نصف منصة المقايسة المناعية التي تم تطويرها مؤخرا بناء على مبادئ البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا وتقنية اللطخة النقطية للكشف القابل للتخصيص عن استجابة الأجسام المضادة في الأمصال البشرية والحيوانية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
لطخة النقاط الخالية من الخلايا كمنصة مقايسة مناعية عملية وقابلة للتكيف للكشف عن استجابة الأجسام المضادة في الأمصال البشرية والحيوانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أبرزت سلسلة الفاشيات المسببة للأمراض العالمية على مدى العقدين الماضيين أهمية استراتيجيات الترصد المصلي. تعد منصات المقايسة المناعية التي تعمل على اكتشاف الأجسام المضادة الخاصة بالمرض في مصل المرضى في صميم الترصد المصلي. تشمل الأمثلة الشائعة فحوصات الممتز المناعي المرتبطة بالإنزيم ومقايسات التدفق الجانبي. ومع ذلك ، في حين أن هذه طرق قياسية ذهبية ، إلا أنها تتطلب مواد استهلاكية خاصة بمسببات الأمراض ومعدات متخصصة ، مما يحد من استخدامها خارج المختبرات ذات الموارد الجيدة.
لقد قمنا مؤخرا بتطوير منصة جديدة للمقايسة المناعية تسمى Cell-Free Dot-Blot (CFDB) والتحقق من صحتها باستخدام الأمصال البشرية والحيوانية ضد SARS-CoV-2. على عكس المقايسات المناعية التقليدية ، يتم تثبيت عينات مصل مريض CFDB إلى مرحلة صلبة (غشاء النيتروسليلوز) ، بينما يتم تعليق المستضد المستهدف في المرحلة المتنقلة من الفحص. لتحسين الوصول إلى قدرات الترصد المصلي ، يتم إنتاج مستضدات CFDB عند الطلب وببنية تحتية منخفضة العبء باستخدام التعبير عن البروتين في المختبر . هنا ، يتم دمج المستضد مع علامة الببتيد التي يمكن اكتشافها باستخدام بروتين مراسل عالمي واحد لأي اختبار CFDB. والنتيجة هي أن CFDB لا يتطلب الوصول إلى قارئ الألواح متعدد الآبار أو مكونات الفحص الجزيئي التجاري النقي. مع اعتبارات التصميم هذه ، يعالج CFDB أوجه القصور في منصات المقايسة المناعية الحالية من خلال توفير إمكانية الوصول إلى المختبرات غير المركزية ، والقدرة على التكيف مع مسببات الأمراض الناشئة ، والقدرة على تحمل التكاليف للمجتمعات ذات الدخل المنخفض.
في المقالة الحالية ، سوف نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لإعداد وإجراء المقايسة المناعية CFDB. باستخدام عملنا الأخير على SARS-CoV-2 CFDB كمثال ، سنغطي تصميم الحمض النووي للمستضد للإنتاج الخالي من الخلايا عند الطلب ، متبوعا بإعداد بروتين مراسل CFDB ، وتثبيت عينات المصل في المرحلة الصلبة ، وأخيرا ، خطوات ربط المستضد والكشف عن المقايس. نتوقع أنه باتباع هذه التعليمات ، سيتمكن الباحثون من تكييف مقايسة CFDB للكشف عن الاستجابات المناعية في الأمصال البشرية والحيوانية لأي مسببات ممرضة معينة.
المقدمة
كشفت جائحة COVID-19 عن الحاجة الماسة لأدوات تشخيصية ميسورة التكلفة وقابلة للتطوير ، لا سيما للإعدادات منخفضة الموارد1. أثبتت المقايسات المناعية التقليدية مثل فحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) أنها ضرورية للكشف عن الاستجابات المناعية2،3. ومع ذلك، فإن تكلفتها العالية، والاعتماد على الكواشف المعقدة، والاعتماد على المعدات المتخصصة يحد من إمكانية الوصول إليها، خاصة أثناء الأزمات الصحية العالمية. استجابة لهذه التحديات ، قمنا بتطوير Cell-Free Dot Blot (CFDB) ، وهي منصة مقايسة مناعية منخفضة التكلفة وقابلة للتكيف مصممة للكشف عن الأجسام المضادة ل SARS-CoV-2 في مصل الإنسان.
يستفيد CFDB من البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا من أجل الإنتاج السريع عند الطلب للمستضدات الفيروسية باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية4،5. هذا يلغي الحاجة إلى عمليات الاستنساخ والتعبير والتنقية التقليدية القائمة على الخلايا ، مما يؤدي إلى تسريع إنتاج المستضد بشكل كبير مع تقليل التكاليف. تعمل طريقة CFDB على تبسيط اكتشاف الأجسام المضادة باستخدام تنسيق اللطخة النقطية ، حيث يتم رصد الأمصال مباشرة على أغشية النيتروسليلوز. يلغي هذا النظام الحاجة إلى ألواح باهظة الثمن متعددة الآبار ومعدات مختبرات متخصصة ، مما يسمح بسير عمل بسيط "للغطس" لخطوات الحضانة والغسيل. تستخدم المنصة أيضا نظام SpyCatcher-SpyTag ، حيث يعمل وهم SpyCatcher2-Apex2 peroxidase ككاشف كشف ثانوي عالمي5،6. يتم إنتاج هذا باستخدام التعبير القياسي القائم على الإشريكية القولونية ، والذي يلغي الاعتماد على اقترانات الأجسام المضادة التجارية المكلفة. نتيجة لذلك ، يمكن لنظام CFDB إجراء فحوصات مصلية بأداء مماثل ل ELISA بتكلفة أقل بكثير - حوالي 3 دولارات أمريكية لكل 96 مقايسة عينة مقارنة بأكثر من 300 دولار أمريكي لمجموعة ELISA التجارية5.
لإثبات فعالية CFDB ، اختبرنا قدرته على اكتشاف الأجسام المضادة في مصل الإنسان المشخص. ترتبط نتائجنا ارتباطا وثيقا ب ELISA في تحديد العينات الإيجابية والسلبية ل COVID-19. بالإضافة إلى التشخيص البشري ، قمنا بتقييم فائدة CFDB في النماذج الحيوانية ، واختبار الأمصال من الهامستر المصاب ب SARS-CoV-2 وأولئك الذين تم تطعيمهم ببروتين Nucleocapsid المؤتلف. أكدت هذه الاختبارات إمكانية استخدام CFDB في كل من التشخيص البشري والبيطري ، مما يجعله أداة متعددة الاستخدامات لمراقبة الاستجابات المناعية عبر الأنواع. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لصندوق الفروقات الدائمين في مرونته. ببساطة عن طريق تعديل قالب الحمض النووي الذي يشفر المستضد محل الاهتمام ، يمكن تكييف المنصة بسرعة للكشف عن الأجسام المضادة ضد مسببات الأمراض المختلفة ، مما يجعلها ذات قيمة للتأهب للوباء في المستقبل. إن تكلفتها المنخفضة وسير العمل البسيط ومتطلبات البنية التحتية الدنيا تجعلها مناسبة بشكل خاص للمختبرات اللامركزية والبيئات منخفضة الموارد ، حيث يكون الوصول إلى التشخيص التجاري محدودا.
في هذا العمل ، سنقدم إرشادات خطوة بخطوة لإعداد وإجراء اختبار CFDB. أولا ، نغطي تصميم وتوليف قوالب الحمض النووي الخطية لإنتاج المستضدات الخالية من الخلايا ، والتي تعد كواشف الكشف الأولية للمقايس. ثم نصف خطوات إعداد كاشف الكشف الثانوي للمقايسة SpyCatcher2-Apex2. بعد ذلك ، نقدم تعليمات للإنتاج الخالي من الخلايا وفحص جودة المستضدات نفسها. أخيرا ، نصف بالتفصيل عملية إجراء اختبار CFDB على عينات مصل الإنسان أو.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع تجارب الهامستر في المختبر الوطني لعلم الأحياء الدقيقة (NML) في وكالة الصحة العامة الكندية ، ووافق عليه المركز العلمي الكندي لصحة الإنسان ، ووفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية. تم الحصول على جميع عينات المصل / البلازما البشرية تجاريا للاختبار الداخلي أو تم توفيرها من قبل المتعاونين السريريين إلى NML لإجراء اختبار مستقل في NML.
1. تصميم وإعداد قوالب التعبير الخطي للمستضد (LETs)
- صمم LETs للتعبير الخالي من الخلايا للمستضد المستهدف بناء على التعليمات الواردة في Norouzi et al.7 وتحتوي على N / C-terminal SpyTag كما هو موضح في Norouzi et al.5.
ملاحظة: نقدم هنا تفاصيل لتحضير بروتين نوكليوكابسيد SARS-CoV-2 (NP ، الأحماض الأمينية 2-419).- تأكد من أن LET ل SARS-CoV-2 NP (الشكل 1 والملف التكميلي 1) يحتوي على مواقع 5 'و 3' Ter مع تسلسل مخزن مؤقت 50 زوجا أساسيا قبل مروج T7 وبعد كودون التوقف.
- ضع علامة على بروتين NP على الطرف N باستخدام 6-SpyTag-TEV.
- احصل على تسلسل البروتين من قاعدة بيانات UniProt (رمز الانضمام P0DTC9) وقم بتحسينه للتعبير المستند إلى الإشريكية القولونية باستخدام أداة تحسين كودون IDT8. اطلب هذا التسلسل للتخليق التجاري كجزء من الحمض النووي أحادي الشريطة معلق في الماء عند 10 نانوغرام / ميكرولتر.
ملاحظة: موقع انقسام البروتياز TEV وعلامة His6 ليسا من الميزات الأساسية في تصميم LET.
- يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم جزء الحمض النووي باستخدام Ter FW العالمي (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC
ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) و Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
CTTCCTTTCGCTTTTTTAGCAGCC) باستخدام مجموعة بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة (انظر جدول المواد)- قم بإعداد تفاعل 100 ميكرولتر على النحو التالي: 75 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، 20 ميكرولتر من 5x عازلة بوليميراز DNA ، 2 ميكرولتر من 10 ملي مولار dNTPs (التركيز النهائي 200 ميكرومتر) ، 0.5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر Ter-FW التمهيدي ، 0.5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر Ter-RV التمهيدي ، 1 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر أحادي الشريطة LET ، 1 ميكرولتر (2U) من بوليميراز الحمض النووي.
- استخدم إعدادات تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: التمسخ الأولي عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. 35 دورة: 98 درجة مئوية لمدة 6 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ؛ استمر في 4 درجات مئوية.
- قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية ، وتحقق من جودته عن طريق تشغيل عينة على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ ، وقياس تركيزه على مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية المرئية.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخام مباشرة للتعبير الخالي من الخلايا. ومع ذلك ، فإن التنقية تسمح بإجراء أكثر توحيدا.
الشكل 1: قالب التعبير الخطي ل SARS-CoV-2-NP. رسم تخطيطي يمثل ميزات قالب الحمض النووي الخطي His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. يتم تصنيف عناصر قالب الحمض النووي الرئيسية. يتم وضع تسلسل الترميز للبروتين محل الاهتمام ، هنا NP ، تحت التحكم النسخي لمحفز T7 للتعبير الفعال. في الطرف N ، يتم إلحاق بروتين NP ب SpyTag للكشف المحدد باستخدام كاشف الكشف SpyCatcher2-Apex2. يمكن الاستغناء عن مواقع البروتياز x6His-tag و TEV ، على الرغم من تضمينها كجزء من تصميم LET العام ، لأغراض CFDB. في نهاية قالب الحمض النووي الخطي ، يتم تضمين مواقع Ter "المنبع" و "المصب" ، كل منها مسبوقة ب 50 تسلسلا عازلة للزوج الأساسي ، للحماية بوساطة Tus ضد تحلل الحمض النووي المحلل للنواة الخارجية في المحللة الخالية من الخلايا. الاختصارات: NP = بروتين نوكليوكابسيد. LET = قالب التعبير الخطي ؛ TEV = فيروس حفر التبغ. CFDB = لطخة نقطية خالية من الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. تنقية بروتين مراسل SpyCatcher2-Apex2
- استخدم البلازميد pET24b-SpyCatcher2-Apex2 ، الذي تم إنشاؤه في الأصل في Norouzi et al.5 (التسلسل الكامل في الملف التكميلي 2 وخريطة البلازميد في الشكل التكميلي S1) لإعداد بروتين مراسل SpyCatcher2-Apex-2.
- تحضير أطباق أجار ومرق ليسوجيني (LB) يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين. تحويل بكتريا قولونية BL21 (DE3) الخلايا باستخدام البلازميد pET24b-SpyCatcher2-Apex2. قم بتلقيح مستعمرة واحدة في ثقافة LB بادئة سعة 15 مل وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
- في اليوم التالي ، أضف 10 مل من مزرعة البادئ إلى 500 مل من وسائط LB الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل الثقافة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.6-0.8 (~ 3 ساعات).
- تحفيز التعبير عن SpyCatcher2-Apex2 عن طريق استكمال المزرعة ب 0.5 ملي مولار من الأيزوبروبيل-β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوزيد و 1 ملي مولار 5-أمينوليفولينيك حمض هيدروكلوريد. قلل درجة حرارة النمو إلى 30 درجة مئوية واترك المزرعة تحتضن لمدة 4 ساعات أخرى.
- حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 15 دقيقة. انتقل إلى تحلل الخلية أو بدلا من ذلك قم بتخزين الحبيبات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على 50 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.8) ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 مجم / مل ليزوزيم ، قرص مثبط البروتياز الخالي من EDTA ، و 1 ملي ديثيوثريتول (DTT). Lyse الخلايا عن طريق صوتنة في 50 ٪ سعة مع 5 ثانية ON و 10 s OFF لإجمالي وقت تشغيل 3 دقائق.
- قم بتوضيح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. مرر المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
- أضف كلوريد الهيمين إلى تركيز نهائي قدره 250 ميكرومتر إلى المحللة المصفاة واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. انتقل إلى تنقية البروتين.
ملاحظة: تعمل الحضانة باستخدام كلوريد الهيمين على زيادة دمج الهيم في بيروكسيداز Apex-2 للحصول على نشاط الإنزيم الأمثل. - أضف 2.5 مل من راتنج النيكل إلى المحللة المصفاة واحتضانها عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف لمدة 45 دقيقة. ضع الخليط على عمود تدفق الجاذبية واغسل الراتنج ب 50 مل من محلول تريس (50 ملي من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.8) و 300 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي DTT).
- قم بإزالة بروتين SpyCatcher2-Apex2 في 25 مل من محلول تريس يحتوي على 400 ملي مولار إيميدازول. يقوم التركيز والمخزن المؤقت بتبادل الشفط في مخزن مؤقت Tris باستخدام وحدة مرشح الطرد المركزي ، بهدف الحجم النهائي من 0.5-1.0 مل.
- استخدم معامل الانقراض المولي ل SpyCatcher2-Apex2 (27،390 M-1 cm-1) لتحديد تركيز البروتين على مقياس الطيف الضوئي UV-Vis. أضف الجلسرين إلى التركيز النهائي بنسبة 40٪ وقم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: من المتوقع أن ينتج عن هذا البروتوكول ما يقرب من 40 مجم من SpyCatcher2-Apex2 عالي النقاء والنشاط ، وهو ما يكفي ل 400 CFDB يعمل على حجم لطخة قياسي مكون من 96 عينة. - للكشف عن بروتينات SpyTagged باستخدام اللطخة الغربيةالتقليدية 9 ولتجارب CFDB ، قم دائما بمنع الأغشية في 5٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم في 1x محلول ملحي مخزن Tris يحتوي على 0.05٪ Tween-20 (TBST). استخدم بروتين SpyCatcher2-Apex2 بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام / مل في محلول الحظر.
ملاحظة: يتطلب مراسل SpyCatcher2-Apex2 حل تلألؤ كيميائي محسن (ECL) لتطوير الإشارة. يمكن الحصول على حل خسائر الائتمان المتوقعة تجاريا أو تحضيره داخليا وفقا للتعليمات الواردة في Mruk et al.10. يتكون محلول ECL النهائي هنا من 0.4 ملي مولار من حمض الكوماريك ، و 2.5 ملي مولار من الألومينول ، و 0.015٪ H2O2 في 100 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.6).
3. إنتاج خال من الخلايا وفحص جودة المستضدات
- تحضير وتجميع بكتريا قولونية BL21 مكونات محللة التعبير الخالية من الخلايا وتفاعل باتباع التعليمات الواردة في Levine et al.11 و Norouzi et al.5. استكمل خليط التفاعل النهائي ب 5 ميكرومتر من بروتين Tus و 1.2 ميكرومتر T7 RNA Polymerase على النحو التالي لتفاعل تمثيلي 100 ميكرولتر: 14.6 ميكرولتر من المحلول A ، 14 ميكرولتر من المحلول B ، 33.3 ميكرولتر من بكتريا قولونية BL21 محللة ، 2.5 ميكرولتر من 200 ملي مولار بروتين Tus ، 1.2 ميكرولتر من 100 ملي مولار T7 RNA polymerase ، 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي الخطي 1.5 ميكرومتر ، 33.4 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
ملاحظة: انظر الملف التكميلي 3 للحصول على إرشادات أساسية حول تحضير بكتريا قولونية BL21 محللة خالية من الخلايا والجدول التكميلي S1 للحصول على وصفة مفصلة للمحللين A و B. يمكن أيضا تحضير نظام التعبير الخالي من الخلايا باستخدام بروتوكولات بديلة أو الحصول عليه تجاريا ، طالما أن التفاعل مكمل ببوليميراز Tus و T7 RNA. - قم بإجراء اختبار تعبير أولي بمقياس 5 ميكرولتر عن طريق إضافة 10٪ (حجم / حجم) منتج PCR الخام إلى التفاعل الخالي من الخلايا في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). احتضن دون اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 15 ساعة.
- تحقق من جودة التعبير عن مستضد NP عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من التفاعل الخالي من الخلايا على هلام بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم بنسبة 12٪ (SDS-PAGE) ثم نقله لاحقا إلى غشاء النيتروسليلوز للبقعة الغربية كما هو موضح في الخطوة 2.12. استخدم بروتين مراسل SpyCatcher2-Apex2 لوضع العلامات على اللطخة عبر SpyTag ، واختياريا ، جسم مضاد تجاري محدد (هنا مضاد ل SARS-CoV-2-NP) ضد المستضد المستهدف.
- قم بتجميع تفاعل خال من الخلايا بمقياس 1 مل مع منتج LET منقى 15 نانومتر لاستخدامه في مقايسة CFDB. احتضان خليط التعبير في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 15 ساعة عند 30 درجة مئوية. تحقق من جودة التعبير باستخدام اللطخة الغربية وقم بتخزين 50 ميكرولتر من الحصص عند -20 درجة مئوية.
4. عينات المصل
- احصل على عينات مصل (أو بلازما) بشرية / حيوانية من مصادر تجارية أو متعاونين سريريين أو داخليا باستخدام الإجراءات القياسية واتباع الإرشادات من لجنة أخلاقيات البحث البشري المؤسسية أو لجنة رعاية واستخدامه. تأكد من اتخاذ تدابير المعالجة المسبقة المناسبة للعينات للتخفيف من مخاطر التلوث.
ملاحظة: قد تشمل تدابير المعالجة المسبقة المعالجة بالمذيبات والمنظفات ، وتعطيل الحرارة ، واختبار علامات الفيروسات المنقولة بالدم. يتوفر بروتوكول مفيد لعزل المصل والبلازما عن الدم الكامل12. كما هو الحال مع منصات المقايسة المناعية الأخرى ، لا يتوقع أن تحتوي عينات المصل التي تم جمعها مبكرا (<3 أسابيع) بعد العدوى الأولية أو ظهور المرض على مستويات كافية من استجابة الأجسام المضادة ويجب التعامل مع نتائجها بحذر. - للتحقق من جودة كواشف SARS-CoV-2 NP CFDB ، استخدم اللوحة المرجعية الدولية التابعة لمنظمة الصحة العالمية التابعة للمعهد الوطني للمعايير البيولوجية والرقابة (NIBSC) للغلوبولين المناعي المضاد ل SARS-CoV-2 ، والذي يحتوي على x1 عينات إيجابية ل SARS-CoV-2 قبل COVID-19 و x4 SARS-CoV-2 مع مستويات متفاوتة من الغلوبولين المناعي المضاد ل NP13. بدلا من ذلك ، استخدم عينات مصل صحية وإيجابية من مصادر أخرى.
- بالنسبة لتجارب CFDB ، احصل على عينة تحكم سلبية أو أعدها عن طريق تجميع عينات مصل صحية متعددة (>3) لزيادة الدقة وتسهيل تحليل النتائج وتفسيرها.
5. إجراء بقعة النقطة الخالية من الخلايا (CFDB)
- قم بتنزيل وطباعة ملف صورة الشبكة الرئيسية (الشكل التكميلي S2). الشبكة الرئيسية عبارة عن نمط 6 × 6 سم يحتوي على 12 × 12 دائرة بقطر 2 مم لكل منها وتوفر قدرة اكتشاف مشابهة للوحة 96 بئرا.
- قم بتضمين الشبكة بإحكام بين طبقتين من فيلم ختم لوحة PCR اللاصق وقم بقصها حسب الحجم على طول حدود الشبكة الخارجية. استخدم لكمة خزعة مقاس 2 مم لتفريغ كل دائرة محددة.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام هذه الشبكة الرئيسية عدة مرات بعد مسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول. - قم بقص قطعة مقاس 6.5 × 6.5 سم من غشاء النيتروسليلوز وضعها تحت الشبكة الرئيسية على سطح نظيف ، وتأمين الإعداد باستخدام شريط لاصق كما هو موضح في الشكل 2 والشكل التكميلي S3. استخدم قلم تحديد لتحديد مواضع الدائرة الخارجية على غشاء النيتروسليلوز لاستخدامه كدليل لقطع الغشاء بعد اكتشاف العينة.
- قم بتخفيف عينات المصل 1/10 في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.4). استخدم ماصة دقيقة لتوزيع أحجام 0.4 ميكرولتر ثلاث نسخ من كل عينة على غشاء النيتروسليلوز في مواضع الشبكة المحددة مسبقا. سوف يستغرق الاستغناء عن 15 ثانية تقريبا لكل بقعة.
ملاحظة: تأكد من تضمين عينات التحكم السلبية والإيجابية مع كل اختبار ، حيث سيكون هذا مطلوبا لتحليل النتائج. - اترك 10 دقائق في درجة الحرارة المحيطة حتى تلتصق العينات المرقطة وتجف. باستخدام الملقط ، استرجع غشاء النيتروسليلوز بعناية واقطع على طول الدوائر الخارجية المحددة.
- قم بسد الغشاء في 10 مل من محلول الحجب (5٪ حليب جاف خالي الدسم في TBST) في طبق بتري مقاس 10 سم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مع رجه برفق عند 100 دورة في الدقيقة.
- قم بإذابة الثلج وإضافة 50 ميكرولتر من خليط التعبير عن المستضد الخالي من الخلايا إلى 5 مل من محلول المنع في طبق بتري مقاس 10 سم. انقل الغشاء مباشرة إلى هذا المحلول المحتوي على المستضد واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، مع رجه عند 100 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: ستكون هذه هي خطوة الكشف الأساسية حيث يرتبط مستضد SpyTagged بمواضع موضعية تحتوي على أجسام مضادة ، إن وجدت. - اشطف الغشاء واغسله لمدة 5 دقائق واشطفه مرة أخرى في TBST قبل الانتقال إلى خطوة الكشف الثانوية.
- احتضان الغشاء في 10 مل من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من بروتين SpyCatcher2-Apex2 المنقى ، لمدة ساعة واحدة أثناء الاهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة.
- اشطف الغشاء واغسله 2 × 5 دقائق في TBST ، مع شطف نهائي في TBS.
- قم بلصق قطعة من البارافيلم وثبتها على منطقة عمل نظيفة بالقرب من أداة تصوير اللطخة. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق النقر على الغشاء باستخدام الملقط وضع الغشاء فوق البارافيلم.
- أضف على الفور 3 مل (100 ميكرولتر / سم2) من محلول ECL أعلى الغشاء واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 ثانية بالضبط.
- جفف الغشاء على الفور ونقله إلى أداة تصوير متوافقة مع التلألؤ الكيميائي لتصور النتائج.
ملاحظة: يمكن أن يختلف وقت التصوير الأمثل باختلاف الأجهزة. يوصى باستخدام إعدادات وقت الاستحواذ التلقائي الافتراضية للأداة ، وفي حالة عدم وجودها ، استخدم عينات مصل مميزة مسبقا لتحسين وقت الحصول على الصورة. - استخدم وظيفة تحليل الصور الخاصة بالأداة للحصول على شدة موضعية ، بما في ذلك ثلاثة مواضع فارغة (خلفية) على غشاء النيتروسليلوز ؛ الحفاظ على حجم قياس ثابت لكل بقعة. قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات، مع تذكر تسمية كل موضع موضع بشكل صحيح.
- احسب المتوسط والانحراف المعياري (SD) لشدة البقع الثلاثية. ثم اطرح خلفية غشاء النيتروسليلوز من جميع العينات.
- استخدم المعادلة التالية للحصول على قيمة فاصلة لتفسير نتائج -/+:
(متوسط الضوابط السلبية) + (3 × SD من الضوابط السلبية). تعتبر العينات إيجابية إذا انخفض متوسط شدتها عن قيمة القطع وسلبية إذا انخفض متوسط شدتها إلى أقل من قيمة القطع.
ملاحظة: يتم توفير تخطيطي لإجراء CFDB في الشكل 3.
الشكل 2: تجميع CFDB. تخطيطي لشبكة CFDB الرئيسية وإعداد تجميع غشاء NC. يتم تراكب الشبكة الرئيسية على غشاء NC لتوفير نمط منتظم وقابل للعنونة لاكتشاف عينات المصل وتثبيتها. الاختصارات: CFDB = لطخة نقطية خالية من الخلايا ؛ NC = النيتروسليلوز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تمثيل تخطيطي لسير عمل CFDB. في اختبار CFDB ، يتم توزيع كمية صغيرة (<0.4 ميكرولتر) من عينات المصل المخففة 10x يدويا على غشاء النيتروسليلوز المقطوع مسبقا (اللوحة اليسرى) في مواقع منفصلة وقابلة للعنونة (اللوحة الوسطى). إيداع عينة مصل واحدة لكل بقعة في بقع ثلاثية النسخ وتثبيت محتوى البروتين ، بما في ذلك خزان الجسم المضاد الكلي للأمصال ، على ركيزة NC الصلبة (بقع بيج في اللوحة الوسطى). في هذا المثال ، يمكن ربط الأجسام المضادة ل NP الموجودة في عينات المصل أولا بواسطة كاشف الكشف الأولي CFDB SpyTag-NP ويتم اكتشافها أخيرا بواسطة كاشف الكشف الثانوي CFDB SpyCatcher2-Apex2 (الفقاعة المكبرة باللوحة اليمنى). هذا الرقم مأخوذ من Norouzi et al.5. الاختصارات: CFDB = لطخة نقطية خالية من الخلايا ؛ NP = بروتين نوكليوكابسيد ؛ LET = قالب التعبير الخطي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لقالب التعبير الخطي للمستضد المستهدف
لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل SARS-CoV-2 NP LET ، تم استخدام بادئات Ter الأمامية والخلفية العالمية كما هو موضح في قسم البروتوكول 1.2 وتم فحص 1 ميكرولتر من المنتج على هلام الاغاروز (الشكل 4) قبل الشروع في تنقية منتج PCR.
الشك...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
سلط كوفيد-19 الضوء على أهمية وسائل التشخيص القوية والميسرة للسيطرة على فاشيات العدوى وتحسين الاستراتيجيات الصحية العالمية. أثبت الاختبار المصلي الذي يكشف عن الأجسام المضادة الواقية أنه ضروري لتتبع أنماط انتقال المتحورات الجديدة ، وتحديد النقاط الساخنة ، وتوجيه تطوير اللقاح ، وفرز الحالات المشتبه فيها وحماية السكان المعرضين للخطر14. كما كشف الوباء عن أوجه عدم المساواة في إمكانية الوصول إلى الاختبار ، مما أدى إلى تراكم الأعمال ومتطلبات المرافق ذات المعدات المتطورة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
M.N. و K.P. مخترعان مشاركان لطريقة اللطخة النقطية الخالية من الخلايا. أودع طلب براءة مؤقت يتعلق بهذا العمل (PCT/CA2024/050097، أودع في يناير 2024).
شكر وتقدير
SS و R.Z. مدعومان بتمويل من وكالة مشاريع البحوث الدفاعية المتقدمة (DARPA) ، العقد رقم N66001-23-2-4042. الآراء و / أو الآراء و / أو النتائج المعبر عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل وجهات النظر أو السياسات الرسمية لوزارة الدفاع أو حكومة الولايات المتحدة. تم دعم هذا العمل بأموال ل K.P. من برنامج منح مؤسسة CIHR (201610FDN-375469) ، وبرنامج كرسي أبحاث CIHR في كندا (950-231075 و 950-233107) ، ومبادرة الطب بالتصميم بجامعة تورنتو ، والتي تتلقى تمويلا من صندوق التميز البحثي الأول في كندا وأموالا إلى KP ، من برنامج البحث والتطوير الدفاعي الكندي للسلامة والأمن (العقد 39903-200137). تم إنشاء الشكل 1 والشكل التكميلي S1 باستخدام SnapGene Viewer.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت | NEB | N3232 | يستخدم كعلامة حجم لمواد الهلام الاغاروز |
| 20 الأحماض الأمينية | سيجما ألدريتش | LAA21-1KT | مكون من التفاعل الخالي من الخلايا الحل B |
| 2 مم خزعة لكمة ؛ | Integra Miltex | 33-31-P / 25 | لإعداد الشبكة الرئيسية CFDB |
| 5-aminoolevulinic acid hydrochloride ؛ | سلائف Sigma-Aldrich | A3785 | Heme لتحريض مسحوق SpyCatcher2-Apex2 |
| Agarose | BioShop | AGA002 | للتحليل الكهربائي للجسم المضاد للحمض النووي |
| المضاد للحمض النووي المضاد ل SARS-CoV2-Nucleocapsid | Sinobiological | 40588-T62 | للكشف عن WB من مستضد NP المنتج الخالي من الخلايا |
| Bio-Rad ChemiDoc & nbsp ؛ XRS + | Bio-Rad | N / A | أداة تصوير هلام |
| مكثفات الطرد المركزي | Cytiva | 28-9323-60 | للتركيز والتبادل العازل للبروتينات أجهزة |
| الطرد المركزي | Eppendorf | EP022628257 | لحصاد الإنزيم المساعد للثقافة البكتيرية |
| ؛ هيدرات ملح الصوديوم (CoA) | Sigma-Aldrich | C3144 | أحد مكونات التفاعل الخالي من الخلايا محلول |
| معيار البروتين الملون الملون مسبقا (نطاق واسع) | NEB | P7719 | يستخدم كعلامة حجم لمواد هلامية SDS-PAGE |
| لوحة مصل Covid-19 | RayBiotech | CoV-PosSet | مصل متميز مسبقا للتحقق من كواشف / ظروف |
| CFDB وتحسينهاD- (& ناقص;)-3-ملح ثنائي الصوديوم بحمض الفوسفوجليسيريك (3-PGA) | Sigma-Aldrich | P8877 | مكون من التفاعل الخالي من الخلايا محلول |
| ب ديثيوثريتول (DTT) | سيجما ألدريتش | 10197777001 | مكون من المخازن المؤقتة |
| بكتريا قولونية 5-ألفا | NEB | C2987 ؛ | لتحضير البلازميد |
| الإشريكية القولونية BL21 | NEB | C2530 | لتحضير المحللات الخالية من الخلايا |
| الإشريكية القولونية BL21 (DE3) | NEB | C2527 | للتعبير عن SpyCatcher2-Apex2 |
| قرص مثبط البروتياز الخالي من EDTA | سيجما ألدريتش | 11836153001 | أحد مكونات محلول تحلل الإشريكية القولونية |
| Eppendorf & nbsp ؛ نيو برونزويك حاضنة Innova 43 / 43R شاكر | Eppendorf | EPM1320 | حاضنة لزراعة خلايا الإشريكية القولونية للتعبير عن البروتين وتحضير المحللة الخالية |
| من الخلايا حمض الفولينيك | Sigma-Aldrich | 47612 | أحد مكونات التفاعل الخالي من الخلايا محلول A |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | مكون من SpyCatcher2-Apex2 التخزين المؤقت |
| Hemin chloride ؛ | سيجما ألدريتش | H9039 | لمكملات الهيم من SpyCatcher2-Apex2 |
| بيروكسيد الهيدروجين 30٪ | سيجما ألدريتش | H1009 | لصنع كاشف ECL |
| برنامج مختبر الصور | Bio-Rad | 1709690 | Software for ChemiDoc gel أداة |
| التصوير Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside | Bioshop | IPT001 | لتحريض SpyCatcher2-Apex2 expressikon |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | لإعداد SpyCatcher2-Apex2 ثقافة بكتيرية |
| LB agar | BioShop | LBL406 | لنمو الإشريكية القولونية |
| LB مرق | BioShop | LBL407 | للإشريكية القولونية نمو |
| luminol ؛ | Sigma-Aldrich | A4685 | لصنع كاشف ECL |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | لتحلل الخلايا البكتيرية |
| أسيتات المغنيسيوم | سيجما-ألدريتش | M5661 | مكون من محلول التفاعل الخالي من الخلايا ب |
| NEBExpress Ni راتنج ؛ | NEB | S1428S | لتنقية الحليب الجاف الخالي من الدسم SpyCatcher2-Apex2 |
| Bioshop | SKI400 | لحجب أغشية WB و CFDB | |
| Parafilm | Bemis | 2099-1337410 | لحضانة ECL لبقع CFDB |
| p-coumaric acid ؛ | Sigma-Aldrich | C9008 | لصنع كاشف ECL |
| pET24b-SpyCatcher2-Apex2 | مختبر البلازميد Pardee | N / A | يستخدم للتعبير عن طبق بتري البروتين SpyCatcher2-Apex2 |
| حاوية FB0875712 Fisherbrand | لحضانة غشاء WB و CFDB ؛ | ||
| ملحي مخزن بالفوسفات 10٪ | BioShop | PBS405 | مكون من المخازن المؤقتة |
| غلوتامات البوتاسيوم | سيجما-ألدريتش | G1501 | مكون من التفاعل الخالي من الخلايا المحلول ب |
| أكسالات البوتاسيوم أحادي الهيدرات (حمض الأكساليك) | سيجما ألدريتش | 223425 | مكون من التفاعل الخالي من الخلايا محلول جل |
| SDS-PAGE مسبقة | الصب BioRad | 4561036EDU | للتحليل الكهربائي للبروتين |
| Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة ؛ | NEB | M0491 | لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ل LETs |
| طقم تنقية QIAquick PCR | Qiagen | 28106 | لتنقية |
| مجموعة محلول الريبونوكليوتيد | NEB | N0450S | أحد مكونات التفاعل الخالي من الخلايا محلول مسحوق |
| الحليب الخالي من الدسم | BioShop | SKI400 | يستخدم كعامل مانع للبقعة الغربية و CFDB |
| كلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S9625 | أحد مكونات مخازن تنقية البروتين |
| Sonicator | Qsonica | Q500 | لتحلل الخلايا البكتيرية |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | أحد مكونات التفاعل الخالي من الخلايا محلول مرشح |
| حقنة | Sigma-Aldrich | SLGSR33SS | لتعقيم المخازن المؤقتة والمحاليل |
| أداة Thermocycler | BioRad | T100 | لاحتضان تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل |
| نقل الحمض النووي الريبي (tRNA) | سيجما ألدريتش | R8759 | أحد مكونات التفاعل الخالي من الخلايا محلول ملحي مخزن |
| من تريس | Thermo Scientific | J60764. K2 | مكون من مخزن غسيل WB و CFDB |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503 | لصنع قارورة |
| اهتزاز Tunair SS-5012 Half-Baffle Shake Flask ، 2.5 L | Cole-Parmer | RK-01835-39 | وعاء لزراعة خلايا الإشريكية القولونية للتعبير عن البروتين وتحضير المحلل الخالي من الخلايا |
| Tween-20 | BioShop | TWN510 | مكون من ملاقط غسيل WB |
| و CFDBAlmedic | 7728-A10-100 | للتعامل مع غشاء CFDB NC | |
| الطيف الضوئي UV-Vis | 13400518 علمي حراري | يستخدم لقياس تركيز الحمض النووي والحمض النووي والثقافة البكتيرية | |
| اللوحة المرجعية الدولية لمنظمة الصحة العالمية للجلوبولين المناعي المضاد ل SARS-CoV-2 | NISBC | 20/268 | مصل متميز مسبقا للتحقق من كواشف / ظروف |
| CFDB وتحسينها>-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد هيدرات (NAD) | سيجما ألدريتش | 10127965001 | أحد مكونات التفاعل الخالي من الخلايا الحل أ |
المراجع
- Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Stadlbauer, D., et al. SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup. Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259.e12 (2016).
- Norouzi, M., et al. Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera. Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- IDT codon optimization tool. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2025).
- General protocol for western blotting. , Bio-Rad. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2025).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting. Spermatogenesis. 1, 121-122 (2011).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), (2019).
- Plasma and serum preparation. , ThermoFisher Scientific. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/plasma-and-serum-preparation.html (2025).
- Mattiuzzo, G., et al. WHO/BS.2020.2403 Establishment of the WHO International Standard and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody. , (2020).
- Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis. Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).
- Peeling, R. W., et al. Serology testing in the COVID-19 pandemic response. Lancet Infect Dis. 20 (9), e245-e249 (2020).
- Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
