نموذج المثانة في المختبر لعدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل نموذجا في المختبر للمسالك البولية القسطرة ، والذي يمكن استخدامه لدراسة كل من مجموعات الخلايا البكتيرية المرتبطة بالعوالق والأغشية الحيوية في التهابات المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة المحاكاة. يمكن استخدام هذا النموذج بشكل أكبر لدراسة فعالية المنتجات المضادة للميكروبات التي تهدف إلى السيطرة على التهابات المسالك البولية.

الملخص

تعد التهابات المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة (CAUTIs) من بين أكثر أنواع العدوى المرتبطة بالرعاية الصحية شيوعا. يعد تكوين الأغشية الحيوية على القسطرة البولية جانبا رئيسيا في التسبب في هذه الالتهابات ، وغالبا ما يؤدي إلى انسداد القسطرة ومضاعفات خطيرة مثل التهاب الحويضة والكلية وتسمم الدم. تعد مناهج نمذجة ودراسة تكوين الأغشية الحيوية في هذا الإعداد ضرورية لكل من الفهم الأساسي للآليات التي تقوم عليها التسبب في CAUTI ، بالإضافة إلى التطوير والتقييم القوي قبل السريري للاستراتيجيات العلاجية الفعالة للسيطرة على CAUTI وانسداد القسطرة. يصف هذا البروتوكول نموذجا في المختبر للمسالك البولية القسطرة ، والذي يكرر نظام التصريف المغلق بالقسطرة كما هو مستخدم في الممارسة السريرية ، مما يسهل دراسة تكوين CAUTI والأغشية الحيوية للقسطرة في ظل ظروف تمثيلية. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول تفاصيل تطبيق نموذج المثانة في المختبر لتقييم فعالية منتجات صيانة القسطرة المضادة للميكروبات ، بما في ذلك المنتجات المتوفرة حاليا على سلسلة التوريد NHS.

المقدمة

القسطرة البولية هي من بين أكثر الأجهزة الطبية انتشارا ، حيث يقدر معدل انتشارها بنسبة 19٪ في مرافق الرعاية الحادة^1،2،3. يتم نشر القسطرة بشكل أساسي للمساعدة في إدارة إخراج البول في حالات ضعف المثانة ، ويتم إدخالها مباشرة في المثانة ، مما يسمح للبول بالتفريغ من المثانة عبر التجويف^{المركزي 2،3}. يمكن استخدام القسطرة البولية إما بشكل متقطع ، حيث يتم إدخالها في المثانة بشكل دوري لتصريف البول ، أو يمكن استخدام القسطرة الساكنة ، حيث تترك القسطرة في مكانها في المثانة لتصريف البول^{باستمرار 3،4}. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع ، فإن القسطرة البولية هي أكبر عامل خطر لتطور التهابات المسالك البولية (UTIs) ، والتي تمثل ما يقدر بخمس الالتهابات المرتبطة بالرعاية الصحية^5،6. في الواقع ، غالبا ما تعمل القسطرة نفسها كموقع أولي للاستعمار الميكروبي ، مما يوفر سطحا لمسببات الأمراض البولية للالتصاق بالمسالك البولية واستعمارها^{بشكل أكبر 1،6،7،8}. تقريبا جميع المرضى الذين يخضعون لقسطرة مستمرة طويلة الأمد (حيث تترك القسطرة في مكانها لمدة ≥28 يوما) سيعانون من البيلة الجرثومية ، مع زيادة الخطر بنسبة ~ 5٪ لكل يوم تكون فيه القسطرة في الموقع^2،9،10،11. بالتناسب ، يرتبط حوالي 80٪ من عدوى المسالك البولية باستخدام قسطرة بولية⁶.

تمثل التهابات المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة عبئا كبيرا على الخدمات الصحية، وغالبا ما ترتبط بأعراض التهاب المسالك البولية العلوي الأكثر خطورة (مثل التهاب الحالب والتهاب الحويضة والكل) من عدوى المسالك البولية غير المصحوبة بمضاعفاتها، فضلا عن زيادة خطر الإصابة بعدوى مجرى الدم الثانوية^{1،7،12،13،14}. تشمل العلاجات القياسية ل CAUTIs العلاج بالمضادات الحيوية ، ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه الالتهابات متمردة للعلاج المضاد للميكروبات نتيجة لتطور مجتمعات الأغشية الحيوية المعقدة على سطح القسطرة^{15،16،17،18،19،20}. في الواقع ، تشير التقديرات إلى أن ~ 80٪ من CAUTIs ناتجة عن مسببات أمراض المسالك البولية المكونة للأغشية^{الحيوية 19}. يتميز تكوين الأغشية الحيوية بربط الخلايا البكتيرية بأسطح القسطرة وتطور المجتمعات المضمنة في مصفوفة واسعة من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) ^{21،22،23،24}. يعد إنتاج EPS سمة مميزة لمجتمعات الأغشية الحيوية وهو مسؤول عن العديد من الخصائص الناشئة التي تظهرها الخلايا المرتبطة بالأغشية الحيوية ، مثل المقاومة المرتفعة للعوامل المضادة للميكروبات وإزالة المناعة^21،22،24. يمكن أن يلعب EPS دورا مباشرا في هذه الأنماط الظاهرية من خلال حماية الخلايا جسديا وحمايتها من مضادات الميكروبات أو المؤثرات المناعية ، وكذلك بشكل غير مباشر من خلال تسهيل تطوير جوانب أوسع من مجتمعات الأغشية الحيوية مثل البيئة المكروية الفيزيائية والكيميائية للأغشية الحيوية وتكوين الخلايا الثابتة^{23،24،25،26}. علاوة على ذلك ، فإن بعض مسببات الأمراض المسببة للبول ، بما في ذلك Proteus spp. ، والتي تمثل ~ 11٪ من CAUTIs ، تمتلك إنزيمات يورياز قوية ، مما يمكنها من تحلل اليوريا الموجودة في البول مما يؤدي إلى زيادة إجمالية في درجة الحموضة البولية^{2،27،28،29،30}. يصاحب هذه الزيادة في الأس الهيدروجيني ترسيب بلورات فوسفات الكالسيوم والمغنيسيوم ، والتي يمكن دمجها في الأغشية الحيوية المتنامية ، مما يؤدي إلى التمعدن الحيوي وتشكيل هياكل غشاء حيوي بلورية كثيفة يمكن أن تسد القسطرة. لا تجعل هذه الأغشية الحيوية البلورية العلاج مشكلة فحسب ، بل يمكن أن تبدأ أيضا مضاعفات خطيرة مثل التهاب الحويضة والكلية وتسمم الدم^{2،28،31،32،33،34}.

يشكل المكانة البيئية المعقدة في المسالك البولية القسطرة ، والدور المهم لتكوين الأغشية الحيوية في هذه الالتهابات ، تحديات خاصة في دراسة التسبب في CAUTI. النماذج المختبرية البسيطة والمستخدمة على نطاق واسع لدراسة وتحديد تكوين الأغشية الحيوية ، مثل المقايسات القائمة على الألواح ذات 96 بئرا ، غير كافية لدراسة تكوين الأغشية الحيوية في CATUI ، وخاصة الأغشية الحيوية البلورية. على سبيل المثال ، لا تأخذ هذه النماذج في الحسبان الجوانب الرئيسية لمكانة CAUTI ، مثل بيئة المغذيات المعقدة التي يوفرها البول ، وكيف يؤثر سطح القسطرة على الالتصاق وإنتاج الأغشية الحيوية اللاحقة ، والتدفق المستمر لوسط البول^{35،36،37،38،39،40}. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما لا تعكس المقايسات القياسية المستخدمة لتحديد قابلية مضادات الميكروبات لمسببات الأمراض البولية القابلية السريرية في العالم الحقيقي. كثيرا ما تستخدم فحوصات الحد الأدنى من التركيز المثبط واختبارات التعليق الميكروبي لاستنتاج قابلية مسببات الأمراض CAUTI لمضادات الميكروبات ، ولكنها عادة لا تحاكي المتغيرات المهمة لبيئة CAUTI ، مثل تأثير وجود قسطرة بولية وأي تكوين غشاء حيوي لاحق قد يحدثه على قابلية مضادات الميكروبات^41،42،43.

توضح هذه الدراسة بالتفصيل إعداد وتشغيل نموذج المثانة في المختبر الذي يحاكي بيئة المسالك البولية القسطرة ، ويكرر نظام تصريف مغلق قسطرة قياسي كما هو مستخدم في الممارسة السريرية ، والذي وصفه لأول مرة Stickler et ^al.44 في عام 1999 (الشكل 1). يستخدم هذا النموذج قسطرة فولي ذات الحجم القياسي (المتوفرة حاليا في سلسلة توريد NHS) ، ووسائط البول الاصطناعية (AUM) كما هو موضح سابقا بواسطة Nzakizwanayo et ^al.45لمحاكاة تكوين CAUTI والأغشية الحيوية. يتكون نموذج المثانة في المختبر من غرفة زجاجية مزدوجة الجدران تعمل بمثابة "المثانة" ولها منفذ يمكن من خلاله إدخال قسطرة فولي في الغرفة الزجاجية المركزية. في الجزء العلوي من الغرفة الزجاجية المركزية ، يوجد مدخل يمكن من خلاله توفير AUM إلى "المثانة" بمعدل تدفق مناسب بيولوجيا باستخدام مضخة تمعجية ، والتي ستتدفق عبر القسطرة عبر فتحات التصريف إلى كيس النفايات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توصيل الغرفة الخارجية بدائرة حمام مائي ، مما يسمح بالحفاظ على النماذج عند درجة حرارة ثابتة. يمكن تلقيح نموذج المثانة في المختبر عبر الغرفة المركزية ، مما يسمح بدراسة مسببات الأمراض CAUTI في مكانة تمثيلية بيولوجيا. علاوة على ذلك ، نظرا لأن النماذج يتم قسطرتها وتزويدها باستمرار ب AUM جديد ، يمكن دراسة ديناميكيات النمو والسكان لكل من الخلايا المرتبطة بالعوالق والأغشية الحيوية.

استخدمت الدراسات السابقة نماذج المثانة في المختبر للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك الدراسة الأساسية لتكوين الأغشية الحيوية في مسببات الأمراض البارزة في CAUTI ، بما في ذلك Proteus mirabilis و Escherichia coli ^{43،45،46،47،48،49}. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام النموذج في المختبر لتقييم فعالية المنتجات التي تهدف إلى التحكم في CAUTI أو منع الانسداد^50،51،52. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام النماذج لتحديد ما إذا كانت التكيفات والطفرات المرتبطة بمقاومة مضادات الميكروبات تؤثر على تكوين الأغشية الحيوية والتسبب في CAUTI في P. mirabilis^43،46. تم استخدام نموذج المثانة في المختبر أيضا لدراسة العلاجات الجديدة المضادة للميكروبات التي تهدف إلى علاج CAUTI ، بما في ذلك طلاء القسطرة العلاجية المصممة حديثا وعلاجات العلاج^{بالعاثيات 47،48}. يشمل هذا البروتوكول إعداد وتشغيل نماذج المثانة في المختبر ، وتعداد الخلايا العوالق والخلايا المرتبطة بالغشاء الحيوي القابلة للحياة من النموذج وسطح القسطرة البولية على التوالي ، وقياس درجة الحموضة البولية لمراقبة إنتاج اليورياز. كما تم تفصيل البروتوكولات لتقييم المنتجات المضادة للميكروبات التي تهدف إلى علاج أو الوقاية من CAUTI ، بما في ذلك محاليل ري المثانة والمواد الهلامية لزيوت التشحيم المضادة للميكروبات ، وهي متوفرة حاليا في سلسلة التوريد NHS.

البروتوكول

يظهر تمثيل تخطيطي لإعداد نموذج المثانة في المختبر في الشكل 1. تم تصميم نماذج المثانة في المختبر لتكون متوافقة مع قسطرة فولي القياسية (الأبعاد الموضحة في الشكل 1 متوافقة مع القسطرة الفرنسية ذات الحجم القياسي 14). قم بتعقيم جميع معدات نموذج المثانة في المختبر ، وقم بتثبيت أي أنابيب سيليكون مستخدمة في دائرة الوسائط قبل الاستخدام. مطلوب الالتزام الصارم بالتقنية المعقمة طوال إعداد النماذج المختبرية ، ويوصى بتجميع النموذج في ظل ظروف معقمة (أي في خزانة أمان ميكروبية من الفئة الثانية أو غطاء تدفق رقائقي). يوصى بالحد الأدنى من n = 5 تكرارات لتحديد الدلالة الإحصائية لتجارب نموذج المثانة في المختبر . وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحضير وسائط البول الاصطناعية

ملاحظة: يوصى باستخدام وسائط البول الاصطناعية (AUM) في نماذج المثانة في المختبر نظرا للكميات الكبيرة من الوسائط المطلوبة للتجريب ، والتباين المرتبط بعينات البول البشرية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إعداد الأصول المدارة كما هو موضح سابقا وتم تحسينه للاستخدام في نموذج المثانة في المختبر بواسطة Nzakizwanayo et al. (الحجم النهائي 5 لتر)^{43،45،46،48،53،54}.

1. إعداد حل الأصول المدارة 1
   1. قم بوزن المركبات التالية وأضفها إلى زجاجة بورسليكات سعة 1 لتر مملوءة ب 850 مل من الماء منزوع الأيونات: 3.25 جم من سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl_{2.6H 2}O) ، 23 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl ) ، 11.5 جم من كبريتات الصوديوم اللامائية (Na₂SO₄) ، 3.25 جم من سترات ثلاثي الصوديوم (Na₃C₆H₅O₇) ، 0.1 جم من أكسالات الصوديوم (Na₂C₂O₄) ، 14 جم من فوسفات أحادي البوتاسيوم (KH₂PO₄) ، 8 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 5 جم من كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl) ، 25 جم من الجيلاتين ، و 5 جم من مرق الصويا التربتون.
2. أثناء تقليب محلول AUM ، قم بقياس الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني واضبطه على 5.75 (± 0.02) بإضافة 3 M NaOH أو HCl حسب الاقتضاء.
   ملاحظة: يجب إضافة هيدروكسيد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك لضبط الأس الهيدروجيني إلى AUM بالتنقيط لمنع ترسيب الملح من المحلول.
3. بمجرد ضبط درجة الحموضة AUM ، قم بتعبئة المحلول إلى الحجم النهائي البالغ 1 لتر بالماء منزوع الأيونات وتعقيم الأوتوكلاف.
   ملاحظة: بمجرد تعقيمه ، يمكن تخزين المحلول لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر في درجة حرارة الغرفة (يجب التخلص من محلول AUM 1 إذا لوحظ هطول الأمطار أو الغيوم).
4. بشكل منفصل ، قم بإعداد محلول AUM 2 ، عن طريق إضافة 125 جم من اليوريا (CH₄N₂O) و 2.45 جم من كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) إلى 400 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات في دورق معقم سعة 500 مل.
   ملاحظة: ينتج عن تحضير محلول يوريا الكالسيوم 2 تفاعل ماص للحرارة ، لذلك يوصى بتقليب محلول AUM 2 وتسخينه إلى ~ 50 درجة مئوية على لوح ساخن / محرك مغناطيسي بينما تذوب المركبات لمنع التجمد.
5. بمجرد ذوبان اليوريا وكلوريد الكالسيوم ، قم بتصفية محلول التعقيم 2 باستخدام مضخة تفريغ ووحدات تصفية النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر ، في زجاجة زجاجية معقمة سعة 500 مل. بمجرد تعقيمه ، يكون المحلول 2 مستقرا لمدة ثلاثة أشهر عند 4 درجات مئوية أو شهر واحد في درجة حرارة الغرفة
   ملاحظة: يجب تجاهل الحل 2 للإدارة الذاتية في حالة ملاحظة هطول الأمطار أو الغيوم.
6. في غطاء التدفق الرقائقي أو خزانة السلامة الميكروبيولوجية من الفئة الثانية ، اجمع بشكل معقم بين محاليل AUM 1 و 2 مع 3.6 لتر من الماء المعقم منزوع الأيونات في زجاجة شفاط زجاجية معقمة سعة 5 لتر. يجب أن تكون الأصول المدارة صفراء شاحبة وشفافة.
7. باستخدام ماصة مصلية، قم بإزالة 50 مل من إجمالي حجم الأصول المدارة وحصتها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل، واحتفظ بها للاستخدام لاحقا.
8. أغلق زجاجة الشفاط باستخدام سدادة مطاطية أو رقائق ألومنيوم واتركها في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تجميع النماذج في المختبر .
9. قم بإزالة 10 مل من AUM بشكل معقم من 50 مل واحتفظ بباقي المحلول لتحضير اللقاح. باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، قم بقياس الرقم الهيدروجيني ل 10 مل من AUM ، والذي يجب أن يكون ~ درجة الحموضة 6.1 (±0.2). تكون الأصول المدارة المحضرة مستقرة في درجة حرارة الغرفة لمدة شهر تقريبا ، ويجب التخلص منها في حالة حدوث هطول أمطار أو غيوم.

2. إعداد نموذج المثانة في المختبر

1. أدخل قسطرة فولي في الغرفة الزجاجية المركزية لنموذج المثانة في المختبر (تخطيطي مفصل في الشكل 1). قم بتأمين القسطرة في مكانها عن طريق نفخ البالون بحقنة الماء المعقم المرفقة، وقم بتوصيل كيس النفايات بمنفذ القسطرة.
2. قم بتوصيل جهاز طراز المثانة في المختبر ⁴⁵ بخزان AUM عبر أنبوب التوصيل. قم بتوصيل أنابيب دائرة الوسائط بالمضخة التمعجية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مما يضمن أن الأنبوب لديه توتر كاف دون التمدد.
3. قم بتوصيل نماذج المثانة في المختبر بحوامل المشبك ، وقم بتأمين أكياس النفايات في حوامل أسفل النماذج لضمان التدفق عبر النماذج عبر الجاذبية.
4. قم بتوصيل الغرفة الخارجية لنموذج المثانة بحمام مائي دائري عبر أنابيب سيليكون (الشكل 1 ب). اضبط الحمام المائي على درجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بتشغيل دوامات الخزان.
   1. قم بتشغيل الحمامات المائية لمدة 30 دقيقة قبل تلقيح نماذج المثانة في المختبر لضمان استقرار درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ، والتأكد من بقاء الحمام المائي مرتفعا إلى مستوى الماء المناسب طوال مدة التجريب.
5. قم بإزالة أي مشابك من أنابيب الوسائط واضبط المضخات التمعجية لتعمل بسرعة 0.75 مل / دقيقة تقريبا لتكرار إنتاج بول الإنسان (~ 1080 مل / يوم). سيتم حساب معدلات التدفق الفعلية أثناء التجريب.
6. قم بتشغيل AUM من خلال نماذج المثانة في المختبر عبر المضخة التمعجية لمدة 30 دقيقة قبل التلقيح للتأكد من أن تدفق الوسائط بمعدل ثابت وأن نظام التصريف المعقم سليم.
7. قم بتصريف أي وسائط متراكمة من كيس النفايات قبل التجريب. يمكن قياس حجم الوسائط لحساب معدلات التدفق الدقيقة (مفصلة في الخطوة 4).

3. تلقيح نماذج المثانة في المختبر

1. قم بإعداد الثقافات الليلية لنماذج المثانة في المختبر عن طريق تعليق حلقة من المستعمرات البكتيرية المزروعة على أجار صلب إلى 10 مل من مرق LB. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التحريض.
   ملاحظة: يمكن استخدام نموذج المثانة في المختبر لدراسة مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض CAUTI ، بما في ذلك السلالات الإيجابية لليورياز مثل Proteus mirabilis ، ويمكن تعديل وسائط النمو المستخدمة وفقا لذلك.
2. قم بالطرد المركزي للحجم الكامل للاستزراع الليلي عند 4,500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من AUM وقم بقياس الامتصاص عند OD_{595 نانومتر} باستخدام مقياس الطيف.
3. تطبيع المزارع المعلقة إلى OD_{595 nm} من 1.0 وحجم نهائي قدره 10 مل في الأصول المدارة باستخدام المعادلة التالية:
   
   حيث ،_{A 1} هو الامتصاص عند OD_{600 نانومتر} من الثقافة الليلية ، A₂ هو الامتصاص المطلوب عند OD_{600 نانومتر} من اللقاح (1.0) ، V₂ هو الحجم المطلوب لللقاح (10 مل) ، و V₁ هو الحجم المطلوب للثقافة الليلية للتطبيع.
   ملاحظة: 10 مل من معلق OD_{595 نانومتر} 1.0 سيضمن تلقيح النماذج بحوالي 10¹⁰ CFU من معظم السلالات البكتيرية (تم التحقق من صحتها ل Proteus mirabilis و Escherichia coli و Enterococcus faecalis و Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus ) ، مما يؤدي إلى تكرار عدوى ثابتة. يمكن تعديل اللقاح المبكر اعتمادا على الأنواع المستخدمة أو مرحلة العدوى التي يتم نمذجتها (أي يمكن استخدام كثافة اللقاح المنخفضة لمحاكاة العدوى في المرحلة المبكرة)⁴⁷.
4. قم بتعقيم نماذج المثانة في المختبر باستخدام 70٪ من الإيثانول وإزالة السدادة (مدخل الوسائط) بحيث يمكن الوصول إلى الغرفة الداخلية. قم بإزالة 10 مل من AUM من الحجم داخل نموذج المثانة باستخدام ماصة مصلية.
   ملاحظة: عند تلقيح النماذج في المختبر وأخذ العينات منها من الغرفة المركزية ، تأكد من أن العمل سريع ومعقم ، وارتد دائما معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، وقم بتطهير القفازات والأسطح بانتظام بنسبة 70٪ من الإيثانول.
5. قم بتلقيح نماذج المثانة في المختبر عبر الغرفة المركزية باستخدام المعلق الطبيعي بالكامل سعة 10 مل واخلطه جيدا باستخدام ماصة مصلية. قم بإزالة 10 مل من الغرفة المركزية لنماذج المثانة في المختبر باستخدام ماصة مصلية وكمية في 15 مل عالميا لحسابات CFU / مل لاحقة وقياس الأس الهيدروجيني.
6. قم بتطهير الأسطح الخارجية لنموذج المثانة تماما والسدادة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واستبدل السدادة. استأنف تدفق الوسائط لفترة وجيزة للتأكد من وصول مستوى الأصول المدارة في الحجرة المركزية إلى ثقب العين، قبل إيقاف التدفق.
7. اسمح للثقافات بالتأسيس في نموذج المثانة لمدة 1 ساعة قبل تشغيل تدفق الوسائط عبر المضخة التمعجية عند ~ 0.75 مل / دقيقة.
8. أثناء إنشاء اللقاح ، قم بإعداد التخفيفات من العينة المأخوذة من الغرفة المركزية.
   1. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من العينة بشكل متسلسل في 900 ميكرولتر من PBS المعقم حتى يتم تخفيف العينة إلى ^10-7. قم بإزالة 10 ميكرولتر من البقع من التخفيفات في ثلاث نسخ على وسائط صلبة مناسبة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
   2. بعد الحضانة ، عد المستعمرات على كل لوحة تخفيف واحسب CFU / مل بالضبط للتلقيح الأولي.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم أنواعا متجمعة ، مثل Proteus mirabilis ، فاستخدم أجار MacConkey بدون ملح (الببتون 20.0 جم / لتر ، اللاكتوز 10.0 جم / لتر ، أملاح الصفراء 5.0 جم / لتر ، الأحمر المحايد 0.075 جم / لتر وأجار 12.0 جم / لتر) لضمان بقاء المستعمرات المفردة مرئية لسهولة العد.
9. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بتشغيل تدفق الوسائط عبر المضخة التمعجية لبدء تشغيل نماذج المثانة في المختبر ، مع ملاحظة الوقت الذي يتم فيه تشغيل النماذج.

4. حساب معدل تدفق نموذج المثانة في المختبر

1. بمجرد تلقيح النماذج في المختبر وبدء تدفق الوسائط ، اسمح للنماذج بالعمل لمدة 4 ساعات. أوقف تدفق الوسائط مؤقتا لفترة وجيزة واجمع الحجم الكامل للإدارة المتبقية من كيس النفايات في قارورة حجمية عبر منفذ الصرف. لاحظ المجلد الذي تم جمعه.
   ملاحظة: يمكن حساب معدل التدفق من حجم الوسائط التي تم جمعها في الخطوة 2.7 ، ولكن يمكن الحصول على معدلات تدفق أكثر دقة عن طريق تشغيل النماذج لفترة أطول (أي موصى بها 4 ساعات) لأن هذا يقلل من احتمالية وجود هواء متبقي في أنابيب دائرة الوسائط يؤثر على معدل التدفق المحسوب.
2. استأنف تدفق الوسائط عبر المضخة التمعجية ، مع التأكد من إغلاق منفذ تصريف أكياس النفايات ، للحفاظ على نظام تصريف معقم.
3. لحساب معدل التدفق الفعلي للنماذج المختبرية ، استخدم المعادلة التالية:
   
   ملاحظة: يوصى بمعدلات تدفق تتراوح بين 0.55-1.0 مل / دقيقة لتكرار إنتاج البول البشري.
4. إذا تم حساب معدل تدفق الوسائط خارج النطاق المقبول، فتخلص من التكرار واضبط عدد الدورات في الدقيقة على المضخة التمعجية ليتناسب مع النطاق المقبول.

5. أخذ عينات من الخلايا العوالق من نموذج المثانة في المختبر

ملاحظة: يجب أخذ عينات من نماذج المثانة في المختبر بشكل روتيني خلال التجربة لمراقبة ديناميكيات السكان. يجب أخذ عينات من جميع النماذج مباشرة بعد التلقيح ، عند نقطة تنشيط تدفق الأصول المدارة ، بعد 4 ساعات من التلقيح (عند حساب معدل التدفق) ، وعند هذه النقطة ، يتم إنهاء النماذج (إما انسداد أو نقطة نهاية محددة مسبقا). في حالة تشغيل النماذج لمدة >24 ساعة ، يوصى بأخذ عينات كل 24 ساعة لمراقبة CFU / مل ، ويمكن أخذ عينات إضافية على النحو المطلوب من قبل المستخدمين.

1. قم بتطهير سدادة نموذج المثانة بنسبة 70٪ من الإيثانول وإزالتها للوصول إلى الغرفة المركزية.
2. تجنب طرف القسطرة والبالون، امزج محتويات الحجرة المركزية برفق باستخدام ماصة مصلية.
3. باستخدام ماصة مصلية ، قم بإزالة عينة سعة 10 مل من الغرفة ، وانقلها إلى أنبوب معقم. قم بتطهير السدادة على الفور بنسبة 70٪ من الإيثانول واستبدلها ، واستكمال دائرة الصرف المعقمة والمغلقة.
4. قم بإزالة 1 مل من العينة باستخدام ماصة ، وقم بتحويلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل للتخفيفات التسلسلية.
5. قم بقياس الرقم الهيدروجيني للعينة المتبقية باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، مع التأكد من خلط العينة جيدا ، ومعايرة مقياس الأس الهيدروجيني قبل الاستخدام.
6. قم بتخفيف كمية 1 مل المحجوزة من العينة بشكل متسلسل ، وقم بلوحة على وسائط صلبة مناسبة كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.8 ، مع طلاء جميع التخفيفات.
   ملاحظة: عينات العوالق المأخوذة من نموذج المثانة مناسبة للتحليلات الأخرى ، بما في ذلك تطبيقات البيولوجيا الجينومية أو الجزيئية (اختياري).

6. أخذ عينات من الخلايا المرتبطة بالغشاء الحيوي من نموذج المثانة في المختبر

1. إزالة القسطرة وتحضيرها
   ملاحظة: أخذ عينات الأغشية الحيوية لنماذج المثانة في المختبر هو تحليل نقطة النهاية ، ويتطلب تعطيل النماذج وإزالة القسطرة للمعالجة.
   1. افصل كيس النفايات عن القسطرة ، واستنزاف أي بقايا بول من النموذج عن طريق تفريغ البالون. قم بإزالة القسطرة من أسفل النموذج باستخدام ملقط معقم.
   2. ضع القسطرة التي تمت إزالتها على لوح معقم ، وباستخدام مشرط معقم ، قم بقطع القسطرة في النقاط المطلوبة للتقسيم (كما هو موضح في الشكل 2).
   3. تأكد من قطع أقسام القسطرة بالطول لفضح التجويف. بعد ذلك ، باستخدام ملقط معقم ، اغمس قسم القسطرة 3 مرات في PBS معقم لإزالة الخلايا غير الملتصقة.
      ملاحظة: في حالة تصوير أقسام القسطرة في اتجاه مجرى النهر ، أي باستخدام SEM ، اترك أقساما بطول 1 سم سليمة (لا تقطع بالطول) وبدلا من ذلك قم بإزالة الرطوبة الزائدة من التجويف بمنشفة ورقية معقمة قبل التثبيت.
2. تعطيل الأغشية الحيوية لتعداد CFU / مل
   ملاحظة: قد تتطلب البروتوكولات التي توضح بالتفصيل اضطراب الخلايا المرتبطة بالغشاء الحيوي مزيدا من التحسين إذا كانت الأغشية الحيوية بلورية أو مخاطية على نطاق واسع.
   1. احتضان قسم القسطرة المحضر في 0.25٪ تربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يجب أن يكون حجم التربسين المستخدم هو الحد الأدنى المطلوب لتغطية القسطرة. على سبيل المثال ، بالنسبة لقسم قسطرة 1 سم مقطوع بشكل عمودي ، يكفي 1 مل من 0.25٪ تربسين.
   2. بعد الحضانة ، صوتنة المحلول الذي يحتوي على القسطرة لمدة 10 دقائق. يمكن بعد ذلك إزالة قسم القسطرة والتخلص منه. لإلغاء تنشيط التربسين ، يجب تخفيف محلول الخلية على الفور في PBS معقم وطلاءه لأعداد CFU على الوسائط الصلبة المناسبة ، كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.8.
3. قياس الأغشية الحيوية للقسطرة عن طريق تلطيخ البنفسجي البلوري
   1. أضف أقسام القسطرة المحضرة إلى الآبار في صفيحة بئر مسطحة القاع ذات الحجم المناسب. استخدم حجما مناسبا من محلول البنفسجي البلوري 0.1٪ لغمر قسم القسطرة بالكامل ، واحتضانه بشكل ثابت في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تأكد من تضمين قسم قسطرة معقمة أيضا كعنصر تحكم في الخلفية.
   2. قم بإزالة أقسام القسطرة من اللوحة ، وانقلها إلى لوحة جديدة. اغسل كل قسم من القسطرة مرتين بالماء المقطر.
   3. بعد الشطف ، انقل أقسام القسطرة إلى طبق جديد ، وقم بتغطيتها بحمض الأسيتيك بنسبة 33٪. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بإزالة قسم القسطرة من اللوحة ، وبعد ذلك ، باستخدام قارئ الألواح ، قم بقياس OD_{595 نانومتر} لكل تكرار ، باستخدام الآبار التي تحتوي على أقسام القسطرة المعقمة كعناصر تحكم في الخلفية.

7. اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات في نموذج المثانة في المختبر

ملاحظة: معظم العلاجات التي تهدف إلى السيطرة على عدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة متوافقة مع قسطرة فولي القياسية ، وتحقق من التوافق قبل البدء في تجارب نموذج المثانة في المختبر .

1. مواد التشحيم المضادة للميكروبات
   ملاحظة: لمحاكاة استخدام عوامل التشحيم عند إدخال القسطرة ، يجب تنفيذ هذه الخطوة خلال الخطوة 2.1 ، مباشرة قبل إدخال قسطرة فولي. بعد إدخال القسطرة ، يجب توصيل النموذج على الفور ، والخطوة 2.6. يجب حذفه حتى لا يتم تخفيف الجل وتصريفه قبل التلقيح. يجب أن يتم التلقيح في نفس يوم إدخال القسطرة. يتم تعبئة عوامل التشحيم المصممة للاستخدام مع القسطرة كمحاقن فردية ومعقمة تستخدم مرة واحدة بحجم 6 مل أو 11 مل. ما يقرب من 5 مل من مواد التشحيم كافية لملء عنق نموذج المثانة وتغطية قاعدة النموذج.
   1. باستخدام تقنية التعقيم ، أدخل نهاية المحقنة التي تحتوي على عامل التشحيم في عنق نموذج المثانة ، وأدخل 5 مل من الجل لملء الرقبة والدخول إلى قاعدة الغرفة.
   2. قم بتدوير النموذج بحيث تكون القاعدة مغلفة بالتساوي بالهلام ، ثم أدخل قسطرة فولي في النموذج عن طريق دفع طرف القسطرة عبر الجل وقم بتثبيتها عن طريق ملء البالون كالمعتاد.
   3. قم بتوصيل النموذج ببقية الإعداد ، ثم املأ تجويف النموذج بالبول حتى يبدأ في التصريف. بمجرد أن يبدأ البول في التصريف من خلال ثقب العين في القسطرة ، أوقف المضخة لمنع فقدان الجل قبل التلقيح.
      1. احتضان النماذج لمدة 30 دقيقة للسماح للبول بالوصول إلى 37 درجة مئوية ، ثم تلقيح النماذج كما هو موضح سابقا لضمان توحيد وقت الانتشار لمكونات الهلام في حجم البول.
   4. قم بتلقيح النموذج كما هو موضح في الخطوة 3.5 واتركه يحتضن لمدة ساعة واحدة قبل تشغيل المضخات التمعجية. عند نقطة تشغيل المضخة ، خذ عينة عوالق سعة 1 مل وقم بإخراج التخفيفات لأعداد CFU كما هو موضح في الخطوة 3.8.
2. حلول الري
   ملاحظة: غالبا ما تتوفر محاليل الري بكميات كبيرة أو على شكل "أكياس" فردية ومعقمة تستخدم مرة واحدة. في حالة استخدام المحاليل الفردية ، تأكد من أنها متوافقة مع منافذ تصريف القسطرة المراد استخدامها قبل التجريب. في حالة استخدام محاليل الري بالجملة ، تأكد من استخدام قسطرة ثلاثية التجويف ، واتباع تعليمات الشركة المصنعة لتحديد الحجم / الإطار الزمني لإدارة المنتج.
   1. قبل العلاج ، قم بتشغيل النماذج في المختبر لمدة 4 ساعات على الأقل لضمان حصول المجتمعات المرتبطة بالغشاء الحيوي على الوقت الكافي لتأسيسها. بمجرد تشغيل النماذج لمدة 4 ساعات، أوقف تدفق الوسائط مؤقتا وخذ عينة معالجة مسبقة من الغرفة الداخلية للنماذج المختبرية ، كما هو مفصل في الخطوة 5.
      ملاحظة: في حالة استخدام محاليل الري بالجملة ، انتقل إلى الخطوة 7.2.5.
   2. إذا كنت تستخدم "كيس" ري فردي ، افصل كيس النفايات عن القسطرة واستخدم الغطاء المرفق مع الكيس لإغلاق كيس النفايات. قم بتوصيل كيس محلول الري على الفور بالقسطرة ، وباستخدام الضغط الخفيف ، اضغط على المنتج في التجويف المركزي. يطبق وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة (أي تطبيق لمدة 15 دقيقة).
   3. بمجرد اكتمال العلاج الموصى به ، اسمح للمحلول المتبقي بالتصريف من الغرفة الداخلية عبر ثقب عين القسطرة في كيس الري ، ثم افصل الحقيبة. يمكن التخلص من المحتويات المتبقية من الحقيبة أو استخدامها لمزيد من التطبيقات النهائية.
   4. قم بتعقيم منفذ تصريف القسطرة ومنفذ توصيل كيس النفايات بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وأعد توصيلهم ، واستكمال نظام تصريف معقم ومغلق.
      ملاحظة: استمر في الخطوة 7.2.7 في حالة استخدام أكياس الري.
   5. في حالة استخدام قسطرة ثلاثية التجويف ، قم بتطهير منفذ تجويف الري بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وابدأ على الفور في الري باستخدام حقنة معقمة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: قم بقياس حجم البول المتبقي في كيس النفايات قبل الري بحيث يمكن حساب ذلك في أي وقت انسداد نهائي أو حسابات معدل التدفق.
   6. بمجرد اكتمال الري ، تخلص من المحقنة وأي محلول ري متبقي في كيس النفايات.
   7. خذ عينة ما بعد المعالجة من الغرفة المركزية لنموذج المثانة في المختبر ، كما هو مفصل في الخطوة 5، واستأنف تدفق الأصول المدارة عبر المضخة التمعجية لمواصلة التجريب.

8. إنهاء تجريب نموذج المثانة في المختبر

ملاحظة: الكائنات الحية الإيجابية لليورياز مثل المتصورة ميرابيليس يمكن أن تسبب انسداد القسطرة البولية عن طريق تكوين الأغشية الحيوية البلورية. وبالتالي يمكن استخدام الانسداد كنقطة نهاية ذات صلة بيولوجيا لنماذج المثانة في المختبر ويتم تحديده بشكل واضح عن طريق الانسداد الكامل لثقوب القسطرة ذات الأغشية الحيوية البلورية وزيادة حجم الأصول المدارة في الغرفة المركزية ل "المثانة" الزجاجية (الشكل 3).

1. بمجرد تشغيل نماذج المثانة في المختبر إلى نقطة النهاية المحددة مسبقا ، والتي قد تكون انسدادا أو وقت تشغيل محددا ، قم بإيقاف تشغيل تدفق الأصول المدارة عبر المضخة التمعجية وخذ عينة نقطة النهاية من الغرفة المركزية كما هو موضح في الخطوة 5.
2. قم بإيقاف تشغيل تدفق الحمام المائي وافصل دائرة الوسائط وأنابيب دائرة الحمام المائي من نماذج المثانة في المختبر .
3. قم بإزالة السدادات من نماذج المثانة في المختبر ، وقم بإزالة الحجم الكامل للبول المتبقي باستخدام ماصة مصلية. تخلص من أي وسائط ملوثة بشكل مناسب (أي تعقيم الأوتوكلاف).
4. صفي أكياس النفايات وتخلصي من أي وسائط متبقية. افصل أكياس نفايات القسطرة من منفذ القسطرة وتخلص منها.
5. باستخدام حقنة، قم بتفريغ بالونات القسطرة ببطء قبل إزالة القسطرة من النماذج.
   ملاحظة: في حالة استخدام أنواع بكتيرية موجبة اليورياز ، يمكن أن تصبح القسطرة "عالقة" بالجدران الزجاجية للنماذج المختبرية . تجنب استخدام كميات كبيرة من القوة على القسطرة ، وبدلا من ذلك ، انتقل إلى الخطوة 8.6.
6. انقع في الموديلات في المختبر في محلول منظف مضاد للميكروبات بنسبة 5٪ (انظر جدول المواد) طوال الليل ، ثم اغسلها جيدا بالماء لضمان إزالة أي مطهر متبقي. الأوتوكلاف للتعقيم.
   ملاحظة: في حالة استخدام الأنواع الموجبة لليورياز ، أضف 5٪ وزن / حجم حامض الستريك إلى محلول المطهر للمساعدة في إذابة أي تمعدن حيوي في الغرفة المركزية. سيساعد هذا المحلول الحمضي أيضا في إطلاق أي قسطرة أصبحت عالقة في النماذج عن طريق تكسير رواسب الأغشية الحيوية البلورية.
7. افصل أنبوب دائرة الوسائط من خزان AUM وتخلص من أي وسائط متبقية. اغسل الأنبوب بالماء لإزالة أي بقايا AUM والأوتوكلاف.
8. لحساب وقت الانسداد الدقيق ، لاحظ الحجم النهائي في كيس النفايات واستخدم المعادلة في الخطوة 4.4 ومعدل التدفق المحسوب مسبقا لتحديد وقت الانسداد.

النتائج

يعتمد التشغيل الناجح لنموذج المثانة في المختبر على ممارسة تقنية معقمة جيدة ومراقبة دقيقة لتعكر الوسائط طوال فترة التجربة (الشكل 3). قبل التلقيح ، كانت الأصول المدارة المعقمة صفراء شاحبة اللون وشفافة في الغرفة المركزية لنموذج المثانة في المختبر (الشكل 3 أ). يجب أن تظل الأصول المدارة في خزان الوسائط صافية طوال فترة التجريب ، حيث أن أي تغييرات في التعكر قد تشير إلى ترسيب الأملاح من المحلول ، أو تلوث الوسائط. إذا أصبحت الأصول المدارة في خزان الوسائط أو أنبوب دائرة الوسائط غائمة أو أظهرت تغيرا جذريا في اللون ، فيجب التخلص من التكرارات وتكرارها. بعد التلقيح ، تظهر بوضوح زيادة في تعكر AUM في الغرفة المركزية لنموذج المثانة في المختبر (الشكل 3 ب). غالبا ما تكون التغيرات في التعكر أكثر وضوحا في الكائنات الحية الإيجابية لليورياز مثل P. mirabilis ، ولكن يجب أن تظل مرئية بعد التلقيح في الكائنات الحية سالبة اليورياز. بعد بدء تدفق AUM ، غالبا ما يلاحظ انخفاض في تعكر AUM حيث يتم غسل الخلايا العوالق ، ولا يشير إلى نقص الخلايا القابلة للحياة في النموذج. يمكن أيضا استخدام مراقبة مستوى الوسائط في الغرفة المركزية لتحديد وقت الانسداد في حالة استخدام الكائنات الحية الإيجابية لليورياز (الشكل 3 ج). أثناء تشغيل النماذج ، يجب أن يكون ثقب العين والطرف في القسطرة مرئيين تماما للإشارة إلى التصريف المناسب في أكياس النفايات. عند الانسداد ، سيرتفع مستوى الأصول المدارة في الغرفة المركزية فوق ثقوب القسطرة وطرفها ، مما يشير إلى أن التجربة جاهزة لأي قراءات وإنهاء نقطة النهاية. أثناء التجريب ، يمكن أن تؤدي تأثيرات الضغط في دائرة وسائط نموذج المثانة في المختبر إلى جعل النماذج تبدو مسدودة. في حالة الاشتباه في وجود انسداد ، فتحقق من أن دائرة AUM والقسطرة وأنابيب أكياس النفايات مشدودة قبل إنهاء الفحص ، لأن أي فقاعات هواء أو مكامن الخلل المحتملة في الأنبوب يمكن أن تسبب "غرف معادلة الضغط" وتمنع القسطرة من التصريف.

أثناء تجارب نموذج المثانة في المختبر ، يمكن أن يوفر أخذ عينات العوالق نظرة ثاقبة حول ديناميكيات النمو داخل النموذج بالإضافة إلى تقدم CAUTI. يمكن مراقبة نمو الخلايا ودرجة الحموضة وتكوين الأغشية الحيوية طوال فترة التجربة دون الحاجة إلى إنهاء النماذج (الشكل 4). في حالة استخدام الكائنات الحية الإيجابية لليورياز ، يمكن استخدام حسابات وقت الانسداد كمقياس لمعدل تكوين الأغشية الحيوية واستخدامها لمقارنة خصائص السلالات البكتيرية المختلفة (الشكل 4). أظهرت مقارنة سلالة من النوع البري من P. mirabilis و LPS المتحولة (إدخال mini-tn5 في waaC) امتدادا للوقت للانسداد وبالتالي تقليل تكوين الأغشية الحيوية في الطفرة (الشكل 4). لا تحجب الكائنات الحية سالبة اليورياز عادة نماذج المثانة في المختبر ، وبالتالي يوصى بتحديد نقطة نهاية محددة قبل التجريب. في بعض الحالات ، يمكن أن تؤدي الكائنات الحية سالبة اليورياز إلى انسداد القسطرة. على سبيل المثال ، يمكن أن تنتج سلالات اليورياز سالبة من Klebsiella pneumoniae أغشية حيوية مخاطية واسعة النطاق ، ومع ذلك ، فإنها عادة ما تستغرق وقتا أطول بكثير من الأغشية الحيوية الإيجابية لليورياز لمنع الصرف ، لذلك لا يزال يوصى بنقطة نهاية محددة.

يمكن أن يوفر قياس الأس الهيدروجيني خلال تجربة نموذج المثانة أيضا نظرة ثاقبة للاختلافات بين السلالة إلى السلالة ، بالإضافة إلى تقدم CAUTI. إذا تم استخدام الكائنات الحية سالبة اليورياز ، فيجب أن يظل الرقم الهيدروجيني في الغرفة المركزية لنموذج المثانة في المختبر مستقرا إلى حد كبير طوال فترة التجربة ، على الرغم من توقع تقلبات طفيفة في الأس الهيدروجيني مع تغير ديناميكيات السكان على مدار التجربة. يؤدي تلقيح النماذج في المختبر بالكائنات الحية الإيجابية لليورياز إلى زيادة كبيرة في الأس الهيدروجيني بمرور الوقت ، مع ملاحظة أعلى درجة حموضة عادة في وقت الانسداد ، حيث يمكن ملاحظة قراءات الأس الهيدروجيني التي تصل إلى ~ 8-9 (الشكل 4 ب).

يعد تعداد CFU / مل العوالق مكونا مهما لنمذجة المثانة في المختبر ، مما يسمح للمشغلين بتقييم ما إذا كان التلقيح ناجحا ومراقبة تقدم التجريب. يمكن أن يؤدي قياس CFU / مل في نهاية التجربة إلى تسليط الضوء على أي اختلافات في استعمار المثانة بين السلالات البكتيرية المختلفة. عند مقارنة السلالة الطافرة mini-Tn5 من P. mirabilis بالنوع البري ، لوحظ انخفاض كبير في CFU / مل في وقت الانسداد (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر تعداد CFUs من الأغشية الحيوية على سطح القسطرة ، والقياس الكمي للكتلة الحيوية للأغشية الحيوية نظرة ثاقبة لقدرة مسببات الأمراض المختلفة على استعمار المسالك البولية القسطرة. تم استخدام بقع البنفسج الكريستالية لتحديد الاختلافات في تكوين الأغشية الحيوية بين النوع البري P. mirabilis سلالة HI4320 والعزلات التي تم تمريرها في الكلورهيكسيدين (الشكل 5). أظهرت قياسات الكثافة البصرية عند 595 نانومتر أن العزلات التي تم تمريرها في الكلورهيكسيدين أظهرت انخفاضا في تكوين الأغشية الحيوية مقارنة بالنوع البري والضوابط التي مرت في غياب الكلورهيكسيدين.

نظرا لأن الهدف من نموذج المثانة في المختبر هو تكرار مكانة CAUTI بدقة ، يمكن أيضا استخدام النماذج لدراسة آثار العلاجات المضادة للميكروبات التي تهدف إلى علاج CAUTI في بيئة ذات صلة سريريا. بالنسبة للكائنات الحية الإيجابية لليورياز ، يمكن أن توفر مقارنة أوقات انسداد النماذج المعالجة بالنماذج غير المعالجة نظرة ثاقبة مفيدة لفعالية العلاج. أدى علاج نماذج المثانة في المختبر الملقحة بالمتصورة ميرابيليس بمحلول ري المثانة الكلورهيكسيدين بنسبة 0.02٪ إلى إطالة وقت الانسداد بشكل كبير مقارنة بالنماذج التي تركت دون معالجة أو معالجة بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ (الشكل 6 أ). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام نموذج المثانة في المختبر لدراسة النشاط المبيد للجراثيم للعلاجات المضادة للميكروبات. يمكن أن تشير مراقبة التغيرات في CFU / مل للخلايا المرتبطة بالعوالق والأغشية الحيوية بعد العلاج بمضادات الميكروبات إلى ما إذا كانت العلاجات فعالة. أظهر علاج نماذج المثانة في المختبر التي تم تلقيحها ب P. mirabilis انخفاضا بمقدار >7 لوغاريتيم في CFU / مل العوالق مباشرة بعد العلاج ، مقارنة بالنماذج المروية غير المعالجة و 0.9٪ المالحة عند تطبيقها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 6 ب).

الشكل 1: تخطيطي للمكونات الرئيسية لنموذج المثانة في المختبر . (أ) نموذج المثانة (نظام الصرف المغلق): (1) غرفة زجاجية مزدوجة الجدران تحاكي المثانة (2) مدخل الوسائط ، يتم توفير AU عبر مضخة تمعجية إلى الغرفة الداخلية لنموذج المثانة (3) مدخل المياه الذي يتم توفيره عبر حمام مائي دائري إلى الغرفة الخارجية (4) مخرج المياه (5) قسطرة فولي ، يتم إدخالها في الغرفة الداخلية (6) نقطة اتصال تجويف الصرف ؛ نقطة اتصال لأكياس النفايات / أكياس الري (7) كيس تصريف يجمع تدفق البول إلى الخارج. (ب) تخطيطي يصور الإعداد لنموذج المثانة في المختبر واتجاه تدفق الوسائط والمياه عبر النموذج. يتم تخزين البول الاصطناعي في خزان وسائط (1) في درجة حرارة الغرفة ويتم توفيره للنموذج عبر مضخة تمعجية (2) بمعدل تدفق ثابت ~ 0.75 مل ^{في الدقيقة -1} طوال مدة التجربة. تتدفق الوسائط إلى الغرفة المركزية للوعاء الزجاجي مزدوج الجدران الذي يمثل المثانة (3) ويخرج عبر ثقب قسطرة فولي (4) في كيس تصريف (5) ، ليكمل نظام الصرف المغلق المعقم. يتم الاحتفاظ بنموذج المثانة في المختبر عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية عبر حمام مائي دائري (6) ، والذي يتدفق عبر الغرفة الخارجية للوعاء الزجاجي مزدوج الجدران. تمثل الخطوط المتقطعة أنابيب السيليكون وتمثل الأسهم اتجاه التدفق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تقسيم القسطرة البولية لمعالجة الخلايا المرتبطة بالغشاء الحيوي. مثال على النقاط على القسطرة البولية للتشريح لقياس كمية الأغشية الحيوية في اتجاه مجرى النهر. (أ) يتم تقسيم القسطرة أولا عرضيا في المنطقة التي يبلغ طولها 8 سم القريبة من الطرف / ثقوب العين (حيث لوحظ معظم تكوين الأغشية الحيوية). تتم إزالة الأقسام التي يبلغ طولها 1 سم بمشرط ، وتجنب المنطقة التي تحتوي على بالون القسطرة المفرغ من الهواء بسبب صعوبات في معالجة قابلية التكاثر (1-3). (ب) بمجرد تقسيم القسطرة في البداية إلى قطع بحجم 1 سم ، يتم إجراء قطع طولي آخر أسفل التجويف المركزي لفضح أي غشاء حيوي موجود لمزيد من القياس الكمي للأغشية الحيوية ، أي تعداد CFU / مل من تلطيخ البنفسج البلوري. تمثل الخطوط المتقطعة نقاط التشريح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مراحل تجربة نموذج المثانة في المختبر . صور للغرفة المركزية لنموذج المثانة في المختبر ، خلال مراحل مختلفة من التجريب. (أ) الأصول المدارة في الغرفة المركزية لنموذج المثانة في المختبر قبل التلقيح. الوسائط في الغرفة المركزية شفافة تماما ، مما يشير إلى التعقيم الناجح ، ويظهر طرف القسطرة وفتحات العين فوق خط الوسائط ، مما يشير إلى تصريف القسطرة بنجاح. (ب) الوسائط في الغرفة المركزية لنموذج المثانة في المختبر بعد التلقيح ب P. mirabilis (4 ساعات بعد التلقيح). يشار إلى التلقيح الناجح من خلال زيادة تعكر وسائل الإعلام. تشير رؤية طرف القسطرة وفتحات العين إلى أن AUM يتم تصريفه بنجاح من خلال القسطرة ، ولم يحدث انسداد. (ج) مثال على نموذج المثانة المسدودة في المختبر . أدى التلقيح باستخدام P. mirabilis وتكوين الأغشية الحيوية اللاحقة والتمعدن إلى انسداد ثقوب القسطرة ، مما يمنع التصريف ويتسبب في ارتفاع مستوى الوسائط في الغرفة المركزية فوق طرف القسطرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تعمل قياسات نقطة النهاية لنموذج المثانة في المختبر حتى الانسداد. مثال على قياسات نقطة النهاية في وقت الانسداد من نموذج المثانة في المختبر الذي تم تلقيحه بسلالة سريرية من P. mirabilis ، RS47 (WT) ، وإسلالة متحولة مع تكوين غشاء حيوي موهن ، RS47-2 (متحول). (أ) وقت الانسداد (ح) للوزن والسلالات الطافرة من المتصورة ميرابيليس. (ب) الرقم الهيدروجيني لنماذج المثانة في المختبر في وقت الانسداد. (ج) CFU / مل من الخلايا العوالق في غرفة نموذج المثانة في المختبر في وقت الانسداد. تمثل جميع البيانات متوسط خمسة مكررات بيولوجية. تظهر أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). * ص ≤ 0.05 ؛ ** ص ≤ 0.01. تم تعديل هذا الرقم من Clarke et ^al.46. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: قياسات الخلايا المرتبطة بالأغشية الحيوية من نموذج المثانة في المختبر . القياس الكمي ل P. mirabilis تكوين الأغشية الحيوية ، مقارنة السلالة من النوع البري HI4320 مع المجموعات السكانية المتكيفة التي مرت مع أو بدون الكلورهيكسيدين (CHD) عن طريق تلطيخ البنفسجي البلوري وقياس الكثافة البصرية (OD) عند 595 نانومتر. WT: P. mirabilis HI4320; 1 ، 3 ، 5: ضوابط المرور بدون تعرض لأمراض القلب التاجية ؛ 2 ، 4 ، 6: HI4320 يمر في 4 ميكروغرام / مل CHD. تمثل جميع البيانات متوسط خمسة مكررات بيولوجية. تظهر أشرطة الخطأ SEM. * ص ≤ 0.05 ؛ ** ص ≤ 0.01. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: قياسات من نماذج المثانة في المختبر بعد العلاج بمضادات الميكروبات. تم أخذ عينات العوالق من نموذج المثانة في المختبر الملقح بالمتصورة ميرابيليس ، بعد الري بمحلول الكلورهيكسيدين المضاد للميكروبات 0.02٪ (100 مل) أو 0.9٪ محلول ملحي. (أ) وقت انسداد نماذج المثانة في المختبر بعد الري. (ب) العوالق CFU / مل مباشرة بعد معالجة الري. تمثل جميع البيانات متوسط خمسة مكررات بيولوجية. تظهر أشرطة الخطأ SEM. * ص ≤ 0.05 ؛ ** ص ≤ 0.01 ؛ * ص ≤ 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تمثل المسالك البولية القسطرة مكانا بيولوجيا معقدا يمكن أن يكون من الصعب تكراره في بيئة معملية. تم تصميم نموذج المثانة في المختبر لغرض محاكاة CAUTI ، ويستخدم القسطرة البولية القياسية لتكرار نظام الصرف المعقم والمغلق المستخدم في الممارسة السريرية. المسالك البولية القسطرة معرضة بشدة للعدوى ، كما يتضح من القسطرة البولية كونها أكبر عامل خطر منفرد لتطور CAUTI^6،55. بشكل متناسب، تعد تقنية التعقيم الدقيقة أمرا بالغ الأهمية لنجاح تشغيل نماذج المثانة في المختبر . تعد تعكر الأصول المدارة مؤشرا واضحا على العقم ، حيث ستصبح الوسائط الملوثة أو منتهية الصلاحية غائمة بمرور الوقت ، مما يتطلب التخلص من جميع التكرارات. يجب أيضا استخدام تقنية التعقيم الدقيقة عند تلقيح نموذج المثانة في المختبر وأخذ عينات منه ، حيث أن فتح الغرفة المركزية لإضافة اللقاح المحضر يكسر نظام الصرف المعقم والمغلق ، مما يجعل نموذج المثانة في المختبر عرضة للتلوث. لتجنب تلوث الغرفة المركزية ، يمكن استخدام القسطرة ثلاثية التجويف لأخذ عينات من خلايا العوالق (عن طريق إغلاق تجويف النفايات والتصريف عبر التجويف الإضافي). من المتوقع حدوث بعض الغسيل في النقطة الزمنية التي تبلغ 4 ساعات ، ولكن قد تكون هناك حاجة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا لم يتم تعداد خلايا العوالق القابلة للحياة في هذه المرحلة. إذا لم يتم تعداد خلايا قابلة للحياة بعد 4 ساعات ، فقد تحتاج كثافة اللقاح أو تركيبة AUM المستخدمة إلى الأمثل لدعم الاستعمار البكتيري بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك ، قد يشير غسل اللقاح إلى وجود مشكلة في دائرة الوسائط. يمكن أن تمنع مكامن الخلل داخل الأنبوب التصريف الكافي ، مما يؤدي إلى تراكم مستقلبات سامة قد تعيق نمو البكتيريا ، في حين أن أي مطهر متبقي يستخدم للتنظيف عبر أنابيب الوسائط يمكن أن يكون له تأثير مبيد للجراثيم.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل تحضير AUM كما هو موضح سابقا من قبل Nzakizwanayo et al. ، حيث تم التحقق من صحته سابقا للاستخدام في نموذج المثانة في المختبر مع مسببات الأمراض البارزة في CAUTI ، بما في ذلك Proteus mirabilis و Escherichia coli^{43،45،46،48}. ومع ذلك ، هناك مجال لتعديل تركيبة الأصول المدارة المستخدمة في البروتوكول لاختيار نمو مسببات الأمراض الأخرى. تم نشر العديد من تركيبات الأصول المدارة المتنوعة ويمكن استخدامها بدلا من ذلك في دائرة الوسائط^{28،56،57،58،59،60}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استكمال الأصول المدارة في خزان الوسائط بالمغذيات أو المضادات الحيوية لاختيار نمو مسببات الأمراض المحددة. تاريخيا ، تم تزويد نماذج المثانة في المختبر أيضا ببول بشري مجمعة ، ومع ذلك ، فإن الكميات الكبيرة من الوسائط المطلوبة لتشغيل تكرار نموذج المثانة في المختبر يمكن أن تجعل جمع العينات البشرية غير عملي^53،54. علاوة على ذلك ، يمكن أن يختلف تكوين بول الإنسان اختلافا كبيرا بين عينات المرضى ، مما يؤثر على قابلية استنساخ التجربة ، حيث ثبت أن الاختلافات في تركيز الهرمونات والأملاح والبروتينات بالإضافة إلى حالة الترطيب تؤثر على نمو البكتيريا وتكوين الأغشية^{الحيوية 38،39،61،62}.

يوضح البروتوكول أعلاه تفاصيل تلقيح نموذج المثانة في المختبر مع ~ 10¹⁰ CFU / مل لتكرار CAUTI في المرحلة المتأخرة. ومع ذلك ، يمكن تعديل موقع التلقيح لنموذج المثانة في المختبر في المقايسات المستقبلية لتكرار المراحل السابقة من CAUTI بشكل أفضل ، أي الاستعمار الأولي للقسطرة البولية والصعود إلى المثانة. يمكن أن يوفر تلويث قسطرة فولي يدويا بلقاح بكتيري معروف قبل إعداد النماذج في المختبر نظرة ثاقبة للمراحل المبكرة من CAUTI. في الواقع ، تم تعديل كثافة اللقاح في العمل السابق لتكرار العدوى في المراحل السابقة. على سبيل المثال ، Nzakizwanayo et al. تم تلقيح نماذج المثانة في المختبر مع انخفاض CFU / مل (ca. 10³ CFU / mL) لتكرار العدوى في المراحل^{المبكرة 47}. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن تغيير كثافة اللقاح قد يؤدي إلى إطالة وقت الانسداد ويتطلب التحقق من صحة إضافية قبل التجريب.

بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن البروتوكول يفصل تلقيح النموذج في المختبر بالزراعة الأحادية البكتيرية ، هناك مجال لتلقيح النماذج بمسببات الأمراض الفطرية. اقترح العمل السابق أن ما يصل إلى 8٪ من CAUTIs ناتجة عن الإصابة بالمبيضات ، والتي تكون قادرة على إنتاج أغشية حيوية غالبا ما تكون متمردة للعلاج المضاد للفطريات^27،63. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل نموذج المثانة في المختبر لاستيعاب دراسة CAUTI متعدد الميكروبات. في الواقع ، تم اقتراح أن ما يصل إلى 86٪ من CAUTIs متعددة الميكروبات ، وغالبا ما ترتبط هذه العدوى بأعراض أكثر حدة ومعدل وفيات أعلى من عدوى أحادية^{النوع 27،64،65،69}. يمكن تلقيح النماذج في المختبر بأنواع متعددة لدراسة تكوين الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات وتطور CAUTI ، ولكن يجب إجراء التحقق الدقيق من صحة المجتمعات متعددة الميكروبات وتعديل كثافة اللقاح قبل التلقيح. استخدمت الدراسات السابقة نموذج المثانة في المختبر لمراقبة الاختلافات في تكوين الأغشية الحيوية في نوع واحد P. mirabilis CAUTI مقارنة بالأنواع المزدوجة CAUTI مع E. faecalis ، مما يسلط الضوء على التفاعل الأيضي بين السلالات ، مما أدى إلى تعزيز تكوين الأغشية الحيوية مقارنة بعدوى النوع الفردي⁷⁰.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لاستخدام نموذج المثانة في المختبر لدراسة CAUTI في القدرة على مراقبة تكوين الأغشية الحيوية على سطح قسطرة بولية قياسية. غالبا ما يبدأ تكوين الأغشية الحيوية في CAUTI عن طريق تكوين أغشية تكييف على تجويف القسطرة ، والتي تتكون من مكونات عضوية للبول يمكن أن تلتصق بها مسببات الأمراض البولية ، قبل أن تتكاثر وتشكل أغشية حيوية ناضجة^{2،18،71،72،73}. غالبا ما تستخدم المقايسات القياسية المستخدمة لدراسة تكوين الأغشية الحيوية وسائط نمو البكتيريا القياسية بدلا من AUM وغالبا ما تستند إلى الالتزام بألواح البوليسترين الدقيقة أو الأوتاد ، أي جهاز كالجاري. ومع ذلك ، فقد اقترح العمل السابق أن البيئة الغذائية ودرجة الحموضة ومستويات الأكسجين للنظام ، بالإضافة إلى الخصائص الفيزيائية مثل التدفق والاختلاف في بنية السطح (السيليكون مقابل البلاستيك) ، يمكن أن تؤثر على تكوين الأغشية الحيوية^{36،37،74،75،76،77،78}. بالإضافة إلى ذلك ، فإن زراعة البكتيريا ذات نشاط اليورياز المكثف ، مثل P. mirabilis في نظام مغلق في AUM ، يمكن أن يؤدي إلى تراكم المستقلبات السامة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا^78،79. يتم تخفيف هذا في نموذج المثانة في المختبر حيث يتم استبدال AUM في الغرفة المركزية باستمرار بوسائط جديدة عبر دائرة الوسائط ، مما يسمح بدراسة الأغشية الحيوية CAUTI في ظل ظروف أكثر صلة^{سريريا 45}. يعتمد التشغيل اليومي لنموذج المثانة في المختبر ونقطة النهاية المختارة للنماذج إلى حد كبير على ما إذا كانت النماذج قد تم تلقيحها بكائنات إيجابية أو سلبية لليورياز. من الناحية النظرية ، يمكن تشغيل النماذج المختبرية إلى أجل غير مسمى إذا تم تزويدها بحجم كاف من الأصول المدارة وإذا تم الحفاظ على عقم النموذج ؛ ومع ذلك، يوصى بتحديد نقطة نهاية قبل التجريب، سواء كان ذلك انسدادا أو عددا عشوائيا من الأيام. يوصى عموما بتشغيل النماذج المختبرية الملقحة بالكائنات السلبية لليورياز لمدة ≤7 أيام لمحاكاة البيئة السريرية ، حيث أن هذا يكفي عادة لمراقبة تكوين الأغشية الحيوية في معظم الكائنات الحية ، مع التماشية مع التدخلات السريرية ، حيث تشير أفضل الممارسات القياسية إلى أنه يجب استبدال القسطرة بمجرد إصابتها بشكل واضح^{1،2 ، 3،47،48}. على الرغم من أنه من المحتمل أن تنتج الكائنات الحية الإيجابية لليورياز أغشية حيوية بلورية ، إلا أن هناك قدرا كبيرا من التباين داخل السلالات الإيجابية لليورياز في الوقت المناسب لانسداد نموذج المثانة في المختبر ، حيث تتسبب بعض سلالات Proteus mirabilis في انسداد القسطرة في أقل من 10 ساعات ، والبعض الآخر يستغرق أكثر من 30 ساعة لمنع^39،46. يمكن استخدام اختبار اليورياز القياسي قبل تجربة نموذج المثانة في المختبر لتحديد ما إذا كان سيتم تشغيل النماذج للانسداد أو نقطة نهاية^{محددة مسبقا 80}.

ربما يكون القيد الرئيسي لاستخدام نموذج المثانة في المختبر لدراسة تكوين الأغشية الحيوية هو أن قياسات الأغشية الحيوية هي قراءة نقطة النهاية ، لأنها تتطلب إزالة وتشريح القسطرة البولية. على العكس من ذلك ، يمكن أخذ عينات من العوالق من نموذج المثانة في المختبر في أي وقت أثناء التجريب. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد أخذ عينات الأغشية الحيوية من نماذج المثانة في المختبر ، يمكن استخدام العديد من التقنيات النهائية الإضافية لتحديد إنتاج الأغشية الحيوية بشكل أفضل. استخدمت الدراسات السابقة القياس الضوئي للهب لتحديد كمية الكالسيوم والمغنيسيوم الموجودة في الأغشية الحيوية البلورية ، ويمكن استخدام بقع أكثر تعقيدا لتحديد مكونات مصفوفة EPS للأغشية الحيوية سالبة اليورياز^{بدقة 45،73،81،82،83،84}.

يصف هذا العمل أيضا تطبيق نموذج المثانة في المختبر لدراسة آثار العلاجات التي تهدف إلى علاج CAUTI. يحاكي نموذج المثانة في المختبر جوانب مهمة من مكانة CAUTI ، مثل استخدام AUM ، بالإضافة إلى تكوين الأغشية الحيوية ذات الصلة سريريا وزيادة الحمل العضوي الذي شوهد في CAUTI. يمكن إضافة العلاجات مثل المضادات الحيوية مباشرة إلى خزان AUM لمحاكاة التوافر البيولوجي للأدوية ذات الصلة سريريا ، وقد استخدمت الدراسات السابقة أدوية معاد استخدامها مثل الثيوريدازين والفلوكستين لإثبات تأثير الأغشية الحيوية⁸¹. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تستخدم فحوصات التركيز المثبط الأدنى واختبارات التعليق البكتيري لاستنتاج النشاط المضاد للميكروبات للمبيدات الحيوية ، على الرغم من وجود القليل من الأدلة التي تشير إلى أن المقايسات مرتبطة بقابلية المبيدات الحيوية في العالم الحقيقي^{41،85،86،87،88}. يعد نموذج المثانة في المختبر مفيدا لاختبار منتجات المبيدات الحيوية التي تهدف إلى علاج أو منع CAUTI ، حيث أن وجود القسطرة البولية والمحاكاة الأكثر تمثيلا لمكانة CAUTI يعني أنه يمكن اختبار منتجات مثل المواد الهلامية لزيوت التشحيم المضادة للميكروبات ومحاليل الري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدمت الدراسات السابقة أيضا نموذج المثانة في المختبر لتحديد فعالية العلاج بالعاثيات ، وأظهرت أن علاج العاثيات يمكن أن يطيل وقت P. mirabilis لمنع نموذج المثانة في المختبر بأكثر من 100 ساعة⁴⁷. يعني استخدام قسطرة فولي ذات الحجم القياسي في نموذج المثانة في المختبر أيضا أنه يمكن فحص القسطرة المغلفة الجديدة للنشاط المضاد للميكروبات. العمل السابق من قبل Slate et al. أظهر أن القسطرة المطلية بطلاء سيبروفلوكساسين الثيرانوسي يمكن أن تمتد P. mirabilis وقت الانسداد بمقدار ~ 60 ساعة في نموذج المثانة في المختبر ⁴⁸. يسلط هذا الضوء على التطبيق المحتمل لنموذج المثانة في المختبر في دراسة العلاجات الجديدة التي تهدف إلى علاج CAUTI ، مما يسمح بتقييم أكثر دقة لمضادات الميكروبات في مكانة محاكاة CAUTI ذات صلة بيولوجيا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
313 تمديد رأس المضخة	سريع التحميل Watson-Marlow	313	مضخة تمعجية - تمديد رأس المضخة الإضافي
323S / D مضخة التحكم اليدوي متغيرة السرعة	Watson-Marlow	323S / D	مضخة التمعجية
3L أكياس السرير ، معقمة مع صنابير رافعة   ؛	الدب العظيم للرعاية الصحية	GDW173
3 مم القطر الداخلي البلاتين معالجة أنابيب السيليكون	فيشر	10111801	أنابيب دائرة AUM الصغيرة (توصيل أنابيب المضخة بالنماذج)
5 مم القطر الداخلي البلاتين معالجة أنابيب السيليكون	فيشر	10539201	أنابيب دائرة AUM المتوسطة (توصيل أنابيب المضخة بخزان AUM)
كلوريد الأمونيوم (NH4< / sub>Cl)	فيشر	11473713
كبريتات الصوديوم اللامائية (Na 2< / sub > SO4< / sub>)	فيشر	11498717
Azlon موصل مدبب   ؛		يستخدم فيشر 10712807	لتوصيل أطوال مختلفة من الأنابيب في دائرة AUM شماعات
أكياس السرير   ؛	الدب العظيم للرعاية الصحية	10705P
Bochem قرصة الديك أنبوب المشابك, 25 مم قطر	فيشر	11805101
كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>) فيشر		10021681
حامض الستريك monohydrate	Merck	C1909-500G	تستخدم لإزالة الأغشية الحيوية البلورية من النماذج بعد التجريب   ؛
Fisherbrand  ماصات فيشر 11992168 من الزجاج المتخرج من الفئة B من النوع 1			تستخدم لتزويد نماذج الشفرات في المختبر بالأصول المدارة للإدارة الذاتية عبر
الجيلاتين	VWR	24360.233
منشور Graphpad 10	GraphPad	V10.0	برنامج تحليلي يستخدم للرسم البياني في نتائج نموذج المثانة في المختبر والتحليل الإحصائي.
Hanna HI 2211-02 مقياس درجة الحموضة على المنضدة	فيليب هاريس & nbsp ؛	PP00057414
في المختبر < / em>bladder model	-		معدات مخصصة كما وصفها سابقا Nzakizwanayo et al. (2019).
Instillagel 6 مل جل التشحيم	mydoctorshop.co.uk	40-006	المواد الهلامية لزيوت التشحيم المستخدمة في القسم 7.1. يتوفر موردون آخرون.
Kartell Plastilab موصل مدبب غير متساو	فيشر & nbsp ؛	11914289	يستخدم لتوصيل أنابيب، بأقطار مختلفة،
أجار ماكونكي بدون ملح (مجفف)	فيشر	10472643	لتعداد المستعمرات المفردة من البكتيريا المحتشبة ، أي بروتيوس ميرابيليس
كلوريد المغنيسيوم ، سداسي هيدرات (MgCl 2< / sub>.6H 2< / sub>O)	فوسفات فيشر	أحادي البوتاسيوم
(KH2< / sub>PO4< / sub>)	موصل فيشر	10573181
Nalgene على شكل حرف	Y فيشر	10186070	يستخدم لتشغيل دوائر إدارة الأصول المدارة المتعددة من خزان واحد للإدارة المدارة (1-4 طرازات لكل خزان)   ؛
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	فيشر	10375810
بيركس مع مقبس جانبي زجاجي مطحون ، السعة: 5000 مل	مطاطية لخزان	فيشر	11347884
مع تجويف ، القطر الخارجي: 37 مم ، أحمر ، القطر: 37 مم	11517612 فيشر		تستخدم في خزان الأصول المدارة ولتزويد الموديلات المختبرية بالأصول
المدارةحجم 14 الفرنسية 100٪ سيليكون قسطرة فولي مع حقنة معقمة من الماء للتضخم	الدب العظيم للرعاية الصحية	4833-0514
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	فيشر	10735921
أكسالات الصوديوم (Na2C2O4)	فيشر	10442211
Teknon Biocleanse مركز منظف مبيدات حيوية 5L	فيشر	12447580	يستخدم لتعقيم النماذج بعد التجريب
سترات ثلاثي الصوديوم (Na3C6H5O7)	فيشر	11434993
مرق الصويا	فيشر	10198002
اليوريا (CH4N2O)	فيشر	10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9٪	B.Braun	FB99833	كيس الري المثانة المالحة المستخدمة في القسم 7.2.
Watson-Marlow Pumpsil 1.6mm القطر الداخلي أنابيب السيليكون المعالجة بالبلاتين	فيشر	12406280	أنابيب دائرة AUM سميكة (للاستخدام في المضخة المعدنية)