مقالة منهجية

اختبار جرعة معدية من زراعة الأنسجة بنسبة 50٪ في الوقت الحقيقي ومبسط وخالي من الملصقات باستخدام المقاومة لقياس عيار الفيروسات الآلي

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67956

⸱

يناير 9, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Agilent Technologies, Inc.

في هذه المقالة

ملخص

يستفيد اختبار TCID50 المذكور هنا من قياسات المقاومة الفورية الخالية من العلامات ووحدة علم الفيروسات في النظام لمراقبة التأثيرات السيتوباتية الناتجة عن الفيروسات (CPE) بشكل موضوعي في الوقت الحقيقي. يقلل هذا الاختبار المبسط بشكل كبير من وقت التفاعل مع دعم قياسات CPE الحركية عالية الإنتاجية والقدرة على الإنتاج، وتمكين حسابات TCID50 آلية في الوقت الحقيقي.

الملخص

قياس عيار الفيروس، وهو تركيز الفيروس في العينة، هو إجراء أساسي في أبحاث علم الفيروسات. على الرغم من ضرورتها، فإن الطرق التقليدية مثل اختبار البلاك واختبار TCID50 قد تستغرق وقتا طويلا، وتتطلب تلوين أو وضع علامات على الكواشف، وغالبا ما تتطلب تفسيرا ذاتيا، خاصة عندما تكون التأثيرات السيتوباتية (CPE) دقيقة أو يصعب قياسها من خلال التصوير. على سبيل المثال، قد تستخدم اختبارات TCID50 أصباغ قابلية للحياة مثل MTT أو MTS، بينما تعتمد اختبارات البلاك على التصوير والتلوين لرؤية اللويحات الفيروسية، وكلاهما يمكن أن يسبب تبانا. علاوة على ذلك، تقدم هذه الطرق التقليدية فقط لمحة ثابتة عن العدوى الفيروسية، مما يحد من القدرة على التقاط التفاعلات الديناميكية بين الفيروسات والخلايا المسموح بها. لتجاوز القيود الحالية في قياس عيار الفيروس، تم تطوير اختبار TCID50 مبسط باستخدام تقنية قائمة على المقاومة لقياس CPE بشكل موضوعي وغير جراحي وفي الوقت الحقيقي، مما ألغى الحاجة إلى الملصقات. في هذه الدراسة، تم استخدام نموذجين للخلايا تسمح بالفيروس للتحقق من اختبار مقاومة TCID50: فيروس الغدة الموسوم ب GFP (Adv-GFP) في خلايا HEK293A وفيروس الإنفلونزا A (IAV) في خلايا MDCK. سير العمل بسيط، ويشمل بذر الخلايا، وتطعيم الفيروسات، والمراقبة اللحظية، والتحليل التلقائي ل TCID50 بواسطة البرنامج. خلال فترة الإصابة، تم حساب قيم TCID50 تلقائيا بواسطة برنامج النظام باستخدام صيغة ريد-مونش في جميع النقاط الزمنية المسجلة. كانت قيم TCID50 للتحليل الداخلي (IAV) التي تم الحصول عليها عبر قراءات الممانعة مماثلة لتلك الناتجة عن اختبار TCID50 التقليدي القائم على التلوين البنفسجي البلوري. تظهر هذه النتائج أن قياس الفيروس يمكن تحقيقه بدقة وكفاءة باستخدام قياس المقاومة بالاقتران مع وحدة علم الفيروسات في برنامج النظام. يبسط الاختبار الجديد الطرق التقليدية مع توفير رؤية معززة لديناميكيات الفيروسات، مما يدعم الأبحاث الفيروسية المتقدمة ويوسع التطبيقات السريرية المحتملة.

المقدمة

مع تطور أبحاث علم الفيروسات بسرعة، يبقى القياس الدقيق للعدوى الفيروسية أمرا حيويا لفهم آليات الفيروس، وتطوير العلاجات المضادة للفيروسات، وتقييم فعالية اللقاح. واحدة من أهم الإجراءات هي قياس عيار الفيروس، وهو تركيز جزيئات الفيروس في العينة. اختبار TCID50، الذي يحدد عدد جزيئات الفيروس المعدية المطلوبة لإنتاج CPE في 50٪ من الخلايا الملقحة، هو أحد أكثر الطرق استخداما لتحديد عيار الفيروسات الوظيفي. يعد هذا الاختبار الواسع الاستخدام للنهاية ذا قيمة خاصة للفيروسات التي لا تشكل لويحات ويمكن أن يكون بديلا لاختبار اللويحات1.

بشكل عام، تستغرق اختبارات TCID50 من 2 إلى 14 يوما، حسب نوع الفيروس والخلايا المسموح بها. يتم تقييم CPE، بما في ذلك التغيرات في تكاثر الخلايا، والشكل، وقابلية البقاء، إما من خلال (1) قياس اللون بعد إضافة كواشف، مثل اختبار MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) واختبار MTS (3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-yl)-5-(3-كربوكسي ميثوكسيفينيل)-2-(4-سلفوفينيل)-2H-تترازوليوم) باستخدام قارئ الألواح2أو (2) التقييم البصري للتغيرات الشكلية أو المرتبطة بالثقافة باستخدام منصات التصوير البصري — على سبيل المثال، تقييم CPE بقياس نسبة التقاء3، أو (3) الكشف البصري ل CPE عن طريق التلوين البنفسجي الكريستالي بعد تثبيت الآبار المعالجة بالفيروس باستخدام الفورمالين أو البارافورمالديهايد (PFA). معدل الإصابة الفيروسية الإيجابي المستمد من عدد النسخ الإيجابية ل CPE عند كل تخفيف فيروسي هو أساس حساب TCID50. يتم حساب التخفيف الذي تظهر فيه 50٪ من الثقافات CPE إحصائيا باستخدام الصيغ4 المعروفة، مثل ريد-مونش، سبيرمان-كاربر، وكاربر المحسن، ويتم الإبلاغ عن النتيجة ك TCID50 لكل مليليتر (TCID50/mL).

تعتبر اختبارات TCID50 التقليدية والبلاك على نطاق واسع المعيار الذهبي لقياس الفيروسات الوظيفية ويمكن أن توفر رؤى لا تقدر بثمن. ومع ذلك، غالبا ما تكون هذه الاختبارات مملة وتستغرق وقتا وتتطلب تلوينا يدويا لرؤية CPE، مما يؤدي إلى انخفاض معدل الإنتاجية، وزيادة مخاطر الخطأ البشري، والذاتية. بالنسبة للفيروسات شديدة العدوى أو القاتلة، فإن تقليل وقت التعرض للفيروسات وتقليل النفايات المحتوية على الفيروسات من الخطوات الإضافية مثل التلوين، من الاعتبارات المهمة لتحسين السلامة البيولوجية. باستثناء اختبار TCID50 المعتمد على التصوير الخالي من الملصقات، فإن معظم اختبارات TCID50 واللويحات هي أيضا اختبارات نهاية، مما قد يؤدي إلى توقيت غير مثالي لتقييم العيار ويحد من القدرة على مراقبة التفاعلات الديناميكية بين الفيروسات وخلايا المضيف. لتجاوز هذه القيود، تم تطوير وإنشاء اختبار TCID50 مبسط، خالي من الملصقات، وفي الوقت الحقيقي. بينما تشبه التجربة التقليدية TCID50 من حيث المفهوم، تستخدم الطريقة الجديدة قراءات مقاومة الخلوية، التي تلتقط وتحلل بواسطة نظام RTCA MP، لمراقبة العدوى بشكل موضوعي ومستمر على مدى الزمن.

لقد ثبت وتحقق من أن الاستشعار الحيوي القائم على المقاومة يوفر قراءة مركبة نوعية وكمية لعدد الخلايا، والشكل، وقوة الارتباط بالركيزة الخلوية بطريقة خالية من العلامات وغير جراحية 5,6. أظهرت دراسات سابقة أن CPE الناتج عن الفيروس يمكن قياسه بدقة في الوقت الحقيقي باستخدام قياسات مقاومة RTCA 7,8,9. بدلا من الإبلاغ عن قيم الممانعة الخام، تستخدم الأنظمة معاملة بدون وحدة تسمى مؤشر الخلية (CI) لعكس التغيرات في المعاوقة الناتجة عن الأحداث الخلوية. على سبيل المثال، عندما تلتصق الخلايا بقاع البئر، وتنتشر، وتنمو في قاع البئر، يزداد CI. وعلى العكس، عندما تموت الخلايا أو تنكمش أو تنفصل، كما حدث أثناء العدوى الفيروسية، ينخفض CI.

وبالنظر إلى التقارير الواعدة التي تستخدم المقاومة لقياس CPE، هدفت هذه الدراسة إلى إثبات أن اختبار TCID50 القائم على المقاومة هو بديل موثوق ودقيق لقياس الفيروسات التقليدي. تمكن وحدة علم الفيروسات في برنامج النظام من الحساب الآلي ل TCID50 طوال فترة قياس CPE في الوقت الحقيقي بالكامل، مما يبسط ويقصر عملية التحليل مع توفير رؤى قيمة حول حركية تكاثر الفيروسات وتفاعلها مع الخلايا المسموحة.

البروتوكول

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. اختبار TCID50 القائم على المقاومة

ملاحظة: كما يوضح الشكل 1 ، يتكون اختبار TCID50 القائم على المقاومة من أربع خطوات، تشمل البذر الخلوي المسموح به على لوحة مستشعر حيوي، تحضير وتطعيم تخفيف الفيروس، قياس CPE في النظام، وأخيرا تحليل البيانات وحساب TCID50 باستخدام وحدة علم الفيروسات في برنامج النظام.

  1. تحضير الاختبار: إحياء وزراعة الخلايا المسموح بها
    ملاحظة: يجب إجراء هذه الخطوة قبل أسبوع من الاختبار. لتقليل التفاوت بين التجارب، يوصى بشدة بإعداد بنك خلوي من الخلايا المسموح بها عند نفس رقم الممر لاستخدامه في الاختبار. لا تستخدم الخلايا التي يزيد عمرها عن 15 مقطعا بعد الشراء من مزود الخدمة.
    1. إذابة الخلايا المسموح بها المحجوزة بالتجميد
      1. وسط نمو الخلايا الدافئ في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. على سبيل المثال، تم استخدام وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو، المدعوم بنسبة 10٪ مصل البقر الجيني (FBS) و1٪ بنسلين/ستريبتومايسين، في HEK293A الزرعة.
      2. إذابة قارورة من الخلايا من بنك الخلايا المخصصة للتجميد لاختبارات TCID50 عن طريق التدوير الخفيف في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة حتى تظهر بعض بلورات الجليد؛ لا تغمروا الغطاء. امسح القارورة بنسبة 70٪ إيثانول وضعها في غطاء طبقي.
      3. انقل الخلايا بلطف إلى أنبوب مخروطي جديد بسعة 50 مل وأضف 9 مل من وسط النمو الدافئ إلى الخلايا.
      4. قم بجهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × g لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      5. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في 15 مل من وسط نمو دافئ. انقلها إلى قارورة T75 جديدة.
      6. تنمو الخلايا حتى تصل إلى 80٪-90٪ في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    2. زراعة فرعية للخلايا المسموح بها.
      1. راقب الخلايا حتى تصل إلى 80٪-90٪ من التلاصق.
      2. أزل الوسط المحتوي على المصل من القارورة وشطف طبقة الخلية أحادية الطبقة بلطف مرة واحدة بمحلول ملحي دولبيكو الخالي من المغنيسيوم والكالسيوم الخالي من الفوسفات (DPBS).
      3. قم بتربسين الخلايا بتوزيع 2 مل من محلول التريبسين/EDTA بنسبة 0.05٪ بالتساوي لكل قارورة T75 وترك القارورة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق.
        ملاحظة: لا تفرط في استخدام التربسين في الخلايا، لأن ذلك قد يكون ضارا للخلايا.
      4. أوقف التربسين بإضافة وسط يحتوي على المصل بحجم 8 مل لتخفيف حجم التربسين الأصلي خمسة أضعاف على الأناقص. انقل 2.5 مل من تعليق الخلية إلى قارورة T75 جديدة، ثم أضف 8 مل من وسط الزرعة.
        ملاحظة: تجنب استخدام الخلايا المسموح بها التي تم إذابتها حديثا في اختبار TCID50. بدلا من ذلك، استخدم خلايا مزروعة عند تلاقي 80٪-90٪. لتقليل التباين بين التجارب، يجب الحفاظ على الخلايا المعادة لمدة أسبوعين كحد أقصى بعد الذوبان. لضمان بقاء الخلايا وتكاثرها العالي خلال فترة الزراعة التي تستمر أسبوعين: (1) تغيير وسط النمو مرتين على الأقل في الأسبوع؛ (2) الخلايا الفرعية عندما تصل إلى التقاء 80٪-90٪. للصيانة الممتدة لأكثر من أسبوعين، يطلب التحقق من القانون.
  2. عيار الفيروسات
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في اليوم الأول.
    1. قياس خلفية لوحة المستشعر الحيوي
      1. انقل بعناية 50 ميكرولتر من الوسط المسبق التسخين إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات، باستخدام تقنية التوصيل العكسي لتقليل تكوين الفقاعات وضمان توزيع حجم متسق.
      2. ضع اللوحة في محطة اللوحة؛ افتح برنامج النظام واختر وحدة علم الفيروسات قبل بدء التجربة. أدخل أي ملاحظات ذات صلة في تبويب ملاحظات الخبرة ، وإدخال معلومات الخلية، بما في ذلك اسم الخلية ورقمها، في علامة تبويب الخلية الفرعية في تبويب التخطيط بعد اختيار الآبار المقابلة. بدلا من ذلك، يمكن إدخال معلومات الخلية بعد البذر.
        ملاحظة: يجب إجراء قياس خلفية الصفيحة قبل إضافة الخلايا إلى آبار اللوحة. يجب أن تقرأ القراءات الخلفية لجميع الآبار بين -0.063 و0.063.
      3. في تبويب الجدول ، انقر على زر إضافة خطوة لإضافة الخطوة 1، وهو مخصص لقياس خلفية اللوحة. ثم ابدأ التسجيل بالنقر على زر البدء .
      4. قم بإزالة اللوحة من المحطة ووضعها مرة أخرى في غطاء المحرك لزرع الخلية.
    2. التلقيح الخلوي المسموح به إلى صفيحة المستشعر الحيوية ذات 96 بئر
      1. قم بتريبسين الخلايا المسموح بها من قارورة T75.
      2. عد الخلايا واضبط تعليق الخلية إلى التركيز المطلوب. في هذه الدراسة، كان تركيز HEK293A 60,000 خلية/مل.
      3. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من اللوح.
        ملاحظة: الكثافة الصحيحة للخلايا أمر أساسي. كثافة البذر غير المثالية قد تؤدي إلى ظهور أثر تجريبي. لذلك، يجب تحسين كثافة البذر قبل إجراء اختبار TCID50.
      4. اترك اللوح في غطاء المحرك بدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بعد إضافة الخلية، مما يسمح للخلايا بالتوزيع بشكل متساو في قاع البئر.
        ملاحظة: الفشل في تنفيذ هذه الخطوة قد يؤدي إلى تغيرات كبيرة بين البئر.
      5. ضع الصفيحة في محطة اللوحة داخل حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      6. انتقل إلى تبويب الجدول في البرنامج وأضف الخطوة 2 باستخدام إعدادات التسجيل الافتراضية: 100 مسح وفاصل 15 دقيقة. سيبدأ هذا مراقبة الممانعة/العجز كل 15 دقيقة، مما يسمح بتقييم فوري لارتباط الخلايا وتكاثرها كخطوة مراقبة جودة الخلايا قبل تلقيح الفيروس.
        ملاحظة: اليوم الثاني - لتعظيم قابلية تكرار الاختبار واتساقه عبر التجارب، من الضروري تقييم أداء الخلايا على النظام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. نظرا لأن CI يعكس التصاق الخلايا ونموها، فإن قيم CI خلال فترة 20-28 ساعة بعد البذر تعد معاملا رئيسيا لمراقبة الجودة. كل من قيمة وحركية CI تعود إلى خلية محددة. في هذه الدراسة، بالنسبة ل HEK293A الخلايا التي تم زرعها عند 6,000 خلية في كل بئر وزرعت لمدة 20-28 ساعة، يجب أن يتجاوز عدد الخلايا الثقيلة 2. إذا لم يصل عدد الضمان إلى 2 خلال 20-28 ساعة بعد البذر، يعتبر HEK293A الزراعة الخلوية قد فشلت في مراقبة الجودة، ولن يتم إجراء اختبار TCID50 اللاحق. يضمن هذا المعيار قابلية تكرار عالية للنتائج التجريبية.
    3. تحضير تخفيف الفيروس بشكل متسلسل.
      1. احسب الحجم الكلي للوسط (DMEM + 2٪ FBS + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) اللازم لتحضير التخفيفات، وسخنه في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. سيتم استخدام الوسط لبقية التجربة.
      2. قم بإذابة قارورة تحتوي على مخزون الفيروس المجمعة بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة حتى تذوب جميع بلورات الجليد.
      3. تحضير فيروسات مخففة تسلسليا بمقدار 10 أطعاف عن طريق نقل 20 ميكرولتر من مخزون الفيروس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على 180 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا في كل خطوة. قم بوضع البيبيت للأعلى والأسفل لضمان خلط كامل للوسط والفيروس.
        ملاحظة: لا تغمس رأس الماصة بعمق شديد في المحلول الفيروسي لمنع حمل بقايا الجسيمات الفيروسية الزائدة خارج الطرف، مما قد يؤدي إلى تخفيف غير دقيق.
      4. لمنع تقلبات قراءات الممانعة الناتجة عن إضافة عينات فيروس البرد، قم بتسوية تخفيف الفيروس عن طريق حضانتها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 20 دقيقة قبل التطعيم.
    4. أدخل معلومات علاج الفيروس في تبويب التخطيط
      1. على لوحة التبويب Layout في البرنامج؛ اختيار الآبار للعلاج بعدادة الفيروس؛ انقر على علامة التبويب الفرعية المعالجة، وأدخل التخفيف الأولي، على سبيل المثال، 0.001 (10-3) في هذه التجربة؛ أدخل 10 ك "عامل التخفيف"؛ اختر اتجاه التخفيف من اليسار إلى اليمين في هذه الحالة. سيتم حساب تخفيف الفيروس تلقائيا بناء على إدخال تخطيط اللوحة وعرضه في كل بئر مقابل.
      2. بعد ذلك، أدخل حجم تطعيم الفيروس واضغط على زر التطبيق لحفظ جميع معلومات العلاج. تعد هذه الخطوة ضرورية لحساب TCID50/mL بدقة أثناء تحليل البيانات.
      3. قم بتعيين الآبار التي لن تعالج بالفيروسات كعناصر تحكم سلبية عن طريق اختيار الآبار المناسبة ثم التحقق من Ctrl السلبي تحت نوع البئر في تبويب العلاج .
        ملاحظة: يجب تعيين آبار التحكم السلبية وإضافتها إلى صفحة التخطيط؛ الحذف سيمنع حساب TCID50.
    5. تلقيح الفيروس
      1. عندما تكون جاهزا، اضغط على زر الإيقاف المؤقت في البرنامج لإيقاف جمع البيانات. أزل اللوحة من المحطة وضعها في غطاء الغطاء الطبقي.
      2. قم بإزالة وسط الزراعة بعناية من آبار اللوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات.
      3. أضف بلطف 50 ميكرولتر من تخفيف الفيروس باستخدام ماصة متعددة القنوات إلى أعلى طبقة الخلية الأحادية، لتجنب تعطيل مزرعة الخلية.
      4. أعد اللوحة إلى المحطة وأضف الخطوة 3 باستخدام إعدادات التسجيل الافتراضية (100 مسح وفاصل 15 دقيقة) في تبويب الجدول لاستئناف مقاومة التسجيل كل 15 دقيقة لمدة ساعتين، مما يسمح للفيروس بالارتباط بالخلايا.
      5. بعد ساعتين من تطعيم الفيروس، أوقف التسجيل وأزل اللوحة من المحطة إلى غطاء الغطاء الطبقي.
      6. أضف ببطء 150 ميكرولتر من الوسط المسبق التسخين إلى الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات، لتجنب تعطيل طبقة الخلية الأحادية؛ أعد اللوحة إلى المحطة.
      7. استأنف الخطوة الثالثة بالنقر على بدء في تبويب الجدول . يتم قياس إشارات الممانعة بشكل مستمر كل 15 دقيقة طوال فترة التطعيم.
    6. حساب TCID50 إما أثناء أو بعد اكتمال اختبار TCID50
      1. في تبويب تحليل البيانات ، اختر وأضف جميع الآبار المستخدمة في الاختبار إلى مخطط المخطط. يتم تحديد محور y للمخطط بواسطة الخيار المختار من قائمة المحور Y المنسدلة.
      2. انتقل إلى قسم المعلمات . اختر TCID50 من قائمة المعلمات المنسدلة لبدء حساب TCID50.
      3. اختر مخطط الشريط لحساب TCID50 في نقطة زمنية محددة أو اختر TCID50 المعتمد على الوقت لتوليد مسار TCID50 الزمني خلال فترة مرغوبة أثناء التطعيم. سيتم حساب TCID50/mL وعرضه بعد الضغط على زر التنفيذ.

2. اختبار البنفسج الكريستالي-TCID50

  1. الخلايا المسموح بها للبذور في صفيحة دقيقة بسعة 96 بئر عند كثافة البذور المثلى كما هو موصوف في اختبار TCID50 القائم على المقاومة (الخطوات 1-2).
  2. قم بتحضير التخفيف التسلسلي للفيروس والتطعيم كما هو محدد في اختبار TCID50 القائم على الممانعة.
  3. التثبيت والتلوين
    1. بعد الانتهاء من الاختبار، تخلص بلطف من المادة الفائقة من كل بئر وأضف 100 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 4٪ لتثبيت الخلايا.
    2. حضانة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعة، ثم أزل المثبت.
    3. صبغ الخلايا الثابتة ب 0.5٪ كريستال بيوليت محضر في PBS. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. اغسل الطبق بماء الصنبور حتى يتم تنظيف الخلفية. اترك الطبق يجف تماما في الهواء قبل التقطيع.
      ملاحظة: تعتبر نفايات البنفسج الكريستالي خطيرة بموجب كل من RCRA وقانون كاليفورنيا (CCR 66261.24). اجمع جميع المحاليل البنفسجية البلورية المستهلكة، والمواد الملوثة (مثل مناشف ورقية، قفازات)، واشطف النفايات في حاوية مخصصة للنفايات الخطرة. تخلص من النفايات عبر مقاول الصحة والسلامة البيئية (EH&S) أو المقاول المرخص للتخلص من النفايات الخطرة.
  4. التقييم وحساب TCID50
    1. افحص كل بئر بصريا للبحث عن CPE. البئر الإيجابي يظهر تدكما جزئيا أو كاملا في الطبقة الأحادية وتلوين أخف. البئر السالب يحتفظ بطبقة أحادية سليمة مع بقع بنفسجية داكنة.
    2. عد عدد الآبار الموجبة والسالبة لكل تخفيف.
    3. حساب TCID50/mL يدويا باستخدام طريقة ريد-مونش، بناء على حجم تلقيح 150 ميكرولتر.

النتائج

مراقبة ديناميكية بدون علامات وفورية وفورية لعملية CPE البوساطة بالفيروس باستخدام الممانعة
للتأكد من أن CPE الناتج عن الفيروس يمكن قياسه بشكل موثوق وكمي بواسطة الممانعة، سجلنا أولا التغيرات الخلوية في HEK293A الخلايا بعد عدوى Adv-GFP باستخدام نظام RTCA eSight الذي يقيس المعاوقة ويلتقط صور الخلايا الحية من نفس المجموعة، مقدما معلومات ثاقبة عن سلوك الخلية. تم زرع HEK293A الخلايا على صفيحة مستشعرة حيوية بسعة 96 بئر بكثافة بذر 6,000 خلية/بئر لمدة 24 ساعة، ثم أصيبت ب Adv-GFP بمعدل 104 وحدة IFU/مل. تم تسجيل المقاومة والتصوير بالخلايا الحية لمدة 250 ساعة بعد التطعيم (الشكل 2A). لتقليل التباين الناتج عن الاختلافات في بذر الخلايا وكشف التغيرات النسبية بعد العلاج، استخدم مؤشر الخلايا الطبيعية (NCI) لتمثيل التغيرات الجماعية في نمو الخلايا والارتباطها وقابليتها للبقاء مع مرور الوقت. يتم حساب NCI بقسمة CI في نقطة زمنية معينة على CI الخاص به عند نقطة التطبيع (الوقت قبل التطعيم). يظهر أثر ال NCI الحركي للضابط غير المصاب (الشكل 2A، الأثر الأسود) زيادة تدريجية خلال أول 48 ساعة، مما يشير إلى استمرار تكاثر الخلايا. يتبع ذلك هضبة في نهاية الاختبار، مما يشير إلى أن الخلايا أصبحت متلاقية وغطت كامل مساحة سطح حساسات الذهب البيولوجية. على النقيض من ذلك، انخفضت حركية NCI من الآبار المصابة بالفيروس إلى ما دون مستوى الضابطة بعد 50 ساعة من التطعيم وتراجعت تدريجيا حتى وصلت إلى الصفر عند 100 ساعة.

أكد التصوير البصري للخلايا الحية التي تم الحصول عليها من نفس مجموعة الخلايا أن إشارة المقاومة تعكس بشكل موثوق الحالة الفيزيائية للخلايا المسموح بها أثناء تقدمها عبر كامل سلسلة CPE. كما هو موضح في الشكل 2A، هناك ارتباط عكسي بين NCI والتعبير عن GFP الفيروسي في خلايا HEK293A المصابة لوحظ خلال أول 100 ساعة قبل التحلل الكامل للخلايا المسموح بها. بالإضافة إلى ذلك، تظهر صور الخلايا الحية (الشكل 2B) المسجلة في النقاط الزمنية المحددة حالة خلية تسمح بها أثناء العدوى الفيروسية. استمر نمو الخلايا خلال أول 48 ساعة بعد العدوى، بينما بقيت جزيئات الفيروس عند مستويات منخفضة داخل الخلايا. ومع ذلك، مع تقدم تكاثر الفيروس والعدوى، بدأ موت الخلايا، كما يتضح من انخفاض التقاء الفيروس وزيادة إشارة GFP في خلايا المضيف. بعد حوالي 100 ساعة من التطعيم، بدأ تعبير الفيروس في الانخفاض بسبب الفقدان الكبير للخلايا القابلة للقبول. يعزز هذا النهج المتكامل موثوقية اكتشاف CPE الناتج عن الفيروس عن طريق المقاومة، مما يؤسس أساسا قويا لاختبار TCID50 القائم على المقاومة.

حساب آلي ل TCID50 مشتق من قراءة المعاوقة
التعرف بدقة على آبار CPE الإيجابية أمر بالغ الأهمية لحساب TCID50 الموثوق. لتقييم ما إذا كان اختبار TCID50 القائم على المقاومة يمكنه التمييز بدقة وموضوعية بين CPE الإيجابي والسالب بدعم من وحدة علم الفيروسات في برنامج النظام، تم زرع الخلايا HEK293A عند 6000 خلية/بئر لمدة 24 ساعة قبل التطعيم وعالجت بسلسلة من تخفيفات العشرة أضعاف من Adv-GFP، باستخدام ثمانية نسخ (آبار) لكل تخفيف. تم تسجيل CPE الناتج عن الدفاع المفرط في الوقت الحقيقي على نظام RTCA. في الشكل 3A، تم تسجيل ورسم آثار الحركية للممانقة، المقدمة كمؤشر NCI، ورسم تلقائيا طوال التجربة. يكشف انخفاض مؤشر المقاومة النارية بعد التطعيم عن وجود CPE واضح يعتمد على الجرعة، يتضح من الارتباط القوي بين كمية الفيروس المضافة ومعدل انخفاض إشارة الممانعة. أظهرت الخلايا التي تعرضت لأحمال فيروسية عالية، بين 10-3 إلى 10-7 تخفيف، انخفاضات حادة ومتسقة في ال NCI، مما يعكس وجود CPE قوي وموحش عبر الآبار المكررة. على النقيض من ذلك، عند تخفيف الفيروس 10-8 ، أظهر الأثر الحركي تباينا كبيرا منذ البداية، مما أدى إلى انحرافات معيارية أكبر بشكل ملحوظ في NCI، خصوصا بعد 100 ساعة من التطعيم. عندما تم تقليل الحمل الفيروسي أكثر إلى ما دون العتبة المطلوبة لإحداث العدوى، في هذه الحالة، تخفيفا بنسبة 10-10 ، أصبح مؤشر العدوى غير قابل للتمييز عن الضوابط السلبية. تشير هذه البيانات إلى أنه عند تخفيف 10-8 ، 1) لم يستطع الفيروس تحفيز CPE في جميع الآبار المتكررة عند نفس الحركة؛ 2) سيكون هذا التخفيف خط فاصل بين التركيزات التي تسبب CPE في جميع التكرارات وتلك التي تحفز CPE فقط في بعض أو لا شيء من التكرارات؛ تشكل هذه النتيجة الثنائية، سواء كانت مصابة (تشير إلى تغييرات CI الناتجة عن CPE) أو غير مصابة (بدون تغيير في CI)، أساسا لحساب TCID50 باستخدام الطرق الإحصائية في برمجيات النظام. لذلك، فإن التفاوت العميق في مؤشر العدوى النارية عند تركيزات معينة من الفيروسات يعد مؤشرا محوريا لحدوث عدوى جزئية وقد يكون حاسما في الاستنتاج المطلوب لحساب TCID50.

مثل اختبار TCID50 الكلاسيكي، يجب تحديد عتبة CPE الإيجابية قبل أن يتمكن البرنامج المدمج من تحديد الآبار الإيجابية تلقائيا ل CPE. نظرا لأن الفيروسات المختلفة ونماذج الخلايا المسموح بها قد تتطلب عتبات مميزة، يسمح البرنامج للمستخدمين بتكوين وتحسين هذه المعايير ضمن وحدة علم الفيروسات. استنادا إلى البيانات التجريبية، تم تطبيق العتبة الافتراضية للبرنامج لإيجابية CPE، والتي عرفت بأنها قيمة NCI للصحة المعالجة بالفيروس أقل بأكثر من ثلاثة انحرافات معيارية عن متوسط NCI للعناصر السلبية (غير الملقحة)، أي <المعالجة بالفيروس NCI (NCI-3 X SD) السلبية ctrl. ثم تم تقييم الآبار الفردية إما موجبة (+) أو سالبة (-) (الشكل 3B). في هذه الحالة، تم حساب TCID50/mL من Adv-GFP لاحقا باستخدام صيغة ريد-مونش، وهي واحدة من الصيغ المدرجة في البرنامج. بخلاف اختيار أو تحديد معايير CPE إيجابية، لم تكن هناك حاجة لإجراءات يدوية لحساب TCID50، حيث كان البرنامج يقوم بأتمتة العملية بالكامل.

التتبع الديناميكي ل TCID50 أثناء الإصابة بالفيروس
لتحديد المدة المناسبة لاختبار TCID50، تم استخراج قيم Adv-GFP TCID50 في النقاط الزمنية المرغوبة بعد العدوى، بدءا من 30 ساعة، واستمرت بزيادات 30 ساعة حتى 240 ساعة. تم اختيار زيادة 30 ساعة عمدا حيث يقال إن تكاثر الفيروس الغدي يستغرق حوالي 30 ساعةو10 ساعات. تم رسم قيم Adv-GFP TCID50 كدالة للزمن (الشكل 4). ومن الملاحظة البارزة الزيادة التدريجية لقيم TCID50، والتي تستمر حتى حوالي 150 ساعة بعد التطعيم. بعد هذه النقطة، تظهر هضبة، مما يشير إلى توازن حيث من المحتمل أن تكون التأثيرات السيتوباتية قد وصلت إلى التشبع. تشير الزيادة المعتمدة على الزمن، تليها الاستقرار، إلى منحنى تكاثر الفيروس النموذجي. تتميز المرحلة الأولى بانتشار نشط للفيروسات، وتبلغ ذروتها في ذروة تعكس أقصى تأثير خلوي في الظروف التجريبية المعطاة. قد تعكس مرحلة الهضبة في TCID50 سقفا بيولوجيا حيث تكون عملية العدوى الفيروسية قد شغلت غالبية الخلايا المسموح بها، مما يؤدي إلى موت خلوي كبير ووقف المزيد من تكاثر الفيروس. تشير دورة الوقت الحركي ل TCID50 إلى إمكانية إنهاء الاختبار بعد ستة إلى سبعة أيام من التطعيم لنموذج HEK293A الفيروس-الغدي، حيث لوحظ قيمة ثابتة ل TCID50 تبلغ 8.9 × 109 TCID50/mL في وقت مبكر يصل إلى 150 ساعة.

قياس عيار فيروس الإنفلونزا A باستخدام اختبار TCID50 القائم على المقاومة
للتحقيق فيما إذا كان يمكن توسيع اختبار TCID50 القائم على المقاومة إلى نماذج أخرى من الفيروس والمضيف، تم إجراء اختبار TCID50 في خلايا MDCK المصابة ب IAV. مع مراعاة التغيرات الطفيفة في وسط العدوى الخاص بفيروس الالتهاب الداخلي، ظل إجراء الفحص الأساسي متسقا مع النظام الذي تم تحديده للفيروس الغدي. يظهر الشكل 5A مقدار NCI لخلايا MDCK على مر الزمن بعد التطعيم باستخدام تخفيفات IAV تتراوح من 1 × 10-2 إلى 5 × 10-9. مماثلة للنتائج التي لوحظت في خلايا HEK293 A المصابة ب Adv، أظهرت آبار التحكم غير المصابة/السلبية NCI ثابتا ومتسقا عبر النسخ المكررة. ومع ذلك، كشفت الآبار المصابة بالفيروس عن تغير في NCI يعتمد على الجرعة. عند الجرعات المنخفضة، تخفيفات 6.4 و1.3 × 10-7 ، لوحظ انحراف معياري كبير. وهذا يشير إلى أنه عند هذه التخفيفات، كان تركيز الفيروس يقترب من TCID50.

تم تحديد الآبار الإيجابية ل CPE باستخدام نفس المعايير والعتبة المطبقة في نموذج Adv-HEK293A، وتحديدا انحراف معياري ثلاثي الأضعاف تحت متوسط الآبار الضابطة السالبة. كما تم تحديد قيم TCID50 القائمة على المعاوقة لنظام IAV في نقاط زمنية مختلفة بعد التطعيم. يوضح الشكل 5B متوسط قيم TCID50 من تجربتين مستقلتين. باستثناء النقطة الزمنية المبكرة عند 60 ساعة، أظهرت قيم TCID50 بعد 90-150 ساعة من العدوى استقرارا وثباتا جيدين، مما يشير إلى أن اختبار TCID50 القائم على المقاومة للعلاج بمثابة IAV يمكن إكماله بشكل موثوق في أربعة أيام بدلا من خمسة. تعزز هذه الاتساق متانة الطريقة القائمة على الممانعة، مؤكدة قدرتها على التكيف والموثوقية عبر مسببات الأمراض الفيروسية المختلفة.

التحقق من صحة اختبار TCID50 القائم على الممانعة باستخدام طريقة TCID50 التقليدية
للتحقق من TCID50 المستمد من المقاومة لقياس تركيز IAV، تم إجراء اختبارات TCID50 باستخدام نهجين بديليين بالتوازي: التصوير الخالي من العلامات والتلوين البنفسجي الكريستالي. لفترة وجيزة، تم تجهيز خلايا MDCK وزرعها في صفائح ميكروتيتر بسعة 96 بئرا. في اليوم التالي، تم تطعيم الخلايا بسلسلة من تخفيفات الالتهاب الداخلي الداخلي لمدة 5 أيام. في اختبار TCID50 المعتمد على التصوير، تم التقاط تصوير الخلايا الحية كل 4 ساعات. تم تقييم تركيزات عشر عينات من IAV في دراسة التحقق. تمت مقارنة التقاء الآبار المعالجة بالفيروس مع الآبار السلبية غير المصابة باستخدام برنامج النظام. ومع ذلك، كان تحليل التصوير لخلايا MDCK تحديا خاصا، كما هو موضح في الشكل 6A. كان التمايز الدقيق بين الخلايا والفراغات الفارغة تحديا بسبب الشكل المسطح والحواف غير المحددة جيدا لخلايا MDCK، مما أثر على التعرف الموثوق على آبار CPE الإيجابية من خلال التحليل المعتمد على التصوير. استخدام برامج تحليل التصوير الأكثر تقدما وتطورا قد يعزز دقة حسابات TCID50 في مثل هذه الحالات11. في هذه الحالة، لم ينجح تقييم TCID50 المعتمد على التصوير الخالي من التسمية باستخدام برنامج النظام الحالي. في اختبار التلوين البنفسجي البلوري - TCID50، تم تثبيت الخلايا وصبغها في اليوم الخامس بعد التطعيم كما هو موضح في قسم البروتوكول. يوضح الشكل 6B وجود ارتباط خطي قوي بين قيم TCID50 المعتمدة على المقاومة وقيم التلوين البنفسجي البلوري، مع معادلة انحدار بقيمة y = 0.9582x وR² = 0.9979. يؤكد هذا التحليل المقارن موثوقية الطريقة القائمة على المقاومة لقياس عيار الفيروسات وملاءمتها لاختبارات TCID50.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل اختبار TCID50 القائم على المقاومة (المقاومة والمقاومة). الخطوة 1: بذر الخلايا المسموح به على لوحة المستشعر الحيوي. زرع الخلايا المسموح بها على صفيحة بكثافة بذور مثالية. يتم بعد ذلك مراقبة نمو الخلايا في النظام كجزء من إجراء مراقبة جودة الخلية (QC). الخطوة 2: تحضير الفيروسات والتطعيم. جهز مخزونات الفيروسات المخففة بشكل متسلسل باستخدام عامل تخفيف محدد من قبل المستخدم. قم بإزالة اللوحة من النظام وإضافة الفيروسات إلى آبار اللوحة في غطاء طبقي. الخطوة 3: قياس وتقييم آبار CPE الإيجابية باستخدام برنامج وحدة علم الفيروسات. أعد اللوحة إلى النظام واستأنف تسجيل CPE الناتج عن الفيروسات في الوقت الحقيقي. يقوم البرنامج تلقائيا بتحديد الآبار الإيجابية ل CPE بناء على العتبة المحددة من قبل المستخدم لاكتشاف CPE. الخطوة 4: حساب TCID50. مع التقييم في الوقت الحقيقي لآبار CPE الإيجابية مقارنة بتحصين الفيروس، يمكن لبرنامج وحدة علم الفيروسات حساب قيم TCID50 في أي نقطة زمنية خلال الاختبار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تم تقييم CPE الناتج عن فيروس الغدة باستخدام كل من الطرق القائمة على المعاوقة والتصوير (أ) التحليل الديناميكي للممانعة (المحور الأيسر) والفلورة الخضراء (المحور الأيمن) في HEK293A الخلايا مع مرور الوقت بعد الإصابة ب Adv-GFP. يتم رسم مؤشر الخلايا الطبيعية للخلايا المصابة بفيروس الغدي (المصابة بفيروس الغدي NCI، الخط الأحمر)، وخلايا التحكم السلبية (NCI NC، الخط الأسود)، والكثافة المتكاملة الكلية ل GFP (مصابة ب GFP Adv، الخط الأخضر) كدالة للزمن. تعكس شدة GFP المتكاملة الكلي تعبيرا في الخلايا المسموح بها وتعمل كمؤشر على العدوى الفيروسية. الأرقام (1-6) على مؤشر الخلايا الطبيعية تتوافق مع نقاط زمنية محددة خلال عملية العدوى. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (N = 8). (ب) صور متسلسلة لخلايا HEK293A قبل وبعد الإصابة بفيروس الغدينو-GFP. (1) تتبع الصورة الأساسية (0 ساعة) لقطات عند 48 ساعة (2)، 72 ساعة (3)، 96 ساعة (4)، 120 ساعة (5)، و200 ساعة (6) بعد العدوى، مما يوضح التغير في نمو الخلية، وقابلية البقاء، وتوهج فيروس الغدينو-GFP مع مرور الوقت. أشرطة المقياس = 160 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: CPE المعتمد على الجرعة لفيروس الغدي (GFP) في HEK293A الخلايا التي تم قياسها بالممانعة. (أ) تم زرع HEK293A الخلايا في صفيحة مستشعرة حيوية بكثافة 6,000 خلية/بئر، وبعد 24 ساعة، أصيبت بسلسلة من الفيروسات الغدية المخففة بعشرة أضعاف. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (N = 8). الإدخال الداخلي: مؤشر الخلايا الطبيعي للآبار المصابة بفيروس الغدية-GFP عند تخفيف 10-8 . تم حذف بيانات التخفيفات 10-9، 10-11، و10-12 للتوضيح. (ب) تم تقييم الآبار/النسخ الفردية عند كل تخفيف للفيروس إما كإيجابية CPE (+) أو سلبية CPE (-). تم معالجة كل عمود من عمود اللوحة بتخفيف فيروس مختلف، حيث تراوح تدرج التخفيف من أدنى في العمود 1 إلى الأعلى في العمود 10. كانت الأعمدة 11 و12 آبار تحكم سلبية، دون علاج للفيروس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: المسار الزمني لقيم TCID50 المستمدة من قياسات مقاومة CPE في خلايا HEK293 بعد الإصابة بفيروس الأدينو-GFP. تم حساب TCID50/mL من فيروس الغدية-GFP في النقاط الزمنية المحددة باستخدام وحدة علم الفيروسات من خمس تجارب. على الرغم من أن وحدة علم الفيروسات توفر ثلاث صيغ حساب TCID50، إلا أن صيغة ريد-مونش تم اختيارها لحساب TCID50. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (N = 5). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تقييم عيار فيروس الإنفلونزا A باستخدام اختبار TCID50 القائم على المقاومة. (أ) CPE المعتمد على الجرعة لفيروس الالتهاب الصناعي في خلايا MDCK يقاس عبر الممانعة. تم زرع خلايا MDCK في صفيحة مستشعر حيوي عند 8000 خلية/بئر، وأصيبت بعد 24 ساعة بتخفيف متسلسل خماسي لفيروس الإنفلونزا. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (N = 8). تم حذف بيانات من تخفيف 2.6 × 10⁻⁸ للوضوح. (ب) المسار الزمني لقيم TCID50 المستمدة من قياسات الممانعة في خلايا MDCK المصابة ب IAV. تم استخدام طريقة ريد-موينش لحساب TCID50. تعرض البيانات كمتوسط ± SD (N = 2). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: الارتباط بين اختبارات TCID50 القائمة على المقاومة والاختبارات المعتمدة على التلوين البنفسجي البلوري. (أ) صورة لخلايا MDCK الملقحة ب IAV. شريط المقياس = 160 ميكرومتر. (B) تم إجراء مقارنة بين قيم TCID50/mL التي تم الحصول عليها من طرق التلوين المعتمدة على المقاومة والبلورات البنفسجية باستخدام عشر عينات من IAV. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: الواجهات التمثيلية لبرنامج وحدة علم الفيروسات في النظام. يقوم البرنامج بتبسيط عملية اختبار TCID50 المعتمدة على الممانعة. (1) تخطيط اللوحة لتسجيل تصميم التجربة؛ (2) تم رسم مؤشر الخلية أو مؤشر الخلايا الطبيعية تلقائيا وعرضه بواسطة البرنامج أثناء تلقيح الفيروس؛ (3) يوفر البرنامج مرونة في تحديد معايير CPE الإيجابية والخيارات لصيغة حساب TCID50؛ (4) يمكن تحديد TCID50/mL في أي نقطة زمنية أثناء الاختبار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

في هذه الدراسة، تم إثبات تطبيق الممانعة لتحديد عيار الفيروسات باستخدام نماذج فيروس الغدية-HEK293A والإنفلونزا A-MDCK. كما أكد آخرون الكشف القوي والموثوق عن التهاب الدماغ المزمنة الناتج عن الفيروس باستخدام أنظمة RTCA عبر مجموعة واسعة من الفيروسات، بما في ذلك فيروس الجدري12، فيروس غرب النيل (WNV) وفيروس التهاب الدماغ في سانت لويس (SLEV)13، فيروس شيكونغونيا14، فيروس الجراب المعدي8، حمى الضنك الصفراء الكيميرية15، فيروس التهاب الكبد A16، SARS-CoV-217، وفيروس حمى الضنك9.

يتيح تسجيل CPE في الوقت الحقيقي من خلال المقاومة اكتشاف انخفاضات زمنية محددة في قيمة CI في بعض نماذج الخلايا التي تسمح بالفيروس. أظهر فانغ وآخرون أولا أن معامل حركية يصف CPE الناتج عن فيروس فلافيروس، CIT50—التعريف بأنه الوقت الذي يصل إلى انخفاض 50٪ في مقاومة الخلية—يتناسب عكسيا مع الجرعة المعدية الفيروسية ضمن نطاق محدد. كما أظهروا أن CIT50 يتناسب مع العكسية للعيار13 من الأجسام المضادة المعادلة. منذ ذلك الحين، قام شارتييه وآخرون في شركة سانوفي باستور بدراسة هذه الطريقة المعتمدة على مقاومة التحليل الخلوي في الوقت الحقيقي (RTCA) لتحديد عدادات العدوى الفيروسية أثناء تطوير منتج وعملية لقاح الحمى الصفراء الكيميرية (CYD) وعملية15. قام شارتييه وآخرون بتأكيد هذه الجرعة المعدية 50٪ (CCID50) المعتمدة على مقاومة الزراعة الخلوية من خلال اختبار CCID50 قائم على التلوين المناعي. أظهروا أن طريقة RTCA القائمة على المقاومة أقل كثافة عملية بحوالي 5 مرات وأكثر فعالية من حيث التكلفة بحوالي 5 مرات وأكثر فعالية من حيث التكلفة بمقدار 3.5 مرات مقارنة باختبار CCID50 القياسي في بيئة صناعية. في دراستنا، تم إثبات التحقق من TCID50 القائم على المقاومة مقابل اختبار TCID50 التقليدي من Crystal Violet لاختبار CPE الناجم عن IAV. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام وحدة برنامج علم الفيروسات في برنامج RTCA. تم تحديد الآبار الإيجابية ل CPE تلقائيا بناء على معايير يحددها المستخدم للآبار الإيجابية في البرمجيات؛ في حالتنا، تنخفض درجة العجز الداخلي مقارنة بالعناصر السلبية. ثم تم حساب TCID50 بواسطة البرنامج وفقا لذلك، مما مكن من تحديد العيار بدقة دون الاعتماد على CIT50 أو المخاطرة بسقوط عينة الاختبار خارج النطاق الأمثل. تحديد عتبة مناسبة لآبار CPE الإيجابية أمر بالغ الأهمية لأنه يؤثر مباشرة على حساسية وخصوصية الاختبار. يوصى بأن يحدد المستخدمون معايير خاصة بالفيروس من خلال مقارنة تغييرات مؤشر الخلايا مع نتائج طريقتهم التقليدية المعتمدة. يمكن بعد ذلك تكوين هذه العتبات المشتقة تجريبيا وتحسينها داخل وحدة علم الفيروسات في البرنامج.

مثل غيرها من الاختبارات المعتمدة على الخلية، فإن حالة الخلايا المسموح بها المستخدمة في اختبارات TCID50 القائمة على المقاومة أمر بالغ الأهمية في تحديد نجاح الاختبار وجودة النتائج. لضمان تكاثر الخلايا العالي وقابلية البقاء، يوصى باستخدام خلايا جديدة منخفضة الممر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحسن إنشاء بنك خلوي من الخلايا القابلة للمرور في نفس الممر من قابلية التكرار عبر التجارب. كما هو موضح في الشكل 3A، عندما كانت الخلايا المسموح بها في ظروف مثالية، تولد إشارات مقاومة مستقرة ومتسقة في الضوابط غير المصابة طوال الفحص بأكمله. وفر مرجعا أساسيا موثوقا لتحديد عتبة لآبار إيجابية ل CPE، مما أدى إلى تحديد دقيق للعيار الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، فإن اختبار TCID50 القائم على المقاومة قادر بشكل فريد على إجراء مراقبة جودة على الخلايا المسموح بها قبل تقييم عيار الفيروس. يعمل ملف الCI الحركي المميز للخلايا الصحية المسموح بها كمقياس موثوق لمراقبة الجودة، يضمن استخدام مجموعات الخلايا الحية والمتسقة فقط لقياس الفيروسات، مما يعزز قابلية التكرار ودقة الاختبار.

لكل فيروس جديد، يجب أيضا إجراء تحسين والتحقق من اختبار مقاومة TCID50 قبل التنفيذ. عوامل رئيسية، مثل ظروف زراعة الخلايا، بما في ذلك الوسط القاعدي وتركيز FBS، حاسمة لتحقيق بيانات مقاومة خلوية قابلة للتكرار وتعزيز حساسية كشف CPE، كما أبرزت الدراساتالسابقة 6,16. في هذا الصدد، أثبتت التكنولوجيا الخالية من العلامات والمعتمدة على المقاومة في الوقت الحقيقي أنها أداة بسيطة وفعالة وقيمة لتحسين ظروف زراعة الخلايا أثناء تطوير التحليل16.

ينشأ قيد اختبار مقاومة TCID50 مع الفيروسات التي لا تسبب CPE، حيث يعتمد الاختبار على CPE لتوليد تغييرات في قراءة المعاوقة، وهو ما يشكل أساس حساب TCID50. في مثل هذه الحالات، قد يكون من الضروري تحديد نموذج خلية بديل يسمح به يمكن أن يظهر CPE ناتج عن الفيروس أو اعتماد نهج تلوين المناعة، بشرط توفر جسم مضاد مناسب ضد مستضد الفيروس المحدد. ومع ذلك، أظهرت هذه الدراسة قدرة نظام RTCA MP على التقاط CPE المعتمد على الجرعة والتمييز بفعالية بين مجموعات الخلايا المصابة وغير المصابة من خلال قراءة مقاومة موضوعية وحساسة.

يمثل إدخال تحليل TCID50 المعتمد على الوقت تقدما كبيرا مقارنة بقياسات النقاط النهائية التقليدية. يبسط عملية تحسين اختبار TCID50، حيث يمكن الحصول بسهولة على نقطة زمنية مثالية لحساب وتقرير عيار الفيروسات من اختبار واحد في الوقت الحقيقي. بينما يمكن لاختبارات TCID50 الخالية من الملصقات المعتمدة على التصوير أن توفر أيضا قيم TCID50 محددة زمنيا، إلا أن تطبيقها يقتصر على نماذج الخلايا الفيروسية التي تظهر CPE يمكن التعرف عليه بواسطة خوارزميات برامج التصوير، كما هو موضح في نموذج IAV-MDCK (الشكل 6A). علاوة على ذلك، فإن استخدام مقاومة خالية من العلامات لكشف CPE يقضي على تعقيدات استخدام كواشف مختلفة وسير عمل متعدد الخطوات التي قد تزيد من المخاطر المرتبطة بالأخطاء البشرية. بالإضافة إلى تبسيط سير العمل، تقوم وحدة علم الفيروسات في برنامج النظام أيضا بتبسيط عملية الاختبار. أولا، يبدأ الأمر بإعداد جدول تجارب سهل للتسجيل التلقائي الذي يتحكم به النظام. يتبع ذلك تقييم إيجابي CPE بشكل تلقائي في الوقت الحقيقي بعد كل قياس، وينتهي بحساب TCID50 الآلي لقياس جزيئات الفيروس المعدية بشكل مباشر (الشكل 7). تقلل هذه الأتمتة بشكل كبير من وقت التفاعل اليدوي، وهو تحسن حاسم، خاصة عند التعامل مع الفيروسات شديدة العدوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ تريبسين 0.53 ملليمورا EDTA  (1x)كورنينغ25-052-CI
12 خزانا لكاشف القناةتقنيات فيستا لاب3054-1011
فيروس الأدينو-GFPفيكتور بايولابز 1060
DMEM mediumATCC30-2002
E-Plate VIEW 96أجيلينت300601020
مصل الأبقار الجنينيأفانتور97068-085
خلية Hek293Aثيرمو فيشر ساينتفيك   R70507
محلول البنسلين-ستريبتوميسينهايكلونSV30010
محلول محلول الفوسفات (1x)هايكلونSH30256.01
أجوروز اللوحة البحريةلونزا50101
نظام xCELLigence RTCA eSightأجيلينتS2833AA
نظام xCELLigence RTCA MPأجيلينت380601040

المراجع

  1. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  2. Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).
  3. Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics. J Virol Methods. 299, 114318(2022).
  4. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).
  5. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  6. Atienza, J. M., et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).
  7. Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).
  8. Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).
  9. Goh, V. S. L., et al. Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2. Virology J. 21 (1), (2024).
  10. Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells. PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).
  11. Wang, T. E., et al. Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN). PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).
  12. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).
  13. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  14. Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).
  15. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).
  16. Lebourgeois, S., et al. Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus. Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).
  17. Suryadevara, N., et al. Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

cytopathic HEK293A MDCK
اختبار جرعة معدية من زراعة الأنسجة بنسبة 50٪ في الوقت الحقيقي ومبسط وخالي من الملصقات باستخدام المقاومة لقياس عيار الفيروسات الآلي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.