass Life Sciences | CLS-1764 | / معالجة العينة |
| غرفة التصوير المطبوعة ثلاثية الأبعاد | داخلي | - | خيار غرفة |
| التصوير 4-hydroxy-2،2،6،6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4-hydroxy-TEMPO) Sigma-Aldrich | 176141 | مكون محلول التبلور | |
| 6-Well Glass Bottom Plate مع جدران سوداء | CelVis | P06-1.5H-N | خيار غرفة التصوير |
| حمض الخليك & nbsp ؛ | Sigma-Aldrich | 818755 | مكون عازلة إنزيم |
| أكريلاميد ؛ | Sigma-Aldrich | A4058 | مكون محلول المونومر |
| بيرسلفات الأمونيوم | سيجما ألدريتش | A3678 | مكون محلول التبلور |
| Axiovert 200 مجهر | زايس | غير متوفر | مجهر متحد البؤر |
| كلوريد الكالسيوم | سيجما ألدريتش | C8106 | مكون عازلة الإنزيم |
| C-Apochromat 63x 1.2 NA هدف الغمر في الماء | Zeiss | غير متوفر | المجهر |
| الموضوعي Cellulase من Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | عديد السكاريد الهضم |
| Chamlide CMB 35 مم غرفة التصوير المغناطيسي للطبق | الخلية الحية | غير متوفرة | خيار غرفة التصوير |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ألدريتش | 472301 | MA-NHS حل مخزون كاشف التثبيت |
| فوسفات ثنائي الصوديوم | Sigma-Aldrich | S3264 | مكون عازلة الإنزيم |
| الإيثانول | سيجما ألدريتش | E7023 | التنظيف والتعقيم |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | ميرك | 324503 | مكون عازلة الإنزيم |
| فالكون البوليسترين 24 لوحة بئر | كورنينج | 351147 | منصة الإجراءات |
| العامة برنامج FIJI | المعاهد الوطنية للصحة | - | برامج معالجة الصور |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | مكون عازلة الإنزيم |
| Guanidine هيدروكلوريد | Thermo Scientific | 24115 | مكون عازلة الإنزيم |
| Huygens Software | برنامج التصوير العلمي | لاستعادة | الصور |
| حمض الهيدروكلوريك | Supelco | 1.00317 | تحضير العازلة |
| مناديل كيمويبس | فيشر ساينتيفيك | 06-666 | إزالة المياه الزائدة |
| ملاقط المختبر | علوم المجهر الإلكتروني | M5E | معالجة / معالجة العينات العامة |
| مرق لوريا بيرتاني | Invitrogen | 12795-027 | وسط نمو الأغشية الحيوية |
| Lyticase من Arthrobacter luteus< / em> | سيجما ألدريتش | L4025 | هضم عديد السكاريد |
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما ألدريتش | D5652 | مكون عازلة الإنزيم |
| حمض الميثاكريليك N-hydroxysuccinimidyl إستر | سيجما ألدريتش | 730300 | كاشف التثبيت |
| الميثانول | سيجما ألدريتش | 32213 | عينة الجفاف والتخزين |
| ميكروب J & nbsp ؛ | - | المساعد لبرنامج معالجة الصور | |
| الشرائح الزجاجية المجهرية | Chemglass Life Sciences | CG-8221 | مكون غرفة التبلور |
| فوسفات أحادي الصوديوم | Sigma-Aldrich | S9638 | مكون عازلة إنزيم |
| Mutanolysin من Streptomyces globisporus< / em> | Sigma-Aldrich & nbsp ؛ | M990 | Peptidoglycan الهضم |
| N ، N ، N '، N'-tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T7024 | مكون محلول التبلور |
| N ، N & prime ؛ -methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | مكون محلول المونومر |
| Nunc 40.4 مم أطباق بتري ذات قاع | زجاجي Thermo Fisher | 12-567-400 | خيار غرفة التصوير |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | تثبيت عينة |
| محلول ملحي عازلة للفوسفات | Sigma-Aldrich | 79383 | مكون محلول مونومر ، غسيل ، عازلة إنزيم |
| Proteinase K من Engyodontium album < / em> | Invitrogen | 25530-031 | هضم |
| البروتين Proteus mirabilis < / em>ATCC 12453 | Microbiologics | 0440P | موضوع الدراسة |
| فرشاة طلاء مسطحة صغيرة | متجر لاجهزة الكمبيوتر المحلي | - | معالجة / معالجة |
| عينة أسيتات الصوديوم | سيجما ألدريتش | 241245 | مكون عازلة إنزيم |
| أكريلات الصوديوم | سيجما ألدريتش | 408220 | مكون محلول مونومر |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما ألدريتش | S5761 | مكون عازلة إنزيم |
| كلوريد | الصوديومSigma-Aldrich | S9888 | مكون محلول المونومر ، مكون عازلة الإنزيم |
| هيدروكسيد الصوديوم | Sigma-Aldrich | 221465 | تنظيف الشرائح الزجاجية |
| خط ليزر الحالة الصلبة | Omicron | غير متوفر | 488 و 568 و 647 نانومتر خط ليزر الإثارة |
| SYTO 61 تلطيخ الحمض | Invitrogen | S11343 | صبغة الفلورسنت |
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد | SAFC | 108219 | مكون العازلة الإنزيمي |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | نفاذية العينة ، مكون العازلة الإنزيمي |
| Volocity 7.0.0 برنامج التقاط | Quorum | Technologies-Microscoy برنامج وحدة التحكم في الاستحواذ | |
| Volocity ViewVox نظام قرص الغزل | Perkin-Elmer | غير متوفر | مجهر |
| الرص جنين القمح &ndash ؛ أليكسا فلور 488 الفلورسنت الليكتين المترافق | Invitrogen | W11261 | صبغة الفلورسنت |
المراجع
- Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
- Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).
- Castagnini, D., et al. Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization. J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging- Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. Q&A: Expansion microscopy. BMC biology. 15 (1), 50(2017).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).
- Kunz, T. C., et al. The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy. Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).
- Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).
- Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties. Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).
- Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).
- Scott, J. H., Schekman, R. Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).
- Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).
- Kaplan, J. B., et al. Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).
- Kaplan, J. B., et al. Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci. J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).
- Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach. J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
