مقالة منهجية

العزل السريع للحويصلات خارج الخلية المشتقة من حليب الثدي البشري

805 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67954

⸱

نوفمبر 14, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

في هذه المقالة

ملخص

تم تصميم هذا البروتوكول لتسريع والسماح بالعزل الفعال للحويصلات خارج الخلية من حليب الثدي البشري ذو النقاء العالي.

الملخص

الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، وهي جزيئات نانوية الحجم يبلغ حجمها حوالي 20-1000 نانومتر ، تحظى بالاهتمام بسرعة لإمكاناتها العلاجية. على وجه التحديد ، ثبت أن الحويصلات خارج الخلية المشتقة من حليب الثدي البشري (HBMDEVs) تمنح الحماية في النماذج التجريبية لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر ، وهو مرض معوي يصيب الأطفال الخدج بشكل أساسي ، مما يؤدي إلى وفيات تصل إلى 50٪. ومع ذلك ، فإن تقنيات عزل الحويصلة خارج الخلية التقليدية ، مثل الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وما إلى ذلك ، إما تستغرق وقتا طويلا أو تتطلب أجهزة متخصصة ، ولا يعد أي منهما عمليا في البيئة السريرية. ومن ثم ، هناك حاجة إلى طريقة عزل بسيطة تسمح بإعطاء تفاعلي سريع لمركبات HBMDEV للمرضى. يقترح هنا مزيج من الطرد المركزي لحليب الثدي البشري لإزالة الدهون والحطام الخلوي ، إلى جانب الترشيح الفائق السريع للحليب الخالي من الدسم المتبقي الذي ينتج إنتاجية عالية وحويصلات وظيفية خارج الخلية. قد يسمح استخدام هذه التقنية باستخدام HBMDEVs كخيار علاجي عملي في البيئة السريرية.

المقدمة

الحويصلات خارج الخلية (EVs) عبارة عن جزيئات نانوية منتشرة في كل مكان يبلغ حجمها حوالي 20-1000 نانومتر ، إما عبر المسارات الداخلية (عندما تندمج الأجسام الحويصلية الدقيقة مع غشاء البلازما ، مما يسهل إطلاق الشحنة الخلوية في الفضاء خارج الخلية) أو مسارات غشاء البلازما (أي التبرعم). تحتوي المركبات الكهربائية على شحنات خلوية مضيفة مثل الدهون والبروتينات والأحماض النووية والمستقلبات المختلفة ومحتويات أخرى حسب مصدرها. علاوة على ذلك ، تعتبر المركبات الكهربائية مهمة في الاتصال بين الخلايا ، وتكوين الأوعية الدموية ، وقمع المناعة ، وإعادة تشكيل البيئة المكروية للورم ، وتطور السرطان ، وما إلى ذلك.1،2،3،4. والجدير بالذكر أن حليب الثدي البشري (HBM) غني بالمركبات الكهربائية ويمكن الوصول إليه بسهولة من الأمهات المرضعات5. في الآونة الأخيرة ، حظيت المركبات الكهربائية المشتقة من حليب الثدي البشري (HBMDEVs) بالاهتمام كناقلات علاجية لعلاج المرض1،2. الأطفال حديثي الولادة الخدج أو منخفضي الوزن عند الولادة معرضون للعديد من أنواع العدوى، بما في ذلك التهاب الأمعاء والقولون الناخر. يتراوح التهاب الأمعاء والقولون الناخر ، الذي يتميز بالنخر اللفائفي أو القولون ، من التهاب معوي خفيف إلى فشل متعدد الأجهزة مع معدل وفيات الرضع يصل إلى 50٪ 6. العلاج المسبق باستخدام EVs المشتقة من حليب الثدي كاف للحماية من التهاب الأمعاء في النماذج التجريبية ل NEC في المختبر وفي الجسم الحي2،7. ومن ثم ، قد يكون استخدام HBMDEVs خيارا قابلا للتطبيق لعلاج NEC في البيئات السريرية.

على الرغم من الوعد العلاجي لمتلازمات HBMDEV ، إلا أن هناك قيودا معروفة باستخدام تقنيات العزل الحالية من حيث أنها إما تستغرق وقتا طويلا أو تتطلب معدات متخصصة ، ولا يعد أي منهما عمليا عالميا للبيئة السريرية. يتضمن "المعيار الذهبي" لعزل المركبات الكهربائية عدة جولات من الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، والذي ، على الرغم من أنه ينتج عائدا مرضيا للمركبات الكهربائية ، إلا أنه قد يؤثر على سلامتها الهيكلية ووظائفها 8,9. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون أوقات الطرد المركزي الفائق ساعتين كحد أدنى ، وهو مورد مكلف في الإعداد السريري9. أثبتت مجموعات العزل أنها موفرة للوقت وفعالة من حيث التكلفة إلى حد ما. ومع ذلك ، فإن العزل باستخدام هذه الطرق يؤدي أيضا إلى انخفاض الغلة وبالتالي انخفاض قابلية التوسع. ومن ثم ، هناك حاجة إلى تقنيات عزل HBMDEV موفرة للوقت وفعالة من حيث التكلفة دون التضحية بإنتاجية المركبات الكهربائية.

يهدف هذا البروتوكول إلى تحديد طريقة خطوة بخطوة لعزل المركبات الكهربائية بسرعة عن HBM باستخدام الأدوات الحالية المتاحة سريريا والمعتمدة من إدارة الغذاء والدواء. لتحقيق ذلك ، تم استخدام الطرد المركزي القياسي ونظام تمديد المرشح من الدرجة السريرية لعزل المركبات الكهربائية من HBM. تقع هذه الحويصلات ضمن نطاق الحجم المتوقع ، وتعرض مورفولوجيا متوافقة مع المركبات الكهربائية المعروفة ، ويتم إثرائها لعلامات EV ، وتشبه وظيفيا المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام تقنيات عزل الطرد المركزي التقليدية. وبالتالي ، قد يسمح بروتوكول عزل HBM EV هذا بالعزل العملي والسريع وتطبيق المركبات الكهربائية المعزولة من HBM في البيئة السريرية.

البروتوكول

تم جمع حليب الثدي في وحدة العناية المركزة الإقليمية بجامعة ألاباما في برمنغهام (UAB). تم جمع العينات التي تم جمعها بعد إذابة حليب الثدي لاستخدام المريض ، ولم يتمكن المريض من أخذ الرضاعة بأكملها. عادة ما يتم التخلص من هذه الوجبات ، ولكن تم جمعها لأغراض البحث. تم جمع العينات من أفراد مجهولين وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى وقت التجارب. تمت الموافقة على المجموعة من قبل بروتوكول مجلس المراجعة الداخلية للبنك العربي المتحد N160203002. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. عزل الحويصلة خارج الخلية (الطرد المركزي التفاضلي)

  1. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتخفيف حليب الثدي 1:10 في PBS معقم في أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. قم بالطرد المركزي لحليب الثدي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، يجب أن يكون هناك 3 طبقات متميزة: دهن الحليب (الطبقة العليا) ، مصل اللبن أو الحليب الخالي من الدسم (الطبقة المائية الوسطى) ، والخلايا والحطام الآخر (حبيبات في الأسفل). في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتصفية دهون الحليب وطبقات مصل اللبن من خلال مرشح 70 ميكرومتر (يسمح بإزالة الدهون بشكل أسهل) مع ترك الحبيبات دون إزعاج. نقل التدفق إلى أنبوب جديد.
  3. قم بالطرد المركزي للعينة عند 2600 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تتم إزالة دهون الحليب المتبقية والخلايا والحطام في هذه الخطوة. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 70 ميكرومتر. انقل المادة الطافية إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق. تأكد من وجود 10 مل على الأقل من السائل في الأنبوب قبل الطرد المركزي الفائق.
  4. جهاز الطرد المركزي الفائق للعينة عند 20,000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي الفائق ، قد تكون هناك ثلاث طبقات مشابهة للخطوة 1.2: دهن الحليب ، مصل اللبن أو الحليب الخالي من الدسم ، والخلايا والحطام الآخر. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتصفية دهون الحليب وطبقات مصل اللبن من خلال مرشح 70 ميكرومتر دون إزعاج الحبيبات. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  5. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتصفية حقنة حليب الثدي بفلتر 0.22 ميكرومتر. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد فائق. تأكد من وجود 10 مل على الأقل من السائل في الأنبوب قبل الطرد المركزي الفائق.
  6. جهاز الطرد المركزي الفائق للعينة عند 110،000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استنشاق المادة الطافية, وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من PBS المعقمة.
  7. قم بالطرد المركزي الفائق للعينة مرة أخرى عند 110,00 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. في خزانة السلامة البيولوجية ، أعد تعليق الحبيبات في 150-200 ميكرولتر من PBS المعقمة.

2. عزل الحويصلة خارج الخلية (طريقة الترشيح السريع)

  1. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتخفيف حليب الثدي (1:10) في PBS المعقم.
  2. قم بالطرد المركزي لحليب الثدي على حرارة 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، يجب أن تكون هناك ثلاث طبقات متميزة: دهن الحليب (الطبقة العليا) ، مصل اللبن أو الحليب الخالي من الدسم (الطبقة المائية الوسطى) ، والخلايا والحطام الآخر (حبيبات في الأسفل). في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتصفية دهون الحليب وطبقات مصل اللبن من خلال مرشح 70 ميكرومتر (يسمح بإزالة الدهون بشكل أسهل) مع ترك الحبيبات دون إزعاج. نقل التدفق إلى أنبوب جديد.
  3. قم بالطرد المركزي للعينة عند 2600 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تتم إزالة دهون الحليب المتبقية والخلايا والحطام في هذه الخطوة. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 70 ميكرومتر. نقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 15 مل.
  4. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتجهيز مجموعة تمديد مرشح 0.22 ميكرومتر و 16 بوصة مع 5.4 مل PBS.
    1. بالنسبة للنظام الأولي ، خذ 5.4 مل من PBS المعقم في حقنة واغسل النظام حتى ينفد PBS من الطرف الآخر من الأنبوب.
  5. قم بتصفية حقنة حليب الثدي من خلال مجموعة تمديد مرشح مقاس 0.22 ميكرومتر مقاس 16 بوصة. تتم إزالة دهون الحليب المتبقية والخلايا والحطام في هذه الخطوة.
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من مجموعة تمديد مرشح واحدة اعتمادا على كمية الحطام الموجودة في العينة.
  6. اجمع التدفق في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

3. تحليل تتبع الرؤية النانوية

  1. تمييع العينة (1: 1000) في PBS معقمة. يمكن استخدام العينات التي تمت تصفيتها بسرعة غير مخففة.
  2. دوامة العينة لفترة وجيزة. قم بتحميل 1 مل من العينة في حقنة توبركولين.
  3. قم بتوصيل المحقنة بجهاز الحقن وقم بتأمين المحقنة.
  4. اضبط مضخة الحقن على 50. قم بتشغيل الكاميرا للتأكد من أن الجسيمات المعروضة ليست كثيرة جدا أو قليلة جدا. تأكد من أن تدفق الجسيمات ثابت دون تخطي أو قفزات مفاجئة في تدفق العينة.
  5. اضبط مضخة الحقن على 100. قم بتشغيل البروتوكول.
    ملاحظة: تم تعيين البرنامج ليتم قراءته مرة واحدة كل دقيقة ليصبح المجموع 5 قراءات.
  6. اقرأ العينة.
  7. اغسل Nanosight بين العينات باستخدام PBS.
    ملاحظة: تم استخدام نظام تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد حجم الجسيمات وتركيز الجسيمات لكل مليلتر. كان متوسط تركيز العينة فائقة الطرد المركزي 3.30 e + 08 +/- 4.08 e + 06 جسيمات / مل ، بينما كانت طريقة الترشيح السريع 5.50e + 08 +/- 1.16e + 08 جسيمات / مل.

4. تلطيخ سلبي للحويصلات خارج الخلية والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال

ملاحظة: استخدمت عينات ذات تركيز إكزوسومات في حدود 108 للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM).

  1. توهج التفريغ فورمفار / شبكة شبكة EM النحاسية المطلية بفيلم الكربون لمدة 25 ثانية عند 20 مللي أمبير باستخدام جهاز التفريغ.
  2. قم بتحميل 7 ميكرولتر من محلول تعليق EV على الشبكة واحتضنه لمدة 1 دقيقة.
  3. قم بفتيل الفائض بورق ترشيح Whatman عن طريق الفتل من أسفل الشبكة "لسحب" العينة نحو الشبكة بدلا من الابتعاد عنها.
  4. قم بتلطيخ العينة على الفور ب 7 ميكرولتر من محلول أسيتات اليورانيل 1٪ (UA) المصفى على سطح شبكة EM بواسطة ماصة.
  5. بعد 15 ثانية ، تمت إزالة محلول UA الزائد من الشبكة عن طريق الاتصال بحافة الشبكة بورق الترشيح. عرض العينة على الفور (في غضون 24 ساعة) على TEM عند 80 كيلو فولت.

5. تركيز البروتين

  1. يترسب الأسيتون 250 ميكرولتر من المركبات الكهربائية المنقاة (1: 4) لمدة ساعة واحدة عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدم 100 ميكرولتر من الإكسوسومات المنقاة لطريقة الطرد المركزي الفائق.
  2. قم بالطرد المركزي للعينة عند 16,000 × جم لمدة 30 دقيقة.
  3. جفف الحبيبات بالهواء ، متبوعا بإعادة التعليق في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA.
  4. اتبع بروتوكول مجموعة أدوات فحص البروتين BCA لتحديد تركيزات البروتين. تم قياس الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
    ملاحظة: ينتج 1 مل من حليب الثدي عادة ما يقرب من 1.3 ميكروغرام / مل من البروتين باستخدام الطرد المركزي الفائق وحوالي 0.2-1 ميكروغرام / مل من البروتين باستخدام الترشيح السريع.

6. وصمة عار غربية

  1. احتضان عينة بروتين 1 حجم بعلامة حارة 4 أحجام ، وقلل المخزن المؤقت للعينة ، واغليها لمدة 7 دقائق عند 90 درجة مئوية.
  2. قم بتحميل وتشغيل 10 ميكروغرام من البروتين على جل SDS 10٪ عند 70 فولت لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بزيادة الجهد إلى 100 فولت وقم بتشغيله لمدة 90 دقيقة إضافية.
  3. انقل الجل إلى غشاء النيتروسليلوز باستخدام الجهاز شبه الجاف لمدة 30 دقيقة عند 15 فولت.
  4. اغسل الغشاء 3 مرات باستخدام TBS-0.1٪ Tween (TBS-T) لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  5. سد الغشاء لمدة 30 دقيقة باستخدام محلول Fast Blocking Buffer (مخفف إلى 1x).
  6. احتضان الجسم المضاد الأولي (Hsp70-1: 1000; CD63-1: 1000 و CD9-1: 1000) في محلول 1x Buffer ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على هزاز10،11،12.
  7. اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام TBS-T.
  8. أضف (H + L) الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر المترافق HRP ، عند تخفيف 1: 1000 لجميع البروتينات التي تم استجوابها (Hsp70 و CD9 و CD63) في 2٪ حليب في TBS-T واحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على هزاز.
  9. اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام TBS-T.
  10. التطوير باستخدام ECL (1: 1) والأفلام مع المطور.

7. الثقافة في المختبر لخلايا IEC-6

  1. بذرة 1.0 × 106 خلايا في قارورة T-25 في 5 مل من وسائط RPMI الكاملة. دع الخلايا تلتصق بين عشية وضحاها.
  2. قم بإزالة الوسائط الكاملة واغسلها ب 1-2 مل من PBS.
  3. استنشاق PBS وأضف 5 مل من RPMI الكامل الخالي من EV.
  4. أضف تركيزا نهائيا قدره 400 ميكرومتر H2O2 لكل بئر و 10 ميكروغرام / مل من المركبات الكهربائية في وقت واحد إلى الخلايا بين عشية وضحاها.
  5. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا ب 1-2 مل من PBS.
  6. استنشق PBS وأضف 1 مل من التربسين.
    1. ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. قم بإلغاء تنشيط التربسين عن طريق إضافة ضعف حجم RPMI الكامل. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 125 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS.
  9. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا.

النتائج

عزل المركبات الكهربائية باستخدام الطرد المركزي الفائق والعزل السريع
من الناحية العقائدية ، يتضمن عزل EV من HBM الطرد المركزي لإزالة دهون الحليب والجزيئات الكبيرة الأخرى ، متبوعا بالترشيح ، وعدة جولات من الطرد المركزي الفائق ، وإعادة تعليق العينة المخصبة ب EV في PBS. تستخدم طريقة الترشيح السريع الطرد المركزي لإزالة دهون الحليب والحطام الخلوي ، متبوعا بالترشيح عبر مرشح تمديد مرشح 0.22 ميكرومتر ، مما يؤدي إلى إزالة الحطام المتبقي ، مما ينتج عنه عينة غنية ب EV يمكن مقارنتها بالطرد المركزي الفائق التقليدي (الشكل 1).

توصيف مرتكبات HBMDEVs من نظام الترشيح السريع لتمديد المرشح
كشف تحليل تتبع البصر النانوي عن حجم جسيمات مماثل بين أجهزة الطرد المركزي الفائقة (الشكل 2 أ) وأجهزة HBMDEVs المعزولة بالمرشح السريع (الشكل 2 ب). تشير كلتا الطريقتين إلى أن المركبات الكهربائية المعزولة لها متوسط حجم يبلغ حوالي 100 نانومتر. تحمل المركبات الكهربائية شحنات مختلفة (مثل البروتينات والدهون والحمض النووي الريبي الريبي وما إلى ذلك) لإفراز الخلايا المضيفة إلى أهدافها المختلفة. ومن ثم ، فإن أول بروتين مستهدف تم فحصه كان بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70) ، وهو بروتين معروف أنه ينتقل عبر EVs13. يظهر تحليل اللطخة الغربية أن المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الترشيح السريع أظهرت تعبيرا مشابها عن Hsp70 ، مثل تلك المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق (الشكل 3 أ والشكل التكميلي 1 أ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التعرف على المركبات الكهربائية من خلال التعبير السطحي للتتراسبانين مثل CD9 و CD6314. كشف تحليل اللطخة الغربية أن المركبات الكهربائية المعزولة عن طريق الترشيح السريع تعبر بالفعل عن CD9 (الشكل 3 ب والشكل التكميلي 2 ب) و CD63 (الشكل 3 ج والشكل التكميلي 3 ج). أخيرا ، كشف التحليل المورفولوجي ل HBMDEVs عبر المجهر الإلكتروني للإرسال عن مورفولوجيا حويصلية مماثلة بين تقنيتي العزل (الشكل 4A-D).

أظهرت العديد من المختبرات أن المركبات الكهربائية تمنح خصائص وقائية تعزز بقاء الخلايا أثناء الإجهاد الخلوي2،3،7. على غرار التقارير المنشورة سابقا ، فإن المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام طريقة الترشيح السريع قادرة على حماية الخلايا الظهارية المعوية (IEC-6) من موت الخلايا الناجم عن بيروكسيدالهيدروجين 2 (الشكل 5 أ ، ب). تشير هذه البيانات إلى أن HBMDEVs المعزولة باستخدام طريقة الترشيح السريع لا تمتلك فقط صفات مقارنة لتلك المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق التفاضلي ولكنها أيضا متشابهة وظيفيا.

figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي يحدد الاختلافات بين الطرد المركزي الفائق وطرق الترشيح السريع لعزل المركبات الكهربائية من حليب الثدي البشري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل تتبع البصر النانوي للمركبات الكهربائية المعزولة من حليب الثدي البشري باستخدام الطرد المركزي الفائق وطريقة الترشيح السريع. (أ) NTA من EVs حليب الثدي البشري (المخفف 1: 1000 في 1x PBS) معزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق. البيانات المعروضة هي تمثيل واحد ل 3-4 تجارب مستقلة. (ب) NTA لحليب الثدي البشري EVs المعزولة باستخدام الترشيح السريع. البيانات المعروضة هي تمثيل واحد ل 3-4 تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل اللطخة الغربية للمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق والترشيح السريع. (أ) التعرض لمدة ثانية واحدة ل 10 ميكروغرام من بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70). يشير الحرف "L" إلى السلم ، ويشير "U" إلى الطرد المركزي الفائق ، ويشير "R" إلى الترشيح السريع. تم تركيز العينات التي تم الحصول عليها عن طريق الترشيح السريع عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، تم إجراؤها مرتين. تمثل الصورة المعروضة واحدة من أربع تجارب مستقلة. (ب) التعرض الثاني والعشرين ل 10 ميكروغرام من CD9. يشير الحرف "L" إلى السلم ، ويشير "U" إلى الطرد المركزي الفائق ، ويشير "R" إلى الترشيح السريع. تم تركيز عينات الترشيح السريع عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، وتم إجراؤها مرتين. تمثل الصورة المعروضة واحدة من أربع تجارب مستقلة. (ج) التعرض الثاني والعشرون ل 10 ميكروغرام من CD63. يشير الحرف "L" إلى السلم ، ويشير "U" إلى الطرد المركزي الفائق ، ويشير "R" إلى الترشيح السريع. تم تركيز عينات الترشيح السريع عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، وتم إجراؤها مرتين. تمثل الصورة المعروضة واحدة من أربع تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل المجهر الإلكتروني للإرسال للمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق والترشيح السريع. (أ) صورة مجهرية إلكترونية للمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق عند تكبير 8,000×. شريط المقياس = 800 نانومتر. تمثل الصورة المعروضة واحدة من ثلاث تجارب مستقلة. (ب) صورة مجهرية إلكترونية للمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق عند تكبير 20,000×. شريط المقياس = 200 نانومتر. تمثل الصورة المعروضة واحدة من ثلاث تجارب مستقلة. (ج) صورة مجهرية إلكترونية للمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الترشيح السريع عند تكبير 8,000×. شريط المقياس = 800 نانومتر. تم تركيز المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، وتم إجراؤها مرتين. تمثل الصورة المعروضة واحدة من ثلاث تجارب مستقلة. (د) صورة مجهرية إلكترونية للمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الترشيح السريع عند تكبير 20,000×. شريط المقياس = 200 نانومتر. تم تركيز المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، وتم إجراؤها مرتين. تمثل الصورة المعروضة واحدة من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: التحليل الوظيفي للمركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق والترشيح السريع. (أ) صلاحية الخلايا لخلايا IEC-6 المزروعة في وسط RPMI-1640 كامل خال من EV. تمت معالجة الخلايا بين عشية وضحاها ب 400 ميكرومتر H2O2 و 10 ميكروغرام / مل من المركبات الكهربائية في وقت واحد. تمثل البيانات المعروضة واحدة من تجربتين مستقلتين. (ب) عدد الخلايا لخلايا IEC-6 المزروعة في وسط RPMI-1640 كامل خال من المركبات الكهربائية. تمت معالجة الخلايا بين عشية وضحاها ب 400 ميكرومتر H2O2 و 10 ميكروغرام / مل من المركبات الكهربائية في وقت واحد. تمثل البيانات المعروضة واحدة من تجربتين مستقلتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: توصيف اللطخة الغربية ل Hsp70 في المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق والترشيح السريع. التعرض لمدة ثانية واحدة ل 10 ميكروغرام من بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70). يشير الحرف "L" إلى السلم ، ويشير "U" إلى الطرد المركزي الفائق ، ويشير "R" إلى الترشيح السريع. تم تركيز عينات الترشيح السريع عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، وتم إجراؤها مرتين. تمثل كل عينة تكرارا بيولوجيا واحدا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: توصيف اللطخة الغربية ل CD9 في المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق والترشيح السريع. التعرض لمدة خمس دقائق ل 10 ميكروغرام من CD9. يشير الحرف "L" إلى السلم ، ويشير "U" إلى الطرد المركزي الفائق ، ويشير "R" إلى الترشيح السريع. تم تركيز عينات الترشيح السريع عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، تم إجراؤها مرتين. تمثل كل عينة تكرارا بيولوجيا واحدا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: توصيف اللطخة الغربية ل CD63 في المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام الطرد المركزي الفائق والترشيح السريع. التعرض لمدة عشر دقائق ل 10 ميكروغرام من CD63. يشير الحرف "L" إلى السلم ، ويشير "U" إلى الطرد المركزي الفائق ، ويشير "R" إلى الترشيح السريع. تم تركيز عينات الترشيح السريع عن طريق الطرد المركزي عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، تم إجراؤها مرتين. تمثل كل عينة تكرارا بيولوجيا واحدا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تحظى المركبات الكهربائية بالاهتمام حيث تشير الأدبيات إلى أنها قد تنظم آليات التهابية مختلفة وقد تقدم فوائد وقائية2،7. ومع ذلك ، فإن الحد من الاستخدام العملي للمركبات الكهربائية في البيئات السريرية هو الوقت اللازم لعزل المركبات الكهربائية واستخراج عائد كاف8،15. هنا ، تم تحديد بروتوكول خطوة بخطوة للعزل السريع والفعال للمركبات الكهربائية من HBM باستخدام نظام ترشيح معتمد من إدارة الغذاء والدواء. تعمل فائدة هذه الطريقة على خفض طرق عزل المركبات الكهربائية التقليدية إلى النصف دون التضحية بالعائد. ومن ثم ، قد يسمح هذا البروتوكول بالتطبيق العلاجي العملي للمركبات الكهربائية المشتقة من حليب الثدي البشري في بيئة سريرية ، إذا تمت الموافقة على العلاج بالمركبات الكهربائية في المستقبل المنظور.

أظهرت بروتوكولات عزل المركبات الكهربائية الحالية إنتاجية ثابتة وفعالة للمركبات الكهربائية من سائل المصدر. ومع ذلك ، فإن وسائل العزل التقليدية ، سواء كانت المعيار الذهبي ، أو الطرد المركزي التفاضلي ، أو استخدام المجموعات التجارية ، لا تخلو من قيودها. إن عزل المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، على الرغم من فعاليته ، يستغرق وقتا طويلا مع البروتوكولات التي تتضمن أوقات دوران مجمعة لا تقل عن ~ 3 ساعات2،8،15. وقت العزل جنبا إلى جنب مع البروتوكولات لتحديد أعداد المركبات الكهربائية بشكل صحيح سيجعل استخدامها في ظل قيود الوقت في بيئة سريرية صعبة. علاوة على ذلك ، فإن المجموعات التجارية ، على الرغم من فعاليتها ، مكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدد العينات التي يمكن معالجتها لكل مجموعة منخفض ، نظرا لارتفاع تكاليف هذه المجموعات8،15.

يقدم هذا البروتوكول حلا لهذه القيود يوفر الوقت والمال دون التضحية بإنتاجية المركبات الكهربائية أو نقاوتها. لكي يكون هذا البروتوكول فعالا ، هناك خطوات رئيسية يجب اتباعها عند تنفيذ البروتوكول. يعد التخفيف والطرد المركزي الأولي لحليب الثدي البشري ضروريين لإزالة الحطام خارج الخلية ودهون الحليب من عينة الحليب. تعد إزالة هذا الحطام أمرا بالغ الأهمية لمنع انسداد نظام تمديد المرشح وبالتالي تمنع الاضطرار إلى استخدام مرشحات متعددة لعينة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تنظيف نظام تمديد المرشح باستخدام PBS أمرا بالغ الأهمية لأنه يهيئ المرشح استعدادا للعينة. يساعد التحضير على ضمان عدم فقد العينة أثناء عملية التحضير. وتجدر الإشارة إلى أنه ، اعتمادا على محتوى عينة حليب الثدي ، قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من مجموعة تمديد مرشح واحدة ، بغض النظر عن تخفيف العينة وطردها بالطرد المركزي قبل الترشيح. في حالة حدوث ذلك ، يمكن استخدام أكثر من مرشح واحد ؛ ومع ذلك ، يجب تحضير مجموعة تمديد المرشح الجديدة قبل ترشيح العينة.

هذا البروتوكول فعال ومتسق في عزل المركبات الكهربائية من حليب الثدي البشري ، ومع ذلك ، هناك بعض القيود التي يجب مراعاتها. خطوات أجهزة الطرد المركزي (~ 20 دقيقة من الوقت الإجمالي بين كلتا الدورتين) ضرورية قبل ترشيح العينة. ستؤدي محاولات تصفية العينة المخففة دون طرد مركزي إلى انسداد متكرر لنظام تمديد المرشح ، وفقدان العينة ، وإضافة وقت إضافي إلى بروتوكول عزل EV. علاوة على ذلك ، لم تكن العينة نقية ، كما يتضح من تحليل NTA و TEM. قد تؤدي محاولات استخدام العينات التي لم يتم طردها بالطرد المركزي قبل الترشيح إلى إدخال ملوثات غير مرغوب فيها في العينة ، مما قد ينتج عنه تأثيرات خارج الهدف اعتمادا على التطبيق المستقبلي للمركبات الكهربائية المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تنفيذ هذا البروتوكول فقط فيما يتعلق بعزل المركبات الكهربائية عن حليب الأم البشري. ومن ثم ، لم يتم التحقيق في فعالية هذا البروتوكول في عزل المركبات الكهربائية عن السوائل الأخرى. نظرا للطبيعة المائية لجميع سوائل الجسم ، فمن غير المتوقع أن تكون هناك أي اختلافات في نقاء المركبات الكهربائية والإنتاجية إذا تم استخدام هذا البروتوكول لعزل المركبات الكهربائية عن مصادر أخرى.

وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا البروتوكول فعال في عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEV). وفقا ل NTA ، كان حجم المركبات الكهربائية المشتقة من HBM ~ 100 نانومتر ، مما يشير إلى أن المركبات الكهربائية الأكبر حجما لم تكن موجودة في العينة. والسبب هو أنه تم ترشيح العينات باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر ، والذي يستخدم بشكل أساسي لعزل الإكسوسومات وغيرها من المركبات الكهربائية الأصغر ، وهو التركيز الأساسي للمختبر في وقت هذه الدراسة. من الناحية النظرية ، قد يسمح استخدام مرشح بأحجام مسام أكبر بعزل المركبات الكهربائية الأكبر. ومع ذلك ، فإن هذه الأسئلة خارج نطاق هذه الدراسة.

تمثل المركبات الكهربائية المشتقة من حليب الثدي مصدرا علاجيا طبيعيا يمكن الوصول إليه بسهولة للاستخدام السريري. أحد القيود التي تحول دون جلب عمل المركبات الكهربائية إلى البيئة السريرية هو عزل المركبات الكهربائية بطريقة عملية يمكن لأي منشأة استخدامها. تم تصميم هذا البروتوكول للتغلب على هذا القيد ويمكن تطبيقه بسهولة في بيئة المستشفى وتنفيذه باستخدام نظام ترشيح موجود من فئة المستشفى ، معتمد من إدارة الغذاء والدواء ، متاح تجاريا ، أو يمكن شراؤه بسعر أقل بكثير من جهاز الطرد المركزي الفائق القياسي. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وتنتج عينة غنية بالمركبات الكهربائية ونقية من نظام ترشيح يستخدم بالفعل في البيئة السريرية.

الإفصاحات

أعلن المؤلف (المؤلفون) عدم وجود تضارب محتمل في المصالح فيما يتعلق بالبحث و / أو التأليف و / أو نشر هذه المقالة.

شكر وتقدير

تم إنشاء الصور والأشكال باستخدام biorender.com. تم دعم البحث المبلغ عنه في هذا المنشور من قبل مرفق التصوير عالي الدقة UAB. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NICHD 5R21HD104481.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(H+L) HRP-مضاد الفأر المزدوجبيو-راد1721011
(H+L) HRP-المضاد المزدوج للأرانببيو-راد1706515
فلتر الحقنة 0.20فيشربراند09-719C
مصفاة خلية 0.70 ميكروكورنينغ431751
1.5 متر تريس HCLصنع داخليا
أنابيب 15 ملفالكون352096
مجموعة تمديد الفلتر بطول 16 بوصةبي-براونFE2012F
1M Tris HCLتيكنوفاT1068
1x PBSجيبكو10010-031
أنابيب 50 ملفالكون353070
5x مخزن عينات مخفضثيرمو ساينتفيك39000
الأسيلاميدفيشر ساينتيفسي BP1410-1
أمفوتيرسين Bجيبكو15290-018
كاميرا AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
مضاد المعارضينجيبكو15240-062
Anti-CD63نوفوسبيوNBP2-32830
Anti-CD9إنفيتروجين10626D
APSثيرمو ساينتفيك17874
مجموعة اختبار بروتين BCAبيرس23227
أنابيب بيكمانبيكمان كولتر  344059
برايت ستار ECL كيميائي مضيءالقلوية العلميةXR92
FBS المستنزف من الإكسوسومفيشر ساينتيفكNC0464480
مخزن الحجب السريعبيرس37575
مصل الأبقار الجنينيتقنيات الحياة10082147
hsp70إنفيتروجينMA3-006
الأنسولين البشريسيغما-ألدرتشI9278-5ML
بيروكسيد الهيدروجينفيشر ساينتيفكH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
جيول 1400 فلاش تيمJEOL USA Inc
مؤشر المسار يقلل من مخزن العينةثيرمو ساينتفيك39000
مسحوق الحليبعالم بيولوجي30620074-1
نانوسايت NS 300شركة مالفرن إنسترومنتس المحدودة
غشاء النيتروسيلولوزتقنيات الحياة88018
جهاز تفريغ التوهج من PELCOتيد بيلا
أقراص صغيرة مثبطة للبروتيزبيرسA32955
مخزن RIPAبيرس89901
RPMI 1640فيشر ساينتيفسي 11875119
SDSفيشر ساينتيفسي BP2436-200
قارورة T-25ثيرمو ساينتفيك156367
TBSصنع داخليا
TEMEDبيو-راد161-0801
تريبسين EDTAجيبسو25200-056
20 سنةثيرمو ساينتفيكJ20605-AP

المراجع

  1. Galley, J. D., Besner, G. E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles. Nutrients. 12 (3), 745(2020).
  2. Martin, C., et al. Human breast milk-derived exosomes attenuate cell death in intestinal epithelial cells. Innate Immun. 24 (5), 278-284 (2018).
  3. Hock, A., et al. Breast milk-derived exosomes promote intestinal epithelial cell growth. J Pediatr Surg. 52 (5), 755-759 (2017).
  4. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 6, 7321(2015).
  5. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma, and breast milk exosomes contain RNA: Uptake by macrophages. J Transl Med. 9, 9(2011).
  6. Chan, C. C., et al. Type I interferon sensing unlocks dormant adipocyte inflammatory potential. Nat Commun. 11 (1), 2745(2020).
  7. Miyake, H., et al. Human breast milk exosomes attenuate intestinal damage. Pediatr Surg Int. 36 (2), 155-163 (2020).
  8. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  9. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  10. Gandhi, J., Naik, M. N., Mishra, D. K., Joseph, J. Proteomic profiling of Aspergillus flavus endophthalmitis-derived extracellular vesicles in an in vivo murine model. Med Mycol. 60 (9), myac064(2022).
  11. Palinski, W., et al. Lysosome purinergic receptor p2x4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients. Cell Death Dis. 12 (9), 797(2021).
  12. Tantengco, O. aG., Radnaa, E., Shahin, H., Kechichian, T., Menon, R. Cross talk: Trafficking and functional impact of maternal exosomes at the feto-maternal interface under normal and pathologic statesdagger. Biol Reprod. 105 (6), 15621576(2021).
  13. Caruso Bavisotto, C., et al. Exosomal hsp60: A potentially useful biomarker for diagnosis, assessing prognosis, and monitoring response to treatment. Expert Rev Mol Diagn. 17 (9), 815-822 (2017).
  14. Feng, X., et al. Latest trend of milk-derived exosomes: Cargos, functions, and applications. Front Nutr. 8, 747294(2021).
  15. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

حويصلات خارج الخلوية في حليب الثديالترشيح السريعالطرد المركزي الفائقعزل الإكسوسوماتلطخة ويسترنالمجهر الإلكتروني النافذتتبع نانو سايتمؤشر CD63
العزل السريع للحويصلات خارج الخلية المشتقة من حليب الثدي البشري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.