يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعرف على الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المتسللة للمحيط في الحبل الشوكي المصاب باستخدام قياس التدفق الخلوي

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67967

⸱

يونيو 24, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

في هذه المقالة

ملخص

من الصعب تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) والضامة المتسللة المحيطية (Mø) في الحبال الشوكية المصابة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي (FCM) لتحديد MG الشبيه ب M1 ، و M2 مثل MG ، و M1 مثل Mø ، و Mø الشبيه ب M2 ، على التوالي. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أمراض الجهاز العصبي المركزي الأخرى لفهم دور MG و Mø.

الملخص

في الحبل الشوكي السليم ، لا يمكن اكتشاف البلاعم المتسللة للمحيط تقريبا ، وتشارك الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) في الحفاظ على استقرار البيئة المكروية للحبل الشوكي عن طريق البلعمة ، وإزالة الحطام الخلوي ، وإنتاج عوامل التغذية العصبية. بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI) ، يتم تنشيط MG ، وتتسلل الخلايا المناعية الطرفية إلى الحبل الشوكي المصاب. من بين هذه الخلايا المناعية ، تلعب MG المنشطة والضامة المتسللة المحيطية (Mø) أدوارا حاسمة في العملية المرضية لمرض اصابات النخاع الشوكي. يمكن تمييز هذه الخلايا إلى أنماط ظاهرية مؤيدة للالتهابات (تشبه M1) ومضادة للالتهابات (تشبه M2). ومع ذلك ، فإن التمييز بينهما يمثل تحديا بسبب تشابههما في التشكل والعديد من العلامات الخلوية. يمكن لقياس التدفق الخلوي (FCM) ، وهي تقنية مستخدمة على نطاق واسع في المجال الطبي الحيوي ، اكتشاف معلمات خلوية متعددة في وقت واحد مثل حجم الخلية وحجم الجسيمات وسطح الخلية والعلامات داخل الخلايا في تجربة واحدة. على مدار سنوات من البحث ، تمت محاولة FCM تحديد MG و Mø في الحبل الشوكي وتم تحسينه باستمرار لتطوير طريقة كشف مستقرة في النهاية. تسمح هذه الطريقة بتحديد M1 / M2 الشبيهة ب MG و M1 / M2 الشبيهة ب Mø بعد SCI عن طريق الكشف عن ملفات تعريف التعبير ل CD45 و CD11b و CD68 و CCR7 وعلامات أخرى. في هذا البروتوكول ، يمكن تحديد خلايا CD11b + CD45 − / منخفضةCD68 + CCR7 + و CD11b + CD45 - / منخفضةCD68 + CCR7- و CD11b + CD45عاليةCD68 + CCR7 + و CD11b + CD45عاليةCD68 + CCR7- على أنها MG شبيهة ب M1 و M2 مثل MG و M1 مثل Mø و M2 مثل Mø ، على التوالي.

المقدمة

إصابة الحبل الشوكي (SCI) هي نتيجة لتلف الحبل الشوكي الناجم عن أسباب مختلفة. يعاني اصابات النخاع الشوكي من معدل عال من الإعاقة ، وفي الوقت الحالي ، لا توجد خيارات علاجية فعالة ، مما يجعلها واحدة من أخطر مشكلات الصحة العامة في العالم1،2. العملية الفيزيولوجية المرضية لمرض اصابات النخاع الشوكي معقدة ، وتنقسم إلى مرحلتين. في البداية ، تسبب الصدمة الميكانيكية الناتجة عن الإصابة على الفور خللا حادا في الخلايا وموت الخلايا. بعد ذلك ، يؤدي الضرر الثانوي إلى مزيد من الخلل الخلوي وموت الخلايا على مدى أيام أو أسابيع أو حتى أشهر. ضمن آليات الإصابة الثانوية ، ثبت أن الالتهاب هو محدد رئيسي لشدة الضرر الثانوي ، مما يملي في النهاية موت الخلية ووظائفالخلية 3. تتمثل خصائص الاستجابات الالتهابية في تسلل الخلايا الالتهابية وتنشيطها داخل الحبل الشوكي المصاب ، مما يؤدي إلى زيادة الخلايا الالتهابية والعوامل الالتهابية ، مما يخلق بيئة مكروية التهابية ، وفي النهاية يتسبب في خلل في الحبل الشوكي4.

تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والضامة المتسللة المحيطية دورا مهما في الاستجابة الالتهابية بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI)5،6. باعتبارها ضامة مقيمة في الجهاز العصبي المركزي ، تشكل الخلايا الدبقية الصغيرة 5٪ -10٪ من خلايا الجهاز العصبي المركزي وهي ضرورية لاستعادة اصابات النخاعالشوكي 7،8. يمكن أن تبتلع الخلايا الدبقية الصغيرة وتزيل الحطام الخلوي بعد اصابات النخاع الشوكي ، مما يتوسط في تكوين ندوب الشفاء9،10. ومع ذلك ، فإن التنشيط المفرط للخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن يؤدي إلى استجابة التهابية مستدامة ويعزز تكوين الندبات الدبقية ، مما يعيق التجديد المحوري11. بعد اصابات النخاع الشوكي ، تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة بشكل أساسي نمطين ظاهريين: مثل M1 و M2 يشبه12،13. النمط الظاهري الشبيه ب M1 مؤيد للالتهابات ، مما يعزز تخليق العوامل الالتهابية التي تساهم في موت الخلايا المبرمج للخلايا والإصابة الثانوية. الخلايا الدبقية الصغيرة الشبيهة ب M1 لها أيضا تأثيرات سامة للأعصاب ، مما يؤدي إلى تفاقم الإصابة وموت الخلايا المبرمج العصبي14،15. في المقابل ، فإن النمط الظاهري الشبيه ب M2 له خصائص مضادة للالتهابات ويعزز تكوين الأوعية الدموية ، وإعادة تكوين الميالين ، والنمو المحوري ، وإصلاحالأنسجة 16،17. تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة الشبيهة ب M2 دورا مهما في تعديل عمليات الالتهاب والإصلاح.

تتسلل البلاعم الطرفية إلى موقع الآفة بعد اصابات النخاع الشوكي من خلال حواجز الحبل الدموي النخاعي التالفة والأوعية الدموية17،18 ، مما ينظم الاستجابة الالتهابية ، والبلعمة ، وتكوين الندبة ، وتجديد الأنسجة العصبية19،20. يمكن أن تقلل البلاعم المتسللة للمحيط من الاستجابة الالتهابية بعد اصابات النخاع الشوكي ، وبقايا الأنسجةالبلعمية 21 ، وتعزيز التجديد العصبي ، وإعادة تشكيل المصفوفة. ومع ذلك ، فإن الاستجابة الالتهابية المستمرة بوساطة البلاعم المتسللة المحيطية قد تؤدي إلى إصابة ثانوية ، مما يضر بالتعافي على المدى الطويل22،23. تتمتع البلاعم المحيطية المتسللة الشبيهة ب M1 بقدرات قوية على البلعمة وتقديم المستضد ، وهي قادرة على تطهير الخلايا النخرية24. ومع ذلك ، فإن إفرازها المفرط للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وأنواع النيتروجين التفاعلية (RNS) يمكن أن يتلف الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج العصبيالأكثر حدة 25. على العكس من ذلك ، يمكن للضامة المحيطية المتسللة الشبيهة ب M2 أن تمنع موت الخلايا المبرمج العصبي وتخفف من الاستجابة الالتهابية بعد اصابات النخاع الشوكي ، وبالتالي تعزيز إصلاح الأنسجةالعصبية 26.

تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة والضامة المتسللة إلى محيط بعد اصابات النخاع الشوكي أوجه تشابه مورفولوجية وجزيئية في التعبير يجعل من الصعب التمييز بينها. يتم استخدام قياس التدفق الخلوي (FCM) ، وهي تقنية معتمدة على نطاق واسع ، لتحليل التعبير عن سطح الخلية والجزيئات داخل الخلايا ، وتحديد مجموعات الخلايا الفرعية المختلفة ، وتقييم المعلمات المتعددة للخلايا الفردية في نفس الوقت. تم اتباع اختبار FCM مستقر للتمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة والضامة المتسللة إلى محيطية ، مما يسهل التحقيق في أدوارها في اصابات النخاع الشوكي. توضح هذه المقالة طريقة الكشف المستقرة التي تم تطويرها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات رعاية بجامعة بنجبو الطبية (رقم 2020-050). امتثلت رعاية للوائح التي تقدمها وزارة العلوم والتكنولوجيا الصينية. تم الحصول على ما مجموعه 18 فأرة C57 / BL6 البالغة من العمر ثمانية أسابيع واستخدامها تجاريا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير التجريبي والحيواني

  1. ضع الفئران في أقفاص جيدة التهوية قبل الجراحة. حافظ على دورة إضاءة / ظلام لمدة 12 ساعة ووفر وصولا مجانيا إلى الطعام والماء. حافظ على درجة حرارة الغرفة البيئية عند 20-22 درجة مئوية والرطوبة عند 30٪ -70٪ لمدة أسبوع واحد من التأقلم.
  2. تعقيم الأدوات الجراحية للفئران عن طريق التعقيم وتجفيفها قبل الاستخدام. تعريض الأدوات وغرفة جراحة للتعقيم بالأشعة فوق البنفسجية قبل نصف ساعة من الجراحة. قم بتجميع الفئران وتسميتها وفقا لمبدأ التجميع العشوائي. سجل وسجل أوزانها لاستخدامها لاحقا.
  3. تخدير الفئران بمزيج من الكيتامين (80 ملغم/كغ) والزيلازين (10 ملغم/كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). حلق الشعر على الظهر من الفقرات T8 إلى T10.

2. إعداد نموذج الماوس SCI

  1. قم بتطهير المنطقة الجراحية باستخدام مسحة من اليود من الرأس إلى الذيل ، مع التركيز على T9 ، متبوعا بالتطهير بمسحة كحولية بنسبة 75٪. قم بعمل شق 1 سم في الجلد في المنتصف عند T9. قم بتشريح اللفافة والعضلات والأربطة المحيطة ب T9 لمدة 1 سم.
    1. افصل العضلات المجاورة للعملية الشائكة T9 لفضح T9. استخدم مقص العيون لكشف وإزالة الصفيحة بين T9 و T10 ، مما يؤدي إلى تعريض الحبل الشوكي الموجود في T9 بالكامل ، والذي يبلغ قطره حوالي 2 مم.
      ملاحظة: عند رفع الصفيحة T9 ، تأكد من أن المقص لا يلمس الحبل الشوكي.
  2. تثبيت العمود الفقري عن طريق تثبيت العمليات الشائكة ل T7 و T11. قم بإنشاء نموذج معتدل من SCI باستخدام قضيب بقطر 1.3 مم وقوة 0.5 نيوتن لاحظ الذيل يلتف لأعلى ويرتعش الطرف الخلفي بعد اصابات النخاع الشوكي. بالنسبة للفئران التي يتم تشغيلها بشكل زائف ، قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية فقط دون كدمة.
  3. تحقيق الإرقاء في موقع الشق. قم بإجراء إغلاق متعدد الطبقات باستخدام خيوط جراحية معقمة 5-0. لتقريب العضلات ، أمسك اللفافة العميقة باستخدام ملقط Adson بالأسنان وقم بخياطة طبقة panniculus carnosus باستخدام خيوط أحادية قابلة للامتصاص 5-0 ، وإدخال الإبرة بشكل عمودي 2 مم من حافة الجرح لتحقيق لدغات متماثلة كاملة السماكة (عمق 2-3 مم) متباعدة 3 مم.
    1. اربط عقدة مربعة بالتوتر المتحكم فيه لمحاذاة مستويات اللفافة تشريحيا. أعد وضع حواف الجلد باستخدام مقص القزحية الدقيقة لإنشاء انقلاب بشرة 1 مم. قم بمحاذاة الأدمة بدقة مع ملقط صانع الساعات وثبتها بخيوط بسيطة متقطعة 5-0 غير قابلة للامتصاص متباعدة بمقدار 2 مم ، مما يضمن ملاءمة موحدة دون مساحة ميتة تحت الجلد.
    2. تطهير خط الخياطة بمسحات اليود باستخدام ضربات أحادية الاتجاه من مركز الجرح إلى الخارج. امسح أي دم متبقي برفق بشاش مبلل بالمحلول الملحي وضع طبقة رقيقة من مرهم المضادات الحيوية الثلاثي على طول الشق.
  4. بعد الجراحة ، ضع الفئران في قفص محفوظ في درجة حرارة ورطوبة مناسبتين. تقديم رعاية التبول مرتين يوميا (صباحا ومساء) لمساعدة الفئران حتى تستعيد التبول المستقل.
  5. حقن كل فأر تحت الجلد ب 0.5 مل من المحلول الملحي والمضادات الحيوية (الجنتاميسين، 2000-2500 وحدة / فأر) يوميا للوقاية من العدوى.

3. عزل أنسجة الحبل الشوكي من الفئران C57 / BL6

  1. تخدير الفئران قبل الجراحة (الخطوة 1.3). بمجرد التخدير الكامل ، قم بتثبيتها على طاولة الجراحة في وضع الاستلقاء. يتم التعامل مع الفئران التي يتم تشغيلها بالمثل.
  2. قم بعمل شق عرضي في التجويف الصدري وأسفل القص وعلى طول الحجاب الحاجز لكشف القلب. قم بتثبيت القلب برفق باستخدام مرقئ الدم وأدخل قنية التروية في البطين الأيسر القمي ، ودفعها إلى الشريان الأورطي.
    1. قم بقص الأذن اليمنى على الفور وابدأ في التروية بمعدل 250 مل / ساعة مع 10 مل من محلول PBS. يعتبر التروية ناجحا عندما يتحول السائل الذي يتم تصريفه من الأذن اليمنى من الأحمر الدموي إلى الصافي وعديم اللون ، أو عندما ينتقل الكبد من الأحمر إلى الأبيض27.
  3. انقل العمود الفقري في نهاية ذيل الفأر لكشف الثقبة الفقرية. باستخدام مقص العين ، قم بتشريح أنسجة الحبل الشوكي بعناية بمقدار 0.5 سم فوق وأسفل موقع الإصابة. ضع أنسجة الحبل الشوكي المعزولة في طبق ثقافة معقم وخالي من الإنزيم يحتوي على 5٪ مخزن مؤقت للتلطيخ ، وقم بتخزينه على الجليد عند 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا في الطرد المركزي المتدرج بكثافة البولي فينيل بيروليدون المغلف بالسيليكا الغروية (PVP).
    ملاحظة: عند تشريح الحبل الشوكي بالقرب من مركز الإصابة ، تأكد من سلامة الأنسجة لتجنب تمزق أو إتلاف الحبل الشوكي في موقع الإصابة. يتكون 5٪ Staining Buffer (SB) من 2.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) و 47.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).

4. الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام السيليكا الغروية المطلية بالبولي فينيل بيروليدون

  1. ضع أنسجة الحبل الشوكي في مصفاة خلية 300 شبكة وطحنها باستخدام مكبس حقنة يمكن التخلص منها 5 مل / 10 مل. بعد الطحن ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 300 شبكة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل للطرد المركزي (5 دقائق ، 110 × جم ، درجة حرارة الغرفة).
    1. بعد الطرد المركزي ، أضف 1 مل من محلول هضم خلايا التربسين إلى رواسب الخلية ، واحتضنه في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أوقف عملية الهضم بإضافة 1.5 مل من مصل الأبقار الجنينية ، ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى (110 × جم ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة). أعد تعليق رواسب الخلية في 1 مل من محلول تلطيخ 5٪ (SB).
  2. أضف بالتتابع 4 مل من محلول بولي فينيل بيروليدون المغلف بالسيليكا الغروية بنسبة 70٪ ، و 4 مل من محلول البولي فينيل بيروليدون المغلف بالسيليكا الغروية بنسبة 30٪ ، و 1 مل من محلول الخلية المعلق بنسبة 5٪ SB إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. الطرد المركزي الخليط (300 × جم ، 30 دقيقة ، 20 درجة مئوية).
    ملاحظة: قم بإعداد كاشف فصل البولي فينيل بيروليدون المغلف بالسيليكا الغروية كخليط 9: 1 من البولي فينيل بيروليدون المغلف بالسيليكا الغروية و 10× PBS. قم بتخفيف محلول البولي فينيل بيروليدون المغلف بالسيليكا الغروية بنسبة 70٪ باستخدام 1× PBS ومحلول البولي فينيل بيروليدون المغلف بالسيليكا الغروية بنسبة 30٪ باستخدام وسط زراعة الخلايا DMEM أو RPMI 1640.
  3. بعد الطرد المركزي ، ستشكل الخلايا طبقات في أنبوب الطرد المركزي (الشكل 1). تخلص من حطام الخلية وطبقات الصفائح الدموية فوق علامة المعايرة 8 مل. استنشق المحلول المتبقي بعناية (حتى علامة المعايرة 1.5 مل) وتخلص من الرواسب الموجودة أسفل العلامة.
    1. انقل المحلول المتبقي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل وأضف 1× PBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 15 مل للطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق رواسب الخلية في 5٪ SB. انقل المحلول إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي (FCM) للغسيل والطرد المركزي (110 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية). أعد تعليق رواسب الخلية في أنبوب FCM ب 200 ميكرولتر من 5٪ SB.

5. تلطيخ FCM

  1. قسم 200 ميكرولتر من معلق الخلية بالتساوي إلى أنبوبين جديدين لقياس التدفق الخلوي. قم بتسمية أحد الأنابيب على أنه "التحكم في النمط المتماثل" والآخر على أنه "تلطيخ محدد".
  2. إجراء تلطيخ
    1. إلى أنبوب "التحكم في النمط المتماثل" ، أضف الأجسام المضادة المتطابقة التالية مع النمط المتماثل: كابا الفئران IgG2b المسمى PE ، وكابا الفئران IgG2b المسمى FITC ، وكابا الفئران IgG2b المسمى APC ، و APC-eFluor 780 يحمل علامة Rat IgG2b kappa.
    2. إلى أنبوب "تلطيخ محدد" ، أضف اللوحة التالية من الأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت وفقا لنسب التخفيف الموصى بها: APC CD45 المضاد للفأر ، CD11b PE المضاد للفئران ، CD68 FITC المضاد للفأر ، CCR7 APC-eFluor 780 المضاد للفأر.
    3. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، لمدة 30 دقيقة.
  3. اغسل الخلايا الملطخة مرتين بإضافة 1 مل من SB في كل مرة. الطرد المركزي الخلايا (110 × [غ], 5 دقائق , 4 [ك]). أخيرا ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) لتحليل قياس التدفق الخلوي.

6. كشف FCM

ملاحظة: للاطلاع على تفاصيل الإجراء، يرجى الرجوع إلى التقارير السابقة27،28.

  1. قم بتحليل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي باستخدام البرنامج المتوافق (انظر جدول المواد).
    1. أولا ، قم بتحليل أنبوب التحكم في النمط المتماثل لإنشاء الرسم البياني الأساسي (FSC على المحور x و SSC على المحور y). اضبط جهد التشتت الأمامي (FSC) والمشتتت الجانبي (SSC) لوضع مجموعة الخلايا ضمن نطاق مناسب.
    2. قم بإعداد رسمين بيانيين إضافيين: أحدهما يحتوي على IgG-APC على المحور x و IgG-PE على المحور y. آخر مع IgG-FITC على المحور x و IgG APC-Cy7 (ملاحظة: تم الكشف عن APC-eFluor 780 في هذه القناة) على المحور y.
    3. اضبط جهد قناة التألق ل IgG-APC و IgG-PE و IgG-FITC و IgG APC-Cy7 لوضع مجموعة الخلايا ضمن 103 من المنطقة السالبة المزدوجة.
  2. بمجرد ضبط جهد FSC و SSC ، بالإضافة إلى جهد قناة التألق ، وتحسينه باستخدام أنبوب التحكم في النمط المتماثل ، يجب أن تظل هذه الإعدادات دون تغيير. تابع تحليل الأنابيب التجريبية الملطخة بالأجسام المضادة.
    1. قم بإنشاء رسم بياني أساسي باستخدام CD11b-PE على المحور x و SSC على المحور y. قم بإعداد رسم بياني آخر باستخدام CD68-FITC على المحور x و CCR7 APC-Cy7 على المحور y. باستخدام أنبوب التحكم في النمط المتماثل كمرجع ، قم بتعيين قيم خط الأساس وحدد "المنطقة" لخلايا CD11b + . في الرسم البياني الأساسي ، قم ببوابة منطقة خلية CD11b + وحددها على أنها "بوابة P1 ".
    2. بعد ذلك ، حدد الرسم البياني مع CD68-FITC على المحور x و CCR7 APC-Cy7 على المحور y. انقر بزر الماوس الأيمن واختر إظهار السكان، ثم اختر P1. سيعرض هذا مجموعات الخلايا داخل مجموعة CD11b + التي تعبر عن CD68 + / CCR7 + أو CD68 + / CCR7-. اجمع 50,000 حدث لكل عينة.
    3. بعد الحصول على البيانات ، اضبط تعويض التألق حسب الضرورة. تحليل وتحديد النسبة المئوية لخلايا CD11b + CD68 + CCR7 + (تشبه M1) وخلايا CD11b + CD68 + CCR7- (تشبه M2). يتم التعبير عن متوسط النسبة المئوية للخلايا المميزة كنسبة مئوية من إجمالي العينة.
  3. باستخدام معلمات الجهد المعدلة جيدا من أنبوب التحكم في النمط المتماثل ، تابع تحليل الأنابيب التجريبية.
    1. أولا ، قم بإنشاء رسم بياني باستخدام CD45-APC و CD11b-PE ، متبوعا برسم بياني باستخدام CD68-FITC و CCR7 APC-Cy7. اجمع 50,000 حدث لكل عينة ، وبعد الحصول على البيانات ، اضبط تعويض التألق.
    2. في مخططات الألوان الزائفة CD45 / CD11b ، قم بتحليل "المناطق" للخلاياالعالية CD11b + CD45 − / منخفضة و CD11b + CD45 لكل عينة. بعد ذلك ، قم بتحليل خلايا CD68 + CCR7 + وخلايا CD68 + CCR7- داخل هاتين المنطقتين.
    3. دمج التحليلات لتحديد النسب المئوية لمجموعات الخلايا التالية: CD11b + CD45 - / CD68 المنخفض + CCR7 + (الخلايا الدبقية الصغيرة الشبيهة ب M1) ، CD11b + CD45 - / CD68 المنخفض + CCR7- (الخلايا الدبقية الصغيرة الشبيهة ب M2) ، CD11b + CD45عالية CD68 + CCR7 + (البلاعم الشبيهة ب M1) ، CD11b + CD45high CD68 + CCR7- (البلاعم الشبيهة ب M2).
      ملاحظة: يتم التعبير عن متوسط النسبة المئوية للخلايا المميزة إيجابيا كنسبة مئوية من إجمالي العينة.

7. تحليل بيانات FCM

  1. قم بتشغيل برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي واسحب ملفات تجربة قياس التدفق الخلوي إلى قسم "جميع العينات" على الواجهة. سيتم عرض تجارب قياس التدفق الخلوي أسفل "جميع العينات" على الواجهة. ابدأ بتحليل أنبوب التحكم في النمط المتنظير لتحديد العتبة بين إشارات التألق الموجبة والسالبة.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق عينة أنبوب التحكم في النمط المتماثل لإظهار نافذة رسومية تعرض مخططا نقطيا ثنائي الأبعاد. حدد FSC-A للمحور x و SSC-A للمحور y. انقر فوق الزر "بوابة مستطيلة" في الجزء العلوي من الواجهة واستخدم المستطيل لتحديد المنطقة بعد إزالة الحطام الخلوي (الشكل 2 أ).
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق المنطقة المحددة لإنشاء نافذة رسومية جديدة. اختر FITC للمحور x والرسم البياني للمحور y. انقر فوق الزر "بوابة المنطقة" في الجزء العلوي من الواجهة لتعيين بوابة في الرسم البياني أحادي المعلمة لتحديد العتبة بين إشارات التألق السلبية والموجبة. ستحدد بوابة المنطقة المنطقة الموجبة (الشكل 2 أ).
      ملاحظة: تمثل المنطقة ذات قيم FSC الأصغر الحطام الخلوي.
    3. لكل من الأجسام المضادة الفلورية الأربعة المستخدمة في التجربة ، حدد العتبة بين الإشارات السالبة والإيجابية باستخدام عينة أنبوب التحكم في النمط المتماثل. على المحور السيني، قم بتغيير الفلوروكرومات بالتتابع إلى PE وAPC وAPC-Cy7، مع الاحتفاظ بالمحور y كرسم بياني.
    4. استخدم أداة بوابة المنطقة في الرسم البياني أحادي المعلمة لتعيين البوابات وتحديد العتبة بين الإشارات السالبة والإيجابية لكل من الأجسام المضادة الفلورية الأربعة (الشكل 2 أ).
  2. لتحليل نسب الخلايا الشبيهة ب M1 و M2:
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق عينة الأنبوب التجريبي لإظهار مخطط نقطي ثنائي الأبعاد. حدد FSC-A للمحور x و SSC-A للمحور y. انقر فوق الزر "بوابة مستطيلة" في الجزء العلوي من الواجهة واستخدم المستطيل لتحديد المنطقة بعد إزالة الحطام الخلوي (الشكل 2 ب).
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق المنطقة المحددة لإنشاء نافذة رسومية جديدة. اختر CD11b-PE للمحور x و SSC-A للمحور y. انقر فوق الزر "بوابة مستطيلة" في الجزء العلوي من الواجهة ، وباستخدام عتبة PE الموجبة / السالبة التي حددها عنصر تحكم النمط المتماثل كمرجع ، حدد بوابة CD11b + (الشكل 2 ب).
    3. انقر نقرا مزدوجا فوق منطقة بوابة CD11b + لإنشاء نافذة رسومية جديدة. حدد CD68-FITC للمحور x و CCR7 APC-Cy7 للمحور y. انقر فوق الزر Cross Gate. باستخدام عتبات FITC و APC-Cy7 الإيجابية / السالبة التي حددها عنصر تحكم النمط المتماثل كمراجع ، استخدم البوابة المتقاطعة لتصنيف الخلايا ، وتحديد نسب خلايا CD11b + CD68 + CCR7 + (تشبه M1) وخلايا CD11b + CD68 + CCR7- (تشبه M2) (الشكل 2 ب).
      ملاحظة: تتوافق مبادئ البوابات لتحليل نسب البلاعم الشبيهة ب M1 (M1 مثل Mø) ، والضامة الشبيهة ب M2 (M2 مثل Mø) ، والخلايا الدبقية الصغيرة الشبيهة ب M1 (M1 مثل MG) ، والخلايا الدبقية الصغيرة الشبيهة ب M2 (M2 مثل MG) مع تلك المستخدمة لتحليل الخلايا الشبيهة ب M1 والشبيهة ب M2. تعتمد عتبات التمييز بين إشارات التألق الإيجابية والسالبة على أنبوب التحكم في النمط المتماثل ، والذي يعمل كمرجع لضبط البوابات. يتم توضيح عملية تشغيل البرنامج في الشكل 2 ب ، ويتم وصف ملفات تعريف تعبير العلامة المستخدمة لتحديد نسب الخلية بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم فصل الخلايا المناعية من أنسجة الحبل الشوكي باستخدام السيليكا الغروية المطلية بالطرد المركزي المتدرج بكثافة البولي فينيل بيروليدون. أثناء عملية الطرد المركزي ، يتم توزيع الخلايا في طبقات مختلفة وفقا لكثافتها الطفو ، وبالتالي تحقيق فصل الخلايا (الشكل 1). من أعلى إلى أسفل ، يكون التوزيع على النحو التالي: الحطام الخلوي ، والطبقة الغنية بالخلايا أحادية النواة ، والطبقة الغنية بالخلايا الليمفاوية ، وفي الأسفل ، طبقة كريات الدم الحمراء والخلايا الحبيبية.

يستخدم تحليل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد الإنشاء الناجح لنموذج حيواني SCI أمرا ضروريا. تم إنشاء نموذج اصابات النخاع الشوكي عن طريق تعريض الحبل الشوكي في الجزء T9 لقوة 0.5 نيوتن. تم إثبات نجاح النموذج الحيواني من خلال تجعد ذيل الفأر ، وكلا الطرفين الخلفيين يعانون من تشنجات ، وإصابة الأطراف الخلفية بالشلل ، مما يجعل من المستحيل على الفأر المشي بعد اصابات النخاع الشوكي (انظر الخطوة 2.3). رعاية ما بعد الجراحة أمر بالغ الأهمية لبقاء الفأر. يتم توفير رعاية المسالك البولية حتى يتمكن الفأر من التبول بشكل مستقل. من الضروري أيضا منع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82072416)؛ وصندوق فريق الابتكار العلمي والتكنولوجي رفيع المستوى للمستشفى الأول التابع لكلية الطب بنجبو (BYYFY2022TD001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1&مرات ؛ برنامج تلفزيوني  سولاربيوص 1020
10× برنامج تلفزيوني  سولاربيوص 1022
18 أنثى الفئران C57 / BL6 تبلغ من العمر ثمانية أسابيع   ؛كافنز مختبر المحدودة ، تشانغ تشو ، الصين
APC-eFluor 780 المصنف الجرذ المضاد للفأر CCR7 (IgG2b kappa)إنفيتروجين47-1971-820.25μ ز / اختبار
APC-eFluor 780 المسمى الجرذ IgG2b kappa   ؛ التحكم في النمط المتماثلإنفيتروجين47-4321-820.25μ ز / اختبار
CD45 مضاد للماوس يحمل علامة APC (IgG2b kappa)إنفيتروجين17-0451-820.125μ ز / اختبار
APC المسمى الجرذ IgG2b kappa   ؛ التحكم في النمط المتماثلإنفيتروجين17-4031-820.125μ ز / اختبار
دي إم إيه إمجيبكو11965092
مصل أبقار الجنينلونسيراS711-001
FITC الجرذ المضادة للفأر CD68 (IgG2b kappa)إنفيتروجين  م اي 5-166760.25μ ز / اختبار
FITC المسمى الجرذ IgG2b kappa   ؛ التحكم في النمط المتماثلإنفيتروجين11-4031-820.25μ ز / اختبار
بارافورمالدهيدبيوشارب23319084
الجرذ المضادة للفأر CD11b المسمى PE (IgG2b kappa)إنفيتروجين12-0112-810.25μ ز / اختبار
PE المسمى الجرذ IgG2b kappa   ؛ التحكم في النمط المتماثلإنفيتروجين12-4031-820.25μ ز / اختبار
بيركول  سولاربيوص 8370
محلول التربسينبيوشاربBL526A

المراجع

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD11b CD68 CCR7 M1 M2
التعرف على الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المتسللة للمحيط في الحبل الشوكي المصاب باستخدام قياس التدفق الخلوي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.